JP2003512015A

JP2003512015A - ラクトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードする核酸

Info

Publication number: JP2003512015A
Application number: JP2000581210A
Authority: JP
Inventors: エム．バーカ，ランディ; ダブリュ．レイ，マイケル
Original assignee: ノボザイムスバイオテック，インコーポレイティド
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1999-11-05
Publication date: 2003-04-02
Also published as: EP1129200A2; WO2000028043A2; WO2000028043A3; AU1909900A; CN1354795A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ラクトノヒドロラーゼ活性を有する単離されたポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。本発明はまた、前記核酸配列を含んで成る、核酸構造体、ベクター及び宿主細胞、並びに前記ポリペプチドの生成及び使用方法にも関する。本発明はさらに、微生物生物フィルムの進行の予防方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景：発明の分野：本発明は、ラクトノヒドロラーゼ活性を有する単離されたポリペプチド、及び
前記ポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。本発明はまた、前
記核酸配列を含んで成る、核酸構造体、ベクター、及び宿主細胞、並びに前記ポ
リペプチドを生成し、そして使用するための方法にも関する。

【０００２】関連技術の記載：ラクトノヒドラーゼは、ラクトン化合物のヒドロキシ酸への加水分解を可逆的
に触媒し、すなわちそれらはラクトンとヒドロキシカルボン酸の酸性形との間の
相互転換に介在する。

【０００３】 Shimizuなど. (1992, European Journal of Biochemistry 209: 383-390) は
、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）から得られるラクトノヒ
ドロラーゼを開示している。この酵素調製物は、アルドネートラクトン、例えば
D−ガラクトノ−γ−ラクトン及びD−グルコノ−δ−ラクトンを立体立体特異的
に加水分解する。

【０００４】さらに、フサリウム・オキシスポラムラクトノヒドロラーゼは、D−パントテ
ネートの合成のためにキラル構築阻止として使用され得る、D−パントイルラク
トンの不斉加水分解を触媒する（Shimazu and kataoka, 1996, Annals of the N
ew York Academy of Sciences 799: 650-658; Kataoka など., 1995, Appl. Mic
robiol. Biotechnol. 44: 333-338; Kataoka など., 1996, Enzyme Microb. Tec
hnol. 19: 307-310）。さらに、ラクトノヒドロラーゼは、多くの芳香族ラクト
ン、例えばジヒドロクマリン及びホモゲンチジン酸ラクトンを可逆的に加水分解
する。

【０００５】フサリウム・オキシスポラムラクトノヒドロラーゼ遺伝子のクローニング及び
発現は開示されている（WO97/10341号）。ラクトノヒドロラーゼ活性を有する改良されたポリペプチド、及び前記ポリペ
プチドをコードする核酸を提供することが、本発明の目的である。

【０００６】発明の要約：本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸18〜400と少なくとも95％の同一性を
有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号１のヌクレオチド90〜1238と少なくとも95％の相同性を有する
核酸配列によりコードされるポリペプチド；（ｃ）１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る、配列
番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体；（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｅ）ラクトノヒドロラーゼ活性を有する、前記（ａ）、（ｂ）又は（ｄ）の
フラグメントから成る群から選択された、ラクトノヒドロラーゼ活性を有する単
離されたポリペプチドに関する。

【０００７】本発明はまた、前記ポリペプチドをコードする単離された核酸配列、及び前記
核酸配列を含んで成る核酸構造体、ベクター及び宿主細胞、並びに前記ポリペプ
チドの生成及び使用方法にも関する。本発明はさらに、微生物の生物フィルム生長を妨げるための方法に関する。

【０００８】発明の特定の記載：ラクトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド：用語“ラクトノヒドロラーゼ活性”は、アルドネート及び芳香族ラクトンのそ
の対応するカルボン酸への加水分解を触媒するヒドロラーゼ活性として本明細書
においては定義される。本発明のためには、ラクトノヒドラーゼ活性は、D−ガ
ラクトノ−γ−ラクトンが測定される。Fishbein and Bessman, 1996, Journal
of Biological Chemistry 241: 4835-4841により記載される方法に従って決定さ
れる。

【０００９】第１の態様においては、本発明は、ラクトノヒドロラーゼ活性を有する、配列
番号２（すなわち、成熟ポリペプチド）のアミノ酸18〜400に対して、少なくと
も約95％、及び好ましくは少なくとも約97％の同一性の程度を有するアミノ酸配
列を有する単離されたポリペプチド（この後、“相同ポリペプチド”と称する）
に関する。好ましい態様においては、前記相同ポリペプチドは、配列番号２のア
ミノ酸18〜400とは、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好まし
くは３個のアミノ酸、さらにより好ましくは２個のアミノ酸、及び最も好ましく
は１個のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を有する。

【００１０】本発明のためには、２個のアミノ酸配列間の同一性の程度は、同一性表及び次
の複数の照準パラメーターを伴って、LASERGENE^TM MEGALIGN^TM ソフトウェア（D
NASTAR, Inc., Madison, WI）を用いて、Clustal方法（Higgins, 1989, CABIOS
5: 151-153）により決定される：10のギャップペナルティー及び10のギャップ長
さペナルティー。対様照準パラメーターは、Ktuple＝１、ギャップペナルティー
＝３、ウィンドウ＝５及び対角線＝５である。

【００１１】好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列又はその対
立遺伝子変異体；又はラクトノヒドロラーゼ活性を有するそのフラグメントを含
んで成る。より好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号２
のアミノ酸配列を含んで成る。もう１つの好ましい態様においては、本発明のポ
リペプチドは、配列番号２のアミノ酸18〜400又はその対立遺伝子変異体；又は
ラクトノヒドロラーゼ活性を有するそのフラグメントから成る。もう１つの好ま
しい態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸18〜400
を含んで成る。

【００１２】もう１つの好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号２の
アミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体；又はラクトノヒドロラーゼ活性を有す
るそのフラグメントから成る。もう１つの好ましい態様においては、本発明のポ
リペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列から成る。もう１つの好ましい態様に
おいては、前記ペプチドは、配列番号２のアミノ酸18〜400又はその対立遺伝子
変異体；又はラクトノヒドロラーゼ活性を有するそのフラグメントから成る。も
う１つの好ましい態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸
18〜400から成る。

【００１３】配列番号２のフラグメントは、このアミノ酸のアミノ及び/又はカルボキシル
末端から欠失される１又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドである。好まし
くは、フラグメントは、少なくとも310個のアミノ酸残基、より好ましくは少な
くとも340個のアミノ酸残基、及び最も好ましくは少なくとも370個のアミノ酸残
基を含む。

【００１４】対立遺伝子変異体は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子のいずれか複数の二
者択一形を示す。対立遺伝子変動は、天然においては、突然変異を通して生じ、
そして集団内の多型現象をもたらす。遺伝子突然変異はサイレンであり（コード
されたポリペプチドの変化がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードすることができる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝
子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。

【００１５】第２の態様においては、本発明は、（i）配列番号１のヌクレオチド90-1238,
（ii）配列番号１のヌクレオチド90-1238を含んで成るゲノム配列、（iii）前記
（i）又は（ii）の副配列、又は前記（iv） (i), （ii）又は（iii）の相補的鎖
と、非常に低い緊縮条件、好ましくは低い緊縮条件、より好ましくは中位の緊縮
条件、より好ましくは中位の高い緊縮条件、さらにより好ましくは高い緊縮条件
及び最も好ましくは非常に高い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸プローブと
その同じ条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるラクトノヒド
ロラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する（J. Sambrook, E.F. Fr
itsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ⁿ ^d edition, Cold Spring Harbor, New York）。

【００１６】配列番号１の副配列は、少なくとも100個のヌクレオチド又は好ましくは少な
くとも200個のヌクレオチドであり得る。さらに、その副配列は、ラクトノヒド
ロラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードすることができる。そ
のポリペプチドはまた、ラクトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの対立
遺伝子変異体又はそのフラグメントでもあり得る。

【００１７】配列番号１の核酸配列又はその副配列、及び配列番号２のアミノ酸配列又はそ
のフラグメントは、当業界において良く知られている方法に従って、異なった属
又は種の株からのラクトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
DNAを同定し、そしてクローン化するための核酸プローブを企画するために使用
され得る。特に、そのようなプローブは、そこにおける対応する遺伝子を同定し
、そして単離するために、標準のサザンブロット方法に従って、興味ある属又は
種のゲノム又はcDNAとのハイブリダイゼーションのために使用され得る。

【００１８】そのようなプローブは、完全な配列よりも相当に短いが、しかし少なくとも15
個、好ましくは少なくとも25個、及びより好ましくは少なくとも35個の長さのヌ
クレオチドであるべきである。より長いプローブもまた使用され得る。DNA及びR
NAの両プローブが使用され得る。プローブは典型的には、対応する遺伝子を検出
するためにラベルされる（たとえば、³²P, ³H, ³⁵S, ビオチン、アビジン、フル
オレセイン又はジゴキシゲニンにより）。そのようなプローブは、本発明により
包含される。

【００１９】従って、そのような他の生物から調製されたゲノムDNA又はcDNAライブラリー
は、本明細書に記載されるプローブとハイブリダイズし、そしてラクトノヒドロ
ラーゼ活性を有するポリペプチドををコードするDNAについてスクリーンされ得
る。そのような生物からのゲノム又は他のDNAは、アガロース又はポリアクリル
アミドゲル電気泳動、又は他の分離技法により分離され得る。ライブラリーから
のDNA又は分離されたDNAが、ニトロセルロース又は他の適切なキャリヤー材料に
移行され、そしてその上に固定され得る。

【００２０】配列番号１と相同であるクローン又はDNA、又はその副配列を同定するために
は、キャリヤー材料がサザンブロットに使用される。本発明のためには、ハイブ
リダイゼーションは、核酸配列が、非常に低い〜非常に高い緊縮条件下で、配列
番号１に示されるヌクレオチド配列、その相補的鎖、又はその副配列に対応する
ラベルにされた核酸プローブにハイブリダイズすることを示す。核酸プローブが
それらの条件下でハイブリダイズする分子は、X−線フィルムを用いて検出され
る。

【００２１】好ましい態様においては、核酸プローブは、配列番号２のポリペプチド又はそ
の副配列をコードする核酸配列である。もう１つの好ましい態様においては、核
酸プローブは配列番号１である。もう１つの好ましい態様においては、核酸プロ
ーブは、配列番号１の成熟ポリペプチドコード領域である。もう１つの好ましい
態様においては、核酸プローブは、E.コリNRRL B−30074に含まれるプラスミド
pFA0576に含まれる核酸配列であり、ここで核酸配列はラクトノヒドロラーゼ活
性を有するポリペプチドをコードする。もう1つの好ましい態様においては、核
酸プローブは、E.コリNRRL B−30074に含まれるプラスミドpFA0576に含まれる成
熟ポリペプチドコード領域である。

【００２２】少なくとも100個の長さのヌクレオチドの長さのプローブに関して、非常に低
い〜非常に高い緊縮条件は、標準のサザンブロット方法に従っての、５×SSPE,
0.3%SDS, 200μg/ml の剪断され、そして変性されたサケ精子DNA、及び25％ホル
ムアミド（非常に低い及び低い緊縮に関して）、35％ホルムアミド（中位い及び
中位の高い緊縮に関して）、又は50％ホルムアミド（高い及び非常に高い緊縮に
関して）における42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーシ
ョンとして定義される。

【００２３】少なくとも100個の長さのヌクレオチドの長さプローブに関しては、キャリヤ
ー材料は最終的に、２×SSC, 0.2%SDS溶液を用いて、好ましくは少なくとも45℃
（非常に低い緊縮）、より好ましくは少なくとも50℃（低い緊縮）、より好まし
くは少なくとも55℃（中位の緊縮）、より好ましくは少なくとも60℃（中位の高
い緊縮）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（高い緊縮）、および最も好ま
しくは少なくとも70℃（非常に高い緊縮）で、それぞれ15分間、３度洗浄される
。

【００２４】約15個〜約70個の長さのヌクレオチドである短いプローブに関しては、緊縮条
件は、0.9MのNaCl、0.09Mのトリス−HCl, pH7.6、６mM のEDTA、 0.5のNP-40,
1×Denhardt’s溶液、１mMのピロリン酸ナトリウム、１mMの一塩基性リン酸ナト
リウム、0.1mMのATP及び0.2mgの酵母RNA（ml当たり）における、Bolton and McC
arthy（1962、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 139
0）に従って計算されたTmよりも約５℃〜約10℃低い温度での標準のサザンブロ
ット方法に従ってのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及
び後−ハイブリダイゼーション洗浄として定義される。

【００２５】約15個〜約70個の長さのヌクレオチドである短いプローブに関しては、キャリ
ヤー材料は、６×SSC及び0.1％SDSにより15分間、1度、及び６×SSCを用いて、
計算されたTmよりも約５℃〜約10℃低い温度でそれぞれ15分間、２度、洗浄され
る。第３の態様においては、本発明は、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/
又は挿入を含んで成る、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異
体に関する。

【００２６】変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は
欠失、及び/又は異なったアミノ酸残基による１又は複数のアミノ酸残基の置換
により、配列番号２のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドと異なることがで
きる。好ましくは、アミノ酸変更は、マイナーな性質のもの、すなわちタンパク
質の折りたたみ及び/又は活性に有意に影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換；
典型的には１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシ
−末端−、たとえばアミノ−末端のメチオニン残基の延長；約20〜25個までの残
基の小さなリンカーペプチドの延長；又は実効電荷又は他の機能、たとえばポリ
−ヒスチジン系、抗原性エピトープ又は結合ドメインを変更することにより精製
を促進する小さな延長のものである。

【００２７】保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、
酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン
及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、
芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さ
なアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグル
ープ内である。

【００２８】一般的に、非活性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られており、
そしてたとえば、H. Neurath and R.L. Hill, 1979, The Proteins, Academic P
ress, New York により記載されている。最も通常生じる交換は次のものである
： Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Va
l, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/G
lu及びAsp/Gly並びにそれらの逆。

【００２９】第４の態様においては、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド又はその成熟ポリペプチドに対して免疫化学同一性又は部分的免疫化学同
一性を有する単離されたポリペプチドに関する。免疫化学性質は、良く知られた
オクテルロニー二重免疫拡散法による免疫学的交差反応同一試験により決定され
る。

【００３０】特に、配列番号２のアミノ酸配列を有するパリペプチド、又は成熟ポリペプチ
ドのエピトープと免疫反応し又はそれに結合する、抗血清含有ポリクローナル抗
体は、Harboe and Ingild, In N.H. Axelsen, J. Kroll, and B. Weeks, editor
s, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific
Publications, 1973, Chapter 23, 又はJohnstone and Thorpe, Immunochemistr
y in Practice, Blackwerr Scientific Publications, 1982 (より特別には、ペ
ージ27〜31) により記載される方法に従って、ウサギ（又は他の囓歯動物）を免
疫化することによって調製される。

【００３１】免疫化学同一性を有するポリペプチドは、同一の態様、例えば沈殿物の全融合
性、同一の沈殿物形態学及び特定の免疫化学的方法を用いての同一の電気泳動性
において抗血清と反応するポリペプチドである。免疫化学的同一性のさらなる説
明は、Axelsen, Bock and Kroll, In N.H. Axelsen, J. Kroll and B. Weeks, e
ditors, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scient
ific Publications, 1973, Chapter 10 により記載される。

【００３２】部分的免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、部分的同一の態様、例えば
沈殿物の部分的態様、部分的に同一の沈殿物形態学、及び/又は特定の免疫化学
技法を用いての部分的に同一の電気泳動移動性において、抗血清と反応するポリ
ペプチドである。部分的免疫化学的同一性は、Bock and Axelsen, In N.H. Axel
sen, J. Kroll, and B. Weeks, editors, A Manual of Quantitative Immunoele
ctrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter11 により
記載される。

【００３３】抗体はまた、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、例えば
E. Harlow and D. Lane, editors, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, C
old Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York の方法に従って、調
製され、そして使用され得る。本発明のポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドのラクトノヒドロラ
ーゼ活性の少なくとも20％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なく
とも60％、さらにより好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なく
とも90％、及び最も好ましくは少なくとも100％を有する。

【００３４】本発明のポリペプチドは、いずれかの属の微生物から得られる。本発明のため
には、用語“〜から得られる”とは、所定の源に関して本明細書において使用さ
れる場合、核酸配列によりコードされるポリペプチドが前記源により、又はその
源からの核酸配列が挿入されている細胞により生成されることを意味する。好ま
しい態様においては、ポリペプチドは細胞外に分泌される。

【００３５】本発明のポリペプチドは、細菌ポリペプチドであり得る。例えば、前記ポリペ
プチドは、グラム陽性細胞ポリペプチド、例えば、バチルス（bacillus）ポリペ
プチド、例えばバチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチ
ルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブ
レビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans
）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ラウタス（
Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケ
ニホルミス（Bacillus licheniformis）、

【００３６】バチルス・メガテリウス（Bacillus megaterium）、バチルス・ステアロサー
モフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillu
s subtilis）又はバチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）ポリ
ペプチド；又はストレプトミセス（Streptomyces）ポリペプチド、例えばストレ
プトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ム
リナス（Streptomyces murinus）ポリペプチド；又はグラム陰性細菌ポリペプチ
ド、例えばE.コリ（E. coli）又はプソイドモナスsp. (Pseudomonas sp.) ポリ
ペプチドであり得る。

【００３７】本発明のポリペプチドは、菌類ポリペプチド、及びより好ましくは、酵母ポリ
ペプチド、例えばカンジダ（Candida）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、
ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（S
chizos accharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）ポリペプチド；又はより
好ましくは、糸状菌ポリペプチド、例えばアクレモニウム（Acremonium）、アス
ペルギラス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、クリプト
コーカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、

【００３８】フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポリス（Magnap
orthe）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカノマス
チックス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（
Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピロミセス（Piromyces）、シ
ゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスカス
（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladiu
m）又はトリコダーマ（Trichoderma）ポリペプチドであり得る。

【００３９】好ましい態様においては、ポリペプチドは、サッカロミセス・カルスベルゲン
シス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシアエ（Sacc
haromyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces di
astaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッ
カロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベ
ンシス（Saccharomyces norbensis）又はサッカロミセス・オビホルミス（Sacch
aromyces oviformis）ポリペプチドである。

【００４０】もう１つの好ましい態様においては、ポリペプチドは、アスペルギラス・アキ
ュレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギラス・アワモリ（Aspergill
us awamori）、アスペルギラス・ホエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペ
ルギラス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギラス・ニジュ
ランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus nige
r）、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、ヒュミコラ・インソ
レンス（Humicola insolens）、

【００４１】ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコル・ミエヘイ（Mucor
miehei）、ミセリオプラソ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、
ネウロスポラ・クラサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプロゲナム
（Penicillium purpurogenum）、トリコダーマ・ハルジアナル（Trichoderma ha
rzianum）、トリコダーマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコダーマ
・ロンジブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコダーマ・レセ
イ（Trichoderma reesei）又はトリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）で
ある。

【００４２】もう１つの好ましい態様においては、ポリペプチドは、フサリウム・バクトリ
ジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusarium c
erealis）、フサリウム・クロックウェレンズ（Fusarium crookwellense）、フ
サリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネアラム（F
usarium graminearium）、フサリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フ
サリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネグンジ
（Fusarium negundi）、

【００４３】フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レチキュ
ラタム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロゼウム（Fusariumu roseum）
、フサリウム・サムブシウム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・サルコク
ロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Fusari
um sporotrichioides）、フサリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、
フサリウム・トルロサム（Fusarium torulosaum）、フサリウム・トリコセシオ
イデス（Fusarium trichothecioides）又はフサリウム・ベネナタム（Fusarium
venenatum）ポリペプチドである。

【００４４】より好ましい態様においては、フサリウム・ベネナタム細胞は、フサリウム・
グラミネアラムATCC20334として最初に寄託され、そして最近、Yoder and Chris
tianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80及びO’Donnell など.
, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67 によりフサリウム・ベネナタ
ムとして再分類されている、フサリウム・ベネナタムA3/5；及び現在知られてい
る種名称にもかかわらず、フサリウム・ベネナタムの分類学的同等物である。も
う１つの好ましい態様においては、フサリウム・ベネナタム細胞は、WO97/26330
号に記載されるように、フサリウム・ベネナタムA3/5又はフサリウム・ベネナタ
ムATCC20334の形態学的変異体である。

【００４５】前述の種に関しては、本発明は完全及び不完全状態の両者、及び他の分類学的
同等物、例えばアナモルフを、それらが知られている種の名称にかかわらず、包
含することが理解されるであろう。当業者は適切な同等物の正体を容易に理解す
るであろう。例えば、フサリウムの分類学的同等物は、D. L. Hawksworth, P. M
. Kirt, B. C. Sutton, and D. N. Pegler(editors), 1995, In Ainsworth & Bi
sby’s Dictionary of the Funji, Eighth Edition, CAB International, Unive
rsity Press , Cambridge, England,pp. 173-174により定義される。

【００４６】それらの種の株は、次の多くの培養物寄託所から容易に入手できる：American
Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen u
nd Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcaltures (CBS),
及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Re
gional Research Center (NRRL)。

【００４７】さらに、そのようなポリペプチドは、他の源、例えば天然源（例えば、土壌、
培養土、水、等）から単離された微生物から、上記プローブを用いて同定され、
そして得られる。天然の生息地から微生物を単離する技法は当業界において良く
知られている。次に、核酸配列は、もう1つの微生物のゲノム又はcDNAライブラ
リーを同様にスクリーニングすることによって誘導され得る。ポリペプチドをコ
ードする核酸配列がプローブにより検出されると、配列は当業者に知られている
技法を用いることによって同定され、又はクローン化され得る（例えば、J. Sam
brook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Labora
tory Manual, Zd Edition, Cold Spring Harbor, New York を参照のこと）。

【００４８】本明細書において定義される場合、“単離された”ポリペプチドは、SDS−PAG
Eにより決定される場合、他のポリペプチドを実質的に有さないポリペプチド、
たとえば少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも40％の純度、より好ま
しくは約60％の純度、さらに好ましくは約80％の純度、最も好ましくは約90％の
純度及びさらに最も好ましくは約95％の純度のポリペプチドである。

【００４９】本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドはまた、もう１つのポリペ
プチドが前記ポリペプチド又はフラグメントのN−末端又はC−末端で融合されて
いる、融合された又は切断可能な融合ポリペプチドも包含することができる。融
合されたポリペプチドは、１つのポリペプチドをコードする核酸配列（又はその
一部）を、本発明の核酸配列（又はその一部）に融合することによって生成され
る。融合ポリペプチドを生成するための技法は、当業界において知られており、
そしてポリペプチドをコードするコード配列を、それらが整合して存在し、そし
て融合されたポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの制御
下にあるよう、連結することを包含する。

【００５０】核酸配列：本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列にも関する
。好ましい態様においては、核酸配列は、配列番号１で示される。もう1つの好
ましい態様においては、核酸配列は、E.コリNRRL B−30074に含まれるプラスミ
ドpFA0576に含まれる配列である。もう１つの好ましい態様においては、核酸配
列は、配列番号１の成熟ポリペプチドコード領域である。

【００５１】もう１つの好ましい態様においては、核酸配列は、E.コリNRRL B−30074に含
まれるプラスミドpFA0576に含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。本発
明はまた、遺伝子コードの縮重により配列番号１とは異なる、配列番号２のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド又はその成熟ポリペプチドをコードする核酸配列
を包含する。本発明はまた、ラクトノヒドロラーゼ活性を有する、配列番号２の
フラグメントをコードする配列番号１の副配列にも関する。

【００５２】配列番号１の副配列は、配列番号１により包含される核酸配列であるが、但し
5’及び/又は3’側末端からの１又は複数のヌクレオチドが欠失されている。好
ましくは、副配列は、少なくとも930個のヌクレオチド、より好ましくは少なく
とも1020個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも1110個オヌクレオチ
ドを含む。本発明はまた、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列における少なくとも
1つの突然変異を含んで成る変異体核酸配列にも関し、ここで前記変異体核酸配
列は配列番号２のアミノ酸18〜400から成るポリペプチドをコードする。

【００５３】ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し、又はクローン化するために使用
される技法は、当業界において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDN
Aからの調製、又はそれらの組み合わせを包含する。そのようなゲノムDNAからの
本発明の核酸配列のクローニングは、例えば良く知られているポリメラーゼ鎖反
応（PCR）、又は共有する構造特徴を有するクローン化されたDNAフラグメントを
検出するために発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いることによっても
たらされ得る。

【００５４】例えば、Innisなど., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application; Aca
demic Press, New York を参照のこと。他の核酸増幅方法、例えばリガーゼ鎖反
応（LCR）、連結された活性化転写（LAT）及び核酸配列に基づく増幅（NASBA）
が使用され得る。核酸配列は、フサリウム株、又は他の又は関連する生物からク
ローン化され得、そして従って、核酸配列のポリペプチドコード領域の対立遺伝
子又は種変異体であり得る。

【００５５】用語“単離された核酸配列”とは、本明細書において使用される場合、アガロ
ース電気泳動により決定される場合、他の核酸配列を実質的に有さず、たとえば
少なくとも約20％純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より好ましくは少
なくとも約60％の純度、さらにより好ましくは少なくとも約80％の純度、及び最
も好ましくは少なくとも約90％の純度である核酸配列を言及する。たとえば、単
離された核酸配列は、それが再生されるであろう異なった部位にその天然の位置
から核酸配列を再配置するために遺伝子工学に使用される標準のクローニング方
法により得られる。

【００５６】クローニング方法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望す
る核酸フラグメントの切除及び単離、ベクター分子中へのフラグメントの挿入、
及び核酸配列の複数コピー又はクローンが複製されるであろう宿主細胞中への組
換えベクターの組み込みを包含する。核酸配列は、ゲノム、cDNA, RNA, 半合成
、合成起源、又はそれらのいずれかの組み合わせのものであり得る。

【００５７】本発明はまた、活性ポリペプチドをコードする、配列番号１の成熟ポリペプチ
ドコード配列（すなわち、ヌクレオチド90〜1238）に対して少なくとも約95％及
び好ましくは約97％の相同生の程度を有する核酸配列にも関する。本発明のため
には、２個の核酸配列間の相同性の程度は、同一性表及び次の複数の照準パラメ
ーターを伴って、LASERGENE^TM MEGALIGN^TM ソフトウェア（DNASTAR, Inc., Madi
son, WI）を用いて、Wilbur-Lipman 方法（Wilbur and Lipman, 1983, Proceedi
ngs of the National Academy of Science USA 80：726-730）により決定される
：10のギャップペナルティー及び10のギャップ長さペナルティー。対様照準パラ
メーターは、Ktuple＝３、ギャップペナルティー＝３及びウィンドウ＝20である
。

【００５８】本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の修飾は、そのポリペプチドに実
質的に類似するポリペプチドの合成のために必要である。用語、ポリペプチドに
“実質的に類似する”とは、ポリペプチドの天然に存在しない形を言及する。そ
れらのポリペプチドは、その天然源から単離されたポリペプチドとは、いくつか
の構築された態様で異なり、たとえば非活性、熱安定性、pH最適性又は同様のも
のにおいて異なる変異体であり得る。

【００５９】変異体配列は、配列番号１のポリペプチドコード部分として提供される核酸配
列、たとえばその副配列に基づいて、及び/又は核酸配列によりコードされるポ
リペプチドのもう1つのアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のた
めに意図された宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入によ
り、又は異なったアミノ酸配列を生ぜしめることができるヌクレオチド置換の導
入により構成され得る。ヌクレオチド置換の一般的記載のためには、Fordなど.,
1991, Protein Expression and Purification 2:95-107を参照のこと。

【００６０】そのような置換は、分子の機能に対して決定的である領域外で行われ、そして
さらに活性ポリペプチドをもたらすことは、当業者に明らかであろう。本発明の
単離された核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に必須であり、そし
て従って、好ましくは置換を受けやすくないアミノ酸残基は、当業界において知
られている方法、たとえば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異
誘発に従って同定され得る（たとえば、Cunningham and Wells, 1989, Science
244: 1081-1085を参照のこと）。

【００６１】後者の技法においては、突然変異は分子における正に荷電された残基ごとに導
入され、そしてその得られる変異体分子は、分子の活性に対して決定的であるア
ミノ酸残基を同定するためにラクトノヒドロラーゼ活性について試験される。基
質−酵素相互作用の部位はまた、核磁気共鳴分析、クリスタログラフィー又は光
親和性ラベリングのような技法により決定されるように、立体構造体の分析によ
り決定され得る（たとえば、de Vos など., 1992, Science 255: 306-312; Smi
th など., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver など
., 1992, FEBS Letters 309: 59-64を参照のこと）。

【００６２】本発明はまた、配列番号１の核酸配列又はその相補的鎖；又はその対立遺伝子
及び副配列と同じ条件下でハイブリダイズする核酸プローブと、非常に低い緊縮
条件、好ましくは低い緊縮条件、より好ましくは中位の緊縮条件、より好ましく
は中位の高い緊縮条件、さらにより好ましくは高い緊縮条件及び最も好ましくは
非常に高い緊縮条件下でハイブリダイズする本発明のポリペプチドをコードする
単離された核酸配列にも関する。（Sambrook など., 1989, 前記）。

【００６３】本発明はまた、（a）非常に低い、低い、中位の、中位の高い、高い又は非常
に高い緊縮条件下で、（i）配列番号１のヌクレオチド90-1238,（ii）配列番号
１のヌクレオチド90-1238を含んで成るゲノム配列、（iii）（i）又は（ii）の
副配列、又は（iV）（i）, (ii)又は（iii）の相補的鎖によりDNAをハイブリダ
イズせしめ；そして（b）核酸配列を単離することによって生成される、単離さ
れた核酸配列にも関する。副配列は好ましくは、少なくとも100個のヌクレオチ
ドの配列、たとえばラクトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメン
トをコードする配列である。

【００６４】変異体核酸配列を生成するための方法：本発明はさらに、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列又はその副配列中
に少なくとも1つの突然変異を導入することを含んで成る。変異体核酸配列を生
成するための方法に関し、ここで前記変異体核酸配列は、ラクトノヒドロラーゼ
活性を有する、配列番号２のアミノ酸１8−400又はそのフラグメントから成るポ
リペプチドをコードする。

【００６５】１つのヌクレオチドをもう1つのヌクレオチドにより交換するためへの核酸配
列中への突然変異の導入は、当業界において知られているいずれかの方法を用い
て、特定部位の突然変異誘発により達成され得る。興味ある挿入体を有する、超
らせん二本鎖DNAベクター及び所望する突然変異を含む２種の合成プライマーを
用いる方法が特に有用である。ベクターの反対鎖に対してそれぞれ相補的なオリ
ゴヌクレオチドプライマーは、Pfu DNAポリメラーゼによる温度サイクリングの
間、延長する。

【００６６】プライマーの組み込みに基づいて、付着されたニッケルを含む突然変異誘発さ
れたプラスミドが生成される。温度サイクリングに続いて、生成物は、親DNA鋳
型を消化し、そして突然変異−含有の合成されたDNAについて選択するために、
メチル化され、そしてヘミメチル化されたDNAに対して特異的であるDpnIにより
処理される。当業界において知られている他の方法もまた使用され得る。

【００６７】核酸構造体：本発明はまた、適切な宿主細胞においてコード配列の発現を方向づける１又は
複数の制御配列に作用可能に連結される本発明の核酸配列を、制御配列と適合で
きる条件下で含んで成る核酸構造体にも関する。発現は、ポリペプチドの生成に
包含されるいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及
び分泌（但し、それらだけには限定されない）を、包含することが理解される方
法。

【００６８】 “核酸構造体”とは、本明細書においては、天然に存在する遺伝子から単離さ
れ、又は他方では、天然に存在しない態様で組み合わされ、そして並置される、
核酸のセグメントを含むように修飾されている、一本鎖又は二本鎖核酸分子とし
て定義される。用語“核酸構造体”とは、核酸構造体が本発明のコード配列の発
現のために必要とされるすべての制御配列を含む場合、用語“発現カセット”と
同じ意味である。

【００６９】用語“コード配列”とは、本明細書において定義される場合、そのタンパク質
生成物のアミノ酸配列を直接的に特定する核酸配列として定義される。そのコー
ド配列の境界は、一般的に、リボソーム結合部位(原核生物)により、又はmRNAの
5’末端で読み取り枠のすぐ上流に位置するATG開始コドン、及びmRNAの3’末端
で読み取り枠のすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列により決定される。
コード配列は、DNA、cDNA 及び組み合わせ核酸配列を包含するが、但しそれらだ
けには限定されない。

【００７０】本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、ポリペプチドの発
現を提供するために種々の手段で操作され得る。ベクター中へのその挿入の前、
核酸配列の操作は、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要とされる。
組換えDNA方法を用いて核酸配列を修飾するための技法は、当業界において良く
知られている。

【００７１】用語“制御配列”とは、本発明のポリペプチドの発現のために必要であるか、
又はそのために好都合であるすべての成分を包含するよう定義される。個々の制
御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来であっても又は外来
性であっても良い。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プ
ロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネータ
ーを包含するが、但しそれらだけには限定されない。

【００７２】最少で、制御配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含す
る。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列と
の連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーを提供され得る。用
語“作用可能に連結される”とは、本明細書においては、制御配列が、それがポ
リペプチドの生成を方向づけるよう、DNA配列のコード配列に対する位置に適切
に配置される形状として定義される。

【００７３】制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸配列の発現のために宿主
細胞により認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチド
の発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、宿主細胞において転写
活性を示すいずれかの核酸配列、たとえば変異体の、切断された、及びハイブリ
ッドのプロモーターであり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種で
ある細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。

【００７４】特に細胞宿主細胞において本発明の核酸構造体の転写を方向づけるための適切
なプロモーターの例は、E.コリlacオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー
（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（dagA）、バチルス・サブチリ
ス（Bacillus subtilis）Lバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルス・リケニホル
ミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、Bチルス・ス
テアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）マルトゲン性アミラー
ゼ遺伝子（amyM）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliguef
aciens） α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、

【００７５】バチルス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バチルス・サブチ
リスxylA及びzylB遺伝子及び原生動物のβ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプ
ロモーター（Villa−Kamaroffなど., 1978, Proceedings of the National Acad
emy of Sciences USA 75: 3727-3731）、及びtac プロモーター（De Boer など.
, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 21-25）で
ある。さらなるプロモーターは、“Useful proteins from recombinant bacteri
a” in Scientific American, 1980, 242: 74-94; 及びSambrookなど., 1989,
前記に記載される。

【００７６】糸状菌宿主細胞における本発明の核酸構造体の転写を方向づけるための適切な
プロモーターの例は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・
ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー中性α−ア
ミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス・
ニガー又はアスペルギラス・アワモリグルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・
ミエヘイリパーゼ、

【００７７】アスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザ
エトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアセトアミダ
ーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ（WA96/007
87号）をコードする遺伝子から得られるプロモーター、並びにアスペルギラス・
ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソ
メラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド、及びそれらの
変異体の切断され、及びハイブリッドのプロモーターである。

【００７８】酵母宿主においては、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシアエ
（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO−１）、サッカロミセス・セレ
ビシアエガラクトキナーゼ（GAL１）、サッカロミセス・セレビシアエアルコー
ルデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH2/
GAP）、及びサッカロミセス・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼか
ら得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romunosなど.,
1992, Yeast8：423−488により記載される。

【００７９】制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するた
めに宿主細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ポリ
ペプチドをコードする核酸配列の3’側末端に作用可能に連結される。選択の宿
主細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが本発明において使用さ
れ得る。

【００８０】糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギラス・オリザ
エTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス
・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーα−グルコ
シダーゼ及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼについて
の遺伝子から得られる。

【００８１】酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシ
アエエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシアエチトクロムC（CYC１）、及びサ
ッカロミセス・セレビシアエグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
についての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネータ
ーは、Romanosなど., 1992, 前記により記載される。

【００８２】制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち宿主細胞による翻訳のために
重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコ
ードする核酸配列の5’末端に作用可能に連結される。選択の宿主細胞において
機能的であるいずれかのリーダー配列が、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKA
アミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼにつ
いての遺伝子から得られる。

【００８３】酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシアエエノ
ラーゼ（ENO−１）、サッカロミセル・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキ
ナーゼ、サッカロミセス・セレビシアエα−因子及びサッカロミセス・セレビシ
アエアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ADH2/GAP）についての遺伝子から得られる。

【００８４】制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の3’末端に操作可
能に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を
付加するためにシグナルとして宿主細胞により認識される配列でもあり得る。選
択の宿主細胞において機能的であるいずれかのポリアデニル化配列が，本発明に
おいて使用される。

【００８５】糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オ
リザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギ
キラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポラム
トリプシン−様プロテアーゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼに
ついての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995,
Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990により記載されている。

【００８６】制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコー
ドし、そしてそのコードされたポリペプチドを細胞の分泌路中に方向づけるシグ
ナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の5’側末端は、
本来、分泌されたポロペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み
取り枠を整合して、天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を含む
ことができる。

【００８７】他方では、コード配列の5’側末端は、そのコード配列に対して外来性である
シグナルペプチドコード領域を含むことができる。そのコード配列が天然におい
て、シグナルペプチドコード領域を含まない外来性シグナルペプチドコード領域
が必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチ
ドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域を単純に
置換することができる。しかしながら、分泌路中に発現されたポリペプチドを方
向づけるいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明に使用され得る。

【００８８】細菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、バチルスNCIB
11837マルトゲン性アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラスα−アミラ
ーゼ、バチルス・リケニホルミススブチリシン、バチルス・リケニホルミスβ−
ラクタマーゼ、バチルス・アステロサーモフィラス中性プロテアーゼ（nprT, np
rS, nprM）、及びバチルス・スブチリスprsAについての遺伝子から得られるシグ
ナルペプチド領域である。追加のシグナルペプチドは、Sinomen and Palva, 199
3, Microbiological Reviews 57: 109-137 により記載される。

【００８９】糸状菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギ
ラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ、アス
ペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスペラギン酸プ
ロテイナーゼ、ヒューミコラ・インソレンスセルラーゼ及びヒューミコラ・ラヌ
ギノサリパーゼについての遺伝子から得られたシグナルペプチドコート領域であ
る。

【００９０】好ましい態様においては、シグナルペプチドコード領域は、配列番号２のアミ
ノ酸１〜17をコードする配列番号１のヌクレオチド38〜89である。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシ
アエα−因子及びサッカロミセル・セレビシアエインバーターゼについての遺伝
子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Romanos など., 1
992, 前記により記載される。

【００９１】制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端で位置するアミノ酸配列をコード
するプロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又
はプロポリペプチド（又は多くの場合、チモーゲン）として知られている。プロ
ポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからプロペプチ
ドの触媒又は自己触媒分解により成熟した活性ポリペプチドに転換され得る。プ
ロペプチドコード領域は、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ（aprE）
、バチルス・サブチリス中性プロテアーゼ（nprT）、サッカロミセス・セレビシ
アエα−因子、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、
及びミセリオプソラ・サーモフィリアラッカーゼについての遺伝子から得られ
る（WO95/33836号）。

【００９２】シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両者がポリペプチドのアミノ末端に
存在する場合、そのプロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置
し、そしてシグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置
する。宿主細胞の増殖に関して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を
付加することがまた所望される。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含
する、化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現の開始又は停止を引き起
こすそれらのシステムである。

【００９３】原核生物系における調節システムは、lac, tac及びtrpオペレーターシステム
お包含する。酵母においては、ADH2システム又はGAL1システムが使用され得る。
糸状菌においては、TAKAα−アミラーゼプロモーター、アスペルギラス・ニガー
グルコアミラーゼプロモーター及びアスペルギラス・オリザエグルコアミラーゼ
プロモーターが、調節配列として使用さえ得る。調節配列の他の列は、遺伝子増
幅を可能にするそれらの配列である。真核システムにおいては、それらはメトト
レキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属
と共に増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。それらの場合、ポリペプ
チドをコードする核酸配列が、調節配列により作用可能に連結される。

【００９４】本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現を変更
するための核酸構造体にも関する。前記構造底は、前記内因性遺伝子の発現を変
えるために必要な最少数の成分を含むことができる。１つの態様においては、核
酸構造体は好ましくは、（a）標的化配列、（b）調節配列、（c）エキソン、及
び（c）スプライス−ドナー部位を含む。細胞中への核酸構造体の導入に基づい
て、その構造体は、相同組換えにより、内因性遺伝子部位で細胞ゲノム中に挿入
する。

【００９５】標的化配列は、要素（b）−（d）が内因性遺伝子に作用可能に連結されるよう
に、その内因性遺伝子中への前記要素（a）−（d）の組み込みを方向づける。も
う１つの態様においては、核酸構造体は、（a）標的化配列、（b）調節配列、（
c）エキソン、（d）スプライス−ドナー部位、（e）イントロン、及び（f）スプ
ライス−受容体部位を含み、ここで標的化配列が、要素（b）−（f）が内因性遺
伝子に作用可能に連結されるように、要素（a）−（f）の組み込みを方向づける
。しかしながら、前記構造体は、追加の成分、たとえば選択マーカーも含むこと
ができる。

【００９６】両態様においては、それらの成分の導入は、内因性遺伝子の発現が変更されて
いる新規転写単位の生成をもたらす。本質的には、その新規転写単位は、標的化
構造体及び内因性遺伝子により導入される配列の融合生成物である。内因性遺伝
子が変更される１つの態様においては、核酸配列が活性化される。この態様にお
いては、相同組換えが、対応する親細胞における現象によりも高いレベルでの核
酸配列の発現を引き起こす調節配列の挿入を通して親細胞の内因性遺伝子に通常
関係する調節領域を置換し、破壊し、又は無能化するために使用される。活性化
された核酸配列はさらに、当業界においてよく知られている方法を用いて、構造
体における増幅できる選択マーカー遺伝子の包含により増幅され得る（たとえば
、アメリカ特許第5,641,670号を参照のこと）。内因性遺伝子が変更されている
もう１つの態様においては、遺伝子の発現が低められる。

【００９７】標的化配列は、内因性遺伝子内に、核酸配列に隣接して、上流の遺伝子内に、
又は内因性遺伝子の上流及びその配列から一定の距離に存在することができる。
１又は複数の標的化配列が使用され得る。たとえば、環状プラスミド又はそのDN
Aフラグメントは好ましくは、単一の標的化配列を使用し、そして線状プラスミ
ド又はそのDNAフラグメントは好ましくは、２種の標的化配列を使用する。構造体の調節配列は、１又は複数のプロモーター、エンハンサー、骨格−結合
領域又はマトリックス結合部位、負の調節要素、転写結合部位、又はそれらの配
列の組み合わせから構成され得る。

【００９８】構造体はさらに、内因性遺伝子の１又は複数のエキソンを含む。エキソンは、
エキソン配列が内因性遺伝子のコード領域と整合して存在するように、RNAにコ
ピーされ、そして成熟mRNA分子に存在するDNA配列として定義される。エキソン
は、本来、１又は複数のアミノ酸をコードし、そして/又はアミノ酸を部分的に
コードするDNAを含むことができる。他方では、エキソンは、5’側非コード領域
に対応するDNAを含む。外因性エキソン又はエキソ類が１又は複数のアミノ酸及
び/又はその一部をコードする場合、核酸構造体は、転写及びスプライシングに
基づいて、読み取り枠が内因性遺伝子のコード領域と整合して存在し、その結果
、第２エキソンに由来するmRNAの一部の適切な読み取り枠が変化していないよう
に企画される。

【００９９】構造体のスプライス−ドナー部位は、１つのエキソンのスプライシングをもう
１つのエキソンに方向づける。典型的には、第１のエキソンは第２のエキソンの
5’側に存在し、そしてその3’側上の第１のエキソンをオーバーラップし、そし
てそれを端に有するスプライス−ドナー部位は、第２のエキソンの5’側上の第
２のエキソンを端に有するスプライス−受容体部位を認識する。スプライス−ド
ナー部位のように、スプライス−受容体部位は、１つのエキソンのスプライシン
グをもう１つのエキソンに方向づける配列である。スプライス−ドナー部位に関
連して作用する場合、スプライシング装置は、イントロンの除去をもたらすため
にスプライス−受容体部位を使用する。

【０１００】発現ベクター：本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグ
ナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々の核酸及び制御配
列は、１又は複数の便利な制限部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入
又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクタ
ーを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明の核酸配列は、前記
配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に
挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード
配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列
により作用可能に連結される。

【０１０１】組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得、そして核酸配
列の発現をもたらすことができるいずれかのベクター（たとえば、プラスミド又
はウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される
予定である宿主細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、線
状又は閉環された環状プラスミドであり得る。

【０１０２】ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体存在物として存在する
ベクター（その複製は染色体複製には無関係である）、たとえばプラスミド、染
色体外要素、ミニクロモソーム又は人工染色体であり得る。ベクターは自己複製
を確かめるためのいずれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、
糸状菌細胞中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込ま
れている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、宿主細胞のゲ
ノム中に導入される全DNA又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又
はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドが使用され得る。

【０１０３】本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にす
る１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、１つの遺伝子であり、そ
の生成物は、殺生物剤又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対
する原栄養要求性、及び同様のものを提供する。細菌選択マーカーの例は、バチ
ルス・サブチリス又はバチルス・リケニホルミスからのdal遺伝子、又は抗生物
質、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイ
クリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは
、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1及びURA3である。

【０１０４】糸状菌宿主細胞に使用するための選択マーカーは、次の群から選択されるが、
但しそれらだけには限定されない；amdS (アセトアミダーゼ)、argB (オルニチ
ンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar (ホスフィノトリシンアセチルトラン
スフェラーゼ)、hph (ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD (硝酸
レダクターゼ)、pyrG (オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC (硫
酸アデニルトランスフェラーゼ) 及びtrpC (アントラニル酸シンターゼ)、並び
にそれらの同等物。アスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザ
エのamdS及びpyrG遺伝子及びストレプトミセス・ヒグロスコピカスのbar遺伝子
が、アスペルギラス細胞への使用のために好ましい。

【０１０５】本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組
み込み、又は細胞のゲノムに無関係に細胞におけるベクターの自律的複製を可能
にする要素を含む。宿主細胞のゲノム中への組み込みのためには、ベクターは、相同又は非相同組
換えによるゲノム中へのベクターの安定した組み込みのためのベクター中のポリ
ペプチド、又はいずれか他の要素をコードする核酸配列に依存する。他方では、
ベクターは、宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを方向づけるた
めの追加の核酸配列を含むことができる。

【０１０６】その追加の核酸配列は、染色体における正確な位置での宿主細胞ゲノム中への
ベクターの組み込みを可能にする。正確な位置での組み込みの可能性を高めるた
めに、組み込み要素は好ましくは、相同組換えの可能性を高めるために対応する
標的配列と高い相同性を示す十分な数の核酸、たとえば100〜10,000個の塩基対
、好ましくは400〜10,000個の塩基対、及び最も好ましくは800〜10,000個の塩基
対を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相
同であるいずれかの配列であり得る。さらに、組み込み要素は、非コード又はコ
ード核酸配列であり得る。他方では、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞の
ゲノム中に組み込まれ得る。

【０１０７】自律複製のためには、ベクターはさらに、問題の宿主細胞においてのベクター
の自律的な複製を可能にする複製の起点を含んで成る。複製の細菌起点の例は、
E.コリにおける複製を可能にするプラスミドpBR322, pUC19, pACYC177及びpACYC
184, 及びバチルスにおける複製を可能にするpUB110, pE194, pTA1060及びpAMβ
１の複製の起点である。酵母宿主細胞への使用のための複製の起点の例は、複製
の２ミクロン起点、すなわちARS1, ARS4, ARS1及びCEN3の組み合わせ、及びARS4
及びCEN6の組み合わせである。複製の起点は、宿主細胞においてその機能を感温
性にする突然変異を有する起点である（例えば、Ehrlich, 1978, Procedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433を参照のこと）。

【０１０８】本発明の核酸配列の１以上のコピーが、遺伝子生成物の生成を高めるために宿
主細胞中に挿入され得る。核酸配列のコピー数の上昇は、宿主細胞ゲノム中に配
列の少なくとも１つの追加のコピーを組み込むことによって、又は核酸配列と共
に増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むことによって得られ、ここで細胞は選択
マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、そしてそれにより、核酸配列の追加
のコピーが、適切な選択剤の存在下で前記細胞を培養することによって選択され
得る。本発明の組換え発現ベクターを構成するために上記要素を連結するために使用
される方法は、当業者に良く知られている（例えば、Sambrookなど., 1989, 前
記を参照のこと）。

【０１０９】宿主細胞：本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成において都合良く使用される、本発
明の核酸配列を含んで成る組換え宿主にも関する。本発明の核酸配列を含んでな
るベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己
複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。用語
“宿主細胞”とは、複製の間に生じる突然変異のために、親細胞と同一ではない
親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコード
する遺伝子及びその源に、かなりの程度依存するであろう。

【０１１０】宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は単細胞微生物、真核生物で
あり得る。有用な単細胞は、細菌細胞、たとえば次のグラム陽性細菌バチルス・アルカロ
フィラス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・ブレビス、バチル
ス・サーキュランス、バチルス・クラウシ、バチルス・コアギランス、バチルス
・ラウタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガ
テリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチ
ルス・スリンギエンシス、又はストレプトミセス細胞、たとえばストレプトミセ
ス・リビダンス又はストレプトミセス・ムリナス、又は次のグラム陰性細菌：E.
コリ及びプソイドモナスsp.（但し、それらだけには限定されない）である。好
ましい態様においては、細菌宿主細胞は、バチルス・レンタス、バチルス・リケ
ニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィラス又はバチルス・サブチリス細胞
である。もう１つの好ましい態様においては、バチルス細胞は、好アルカリ性バ
チルスである。

【０１１１】細菌宿主細胞中へのベクターの導入はたとえば、コンピテント細胞（たとえば
、Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, 又はDub
nau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221
を参照のこと）を用いてプロトプラスト形質転換（たとえば、Changand Cohen,
1979, Molecular General Genetics 168: 111-115）、エレクトロポレーション
（たとえば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751を参照の
こと）又は接合（たとえば、Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriol
ogy 169: 5771-5278を参照のこと）によりもたらされ得る。宿主細胞は、真核生物、たとえば哺乳類、昆虫、植物、又は菌類細胞であり得
る。

【０１１２】好ましい態様においては、宿主細胞は菌類細胞である“菌類”とは、本明細書
において使用される場合、門アスコミコタ（Ascomycota）、バシジオミコタ（Ba
sidiomycota）、キトリジオミコタ（Chytridiomycota）及びヅイゴミコタ（Zygo
mycota）（Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fun
gi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, U
Kにより定義される）、及びオーミコタ（Oomycota）（Hawksworth など., 1995,
前記、171ページに引用される）、並びに栄養胞子菌（Hawksworh など., 1995,
前記）を包含する。

【０１１３】より好ましい態様においては、菌類宿主細胞は酵母細胞である“酵母”とは、
本明細書において使用される場合、子嚢胞子酵母（Endomycetals）、担子胞子酵
母、及び不完全菌類（Blastomycetes）に属する酵母を包含する。酵母の分類は
未来において変化し得るので、本発明のためには、酵母は、Biology and Activi
ties of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds.
Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980) に記載のようにして定
義されるであろう。

【０１１４】さらにより好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）
、ハンセヌラ（Hunsenula）、クレベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pich
ia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosacchar
omyces）又はヤロウィア（Yarrowia）である。

【０１１５】最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カルスベル
ゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシアエ（
Saccharomyses cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyce
s diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、
サッカロミセス・クルイビリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノ
ルベンシス（Saccharomyces norbensisi）、又はサッカロミセス・オビホルミス
（Saccharomyces oviformis）細胞である。もう1つの最も好ましい態様において
は、酵母宿主細胞は、来るべろミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）であ
る。もう１つの最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リ
ポリチカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。

【０１１６】もう１つのより好ましい態様においては、菌類宿主細胞は糸状菌細胞である。
“糸状菌”とは、ユーミコタ（Eumycota）及びオーミコタ（Oomycota）のすべて
の糸状形を包含する（Hawksworthなど., 1995, 前記により定義されるような）
。糸状菌は一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び
他の複合多糖類から構成される菌子体壁により特徴づけられる。成長増殖は、菌
子拡張によってであり、そして炭素代謝は絶対好気性である。対照的に、酵母、
たとえばサッカロミセス・セレビシアエによる成長増殖は、単細胞葉状体の発芽
によってであり、そして炭素代謝は発酵性である。

【０１１７】さらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Ac
remonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、フサリウム（Fusarium）、ヒュ
ーミコラ（Humicola）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）
、ネウロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicilium）、チエラビア（Th
ielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）又はトリコダーマ（Trichoderm
a）の種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。

【０１１８】最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アスペルギラス・アワモリ
、アスペルギラス・ホエチダス、アスペルギラス・ジャポニカ、アスペルギラス
・ニジュランス、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・オリザエ細胞で
ある。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム
・バクトリジオイデス、フサリウム・クロックウェレンズ、フサリウム・セレ
アリス、フサリウム・クルモラム、フサリウム・グラミネアラム、フサリウム・
グラミナム、フサリウム・ヘテロスポラム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム
・オキシスポラム、フサリウム・レチキュラタム、フサリウム・ロゼウム、フサ
リウム・サムブシウム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・ソラニ、フ
サリウム・スポロトリキオイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・ト
ルロサム、フサリウム・トリコセシオイデス又はフサリウム・ベネナタム細胞で
ある。

【０１１９】さらに最も好ましい態様においては、糸状菌親細胞は、フサリウム・ベネナタ
ム（Nirenberg sp. nov.）細胞である。さらに最も好ましい態様においては、糸
状菌宿主細胞は、ヒューミコラ・インソレンス、ヒューミコラ・ラヌギノサ、ム
コル・ミエヘイ、ミセリオプソラ・サーモフィリア、ネウロスポラ・クラサ、ペ
ニシリウム・プルプロゲナム、チエラビア・テレストリス、トリコダーマ・ハル
ジアナム、トリコダーマ・コニンギ、トリコダーマ・ロンジブラキアタム、トリ
コダーマ・レセイ又はトリコダーマ・ビリデ細胞である。

【０１２０】菌類細胞は、プロトプラスト形質転換、プロトプラストの形質転換、及びそれ
自体知られている態様での細胞壁の再生を包含する工程により形質転換され得る
。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第
238023号及びYeltonなど., 1984, Proceedings of the National Academy of Sc
iences USA 81; 1474-1874に記載される。フラリウム種を形質転換するための適
切な方法は、Malardierなど., 1989, Gene78: 147-156, 及びWO96/00787号によ
り記載される。酵母は、Becker and Guarente. In Abelson, J.N. and Simon, M
.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in
Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito
など, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 及びHinnen など, 1978, Pro
ceedings of the National Academy of Sciences USA 75; 1920により記載され
る方法を用いて形質転換され得る。

【０１２１】生成方法：本発明はまた、（a）その野生型において、ポリペプチドを生成できる菌株を
培養することにより、ポリペプチドを含んで成る上清液を生成せしめ；そして（
b）ポリペプチドを回収する、ことを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成
するための方法にも関する。好ましくは、前記菌株は、フサリウム属の株、及び
好ましくは、フサリウム・ベネナタムである。本発明はまた、（a）ポリペプチドの生成を助ける条件下で宿主細胞を培養し
；そして（b）ポリペプチドを回収する、ことを含んで成る、本発明のポリペプ
チドを生成するための方法にも関する。

【０１２２】本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で宿主細胞を培
養し、ここで前記宿主細胞は配列番号１の成熟ポリペプチドコード領域に少なく
とも１つの突然変異を有する変異体核酸配列を含んで成り、そして前期変異体核
酸配列は配列番号２のアミノ酸18〜400から成るポリペプチドをコードし；そし
て（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、ことを含んで成る、本発明のポリペプチ
ドの生成方法にも関する。

【０１２３】本発明はさらに、（a）ポリペプチドの生成のために適切な条件下で、調節配
列、エキソン、及び/又はポリペプチドをコードする内因性核酸配列の第２エキ
ソンに作用可能に連結されるスプライスドナー部位を含んで成る新規転写単位を
そこに組み込んでいる、相同組換え細胞を培養し、；そして（b）ポリペプチド
を回収することを含んで成る、ポリペプチドを生成するための方法にも関する。
前記方法は、アメリカ特許第5,641,670号に記載されるように、遺伝子活性化技
法の使用に基づかれる。

【０１２４】本発明の生成方法においては、細胞は、当業界において知られている方法を用
いて、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。例えば
、細胞は、ポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする、適切な培地におい
て、及び条件下で行われる実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培
養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、又は団体状態発酵を包
含する）により培養され得る。

【０１２５】培養は、炭素及び窒素源及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において、当
業界において知られている方法を用いて行われる。適切な培地は、市販されてい
るか、又は公開されている組成（例えば、American Type Culture Collection
のカタログにおける）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地に分泌さ
れる場合、ポリペプチドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌
されない場合、それは細胞溶解物から回収され得る。

【０１２６】ポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的である、当業界において知
られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特定の抗体、酵素
生成物の形成、又は酵素基質の消出の使用を包含する。例えば、酵素アッセイは
、本明細書に記載されるようなポリペプチドの活性を決定するために使用され得
る。得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得
る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧
−乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定されない）により、栄養培地
から回収され得る。

【０１２７】本発明のポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、例えばク
ロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシ
ング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差
溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS−PAGE又は抽出（但し、それら
だけには限定されない）により精製され得る（例えば、Protein Purification,
J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publlishers, New York, 1989を参
照のこと）。

【０１２８】植物：本発明はまた、ポリペプチドを、回収可能な量で発現し、そして生成するため
に、本発明のラクトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸
配列により形質転換されている、トランスジェニック植物、植物部分又は植物細
胞にも関する。ポリペプチドは、植物又は植物部分から回収され得る。他方では
、組換えポリペプチドを含む植物又は植物部分が、食品又は飼料の品質を改良す
るために、例えば、栄養価値、味のよさ及び流動性質を改良するために、又は抗
栄養因子を破壊するために使用され得る。

【０１２９】トランスジェニック植物は、双子葉植物又は単子葉植物であり得る。単子葉植
物の例は、草、たとえば湿地帯を好む草（イチゴツナギ属の草、イネ科）、飼草
、たとえばウシノケグサ・トボシガラ、ドクムギ、温帯性草、たとえばヌカボ、
及び穀草類、たとえば小麦、カラスムギ、ライ麦、大麦、イネ、モロコシ及びト
ウモロコシである。双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、たとえばハウチワマメ、ジャガイモ
、テンサイ、エンドウ、豆及び大豆、並びにアブラナ科（ブラシカセアエ科（Br
assicaceae））、たとえばカリフラワー、ナタネ及び密接に関連するモデル生物
アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis Thaliana）である。

【０１３０】植物部の例は、茎、カルス、葉、根、果物、種子、及び塊根である。現在、ま
た特定の植物組織、たとえばクロロプラスト、アポプラスト（apoplast）、ミト
コンドリア、液胞、ペルオキシソーム、及び細胞質が植物部分であると思われる
。さらに、いずれの植物細胞でも、その組織起源が何であろうと、植物部分であ
ると見なされる。また、そのような植物、植物部分及び植物細胞の子孫も、本発明の範囲内に包
含される。

【０１３１】本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は、当
業界において知られている方法に従って構成され得る。手短には、植物又は植物
細胞は、本発明のポリペプチドをコードする１又は複数の発現構造体を植物宿主
ゲノム中に組み込み、そしてその得られる修飾された植物又は植物細胞をトラン
スジェニック植物又は植物細胞に生長せしめることによって構成される。

【０１３２】便利には、核酸構造体は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を、選
択の植物又は植物部分において前記核酸配列の発現のために必要とされる適切な
調節配列と共に操作可能的に関連して含んでなるDNA構造体である。さらに、発
現構造体は、その発現構造体が組み込まれている宿主細胞を同定するために有用
である選択マーカー、及び問題の植物中への前記構造体の導入のために必要なDN
A配列を含むことができる（後者は、使用されるDNA導入方法に依存する）。

【０１３３】調節配列、たとえばプロモーター及びターミネーター配列、及び任意には、シ
グナル又は遷移配列の選択は、ポリペプチドがいつ、どこで及びいかにして、発
現されるかの所望に基づいて決定される。たとえば、本発明のポリペプチドをコ
ードする遺伝子の発現は、構造的又は誘発的であり、又は進行的、段階的又は組
織特異的であり、そして遺伝子生成物は特定の組織又は植物部分、たとえば種子
又は葉に標的化され得る。調節配列は、たとえばTague など., Plant Phys., 86
: 506, 1988により記載されている。

【０１３４】構成的発現のためには、35S−CaMVプロモーターが使用され得る（Franck など
., 1980, Cell 21:285-294）。器官−特異的プロモーターは、貯蔵組織たとえば
種子、ジャガイモ塊茎、及び果物（Edwards & Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Gene
t. 24: 275-303）、又は代謝組織、たとえば分裂組織（Ito など., 1994, Plant
Mol. 24: 863-878）からのプロモーター、又は種子特異的プロモーター、たと
えばイネからのグルテリン、プロラミン、グロブリン又はアルブミンプロモータ
ー（Wu など., Plant and Cell Physiology Vol.34, No.39, No.8, pp.885-889
(1998)）、Conrad U. など, Journal of Plant Physiology Vol. 152, No.6, pp
.708-711 (1998)により記載されるビシア・ファバ（Vicia faba）からのレグミ
ンB４及び未知の種子タンパク質遺伝子からのビシア・ファバプロモーター、

【０１３５】種子油本体のタンパク質からのプロモーター（Chen など., Plant and Cell P
hysiology Vol.39, No.9, pp.935-941 (1998)）、ブラシカ・ナパス（Brassica
napus）からの貯蔵タンパク質napAプロモーター、又はたとえばWO91/14772号に
記載のような当業界において知られているいずれか他の種子特異的プロモーター
であり得る。さらに、プロモーターは、葉特異的プロモーター、たとえば株又は
トマトからのrbcsプロモーター（Kyozuka など., Plant Physiology Vol.102, N
o.3, pp.991-1000 (1993)）、

【０１３６】コレラウィルスあでのメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Mitra,
A. and Higgins, DW, Plant Molecular Biology Vol.26, No.1, pp.85-93 (199
4)）、又はイネからのaldP遺伝子プロモーター（Kagayaなど., Molecular and G
eneral Genetics Vol.248, No.6, pp.668-674 (1995)）、又は創傷誘発性プロモ
ーター、たとえばジャガイモpin２プロモーター（Xuなど., Plant Molecular Bi
ology Vol.22, No.4, pp.573-588 (1993)）であり得る。

【０１３７】プロモーターエンハンサー要素は、植物において、より高い酵素の発現を達成
するために使用され得る。たとえば、プロモーターエンハンサー要素は、プロモ
ーターと本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に配置され
るイントロンであり得る。たとえば、Xuなど、前記は、発現を増強するためにイ
ネアクチン１遺伝子アクチン１遺伝子の第１イントロンの使用を開示する。選択マーカー遺伝子、及び発現構造体のいずれかの他の部分は、当業界におい
て入手できるものから選択され得る。

【０１３８】核酸構造体は、当業界において知られている従来の技法、たとえばアグロバク
テリウム−介在性形質転換、ウィルス−介在性形質転換、マイクロインジェクシ
ョン、粒子衝撃、バイオリスティク形質転換、及びエレクトロポレーションに従
って、植物ゲノム中に組込まれる（Gasser など., Science, 244, 1293; Potryk
us, Bio/tech. 8,535,1990; Shimamoto など., Natune, 338, 274, 1989）。

【０１３９】現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンス介在性遺伝子トランスファーは
、トランスジェニック双子葉植物を生成するための好ましい方法（Hooykas & Sc
hilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38を参照のこと）であるが、しか
しながら、それはまた、他の形質転換方法が一般的に、それらの植物のためには
好ましいけれども、単子葉植物を形質転換するためにも使用され得る。

【０１４０】現在、トランスジェニック単子葉植物を生成するための好ましい方法は、胚カ
ルス又は成長する胚の粒子衝撃法（形質転換性DNAにより被覆された微小金又は
タングステン粒子）である（Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto
, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil など., 1992, Bio/Techn
ology 10: 667-674）。単子葉植物の形質転換のための他の方法は、Omirulleh B
, など., Plant Molecular Biology Vol. 21, No.3, pp.415-428 (1993) により
記載されるように、プロトプラスト形質転換に基づかれている。

【０１４１】形質転換に続いて、発現構造体を組み込んでいる形質転換体が、当業界におい
て良く知られている方法に従って、選択され、そして完全な植物に再生される。本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの生成のために適切な条件下で、本発明の
ラクトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んで
成るトランスジェニック植物又は植物細胞を培養し；そして（ｂ）前記ポリペプ
チドを回収することを含んで成る本発明のポリペプチドを生成するための方法に
も関する。

【０１４２】ラクトノヒドラーゼ活性の除去又は低下：本発明はまた、同じ条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチドを少
なく生成する変異体細胞をもたらす、ポリペプチドをコードする核酸配列又はそ
の制御配列を破壊し、又は欠失することを含んで成る、親細胞の変異体細胞を生
成するための方法にも関する。

【０１４３】低められたラクトノヒドロラーゼ活性を有する菌株の構成は便利には、細胞に
おいてラクトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの発現のために必要な核
酸配列の修飾又は不活性化により達成され得る。修飾されるか又は不活性化され
る核酸配列は、例えば前記ポリペプチド、又はラクトノヒドロラーゼ活性を示す
ために必須のその一部をコードする核酸配列であり得、又は前記核酸配列は、前
記核酸配列のコード配列からのポリペプチドの発現のために必要とされる調節機
能を有することができる。そのような調節又は制御配列の例は、プロモーター配
列、又はその機能的部分、すなわちポリペプチドの発現をもたらすために十分で
ある部分であり得る。可能性ある修飾のための他の制御配列は上記に記載される
。

【０１４４】核酸配列の修飾又は不活性化は、細胞を突然変異誘発にゆだね、そしてラクト
ノヒドラーゼ生成能力が低められている細胞を選択し、又はスクリーニングする
ことによって行われ得る。特異的又はランダムであり得る突然変異誘発は、例え
ば適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオ
チドの使用により、又はDNA配列をPCR生成された突然変異誘発にゆだねることに
より行われ得る。さらに、突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいずれか
の組み合わせの使用により行われ得る。

【０１４５】本発明のために適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（UV）
照射、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン
（MNNG）、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート
（EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、選択の突然変異
誘発の存在下で突然変異誘発されるベき細胞をインキュベートし、そして低めら
れたラクトノヒドロラーゼ活性又は生成を示す細胞を選択することによって行わ
れる。

【０１４６】本発明のポリペプチドの生成の修飾又は不活性化は、その転写又は翻訳のため
に必要とされるポリペプチド又は調節要素をコードする核酸配列における１又は
複数のヌクレオチドの導入、置換又は除去により達成され得る。例えば、ヌクレ
オチドは、停止コドン導入、開始コドンの除去又は読み取り枠の変更をもたらす
ために、挿入され又は除去され得る。そのような修飾又は不活性化は、当業者に
おいて知られている方法に従って、特定部位の突然変異誘発又はPCR生成された
突然変異誘発により達成され得る。主に、修飾はインビボで、すなわち修飾され
るべき核酸配列を発現する細胞に対して直接的に行われ得るが、修飾は下記に例
示されるようにインビトロで行われ得ることが好ましい。

【０１４７】選択の宿主細胞による生成を排除するか低められるための便利な手段の例は、
遺伝子置換又は遺伝子中断を包含する。遺伝子中断方法においては、興味ある内
因性遺伝子又は遺伝子フラグメントに対応する核酸配列が、欠失遺伝子を生成す
るために、宿主細胞を形質転換する欠失性核酸配列を生成するようインビトロで
突然変異誘発される。相同組換えにより、その欠失性核酸配列は、その内因性遺
伝子又は遺伝子フラグメントを置換する。その欠失性遺伝子又は遺伝子フラグメ
ントはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子が修飾されるか又は破壊されてい
る形質転換体の選択のために使用され得るマーカーをコードする。

【０１４８】他方では、核酸配列の修飾又は不活性化は、ポリペプチドコード配列に対して
相補的なヌクレオチド配列を用いて、確立されたアンチセンス技法により行われ
得る。より特定には、細胞によるポリペプチドの生成は、細胞において転写され
得、そして細胞において生成されるポリペプチドmRNAに対してハイブリダイズす
ることができるポリペプチドをコードする核酸配列に対して相補的なヌクレオチ
ド配列を導入することによって低められ又は排除され得る。相補的アンチセンス
ヌクレオチド配列のポリペプチドmRNAへのハイブリダイズを可能にする条件下で
、翻訳されるポリペプチドの量が低められ又は排除される。

【０１４９】本発明の方法により修飾される細胞は、微生物起源のもの、例えば細胞に対し
て相同又は異種である所望するタンパク質生成物の生成のために適切である菌類
株である。本発明はさらに、親細胞よりもポリペプチドを少なく生成する変異体細胞をも
たらす、ポリペプチドをコードする核酸配列又はその制御配列の破壊又は欠失を
含んで成る親細胞の変異体細胞に関する。

【０１５０】そのようにして創造されたポリペプチド欠失変異体細胞は、相同及び/又は異
種ポリペプチドの発現のための宿主として特に有用である。従って、本発明はさ
らに、（ａ）ポリペプチドの生成のために適切な条件下で変異体細胞を培養し；
そして（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んで成る、相同体又は異種ポリペ
プチドの生成方法に関する。用語“異種ポリペプチド”とは、宿主細胞に対して
生来ではないポリペプチド、生来の配列を変更するために修飾が行われている生
来のタンパク質、又はその発現が組換えDNA技法による宿主細胞の操作の結果と
して定量的に変更されている生来のタンパク質として本明細書において定義され
る。

【０１５１】さらなる観点においては、本発明は、本発明のポリペプチド及び興味あるタン
パク質生成物の両者を生成する細胞の発酵によりラクトノヒドロラーゼ活性を実
質的に有さないタンパク質生成物の生成方法に関し、ここで前記方法は、発酵が
完結される前、その間、又は完結された後、ラクトノヒドロラーゼ活性を阻害す
ることができる、有効量の剤を、発酵ブイヨンに添加し、その発酵ブイヨンから
興味ある生成物を回収し、そして任意には、回収された生成物を、さらなる精製
にゆだねることを含んで成る。

【０１５２】さらなる観点においては、本発明はラクトノヒドロラーゼ活性を実質的に有さ
ないタンパク質生成物の生成方法に関し、ここで前記方法は、細胞を、生成物の
発現を可能にする条件下で培養し、ラクトノヒドロラーゼ活性を実質的に低める
ために、前記得られる培養物ブイヨンを、組み合わされたpH及び温度処理にゆだ
ね、そして培養物ブイヨンから生成物を回収することを含んで成る。他方では、
前記組み合わされたpH及び温度処理は、培養物ブイヨンから回収された酵素調製
物に対して行なわれ得る。前記組み合わされたpH及び温度処理は任意には、ラク
トノヒドロラーゼインヒビターによる処理と組合して使用され得る。

【０１５３】本発明のこの観点によれば、ラクトノヒドロラーゼ活性の少なくとも60％、好
ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましく
は少なくとも95％、及び最も好ましくは少なくとも99％を除去することが可能で
ある。ラクトノヒドロラーゼ活性の完全な除去は、この方法の使用により得られ
る。前記組み合わされたpH及び温度処理は好ましくは、所望する効果を達成するた
めの十分な時間、典型的には30〜60分間、6.5〜7.5の範囲のpH及び40〜70℃の範
囲の温度で行われる。興味ある生成物の培養及び精製のために使用される方法は、当業界において知
られている方法により行われ得る。

【０１５４】ラクトノヒドロラーゼを実質的に有さない生成物を生成するための本発明の方
法は、真核生物ポリペプチド、特に菌類タンパク質、例えば酵素の生成において
特に興味あるものである。前記酵素は、例えば澱粉分解酵素、脂肪分解酵素、タ
ンパク質分解酵素、細胞分解酵素、オキシドレダクターゼ又は植物細胞壁分解酵
素から選択され得る。

【０１５５】そのような酵素の例は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダ
ーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、
キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン、グルコシルトランスフェラーゼ
、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロ
ペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカー
ゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン
分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェ
ノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスフェラ
ーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼを包含する。ラクトノヒドロラ
ーゼ欠失細胞はまた、医薬的に興味あるもの、例えばホルモン、成長因子、受容
体及び同様のものの異種タンパク質を発現するために使用され得る。

【０１５６】用語“真核生物ポリペプチド”とは、生来のポリペプチドのみだけではなく、
またアミノ酸置換、欠失又は付加、又は活性、熱安定性、pH耐性及び同様のもの
を増強するための他のそのような修飾により修飾されているそれらのポリペプチ
ド、例えば酵素を包含する。もう１つの観点においては、本発明は、本発明の方法により生成される、ラク
トノヒドロラーゼ活性を実質的に有さないタンパク質生成物に関する。

【０１５７】生物フィルム（Biofilm）：本発明のポリペプチドは、微生物性生物フィルム（また、スライムとしても知
られている）の発生を妨げるために使用され得る。生物フィルムは、固体表面上への微生物細胞の吸着から水性環境における固体
表面で進行し、そして存続する生物学的フィルムである（Palmer and White, 19
97, Trends in Microbiology 5: 435-440; Costerton など., 1987, Annual Rev
iews of Microbiology 41; 435-464; Mueller, 1994, TAPPI Proceedings, 1994
Biological Sciences Symposium 195-201）。

【０１５８】この吸着は、微生物が生殖でき、広範囲の種類の栄養物及び酵素状態に接近す
ることができ、洗浄されず、そして抗微生物剤に対して低い感受性であるので、
それらの微生物のために競争的な利点を提供することができる。生物フィルムの
形成はまた、細胞と共に、水により満たされた空間により分離される区別された
構造体の厚い層を形成するエキソ−ポリマー−材料（多糖類、ポリウロン酸、ア
ルボネート、糖タンパク質及びタンパク質）の生成を付随する（McEldowney and
Fletcher, 1986, Journal of General Microbiology 132: 513-523; Sutherlan
d, Surface Carbohydrates of the Prokaryotic Cell, Academic Press, New Yo
rk, 1997, pp. 27-96）。在住微生物は、好気性及び嫌気性細菌、藻類、原生動
物及び菌類を包含することができる、微生物細胞の個々の種、又は微生物細胞の
混合された集団であり得る。

【０１５９】従って、生物フィルムは、在住微生物により分泌される１又は複数のマトリッ
クスポリマーから構成される有機構造体に包埋される生存微生物の複雑なアセン
ブリーである。

【０１６０】生物フィルムは、数ミリ又は数センチメーターの厚さで肉眼的構造体中に進行
し、そして大きな表面積を占めることができる。それらの形成は、配管工事シス
テムにおける流れを制限し、又は完全に阻止すること、熱交換体における熱移行
を低めること、又は自治体の水供給、食品加工、医学装置（例えば、カテーテル
、歯科矯正装置、移植体）において病原問題を引き起こすことにおいて役割を演
じることができ、そしてしばしば、包埋された微生物により介在される腐蝕作用
を通して材料の寿命を低める。この生物学的付着物は、産業的な水処理システム
、パルプ及び紙製造工程、冷却水システム、油回収のための射出壁、冷却タワー
、多孔性媒体（砂及び土壌）、海洋環境及び空冷システム、並びにいずれかの密
閉水再循環システムにおける重大な経済的問題である。

【０１６１】生物フィルムの除去又は予防は、従来、分散剤、界面活性剤、洗剤、酵素配合
物、抗微生物剤、殺生物剤、煮沸方法、及び/又は腐蝕性化学物質、例えば塩基
の使用を必要とする。それらの処理を用いるための方法は、当業界において良く
知られている。例えば、パルプ及び紙産業における成紙機械における生物フィル
ム付着の除去は従来、スプラッシュされたストックを有さない表面を維持するた
めの正しい管理、新鮮な水及び添加剤の抗微生物処理、機械上で微生物増殖を減
じるためへの殺生物剤の使用、及び形成する付着物を除去するためへの管理され
た煮沸を包含する付着物制御プログラムを必要とする。

【０１６２】プソイドモナス・アエルギノサによる生物フィルムの形成は、細胞対細胞の伝
達に包含される少なくとも２種の細胞外シグナルの生成を包含する（WO98/58075
号）。それらの細胞対細胞システムは、lasR-lasI及びrhlR-rhiI（いわゆる、vs
mR-vsmIと呼ばれる）システムである（Daviesなど., 1998, Science 280: 295-2
98）。lasI遺伝子は、拡散性細胞外シグナル、すなわちN−（３−オキソドデカ
ノイル）−L−ホモセリンラクトンの合成を方向づける。lasR生成物は、多くの
ウィルス遺伝子、例えばlasI及びrhlR-rhlIシステムを活性化するために十分な
レベルのN−（３−オキソデデカノイル）−L−ホモセリンラクトンを必要とする
転写レギュレーターである。

【０１６３】 rhiI遺伝子は、ウィルス遺伝子の活性化、及び定常相因子、すなわちRpoSのrh
lR遺伝子生成物による発現のために必要とされる細胞外シグナル、すなわちN−
ブチリル−L−ホモセリンラクトンの合成を方向づける。このタイプの遺伝子調
節は、センシング及び応答と呼ばれて来た。Daviesなどは、lasR-lasIシステム
が生物フィルム形成の分化に関与することを示している。WO98/58075号は、lask
-lasIシステムを通しての細菌における細胞−細胞伝達が、生物フィルム構成及
び構成的完全性を調節するために操作される方法を提供する。

【０１６４】本発明はまた、１又は複数の微生物による液体−固体表面上での生物フィルム
進行を妨げるための方法にも関し、ここで前記方法は、１又は複数の微生物によ
り生成される、生物フィルムの形成に関与する１又は複数のクラトンを分解する
ために、ラクトノヒドロラーゼ活性を有する１又は複数のポリペプチド及びキャ
リヤーを含んで成る、有効量の組成物を、前記液体−固体表面に投与することを
含んで成る。

【０１６５】ラクトンは、生物フィルム形成に関与するいずれかのラクトンであり得る。好
ましい態様においては、ラクトンはホモセリンラクトンである。より好ましい態
様においては、ラクトンはN−（３−オキソドデカノイル）−L−ホモセリンラク
トンである。さらにより好ましい態様においては、ラクトンは、N−ブチリン−L
−ホモセリンラクトンである。液体−固体界面は、生物フィルム進行しやすいいずれかのシステム、特に上記
に列挙されたシステムであり得る。

【０１６６】生物フィルムは、複数の微生物の統合された共同体により、又は１つの微生物
により生成され得る。微生物は、生物フィルム生成に関与するいずれかの微生物
、例えば好気性又は嫌気性細菌（グラム陽性及びグラム陰性）、菌類（酵母又は
糸状菌）、藻類及び原生動物であり得る。好ましい態様においては、細菌は好気
性細菌である。もう１つの好ましい態様においては、細菌は嫌気性細菌である。
より好ましい態様においては、好気性細菌は、プソイドモナスである。もう１つ
のより好ましい態様においては、好気性細菌はフラボバクテリウムである。もう
１つのより好ましい態様においては、嫌気性細菌はデスルホビブリオである。最
も好ましい態様においては、好気性細菌はプソイドモナス・アエルギノサである
。もう１つの最も好ましい態様においては、嫌気性細菌はデスルホビブリオ・デ
スルフリカンスである。

【０１６７】ラクトノヒドロラーゼ活性を有する１又は複数のポリペプチドを含んで成る組
成物は、液体、噴霧又は粉末配合物であり得る。組成物は、生物フィルムの形成
を分解し、除去し、又は妨げるために１又は複数の剤を添加され得る。それらの
剤は、分散剤、界面活性剤、洗剤、酵素配合物、抗微生物剤及び殺生物剤を包含
するが、但しそれらだけには限定されない。

【０１６８】好ましい態様においては、前記剤は界面活性剤である。より好ましい態様にお
いては、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、第四アンモニウム化合物、ア
ルキルピリジニウムヨージド、Tween 80, Tween 85, Triton X-100, Brij 56,
生物学的界面活性剤、ラムノリピッド、サーファクチン、ビスコンシン又はスル
ホネートである。

【０１６９】好ましい態様においては、前記剤は１又は複数の酵素である。より好ましい態
様においては、前記１又は複数の酵素は、プロテアーゼ、アルギン酸リアーゼ及
びカルボヒドラーゼから成る群から選択される。本発明はまた、生物フィルムの進行を妨げるためのそのような組成物にも関す
る。さらに、前記組成物は、殺菌剤組成物であり得る。前記殺菌剤組成物は、グ
ラム陰性細菌、例えばプソイドモナダセアエ、アザトバクテラセアエ、リズアビ
アエセアエ、メチロコカセアエ、ハロバクテリアセアエ、レジオネラセアエ、ネ
イセリアセアエに対する殺菌剤として有用である。

【０１７０】他の用途：本発明はまた、ラクトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを用いる他の
方法にも向けられる。本発明のポリペプチドは、アルドネートγ−又はδ−ラクトン（例えば、D−
グロン−γ−ラクトン、L−マンノノ−γ−ラクトン、D−ガラクトノ−γ−ラク
トン又はD−グルコノ−δ−ラクトン）、又は芳香族γ−又はδ−ラクトン（例
えば、ジヒドロクマリン及びホモゲンチジン酸ラクトン）のそれらの対応する酸
への加水分解において使用され得る。

【０１７１】本発明のポリペプチドはまた、WO97/10341号に記載される方法に従って、D−
パントテネートを生成するためにD−選択性不斉加水分解を通してのD, L−パン
トラクトンの光学的分解のためにも使用され得る。しかしながら、酵素は、細胞
結合され、キャリヤー上に固定され、又は酵素光学分解について当業界において
良く知られている方法を用いて、遊離形で使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、アルドネート又は芳香族γ−又はδ−ラクトン
、例えばリモニンの加水分解を通しての柑橘類ジュースの苦味取りのために使用
され得る。本発明のポリペプチドはまた、パツリンにより汚染されたリンゴジュースの解
毒のためにも使用され得る。

【０１７２】シグナルペプチド：本発明はまた、配列番号２のアミノ酸１〜17から成るシグナルペプチドをコー
ドする、配列番号１のヌクレオチド38〜89から成る核酸配列に作用可能に連結さ
れるタンパク質をコードする、前記核酸配列に対して外来性の遺伝子を含んで成
る核酸構造体にも関する。

【０１７３】本発明はまた、組換え発現ベクター、及びそのような構造体を含んで成る組換
え宿主細胞にも関する。本発明はまた、（ａ）そのような組換え宿主細胞を、タンパク質の生成のため
に適切な条件で培養し；そして（ｂ）タンパク質を回収することを含んで成るタ
ンパク質の生成方法にも関する。前記核酸配列は、他の制御配列と共に、外来性遺伝子に作用可能に連結され得
る。そのような他の制御配列は、前記の通りである。

【０１７４】前記タンパク質は、宿主細胞に対して生来性でも又は異種性でもあり得る。用
語“タンパク質”とは、コードされた生成物の特定の長さを言及することを本明
細書においては意味せず、そして従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパ
ク質を包含する。用語“タンパク質”とはまた、コードされた生成物を形成する
ために組み合わされ得る核酸のポリペプチドを包含する。タンパク質はまた、少
なくとも２種の異なったタンパク質（ここで、１又は複数のタンパク質は宿主細
胞に対して生来のものであるか又は異種のものであり得る）から得られた部分又
は完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んで成るハイブリッドポリペプチド
を包含する。タンパク質はさらに、上記タンパク質及びハイブリッドタンパク質
の天然に存在する対立遺伝子及び構築された変動性を包含する。

【０１７５】好ましくは、タンパク質は、ホルモン、ホルモン変異体、受容体又はその一部
、抗体又はその一部、又はレポーターである。より好ましい態様においては、タ
ンパク質はオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアー
ゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである。さらにより好ましい態様においては、タ
ンパク質は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシ
ペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキ
ストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラ
ーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−
グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ
、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシ
ダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボ
ヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである。前記遺伝子は、いずれかの原核、真核生物又は他の源から得られる。本発明はさらに、次の例により記載されるが、但しそれは本発明を制限するも
のではない。

【０１７６】実施例例：緩衝液及び基質として使用される化物物質は、少なくとも試薬品種の市販の製
品であった。培地及び溶液： COVE微量金属溶液は、１ｌ当たり、0.04gのNaB₄O₇・10H₂O, 0.4gのCuSO₄・5H₂ O, 1.2gのFeSO₄・7H₂O, 0.7gのMnSO₄・H₂O，0.8gのNa₂MoO₂・2H₂O及び10gのZnSO ₄ ・7H₂Oから構成された。

【０１７７】 50×COVE塩溶液は、１lあたり、26gのKCl、26gのMgSO₄・7H₂O, 76gのKH₂PO₄及
び50mlのCOVE微量金属から構成された。 COVE培地は、１ｌ当たり、342.3gのスクロース、20mlの50×COVE塩溶液、1mM
のアセトアミド、1.5mMのCsCl₂及び25gのNoble寒天から構成された。 50×Vogels培地は、１ｌ当たり、150gのクエン酸ナトリウム、250gのKH₂PO₄,
10gのMgSO₄・7H₂O, 10gのCaCl₂・2H₂O, 2.5mlのビオチン原液、及び5.0mlのAMG
微量金属溶液から構成された。

【０１７８】 COVE上部アガロースは、１ｌ当たり、20mlの50×COVE塩、0.8Mのスクロース、
15mMの塩化セシウム、10mMのアセトアミド、及び10gの低溶融アガロース（0.6に
調節されたpH）から構成された。 RA胞子形質培地は、１ｌ当たり、50gの琥珀酸、12.1gのNaNO₃, 1gのグルコー
ス、20mlの50×Vogels及び0.5mlの10mg/mlのNaMoO₄原液（pH6.0）から構成され
た。 YEPG培地は、１ｌ当たり、10gの酵母抽出、20gのペプトン及び20gのグルコー
ズから構成された。

【０１７９】 STCは、0.8Mのソルビトール、25mMのトリス（pH8）、25mMのCaCl₂から構成さ
れた。 SPTCは、40％のPEG4000、0.8Mのソルビトール、25mMのトリス（pH8）、25mMの
CaCl₂から構成された。 M400Da培地は、１ｌ当たり、50gのマルトデキストリン、2gのMgSO₄・7H₂O, 2g
のKH₂PO₄, 4gのクエン酸、8gの酵母抽出物、2gのウレア及び1mlのCOVE微量金属
溶液から構成された。

【０１８０】例１．発酵及び菌糸体組織フサリウム・ベネナタムCC１−３、すなわちフサリウム株ATCC20334（Wiebe
など., 1991, Mycol. Research 95: 1284-1288）の形態学的変異体を、炭素源と
してのNUTRIOSE^TM (Roquette Freres, S.A., Beinheim, France) 及び酵母抽出
物と共に、供給−バッチ酵素スキームを用いて、２Lの実験規模発酵器において
増殖した。リン酸アンモニウムを、供給物に提供した。pHを６〜6.5で維持し、
そして温度を、正の溶解された酸素と共に30℃で維持した。菌糸体サンプルを、接種後２，４，６及び８日で収穫し、そしてすばやく、液
体窒素において凍結した。サンプルを、それらがRNA抽出のために破壊されるま
で、−80℃で貯蔵した。

【０１８１】例２．cDNAライブラリー構成全細胞RNAを、Timberlake and Barnard (1981, Cell 26: 26-37) の方法に従
って、例１に記載される菌糸体サンプルから抽出し、そしてRNAサンプルを、１
％ホルムアルデヒド−アガロースゲルからのブロットの後、ノザンハイブリダイ
ゼーションにより分析した（Davis など., 1986, Basic Methods in Molecular
Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc. New York）。ポリアデニル
化されたmRNA画分を、mRNA Separator Kit（商標）(Clontech Laboratories, In
c., Palo Alto, CA) により、その製造業者の説明書に従って、全RNAから単離し
た。

【０１８２】二本鎖cDNAを、Gubler and Hoffman (1983, Gene 25; 163-269) の方法に従っ
て、約５μgのポリ (A)⁺mRNAを用いて合成し、但しNotI−（dT）18プライマー（
Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ）を用いて、第１鎖合成を開始した
。cDNAを、ヤエナリヌクレアーゼにより処理し（Boehringer Mannheim Corporat
ion, Indianapolis, IN）、そして末端を、T4 DNA ポリメラーゼによりブラント
末端化した（New England Biolabs, Beverly, MA）。

【０１８３】 cDNAを、NotIにより消化し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ選択し（約
0.7−4.7kb）、そしてNot1及びEcoRVにより分解され、そしてウシ腸アルカリホ
スファターゼにより脱リン酸された、pZErO−2.1（Invitrogen Corporation, Ca
rlsbad, CA）により連結した（Boehringer Mannheim Corporation, Indianapoli
s, IN）。その連結混合物を用いて、コンピテントE.コリTOP10細胞（Invitrogen
Corporation, Carlsbad, CA）を形質転換した。形質転換体を、50μg/mlの最終
濃度でカナマイシンを含む２YT寒天プレート（Miller, 1992, A Short Course i
n Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia c
oli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
New York）上で選択した。

【０１８４】２種の独立した指図的cDNAライブラリーを、プラスミドクローニングベクター
pZErO−2.1を用いて構成した。ライブラリーAを、４日目で収穫された菌糸体か
らのmRNAを用いて製造し、そしてライブラリーBを、６日目の時点からのmRNAに
より構成した。細胞における遺伝子発現プロフィールの代表的“スナップショッ
ト”を試験するためには、どちらのcDNAライブラリーも増殖しなかった。代わり
に、ライブラリーをプレーとし、力価し、そしてそれぞれからの独立したクロー
ンを、DNA配列決定により分析した。

【０１８５】ライブラリーA（４日目の細胞）は約7.5×10⁶個の独立したクローンから成り
、そしてライブラリーB（６日目の細胞）は約1.2×10⁵個のクローンから成った
。Miniprep DNAを、個々のライブラリーにおける40のコロニーから単離し、そし
てcDNA挿入体の存在及びサイズについて調べた。この分析においては、ライブラ
リーAからの40のコロニーのうち39のコロニー（97.5％）は、600bk〜2200bpの範
囲のサイズ（平均＝1050bp）の挿入体を含んだ。同様に、ライブラリーBから採
取された40のコロニーのうち39のコロニー（97.5％）は、800bp〜3600bpの範囲
サイズ（平均＝1380bp）の挿入体を有した。

【０１８６】例３．鋳型調製及びヌクレオチド配列決定例２に記載される個々のcDNAライブラリーから、1192個の形質転換体コロニー
を、50μg/mlのカナマイシンと共に200μlのZYTブイヨン（Miller, 1992, 前記
）を含む96−ウェルマイクロタイター皿中に、形質転換プレートから直接的に採
取した。プレートを振盪しながら、37℃で一晩インキュベートした。インキュベ
ートの後、100μlの無菌50％グリセロールを、個々のウェルに添加した。形質転
換体を、個々のウェルに1ml当たり、50μgのカナマイシンに補充されたMagnific
ent Broth（商標）(MacConnell Research, San Diego, CA) 1ml を含む二次深皿
96−ウェルマイクロ培養プレート（Advanced Genetic Technologies Corporatio
n, Gaithersburg, MD）中で複製した。前記二次深皿プレートを、回転振盪機上
で激しく撹拌しながら（300rpm）、37℃で一晩インキュベートした。あふれ及び
交差−汚染を妨げ、そして十分な通気を可能にするために、個々の二次培養プレ
ートを、ポリプロピレンパッド（Advanced Genetic Technologies Corpotation,
Gaithersburg, MD）及びプラスチックマイクロタイター皿カバーにより被覆し
た。

【０１８７】 DNAを、Utterbarkなど. (1995, Genome Sci. Technol. 1:1-8) により改良さ
れるようなAdvanced Genetic Technologies Corporation (Gaithersburg, MD)
の96−ウェルMiniprep Kit プロトコールを用いて、個々のウェルから単離した
。シングル−パスDNA配列決定を、色素−ターミネーター化学（Gieseckeなど.,
1992, Journal of Virology Methods 38: 47-60）及び逆lac配列決定プライマー
を用いて、Perkin-Elmer Applied Model 377XL Antomatic DNA Sequencer (Perk
in-Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) により行った。

【０１８８】例４．DNA配列データの分析ヌクレオチド配列データを品質について詳しく調べ、そして２％を越える不適
切な空間又は不明瞭性レベルを付与するサンプルを、捨てるか、又は再実行した
。ベクター配列を、FACTURA（商標）ソフトウェア（Perkin−Elmer Applied Bio
systems, Inc., Foster City, CA）の助けを伴って、手動的に整えた。さらに、
あいまいな塩基要求の数が高まる場合、個々のサンプルの末端で、配列を切断し
た。すべての配列を、AutoAssembler（商標）ソフトウェア（Perkin-Elmer Appl
ied Biosystems, Inc., Foster City, CA）を用いて、多重性を決定するために
、お互いと比較した。

【０１８９】最後に、すべての配列を、70の限界評点を有するBLOSUM62マトリックスを用い
て、改良されたSmith−Watermanアルゴリズムと共に、GeneAssist^TM ソフトウェ
ア（Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）を用いて、３
種のフレームで翻訳し、そして非冗長性データベース（NRDB）に対して研究した
。NRDBを、Genpept, Swiss-Prot 及びPIRデータベースからアセンブリーした。

【０１９０】例５．ラクトノヒドロラーゼcDNAクローンの同定推定上のラクトノヒドロラーゼクローンを、Applied Biosystems Model 377XL
Automated DNA Sequencer を用いて、製造業者の説明書に従って、ランダムcDN
Aクローンの部分的配列決定、及び例４に記載のように、フサリウム・オキシス
ポラムラクトヒドロラーゼ（Swissprot 受託番号W21857）のアミノ酸配列に対す
る推定上のアミノ酸配列の比較により同定した。

【０１９１】この態様で発見されたいくつかのクローンの中で、１つのクローンは、Signal
-Pコンピュータープログラム（Nielsen, など., 1997, Protein Engineering 10
:6）を用いて検出される、フラリウム・オキシスポラムラクトノヒドロラーゼア
ミノ酸配列のその一列配列、及び可能なシグナルペプチドの存在に基づいて、十
分な長さであることが仮定された。pFA0576を含む、E.コリFA0576と称するこの
クローンを、ヌクレオチド配列分析及び発現研究のために選択した。

【０１９２】例６．E.コリFA0576からのフサリウム・ベネナタムラクトノヒドロラーゼcDNAのヌクレオチド配列決定及び特徴化 DNA配列決定を、色素―ターミネーター化学を用いて、Applied Biosystems Mo
del 377 XL 自動DNA配列決定機により行った。連続配列を、トランスポゾン挿入
方法（Primer Island Transposition Kit, Perkin-Elmer/Applied Biosystems I
nc., Faster City, CA）を用いて生成した。E.コリFA0576からのラクトヒドロラ
ーゼクローンを、５，９の平均冗長度まで配列決定した。

【０１９３】ラクトノヒドロラーゼクローンは、400個のアミノ酸のポリペプチドをコード
する1200bpの読み取り枠をコードした。そのヌクレオチド配列（配列番号１）及
び推定上のアミノ酸配列（配列番号２）は、図１に示される。Signal Pプログラ
ム（Nielsenなど., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、17個の残
基のシグナルペプチドを予測した。従って、成熟ラクトノヒドロラーゼは、383
個のアミノ酸から構成される。

【０１９４】ラクトノヒドロラーゼ配列の比較一列配列を、同一性表及び次の複数の一列配
列パラメーターと共に、LASERGENE^TM MEGALIGN^TM ソフトウェア（DNASTAR, Inc.
, Madison, WI）を用いてのClustal方法（Higgins, 1989, CABIOS 5:151-153）
を用いて企画した：10のギャップペナルティー及び10のギャップ長さペナルティ
ー。対様照準配列パラメーターは、Ktuple＝１、ギャップペナルティー＝３、ウ
ィンドウ＝５及び対角線＝５であった。

【０１９５】前記比較一列配列は、フサリウム・ベネナタムラクトノヒドロラーゼがフサリ
ウム・オキシスポラムからのラクトノヒドロラーゼと87％の同一性を共有するこ
とを示した（WO97/10341号）。フサリウム・ベネナタムラクトノヒドロラーゼ内
に５個の可能性あるN−結合されたグリコシル化部位（Asn−X−Ser/Thr）が存在
するが、しかしながら、それらの部位の１つは内部Pro残基を含み、そして従っ
て、それはたぶん使用されない。すべての残るグルコシル化部位は、Asn残基28,
106, 179及び277で3種の型のN−結合された高−マンノース炭水化物を生成する
ことが知られているフサリウム・オキシスポラムラクトノヒドロラーゼに保存さ
れる（WO97/10341号）。

【０１９６】例７．pDM181の構成プラスミドpDM181を、1.1kbのフサリウム・オキシスポラムトリプシンターミ
ネーター（SP387）に1.2kbのフサリウム・オキシスポラムトリプシンプロモータ
ー（SP387）を融合するために、スプライスオーバーラップ延長技法を用いて構
成した。SwaI, KpnI及びPacI制限部位を含むポリリンカーを、オーバーラッピン
グPCR技法の一部として、プロモーターとターミネーターとの間に挿入した。プ
ロモーターの5’末端で、XhoI部位を付加し、そして生来のEcoRI部位を保存した
。ターミネーターの3’末端で、EcoRI, HindIII及びNsiI部位を、PCR反応により
組み込んだ。

【０１９７】フサリウム・オキシスポラムトリプシンプロモーターの−1280〜−１及び25
個の塩基対のポリリンカーを含むPCRフラグメントを、次のプライマーを用いて
、プラスミドpJRoy 20 (Royer など., 1995, Biotechnology 13: 1479-1483)か
ら生成した：

【０１９８】

【化１】

【０１９９】 100μlのPCR反応は、IX Pwo緩衝液（Boehringer Mannheim, Indianapolis, I
N）, 200μMの個々のdATP, dCTP, dGTP及びdTTP, 10ngのpHRoy20, 及び５単位の
Pwo DNAポリメラーゼ（Boehiringer Mannheim, Indianapolis, IN）を含んだ。
使用されるPCR条件は、95℃で３分、続いて、それぞれ95℃で30秒、50℃で１分
、及び72℃で１分の25サイクルであった。最終延長サイクルは、72℃で５分であ
った。

【０２００】同じPCR条件を用いて、フサリウム・オキシスポラムトリプシンプロモータ
ーのbp−５〜−１、25塩基対のポリリンカー、及びフサリウム・オキシスポラム
トリプシン遺伝子の3’側の未翻訳領域の1060個の塩基対（ターミネーター領
域）を含む第２PCRフラグメントを、次のプライマーを用いて、プラスミドpJRoy
20から生成した：

【０２０１】

【化２】

【０２０２】フサリウム・オキシポラムトリプシンプロモーターの−1208〜−１、25個塩
基対のポリリンカー及びフサリウム・オキシスポラムトリプシンターミネータ
ーの1060個の塩基対を含む最終の2.3kbのオーバーラッピングPCRフラグメントを
、0.2μlの第１PCR（プロモーター）反応及び３μlの第２（ターミネーター）反
応を鋳型及びプライマー１及び４として用いて得た。使用されるPCR条件は、95
℃で３分、続いて、それぞれ、95℃で30秒、62℃で１分及び72℃で３分の30サイ
クルであった。最終延長サイクルは72℃で５分であった。pwo DNAポリメラーゼ
をまた、この反応のために使用した。

【０２０３】トリプシンプロモーター、ポリリンカー及びトリプシンターミネーターを含む
、その得られる2.3kbのフラグメントを、EcoRIにより消化し、そしてbar遺伝子
（WO97/26330号）を含む、EcoRIにより消化されたベクターpMT1612中に連結し、
pDM181を創造した（図２）。

【０２０４】例８．プラスミドpSheB1の構成フサリウム・ベネナタム発現ベクターpSheB1 (図３)を、pDM181の修飾により
生成した。その修飾は、（ａ）pDM181配列内の２つのNcoI部位の除去、及び（ｂ
）フサリウム・オキシスポラムトリプシンプロモーターの天然の翻訳開始の再生
（ATG開始コドンでのNeoI部位の再構成）を包含した。

【０２０５】 pDM181配列内の2つのNcoI部位の除去は、QuikChange（商標）特定部位の突然
変異誘発キット（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA）、及び次の突然
変異誘発プライマー対を用いて、製造業者の説明書に従って達成した： 5’-dCAGTGAATTGGCCTCGATGGCCGCGGCCGCGAATT-3’＋（配列番号７） 5’-dAATTCGCGGCCGCGGCCATCGAGGCCAATTCACTG-3’（配列番号８） 5’-dCACGAAGGAAAGACGATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’＋（配列番号９） 5’-dCAGACACCGTGAAAGCCATCGTCTTTCCTTCGTG-3’（配列番号１０）

【０２０６】フサリウム・オキシスポラムトリプシンプロモーターの天然の翻訳開始の再生
をまた、次の突然変異誘発プライマー対と共に、Stratagene QuikChange^TM 特定
部位の突然変異誘発キットを用いて達成した： 5’-dCTATCTCTTCACCATGGTACCTTAATTAAATACCTTGTTGGAAGCG-3’＋（配列番号１１
） 5’-dCGCTTCCAACAAGGTATTTAATTAAGGTACCATGGTGAAGAGATAG-3’（配列番号１２）すべての特定部位の変化は、適切なベクター領域のDNA配列分析により確認さ
れた。

【０２０７】例９．発現ベクターpTriggs1の構成次のプロトコールを用いて、ラクトノヒドロラーゼ−発現ベクターpTriggs１
（図４）を構成した。ラクトノヒドロラーゼコード領域を、次のプライマー対を
用いて、クローンFA0576から増幅した： 5’-dCGGCATGCCTTCCACCATTGCTG-3’（前方向）（配列番号１３） 5’-dTTAATTAACTAGTCATATAACTTGGGTCC-3’（逆方向）（配列番号１４）前方向プライマーは、開始コドンでSphI部位を導入し、そして逆方向プライマ
ーは、停止コドンの後にPacI部位を導入する。

【０２０８】増幅反応（50μl）は、次の成分を含んだ：0.8μgのクローンFA0576 cDNA, 40
pモルの前方向プライマー、40pモルの逆方向プライマー、200μMの個々のdATP,
dCTP, dGTP及びdTTP, 1×Pwo DNAポリメラーゼ緩衝液、及び2.5単位のPwo DNAポ
リメラーゼ。反応物を、それぞれ95℃で３分間、58℃で２分間及び72℃で２分間
、30サイクルについてプログラムされたPerkin−Elmer Model 480 Thermal Cycl
er においてインキュベートした。反応生成物を、1.5％アガロースゲル（Eastma
n Kodak, Rochester, NY）上で単離し、（ここで、1.2kbの生成物バンドをゲル
から切り出した）、そしてQiaex II (Qiagen，Chatsworth, CA) を用いて、製造
業者の説明書に従って精製した。

【０２０９】増幅されたラクトノヒドロラーゼセグメントを、SphIにより消化し、そして次
に、dNTPの存在下でDNAポリメラーゼI（クレノウフラグメント；Boehringer Man
nheim, Indianapolis, IN）により処理した。この酵素の３−5’エキソヌクレア
ーゼ活性は、SphI付着末端の４個のヌクレオチドを除去し、フラグメント末端化
されたDNAフラグメントを生成する。次に、クレノウ−処理されたフラグメント
をPacIにより消化し、そして標準方法（Sambrook など., 1989, 前記を参照のこ
と）を用いて、アガロースゲル電気泳動により精製した。

【０２１０】精製されたDNAセグメントを、前もってNcoIにより切断され、DNAポリメラーゼ
I（クレノウフラグメント）により上記のようにして処理され、次にPacIにより
消化されたベクターpSheB1に連結した。クレノウフラグメントによる、NcoI−消
化されたベクターの処理は、NcoI付着末端の“フィルイン”をもたらし、それに
よりそれをブラント化し、そしてラクトノヒドロラーゼDNAセグメントのクレノ
ウ−処理されたSphI部位と比較できる。得られる発現プラスミドを、pTriggs1と
命名した（図４）

【０２１１】例１０．フサリウム・ベネナタムにおけるラクトノヒドロラーゼcDNAの発現フサリウム・ベネナタムCC1−３の胞子を、2.5％のグルコース及び2.5mMの硝
酸ナトリウムにより補充された１×Vogels培地プレート（2.5％のNoble寒天）か
らの10個のプラグにより500mlのRA胞子形成培地を含むフラスコを接種し、そし
て28℃、150rpmで２〜３日間インキュベートすることによって生成した。胞子を
Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA)を通して収穫し、そしてSorvall RC-5B
遠心分離機（E.I. Dupont De Nemours and Co., Wilmington, DE）により7000rp
mで20分間、遠心分離した。ペレット化された胞子を、無菌蒸留水により2度洗浄
し、少量の水に再懸濁し、そして次に、血球計数器を用いて計数した。

【０２１２】プロトプラストを、フサリウム・ベネナタムCC1−３の４×10⁷個の胞子により
100mlのYEPG培地を接種し、そして24℃及び150rpmで16時間インキュベートする
ことによって調製した。培養物を、Sorvall RT6000D (E.I. DuPont De Nemours
and Co., Wilmington, DE) により、3500rpmで７分間、遠心分離した。ペレット
を、30mlの１MのMgSO₄により２度洗浄し、そして１Mの硫酸マグネシウム中、15m
lの5mg/mlのNOVOZYME234^TM (バッチPPM4356, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, De
nmark) に再懸濁した。

【０２１３】培養物を、プロトプラストが形成するまで、24℃及び150rpmでインキュベート
した。35mlの体積の２Mソルビトールをプロトプラスト消化物に添加し、そして
その混合物を2500rpmで10分間、遠心分離した。ペレットを再懸濁し、STCにより
２度洗浄し、そして2000rpmで10分間、遠心分離し、プロトプラストをペレット
化した。プロトプラスト血球計数器により計数し、そしてSTC：SPTC：DMSOの８
：２：0.1溶液に再懸濁し、1.25×10⁷個のプロトプラスト/mlの最終濃度にした
。プロトプラストを、Nalgene Cryo 1℃ Freezing Container (VWR Scientific,
Inc., San Francisco, CA) における調節された速度での凍結の後、−80℃で貯
蔵した。

【０２１４】フサリウム・ベネナタムCC1−３の凍結されたプロトプラストを氷上で融解し
た。５μgの例９に記載されるpTriggs1及び５μlのヘパリン（STC 1ml 当たり5m
g）を、50mlの無菌ポリプロピレン管に添加した。100μlのプロトプラストを添
加し、軽く混合し、そして氷上で30分間インキュベートした。1mlのSPTCを添加
し、そして室温で20分間インキュベートした。40℃のCOVE上部アガロース25mlの
添加の後、その混合物を、空の150mm直径のプレートに注ぎ、そして室温で一晩
インキュベートした。

【０２１５】次に、1ml当たり10mgのBASTA（商標）を含む40℃のCOVE上部アガローズの追加
の25mlをプレートの上部に注ぎ、そして室温で14日までの間インキュベートした
。除草剤BASTA（商標）における活性成分は、ホスフィノトリシンである。BASTA
（商標）をAgrEvo (Hoechst Schering, Rodovre, Denmark) から得、そして使用
前、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）により２
度、及びクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）により1度抽出した。

【０２１６】３個の形質転換体を、選択プレート（COVE下層及びCOVE−BASTA（商標）オー
バーレイ）から、1mMのCaCl₂及び100μg/mlのアンピシリン（細胞汚染を妨げる
ために）により補充されたM400Da培地25mlを含む125mlの振盪フラスコ中に直接
的に採取し、そしてプラットフォーム振盪機上で28℃で6日間インキュベートし
た。形質転換されなかった受容体株をまた、負の対照として包含した。

【０２１７】フラスコを６日でサンプリングした。細胞を遠心分離により除去し、そして10
μlの個々の上清液サンプルを、等体積のSDS−PAGEサンプル緩衝液（Novex Expe
rimental Technology, San Diego, CA）と共に95℃に５分間、加熱した。変性さ
れた上清液タンパク質を、10−20％グラジエントゲル（Novex Experimental Tec
hnology, San Diego, CA）上で分離し、そしてクーマシーブルーにより染色した
。

【０２１８】 SDS−PAGE分析は、ラクトノヒドロラーゼ生成形質転換が約55kDaの見掛け分子
量（約55,000）は、成熟ラクトノヒドロラーゼの予測される分子量（約4.1600）
よりも実質的に大きく、このことは、酵素が広範囲にグリコシル化され得ること
を示唆する。観察される分子量は、Shimizu and Kataoka (1996, Annals of the
New York Academy of Sciences 799: 650-658) により報告されるフサリウム・
オキシスポラムラクトノヒドロラーゼサブユニット分子量（60,000）と厳密に一
致する。活性ラクトノヒドロラーゼは、報告によれば、ダイマーである（Shimiz
u and Kataoka、 1996、前記）。

【０２１９】例１１．組換え的に生成されたラクトノヒドロラーゼの精製例９に記載のようにして得られた振盪フラスコブイヨンを、Miracloth を通し
て濾過し、次に凍結した。融解されたサンプルを、0.45μmの注射器フィルター
を通して濾過し、そして希釈し、そしてpHを、pH7.5に調節した。サンプルを、1
mMのCaCl₂を含む、20mMのトリス−HCｌ（pH7.5）溶液を用いて前もって平衡化さ
れているQ−Sepharose Big Beads カラム（90ml）上に負荷した。カラムを、基
線吸光度に達するまで、洗浄した。1mMのCaCl₂を含む、20mMのトリス−HCl（pH7
.5）中、0−0.3MのNaCl線状グラジエントを、6.67カラム体積に体積に対して行
った。画分を次のアッセイを用いてアッセイした。

【０２２０】 20μlの体積の酵素サンプルを、50mMのリン酸カリウム（pH7.0）中、40μlの1
00mMのD−ガラクツロン酸γラクトンと共に、50mMのリン酸カラム（pH7.0）140
μlに添加した。反応物を34分間インキュベートした。前記溶液のサンプル50μl
を、１：１の２Nのヒドロキシルアミン−HCl：3.5NのNaOH溶液50mlと共に、もう
1つのウェルに配置した。次に、４NのHCl中、１：１のエタノール：10％（w/v）
塩化第ニ鉄溶液100μlを添加した。520nmでの吸光度を測定した。520nmでの吸光
度低下は、ラクトン基質の低い濃度を示した。溶出された酵素は、SDS−PAGEにより均質であることが測定された。

【０２２１】例１２．パントン酸のラクトン化パントン酸（Pantoic acid）を、５NのNaOH 2mlのおいてパントイルラクトン
（130mg）を室温で15分間、加水分解することによって調製した。溶液のpHを、6
MのHCl約1.5mlの添加により５に調節し、そして水を添加し、10mlの最終体積に
し、100mMの最終パントイン酸濃度を達成した。基質をブイヨンと共に30℃で30分間インキュベートし、そして下記標準方法に
よりラクトン形成についてアッセイした。0.25Mの酢酸ナトリウム（pH５）との
インキュベーションは、20mMのリン酸ナトリウム（pH6.4）よりも４倍より多量
のラクトン化をもたらした。

【０２２２】生物学的材料の寄託次の生物学的材料を、Agriculture Research Service Patent Culture Collec
tion, Northern Regional Research Center (NRRL),1815 University Street,
Peoria, Illinois に、ブタペスト条件に基づいて寄託し、そして次の受託番号
を付与された：寄託物：E.coli TOP10(pFA0576) 受託番号：NRRL B-30074 寄託日：1998年10月27日

【０２２３】前記株は、培養物への接近が、37 C.F.R.§1.14.及び35 U.S.C.§122下で特許
及び商標局長により決定される本特許出願の係属の間、利用できることを保証す
る条件下で寄託された。寄託物は、寄託された株の実質的に純粋な培養物を示す
。寄託物は、本出願の対応物又はその子孫が出願される国々における外国特許法
により要求される場合、利用できる。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政
府の指令により許される特許権の低下において本発明を実施する許可を構成しな
いことが理解されるべきである。

【０２２４】本明細書に記載される発明は、本明細書に開示される特許の態様により範囲を
限定されるものではない。何故ならば、それらの態様は本発明のいくつかの観点
を例示するものである。いずれかの同等の態様が本発明の範囲内で意図される。
実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの修飾の他に、本発明の種々
の修飾は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はま
た本発明の範囲内にある。種々の文献が本明細書に引用されており、それらの開示は引用により本明細書
に組み込まれている。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Aは、フサリウム・ベネナタンラクトノヒドロラーゼのcDNA配列及び推定
されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１及び２）を示す。

【図１Ｂ】図１Bは、フサリウム・ベネナタンラクトノヒドロラーゼのcDNA配列及び推定
されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１及び２）を示す。

【図２】図２は、pDM181の制限地図を示す。

【図３】図３は、pSheB1の制限地図を示す。

【図４】図４は、pTriggs1 の制限地図を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年８月８日（２００１．８．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:77） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡＦターム(参考） 4B024 AA08 BA11 CA04 DA11 EA04 FA02 GA11 HA01 HA12 4B050 CC01 CC04 DD03 FF12E LL10 4B065 AA26X AA65X AA65Y AB01 AC14 AC20 BA02 CA31 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸18〜400と少なくとも95％の同
一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号１のヌクレオチド90〜1238と少なくとも95％の相同性を有する
核酸配列によりコードされるポリペプチド；（ｃ）１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る、配列
番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体；（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｅ）ラクトノヒドロラーゼ活性を有する、前記（ａ）、（ｂ）又は（ｄ）の
フラグメント；から成る群から選択された、ラクトノヒドロラーゼ活性を有する単離されたポ
リペプチド。
【請求項２】配列番号２のアミノ酸18〜400と少なくとも95％の同一性を
有するアミノ酸配列を有する請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】配列番号２のアミノ酸18〜400と少なくとも97％の同一性を
有するアミノ酸配列を有する請求項2記載のポリペプチド。
【請求項４】配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る請求項１〜３のいず
れか１項記載のポリペプチド。
【請求項５】配列番号２のアミノ酸配列又はそのフラグメントから成る請
求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６】配列番号２のアミノ酸配列から成る請求項５記載のポリペプ
チド。
【請求項７】配列番号２のアミノ酸配列18〜400から成る請求項６記載の
ポリペプチド。
【請求項８】配列番号１のヌクレオチド90〜1238と少なくとも95％の相同
性を有する核酸配列によりコードされる請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】配列番号１のヌクレオチド90〜1238と少なくとも97％の相同
性を有する核酸配列によりコードされる請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】前記ポリペプチドが、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失
及び/又は挿入を含んで成る、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド
の変異体である請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１１】Ｅ．コリNRRL B-30074に含まれるプラスミドpFA0576に含
まれる核酸配列によりコードされる請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１２】配列番号２のラクトノヒドロラーゼ活性の少なくとも20％
を有する請求項１〜11のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１３】請求項１〜12のいずれか１項記載のポリペプチドと同じラ
クトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項１４】請求項１〜13のいずれか１項記載のポリペプチドをコード
する核酸配列を含んで成る単離された核酸配列。
【請求項１５】配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列において少なく
とも１つの突然変異を有する核酸配列（前記変異体核酸配列は、配列番号２のア
ミノ酸18〜400から成るポリペプチドをコードする）を含んで成る単離された核
酸配列。
【請求項１６】適切な発現宿主においてポリペプチドの生成を方向づける
１又は複数の制御配列に作用可能に連結された請求項１４記載の核酸配列を含ん
で成る核酸構造体。
【請求項１７】請求項１６記載の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベク
ター。
【請求項１８】請求項１６記載の核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞
。
【請求項１９】変異体核酸配列の生成方法であって、（ａ）配列番号１の
成熟ポリペプチドコード配列中に少なくとも1つの突然変異を導入し、ここで前
記変異体核酸配列は配列番号２のアミノ酸18〜400から成るポリペプチドをコー
ドし；そして（ｂ）前記変異体核酸配列を回収する、ことを含んで成る方法。
【請求項２０】請求項１９記載の方法により生成される変異体核酸配列。
【請求項２１】ポリペプチドの生成方法であって、（ａ）前記ポリペプチ
ドをコードする請求項20記載の変異体核酸配列を含んで成る株を培養することに
より、前記ポリペプチドを含んで成る上清液を生成せしめ；そして（ｂ）前記ポ
リペプチドを回収する、ことを含んで成る方法。
【請求項２２】請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドの生成
方法であって、（ａ）菌株を培養することにより、前記ポリペプチドを含んで成
る上清液を生成せしめ；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、ことを含ん
で成る方法。
【請求項２３】請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドの生成
方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの生成のために適切な条件下で、前記ポ
リペプチドをコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体を含んで成る宿主細胞
を培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、ことを含んで成る方法。
【請求項２４】ポリペプチドの生成方法であって、（ａ）前記ポリペプチ
ドの生成の助けと成る条件下で宿主細胞を培養し、ここで前記宿主細胞は配列番
号１の成熟ポリペプチドコード配列に少なくとも１つの突然変異を有する変異体
核酸配列を含んで成り、前記変異体核酸配列は配列番号２のアミノ酸18〜400か
ら成るポリペプチドをコードし；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、こ
とを含んで成る方法。
【請求項２５】請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドの生成
方法であって、（ａ）調節配列、エキソン、及び/又は前記ポリペプチドをコー
ドする内因性核酸配列の第２エキソンに作用可能に連結されたスプライスドナー
部位を含んで成る新規転写単位を組み込んでいる相同組換え細胞を、前記ポリペ
プチドの生成の助けとなる条件下で培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回
収する、ことを含んで成る方法。
【請求項２６】細胞の変異体の生成方法であって、前記細胞よりもポリペ
プチドを低く生成する変異体をもたらす、請求項１〜１３のいずれか１項記載の
ポリペプチドをコードする核酸配列又はその制御配列を中断し又は欠失せしめる
ことを含んで成る方法。
【請求項２７】請求項２６記載の方法により生成される変異体。
【請求項２８】異種タンパク質をコードする核酸配列をさらに含んで成る
請求項２７記載の変異体。
【請求項２９】異種ポリペプチドの生成方法であって、（ａ）請求項２８
記載の変異体を、前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で培養し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、ことを含んで成る方法。
【請求項３０】配列番号１のヌクレオチド３８〜８９から成るシグナルペ
プチドをコードする核酸配列に作用可能に連結された、タンパク質をコードする
、前記核酸配列に対して外来性である遺伝子を含んで成る核酸構造体。
【請求項３１】請求項３０記載の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベク
ター。
【請求項３２】請求項３０記載の核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞
。
【請求項３３】タンパク質の生成方法であって、（ａ）請求項３２記載の
組換え宿主細胞を、前記タンパク質の生成のために適切な条件下で培養し；そし
て（ｂ）前記タンパク質を回収する、ことを含んで成る方法。
【請求項３４】１又は複数の微生物による液体−固体界面上での生物フィ
ルム生長を妨げるための方法であって、前記１又は複数の微生物により生成され
る、前記生物フィルムの形成に関与する１又は複数のラクトンを分解するために
、ラクトノヒドロラーゼ活性を有する１又は複数のポリペプチド及びキャリヤー
を含んで成る組成物の有効量を、前記液体−固体界面に投与することを含んで成
る方法。