CN1761742A - 内酯酶的制造方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

作为医药品等有用物质的合成中间体,需要大量并且低价地生产光学活性的泛解酸内酯等γ-内酯衍生物。为了这个目的,利用可进行不对称水解的酶-内酯酶的技术很有优势,不过该酶的制造或该酶产生微生物的利用还存在尚未解决的问题。当使用重组技术时也很难以取得到充分并且稳定的酶活性。用重组技术将成熟内酯酶DNA和信号肽区域DNA均导入到宿主中生产能够选择性地不对称水解外消旋泛解酸内酯等的γ-内酯衍生物的内酯酶,能够得到天然内酯酶所欠缺的稳定的活性,还能够得到保持高的酶活性并且稳定地保持该活性的转化子,可以有效并且具有工业化优势地不对称合成γ-内酯衍生物。

Description

内酯酶的制造方法及其应用
技术领域
本发明涉及具有D-泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶的制造方法。本发明涉及用微生物表达和分泌生产具有D-泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶。此外,本发明涉及使用该酶和使用生产该酶的系统制造光学活性γ-内酯及其相关化合物的方法。
背景技术
已知D-泛解酸内酯是制造D-泛酸、D-泛醇、双泛酰巯乙胺的中间体。上述物质作为医学上或生理学上重要的维生素除了用于医药品之外,还用作食品添加剂、饲料添加剂,此外还用作化妆品原料。以前,通过光学拆分化学合成的D、L-泛解酸内酯制造D-泛解酸内酯。不过,这种方法存在需要奎尼酸、番木鳖碱等高价的拆分剂,并且存在不容易回收D-泛解酸内酯等缺点。为了解决上述问题,本发明人等在专利文献1和专利文献2各公报提出了用酶对D、L-泛解酸内酯的不对称水解进行光学拆分的方法。
即,涉及制造D-泛解酸内酯的方法和用属于下述种属的微生物制造D-泛解酸内酯水解酶的方法,其特征是,从属于镰孢属、柱孢属、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、周刺座霉属、胶霉属、散囊菌属、从赤壳菌属、Schizophyllum、漆斑菌属、链孢霉属、支顶孢属、锈生座孢属、犁头霉属、Sporothrix、轮枝孢属、节皮菌属的微生物中选取具有内酯水解能力的微生物,通过该微生物选择性地不对称水解D、L-泛解酸内酯中的D-构型,使之生成D-泛酸,分离该D-泛酸,转换成D-泛解酸内酯。
可是,其中公开的多数微生物不一定具有可在工业上应用程度的水解活性,为了使相应的微生物所具有的酶活性上升到可以在工业水平应用的程度,必须对培养条件或活性诱导条件等花费长时间进行复杂而艰难的研究。此外,因为其中相应的微生物是真菌,所以菌体呈现多种形态的菌丝状,和具有单一形态的细菌等相比,在制造成对工业生产有利的固定化菌体方面存在相当大的难度。而且,从菌体中纯化酶的时候,存在D-泛解酸内酯水解酶回收率相当差的问题。
为了解决上述各个问题,并且通过改变D-泛解酸内酯水解酶实现使酶活性产生飞跃性上升的目的,明确了编码天然D-泛解酸内酯水解酶例如:源自尖孢镰孢属(Fusarium oxysporum)的天然的D-泛解酸内酯水解酶或与之本质上具有同等活性的蛋白质的基因,并且制造转化后含有编码该蛋白质的碱基序列的DNA的宿主细胞(专利文献3),不过需要使由该转化宿主细胞得到的酶活性可以达到在工业上直接应用的更为有效的方法。
【专利文献1】特开平3-65198号
【专利文献2】特开平4-144681号
【专利文献3】国际公开小册子WO,A,97/10341
发明内容
以前用大肠杆菌等得到的转化子存在所生产的酶不能添加糖链、比天然型(野生型)分子量小、缺乏稳定性的问题,一直在寻求解决上述问题的办法。
本发明利用天然的内酯酶基因,制造出有效并且生产性优异的生产该酶的系统。此外,本发明还用该酶和生产该酶的系统,构建了有效并且生产性能更优异的光学活性γ-内酯生产系统。
具有D-泛解酸内酯水解酶活性的D-泛解酸内酯水解酶(以下称为“内酯酶”),尤其是从尖孢镰孢属克隆鉴定的内酯酶,其基因的分析结果表明该酶由含有5个内含子的1453个碱基对的染色体基因所编码,该酶在NH2末端含有20个氨基酸组成的信号肽。与由该染色体基因转录来的mRNA互补的cDNA所编码的成熟酶是380个氨基酸的蛋白质。
其野生型酶添加有糖链。
鉴于上述问题,本发明人等为了开发能够在重组型酶上添加糖链的系统,进行了刻苦的研究,将编码该内酯酶的基因和信号肽的基因序列一起导入到宿主细胞中,使之表达,结果成功地大量表达了添加有天然型糖链的该酶,完成了本发明。
本发明提供:
〔1〕产生内酯酶的转化子,其特征是,其中导入了编码具有D-泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶和信号肽区域的DNA;
〔2〕上述〔1〕记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,内酯酶来自镰孢属;
〔3〕产生内酯酶的转化子,其特征是,导入的DNA是编码具有序列表编号9中的第1~第380个氨基酸的氨基酸序列的内酯酶的DNA,或编码上述序列一部分序列与信号肽区域的DNA;
〔4〕上述〔3〕记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,信号肽区域是序列表编号9中的第-20~第-1个氨基酸所组成的氨基酸序列或上述序列的一部分序列,或是Alp信号肽区域;
〔5〕具有D-泛解酸内酯水解活性的重组内酯酶的制造方法,其特征是,培养上述〔1〕~〔4〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子,使之产生重组内酯酶,并得到重组内酯酶;和
〔6〕制造通式(II)或通式(IV)所示的光学活性的γ-内酯衍生物或其盐的方法,其特征是,使用通式(I)所表示的化合物或其盐接触选自上述〔1〕~〔4〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子的培养物、其细胞、细胞处理物或固定化菌体、从该转化子得到的重组内酯酶和固定化的重组内酯酶。
通式(I)
Figure A20048000757600061
(R表示羟基、氨基,R1和R2相同或不同,各自独立表示氢或低级烷基)
通式(II)
Figure A20048000757600071
(R、R1和R2分别和上述相同)
通式(IV)
Figure A20048000757600072
(R、R1和R2分别和上述相同)。
在其他实施方案中,本发明提供:
〔7〕产生内酯酶的转化子,其特征是,其中导入了编码具有D-泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶和信号肽区域的DNA或导入了插有该DNA的载体;
〔8〕上述〔7〕记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,其中的载体具有1个或多个丝状菌的增强子碱基序列;
〔9〕上述〔1〕~〔4〕、〔7〕和〔8〕中记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,其中的载体在于丝状菌中具有功能的启动子区域导入1个或多个丝状菌的增强子碱基序列;
〔10〕上述〔1〕~〔4〕和〔7〕~〔9〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,其中的载体在于丝状菌中具有功能的启动子区域导入了1个或多个米曲霉的α-葡糖苷酶(agdA)启动子上的增强子序列;
〔11〕上述〔9〕或〔10〕记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,其启动子区域为来自丝状菌的水解酶基因或糖分解系统酶基因的启动子区域;
〔12〕上述〔9〕~〔11〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,其启动子区域为源于米曲霉的α-葡糖苷酶(agdA)基因的启动子区域,或含有其部分序列的启动子区域;
〔13〕上述〔7〕~〔12〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,载体是含有适于对宿主丝状菌的转化子进行选择的标记(marker)基因、含有在大肠杆菌中进行复制的DNA区域的用于在丝状菌中表达多肽的质粒;
〔14〕上述〔13〕中记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,标记基因源自丝状菌的硝酸还原酶基因、鸟氨酸氨基甲酰转移酶基因、色氨酸合成酶基因或乙酰氨酶基因;
〔15〕上述〔13〕或〔14〕记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,标记基因为曲霉菌属的硝酸还原酶基因;
〔16〕上述〔13〕记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,终止子为源于米曲霉的α-葡糖苷酶基因的终止子或含有其部分序列的终止子;
〔17〕上述〔7〕记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,载体含有表达镰孢属丝状菌所产生的碱性蛋白酶(Alp)的启动子区域;
〔18〕上述〔1〕或〔7〕记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,信号肽区域是分泌该Alp的信号肽序列区域或该内酯酶的信号肽序列区域;
〔19〕产生内酯酶的转化子,其特征是,其中导入了含有下述序列的DNA:(a)编码全长的具有D-泛解酸内酯水解酶活性的全长内酯酶的DNA序列和(b)编码该内酯酶NH2末端的信号肽区域DNA序列;
〔20〕上述〔19〕记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,其中导入了含有下述序列的DNA:(a)编码全长内酯酶的cDNA序列(i)、或染色体基因DNA序列(ii)和(b)编码该内酯酶NH2末端信号肽区域DNA序列;
〔21〕产生内酯酶的转化子,其特征是,其中导入了含有下述序列的DNA:(a)编码全长的具有D-泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶的DNA序列和(b)含有编码镰孢霉菌属丝状菌产生Alp信号区域DNA序列;
〔22〕上述〔21〕记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,其中导入了含有下述序列的DNA:(a)编码全长内酯酶的cDNA序列(i)、或染色体基因DNA序列(ii)和(b)含有编码该Alp信号肽区域DNA序列;
〔23〕产生内酯酶的转化子,其特征是,其中导入了序列表编号8中的编码第61~第1453个碱基序列的DNA和编码信号肽区域DNA所组成的NDA;
〔24〕上述〔23〕记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,信号肽区域是序列表编号9中的第-20~-1的氨基酸所组成的氨基酸序列或镰孢霉菌属丝状菌的Alp信号肽区域;
〔25〕(S)-γ-内酯衍生物或其盐的制造方法,该方法包括:用通式(I)所表示的化合物或其盐接触选自上述〔1〕~〔4〕和〔7〕~〔24〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子的培养物、其细胞、细胞处理物或固定化菌体、由该转化子得到的重组内酯酶和固定化的重组内酯酶,从反应系统中分离未反应的通式(II)所示的化合物或其盐;
通式(I)
Figure A20048000757600091
(R表示羟基、氨基,R1和R2相同或不同,各自独立表示氢或低级烷基)
通式(II)
Figure A20048000757600092
(R、R1和R2分别和上述相同);
〔26〕(R)-γ-内酯衍生物或其盐的制造方法,该方法包括:用通式(I)所表示的化合物或其盐接触选自上述〔1〕~〔4〕和〔7〕~〔24〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子的培养物、其细胞、细胞处理物或固定化菌体、由该转化子得到的重组内酯酶和固定化的重组内酯酶,得到通式(III)所示的化合物或其盐,将其转变成通式(IV)所示的化合物或其盐;
通式(I)
Figure A20048000757600101
(R表示羟基、氨基,R1和R2相同或不同,各自独立表示氢或低级烷基)
通式(III)
(R、R1和R2分别和上述相同)
通式(IV)
(R、R1和R2分别和上述相同);
〔27〕一种DNA,其特征是,含有编码内酯酶和信号肽区域的序列;
〔28〕一种DNA,其特征是,含有(a)编码内酯酶全长的DNA序列和(b)编码该内酯酶的NH2末端信号肽区域的DNA序列;
〔29〕一种DNA,其特征是,其中含有(a)编码全长内酯酶的cDNA序列(i)、或染色体基因DNA序列(ii)和(b)编码该内酯酶NH2末端信号肽区域的DNA序列。
另外的实施方案中,本发明提供:
〔30〕上述〔1〕~〔4〕、〔7〕和〔18〕~〔24〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,导入到属于曲霉属、支顶孢属、镰孢菌属的微生物中,以此作为宿主微生物;
〔31〕上述〔1〕~〔4〕、〔7〕和〔18〕~〔24〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,导入到属于米曲霉、顶头孢霉、尖孢镰孢的微生物中,以此作为宿主微生物;
〔32〕一种制造方法,其特征是,在通式(II)或(IV)的光学活性γ-内酯衍生物的制造方法中,固定产生内酯酶的转化子、其培养物、其细胞、其细胞处理物和由该转化子得到的重组的内酯酶,使之可重复反应;
〔33〕通式(I)中R为羟基、R1和R2都为甲基的光学活性泛解酸内酯及其盐的制造方法;
〔34〕泛酸或其盐、泛醇或双泛酰巯基乙胺的制造方法,其特征是,用通式(I)所示的化合物或其盐与选自上述〔1〕~〔4〕、〔7〕~〔24〕、〔30〕和〔31〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子的培养物、其细胞、细胞处理物或固定化菌体、由该转化子得到的重组内酯酶和固定化重组内酯酶相接触,应用以此得到的D-泛解酸内酯;
〔35〕一种固定菌体,其特征是,固定上述〔1〕~〔4〕、〔7〕~〔24〕、〔30〕和〔31〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子;和
〔36〕一种固定化重组酶,其特征是,固定由上述〔1〕~〔4〕、〔7〕~〔24〕、〔30〕和〔31〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子得到的重组内酯酶。
此外在其他实施方案中,本发明提供:
〔37〕D-泛解酸内酯衍生物或其盐的制造方法,其特征是,用上述通式(I)所示化合物或其盐接触选自上述〔1〕~〔4〕、〔7〕~〔24〕、〔30〕、〔31〕、〔35〕和〔36〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子的培养物、其细胞、细胞处理物或固定化菌体、由该转化子得到的重组内酯酶和固定化重组内酯酶,制造上述通式(III)所示的光学活性化合物或其盐,然后将通式(III)所示的光学活性化合物或其盐作为出发物质,使用公知的方法或与之等价的方法或适宜的改变的方法,制造通式(IV)所示的化合物、泛酸、泛酸钙、泛醇、泛酰巯基乙胺、辅酶A(CoA)、泛酰乙基醚、双泛酰硫乙胺等D-泛解酸内酯衍生物或其盐;
〔38〕上述〔37〕记载的制造方法,其特征是,(a)用β-丙氨酸的钙盐或其酯与D-泛解酸内酯缩合,制造泛酸钙、
(b)用β-丙氨酸或其酯与D-泛解酸内酯缩合,产生D-泛酸后,使之与钙化合物反应,制造D-泛酸钙、
(c)在仲胺或叔胺存在下,使D-泛解酸内酯和β-丙氨酸反应,向得到的反应混合物中加入氧化钙,制造D-泛酸钙、
(d)使D-泛解酸内酯和3-氨丙醇缩合,制造D-泛醇;
(e)使D-泛解酸内酯和γ-氨丙腈(aminopropionitrile)反应,制造D-泛酸腈(pantothenonitrile),然后和半胱氨酸反应,成为2-(2-D-泛酸酰胺乙基)-2-噻唑啉后,水解,制造D-泛酰巯基乙胺,或
(f)在过氧化氢存在的情况下,缩合上述(e)工序得到的D-泛酰巯基乙胺,制造双泛酰硫乙胺;
〔39〕在制造通式(III)所示的化合物、通式(IV)所示的化合物、泛酸、泛酸钙、泛醇、泛酰巯基乙胺、辅酶A(CoA)、泛酰乙基醚、双泛酰硫乙胺等D-泛解酸内酯衍生物或其盐时,上述〔1〕~〔4〕、〔7〕~〔24〕、〔30〕、〔31〕、〔35〕和〔36〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子的培养物、其细胞、细胞处理物和固定菌体、由该转化子得到的重组内酯酶和固定的重组内酯酶、或上述〔27〕~〔29〕中任一个记载的DNA的应用。
发明效果
本发明提供了利用天然的内酯酶基因,制造生产有效并且生产性优异的生产该酶的系统的技术,此外,本发明还用该酶和生产该酶的系统,构建了能够有效并且生产性更优异的光学活性γ-内酯生产系统。
通过本发明,不需要高价的拆分剂,采用简单的操作,适合工业化生产,环境方面的问题少,并且能够以有效的方法制造有用的医药品中间体或氨基酸或以泛酸为出发原料的光学活性γ-内酯衍生物。提供了简便地并且可以工业化制造光学活性γ-内酯衍生物的制造方法。此外,可以有效并且具有经济优势地制造D-泛解酸内酯和其衍生物,例如:泛酸、泛酸钙、泛醇、泛酰巯基乙胺、辅酶A(CoA)、泛酰乙基醚、双泛酰硫乙胺或其盐。
本领域的技术人员可以从下面的记载中理解本发明的其他的目的、特征、优越性和其观点。不过,包括下面的内容和具体的实施例等内容在内的本说明书的内容展示了本发明的优选实施方案,只是为了说明而提出的。通过下面的内容和本说明书的其他部分的内容,本领域的技术人员能够很容易地理解在本说明书中公布的本发明的宗旨和范围,可以进行各种变化和/或改变(或修饰)。在本说明书中引用的全部专利文献和参考文献是出于说明的目的引用的,它们只是本说明书的一部分,所含有的内容包含在其中,仅用于解释。
附图说明
图1是关于在米曲霉中表达外来的内酯酶基因的调查结果的电泳照片。
A表示用考马氏亮蓝染色的电泳分离蛋白质的凝胶。泳道1是分子量标准(Daiichi Chemicals公司,东京,日本):磷酸酶b(97kDa)、牛血清白蛋白(66kDa)、醛缩酶(42kDa)和碳酸酐酶(30kDa)。泳道2是pNAN-PC转化的米曲霉的无细胞(cell free)抽提液,泳道3是pNAN-XG转化的米曲霉的无细胞抽提液。每个泳道采用25μg。泳道4是从尖孢镰孢中纯化的内酯酶。采用0.5μg。
B表示的是Western印记的结果,用对野生型内酯酶特异性的抗体进行免疫染色的与A相同的凝胶。泳道1是分子量标准(SDS-PAGE预染低分子量标准,Bio-Rad,Hercules,USA):磷酸酶b(97kDa)、牛血清白蛋白(66kDa)、卵清白蛋白(45kDa)、碳酸酐酶(31kD)和胰蛋白抑制剂(22kDa)。
图2用尖孢镰孢和重组米曲霉不对称水解外消旋泛解酸内酯的结果。A表示使用湿润细胞的结果,B表示使用固定化细胞的结果。白色圆形表示pNAN-PC转化的米曲霉,黑色圆形表示pNAN-XG转化的米曲霉,白色四方形表示尖孢镰孢。
图3表示用于分泌表达内酯酶的质粒的结构。通过PCR进行组合构建融合基因,用SalI和XbaI切割,亚克隆到pBluescript II SK+中。
图4表示顶头孢霉转化子分泌内酯酶的电泳(SDS-PAGE)照片。使用的是10%的聚丙烯酰胺凝胶。泳道1为从尖孢镰孢中纯化得到的野生型的内酯酶(0.5μg);泳道2为用pAlpS转化的顶头孢霉(含有3μg蛋白质);泳道3为pLacS转化的顶头孢霉(3μg蛋白质)。泳道4为分子量标记:磷酸酶b(97kDa)、牛血清白蛋白(66kDa)、醛缩酶(42kDa)和碳酸酐酶(30kDa)。
图5表示糖链切割处理后的内酯酶的电泳(SDS-PAGE)照片。用EndoHf处理后的野生型内酯酶(泳道2-5)和用EndoHf处理后由pAlpS转化的顶头孢霉纯化得到的重组型内酯酶后(泳道8-11)在10%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳的结果(每个泳道各0.8μg)。泳道2和泳道8为经过1分钟糖链切割处理;泳道3和泳道9为经过5分钟糖链切割处理;泳道4和泳道10为经过15分钟糖链切割处理;泳道5和泳道11为经过60分钟糖链切割处理。泳道1和泳道7分别表示未进行糖链切割处理的野生型内酯酶和重组型内酯酶,泳道6为分子量标准,详细情况和图4相同。
图6表示固定化酶不对称水解外消旋泛解酸内酯的结果。用HPLC测定D-和L-泛酸的比例。黑色圆形表示D-泛酸;白色圆形表示L-泛酸;白色四方形表示DL-泛解酸内酯(外消旋泛解酸内酯)。
图7表示编码来自镰孢属丝状菌的内酯酶的染色体DNA(基因组基因)的碱基序列。用添加阴影表示NH2末端的20个氨基酸残基序列的信号肽区域(1~60的碱基序列)。此外,用小写字母表示5个内含子,用菱形表示推测的N-糖基化的天冬酰胺,用星号表示相关的终止密码子。
具体实施方式
在本发明中,提供了重组表达编码有具有分解天然的D-泛解酸内酯能力的内酯酶,例如:来自尖孢镰孢野生型(天然型)(D-泛解酸内酯水解酶)的内酯酶的基因,或重组表达编码与之具有本质上等同活性的蛋白质的基因的技术及其该技术的应用。还提供了制造和培养/增殖用含有该内酯酶的碱基序列的编码DNA转化的宿主细胞、用该宿主细胞制造该蛋白质、和该蛋白质和宿主细胞的应用等。此外,本发明还提供了多种有用的利用编码上述内酯酶的基因的手段,还利用设计的表达载体等,提供了有效并且生产性能更优异的D-泛解酸内酯生产系统。
本发明涉及内酯酶,其特征是,该酶具有选择性不对称水解D、L-泛解酸内酯中的D-构型的活性;本发明涉及利用下述发现的技术:使用编码包含NH2末端信号肽区域的全长该内酯酶的基因进行转化,得到的转化子不仅能够表达生产和野生型酶具有同等分子量的重组酶,而且得到的该酶的活性在稳定性方面也令人满意。本发明还涉及用重组技术,得到能够保持比上述内酯酶具有更高催化能力和稳定酶活性的转化的细胞,应用该细胞的技术。
本发明提供用微生物表达和分泌具有D-泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶的技术,代表性的有:将含有N末端信号肽区域的形式的编码该内酯酶全长的基因导入到丝状菌,如:曲霉属或支顶孢属等菌中,得到的转化子产生和野生型分子量一致的添加了糖链的重组酶,该酶在DL-泛解酸内酯等的γ-内酯类的水解反应中比未添加糖链的酶具有更优异的稳定性,而且,当转化菌为米曲霉时,所得到酶比尖孢镰孢的酶的水解率更高。另外,当转化菌为顶头孢霉时,该菌能够向菌体外大量分泌内酯酶,具有可在酶(粗酶、纯化酶或固定化酶)水平进行DL-泛解酸内酯的水解反应等优点。
本发明所用的基因重组技术可以采用例如:Maniatis等人,“Molecular Cloning”,2nd Ed,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.T.(1989);日本生化学会编,《续生化学实验讲座1、基因研究方法II》,东京化学同人(1986);日本生化学会编,《新生化学实验讲座2、核酸III(重组DNA技术)》、东京化学同人(1992);R.Wu编,“Methodsin Enzymology”,Vol.68,Academic Press,New Youk(1980);R.Wu等人编,“Methods inEnzymology”,Vol.100 & 101,Academic Press,New York(1983);R.Wu等人编,“Methods in Enzymology”Vol.153,154 & 155,AcademicPress,New Youk(1987)等中记载的方法或其中引用的文献所记载的方法或本质上与之相同的方法或改变的方法等。这些方法也可以是符合本发明的目的的对公知的方法单独加以改良的方法。
本说明书中,“聚合酶链反应(polymerase chain reaction)”又称为“PCR”,通常指的是在美国专利4683195号的说明书等中记载的方法,例如:指的是在体外用酶扩增目的核酸序列的方法。通常PCR法包括:使用模板和与之能够很好地杂交的2个寡核苷酸引物,重复引物的延长合成循环。在PCR法中应用的典型的引物为与扩增模板内部的核酸序列相对应的互补的引物,例如:优选使用可以与该扩增核酸序列的两端相互补的或可以与该扩增核酸序列的邻接位置相互补的作为引物。优选的5’端的引物至少含有起始密码子或可进行使之含有该起始密码子的扩增,此外,优选3’端的引物至少含有终止密码子或可进行使之含有该终止密码子的扩增。优选5个以上碱基、更优选10个以上碱基组成的寡核苷酸作为引物,更优选18~25个碱基组成的寡核苷酸作为引物。
可以用领域内公知的方法或与之等价的方法或改变的方法进行PCR反应。例如可以按照:R.Saiki等人,Science,130:1350,1985;R.Saiki,等人,Science,239:487,1988;H.A.Erlich编,PCRTechnology,Stockton Press,1989;D.M.Glover等人编,“DNACloning”,第二版,Vol.1(The Practical Approach Series)”,IRLPress,Oxford University Press(1995);M.A.Innis等人编,“PCRProtocols:a guide to methods and applications”,Academic Press,New Youk(1990);M.J.McPherson,P.Quirke and G.R.Taylor(编),PCR:a practical approach,IRL Press,Oxford(1991);M.A.Frohman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8998-9002(1988)等中所记载的方法或对其修饰加以改变的方法等。此外,可以按照试剂盒制造者或试剂盒销售者所阐明的流程实施PCR法使用市售的试剂盒进行PCR。
本说明书中的“寡核苷酸”是比较短的单链或双链的多聚核苷酸,优选多聚脱氧核糖核酸,可以按照Angew.Chen.Int.Ed.Engl.,Vol.28,p.716-734(1989)中记载的已知方法,如:磷酸三酯法、磷酸二酯法、亚磷酸法、磷酸胺法、磷酸法等方法化学合成。已知在修饰的固体载体上能够便利地进行常规的合成,例如:可以采用自动合成装置,该装置在市场上有销售。该寡核苷酸可以含有一个或一个以上的修饰碱基,例如:含有次黄嘌呤核苷等在天然情况下通常没有的碱基或三苯甲基化的碱基等,根据不同情况还可以含有添加有标记的碱基。
可以利用杂交技术鉴定目的核酸。可按照上述公布的《基因重组技术》的文献记载的方法或基本与之等价的方法或者该变的方法进行该杂交。例如:将含有DNA等核酸的样本转移到含有尼龙滤膜等的载体上,根据需要进行变性、固定、洗涤等,在杂交缓冲液中,根据需要用变性的标记探针DNA片段等和转移到载体(例如:膜等)上的核酸反应,以此实现杂交。
通常杂交处理大约35~大约80℃、更优选大约50~大约65℃下,进行大约15分钟~大约36小时、更优选大约1~大约24小时,可以选择最适宜的条件进行杂交处理。例如:在大约55℃下进行18小时杂交处理。可以从本领域内普遍使用的缓冲液中选择用于杂交的缓冲液,例如:可使用Rapid hybridization buffer(Amersham公司)等。例如:使用碱变性液的方法变形转移后的载体(例如:膜等),优选在其处理后用中和液或缓冲液进行处理。另外,可以选择在通常大约40~大约100℃、更优选大约70~大约90℃、加热大约15分钟~大约24小时、更优选大约1~大约4小时,选择适当的条件进行载体(例如:膜等)固定处理。例如:在大约80℃,加热大约2小时固定滤膜等载体。可以用本领域内通常使用的洗涤液,例如:用含有1MNaCl、1mM EDTA和0.1%十二烷基磺酸钠(SDS)的50mM Tris-HCl缓冲液,pH8.0等进行洗涤,以此作为转移后的载体(例如:膜等)的洗涤处理。可以从本领域内通常使用的载体中选择含有尼龙滤膜等的膜的载体。
上述碱性变性液、中和液、缓冲液可以从本领域内通常所使用的各种液中加以选择。例如:可以使用含有0.5M NaOH和1.5M NaCl的液体等作为碱性变性液;可以用含有1.5M NaCl的0.5M Tris-HCl缓冲液,pH8.0等作为中和液;例如:可以用2×SSPE(0.36M NaCl、20mMNaH2PO4和2mM EDTA)等作为缓冲液。此外,在进行杂交处理之前,为了防止非特异性的杂交反应,根据需要,优选对转移的载体(例如:膜等)进行杂交预处理。该杂交预处理可以如下进行,例如:浸泡到杂交预处理溶液(50%甲酰胺、5×Denhart溶液(0.2%牛血清白蛋白,0.2%聚乙烯吡咯烷酮)、5×SSPE、0.1%SDS、100μg/ml热变性鲑精DNA)等中,在大约35~大约50℃、优选大约42℃、反应大约4~大约24小时,优选大约6~大约8小时。本领域的技术人员可以重复适当的实验,以此选择更优选的条件作为该条件。例如:可以在大约70~大约100℃、优选大约100℃,加热大约1~大约60分钟,优选大约5分钟等变性用于杂交的标记探针DNA片段。并且,可以按照本身公知的方法或以之为基准的方法进行杂交。本说明书中的杂交条件,例如:钠的浓度,大约为15~大约50mM,优选大约19~大约40mM,更优选大约19~大约20mM,温度大约为35~85℃,优选大约50~大约70℃、更优选大约60~大约65℃的条件。
杂交结束后,充分洗涤滤膜等载体,去除已经特异性杂交反应的标记探针DNA片段以外的标记探针等,然后进行检测。可以用本领域内通常使用的溶液洗涤滤膜等载体,例如:用含0.1%SDS的0.5×SSC(0.15M NaCl、15mM柠檬酸)溶液等实施洗涤。
可以用具有代表性的自放射显影检测杂交的核酸,也可以适当选择本领域所用的方法,进行检测。将检测信号相对应的核酸条带重悬到适宜的缓冲液,例如:SM溶液(含有100mM NaCl和10mM MgSO4的50mM Tris-HCl缓冲液,pH7.5)中,然后,将该悬浊液适当稀释,分离、纯化目的核酸,并且可以再扩增。
可以用杂交处理从含有核酸样品的基因库或cDNA库等中重复筛选目的核酸。
可以从属于下述各属的微生物中获得本发明所用的该内酯酶,例如:镰孢属、柱孢属、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、轴刺座霉属、胶霉属、散囊菌属、从赤壳菌属、漆斑菌属、链孢霉属、支顶孢属、锈生座孢属、犁头霉属、Sporothrix、轮枝孢属、节皮菌属等。具有代表性的有例如:尖孢镰孢IFO 5942、半裸镰孢IFO 30200、Cylindrocarpon tonkinense IFO 30561、稻恶苗赤霉IFO 6349、米曲霉ATCC 91002、米曲霉IFO 5240、泡盛曲霉IFO 4033、产黄青霉IFO 4626、米根霉IFO 4706、Volutella buxi IFO 6003、链孢胶霉IFO 6121、Eurotium chevalieri IFO 4334、Nectria elegans IFO 7187、群交裂褶菌IFO 4928、露湿漆斑菌IFO 9531、粗糙链孢菌IFO 6067、Acremonium fusidioides IFO 6813、柄锈生座孢IFO 6464、李克氏梨头霉IFO 4009、Sporothrix schenckii IFO 5983、VerticilliumMalthousei IFO 6624、钩骨节皮病IFO 7865等。
可以基于WO,A,97/10341;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,12787-92,1998,利用基因重组技术得到本发明中使用的编码内酯酶的基因。例如:破碎培养的尖孢镰孢菌体,用常规方法离心分离染色体DNA后,分解去除RNA,进行去除蛋白质的操作,纯化DNA成分。可以参考“植物生物实验指南:农村文化社,252页”进行上述操作。同样,从破碎的菌体中,按照AGPC法提取总RNA,然后用适当的方法,例如:用寡聚dT纤维素柱纯化mRNA,之后以得到的mRNA为模板,用逆转录酶等合成cDNA。此外,使用已经构建好的基因库,采用适当的引物,通过PCR法,或逆转录PCR(polymerase chain reactioncoupled reverse transcription;RT-PCR)法得到目的基因。可以将已经获得的内酯酶基因作为探针使用。可以使用市售的标记试剂盒,例如:随机DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim公司)等对探针等进行同位素等的标记。例如:可以使用random-priming试剂盒(Pharmacia LKB公司,Uppsala)等,向探针DNA上标记[α-32P]dCTP(Amersham公司)等,得到具有放射活性的探针。
可以用本领域内常规使用的方法分别纯化分离含有目的核酸的噬菌粒、重组质粒、重组载体等。例如:可以用甘油梯度超速离心法(Molecular Cloning,a laboratory manual,ed.T.Maniatis.ColdSpring Harbor Laboratory,2nd ed,78,1989)、电泳法等进行纯化。可以用本领域常规使用的方法从噬菌粒中纯化分离DNA,例如:将得到的噬菌粒等重悬到TM(含10mM MgSO4的50mM Tris-HCI缓冲液,pH7.8)等溶液中,用DNaseI和RNase A等处理后,加入20mM EDTA,50μg/ml的Proteinase K和0.5%SDS混合液,在大约65℃,保温大约1小时,将其酚抽提和二乙基醚抽提后,通过乙醇沉淀使DNA沉淀,然后用70%的乙醇洗涤得到的DNA后,干燥,用TE溶液(含10mMEDTA的10mM Tris-HCl缓冲液,pH7.8)溶解得到目的核酸等。通过亚克隆等可以得到大量的目的DNA。例如:可以用质粒载体等以大肠杆菌为宿主进行亚克隆。可以采用和上述同样的离心、酚抽提、乙醇沉淀等方法纯化分离所得到的亚克隆的DNA。可以用双脱氧法、例如:M13双脱氧法等、Maxam-Gilbert法等测定碱基序列,也可以用市售的测序试剂盒,例如:Taq dyeprimer循环测序试剂盒等、自动碱基序列测定装置,例如:荧光DNA测序装置等测序。
在本说明书中,核酸(或多聚核酸)是单链DNA、双链DNA、RNA、DNA:RNA杂合体、合成DNA等。此外,也可以是基因组DNA(染色体基因DNA)、基因组DNA文库、cDNA、合成DNA中的任何一种。核酸的碱基序列可以进行修饰(例如:添加、去除、置换等),也可以包括经过上述修饰后的序列。核酸可以是编码本发明中记载的肽或编码其一部分的核酸,优选DNA。也可以通过化学合成的方法得到核酸。在化学合成片段时,也可以通过酶使之连接。
在本说明书中,所得到PCR产物等的核酸(包括DNA在内),通常经过1%~2%的琼脂糖凝胶电泳,切取特异的条带后,用市售的试剂盒,例如:gene clean kit(Bio 101)等抽提。用适当的限制性内切酶切割抽提的DNA,根据需要进行纯化处理,然后再根据需要用T4多聚核苷酸激酶等将其5’末端磷酸化后,连接到pUC18等pUC系列载体等适当的质粒载体上,转化到适当的感受态细胞中。测定并分析克隆化后的PCR产物的碱基序列。可以使用例如:p-Direct(Clontech公司)、pCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene公司)、pGEM-T(Promega公司)、pAmpTM(Gibco-BRL公司)等销售的质粒载体进行PCR产物的克隆。向宿主细胞转化时,可以使用例如:噬菌粒载体、钙法、铷/钙法、钙/锰法、TFB高效率法、FSB冷冻感受态细胞法、快速克隆法、电穿孔法等领域内公知的方法或与之等价的方法(D.Hanahan,J.Mol.Biol.,166:557,1983等)。
可以向该质粒的序列内导入例如:适合所选择宿主细胞表达的密码子或设置限制性酶切位点。此外,可以含有调控序列、增强子序列等使目的基因容易表达的序列,和其他对目的基因连接有利的连接链(linker)、接头(adaptor)等,还可以含有控制抗生素耐受性等、控制代谢、对筛选等有用的序列等。
以大肠杆菌为宿主的质粒可以列举:pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4Z、pGEM-5Zf(-)、pBluescript KSTM(Stratagene)等。适合在大肠杆菌中表达的质粒载体可列举:pAS、pKK223(Pharmacia)、pMC1403、pMC931、pKC30等。
宿主细胞为大肠杆菌时,例如:来自大肠杆菌K12菌株的大肠杆菌,可列举:NM533 XL1-Blue、C600、DH1、HB101、JM109等。在本发明的基因工程操作中,可以使用本领域内已知的或广泛使用的限制性酶、逆转录酶、可以为了使DNA片段适合克隆化,使用对其构造进行修饰或改变的DNA修饰酶、分解酶、DNA聚合酶、末端核苷转移酶、DNA连接酶等。
根据本发明,也可以将该内酯酶以融合蛋白的形式表达,在生物体内或生物体外,进行转变、加工,使之具有与野生型基本等同的生物学活性。此外,可以用基因工程中常用的融合表达方法,利用该融合蛋白的融合部分,可以用亲和层析等进行纯化。可以用领域内公知的方法,通过例如:利用合成寡核苷酸等向指定位置导入突变的方法(部位特异性突变导入法)或使用PCR等对蛋白质的结构进行修饰、改变等。
在本发明中,为了制造表达该内酯酶的转化子,构建编码该内酯酶和信号肽的DNA,适当加以利用。优选来自镰孢属丝状菌的编码该内酯酶的基因,例如:在本发明中所使用的用于表达重组内酯酶的碱基序列为含有编码内酯酶全长的DNA序列和编码该内酯酶NH2末端信号肽区域的DNA序列。此外,该用于表达的重组内酯酶的碱基序列可以含有(a)来自镰孢菌属丝状菌的内酯酶全长cDNA序列或染色体基因DNA序列和编码该内酯酶的NH2末端信号肽区域的DNA序列。
优选的例子:可以将含有编码该来自镰孢菌属丝状菌的内酯酶和信号肽区域序列的序列重组到适当的表达载体内。该表达载体可以含有一个或多个丝状菌的增强子碱基序列、含有在镰孢菌属丝状菌表达碱性磷酸酶(Alp)所用的启动子区域、将一个或多个丝状菌的增强子碱基序列导入到在丝状菌中具有启动子功能的区域、由在Alp分泌中的信号肽序列区域或内酯酶的信号肽序列区域所组成的信号肽区域。
例如:含有米曲霉α-糖苷酶基因(agdA)启动子上的增强子序列和启动子区域的表达用载体适于在丝状菌中表达。对于导入了该增强子的启动子序列,只要能在丝状菌中发挥功能即可,没有特殊的限制。具体可以列举:编码α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、细胞生物水解酶和乙酰氨酶等水解酶的基因的启动子,和编码在糖酵解途径中的3-磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、醇脱氢酶和烯醇酶等糖酵解酶基因的启动子。
可以从曲霉菌属的α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-糖苷酶的基因中分离得到适合的启动子。更优选米曲霉的α-糖苷酶基因的启动子。该启动子也可以是部分序列,只要含有在丝状菌中的发挥启动子功能即可。而且,适于在本发明中使用的表达质粒中含有能在上述的改良的丝状菌中发挥功能的启动子、终止子、适合进行宿主转化子筛选的标记基因、可以在大肠杆菌中进行复制的的DNA区域。对于启动子上导入该增强子的部位,只要是在启动子区域即可,没有特别的限制。终止子只要在丝状菌中能发挥功能即可,没有特别的限制。例如:更优选米曲霉的α-糖苷酶基因的终止子,或含有其部分序列的终止子。优选的选择性标记可列举:硝酸还原酶(niaD)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(argB)、色氨酸合成酶基因(trpC)或乙酰氨酶的基因。更优选的选择性标记基因是硝酸还原酶基因(niaD)。利用在启动子和终止子间设置的限制性内切酶识别位点,向这些质粒中插入编码表达本发明的目的蛋白质的DNA片段
作为适合表达用的载体可以使用例如:特开平09-9968号公报、特开平5-268972号公报等公布的载体,或者采用公知的技术由上述载体衍生的载体。例如:优选使用pNLH2、pNAN8142等质粒。连接基因时,可以使用合成DNA作为基因间的接头DNA。该合成DNA只要和两个基因的侧翼一致,并且不会导致目的基因失去活性即可。例如:用AP酶基因启动子和翻译起始位置和/或者分泌信号肽表达目的基因时,可以使来自该AP酶基因的部位和目的基因的侧翼一致,以此制造融合基因,连接到对应于和AP酶分泌信号肽翻译起始密码子的下游的侧翼上,进行目的物质在菌体外的分泌表达。只要不丧失启动子的功能,缺失一部分DNA片段也没有关系。此外,可以相应的适当加以改变,使启动子和翻译起始部位的功能发生变化,例如:改变包含启动子和翻译起始部位的DNA碱基序列,也可以改变与启动子和翻译起始部位无关区域的DNA碱基序列使之增加表达能力。
可以使用任何一种生物作为导入如上所述构建的目的基因的宿主,只要是能够使上述基因复制、表达的生物即可。代表性的宿主,可以从酵母、丝状菌、植物等真核生物中适当选择。可列举:属于镰孢属、柱孢属、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、轴刺座霉属、胶霉属、散囊菌属、从赤壳菌属、、漆斑菌属、链孢霉属、支顶孢属、锈生座孢属、犁头霉属、Sporothrix、轮枝孢属、节皮菌属等。具有代表性的有例如:尖孢镰孢IFO 5942、半裸镰孢IFO 30200、Cylindrocarpon tonkinense IFO 30561、稻恶苗赤霉IFO 6349、米曲霉ATCC 91002、米曲霉IFO 5240、泡盛曲霉IFO 4033、产黄青霉IFO 4626、米根霉IFO 4706、Volutella buxi IFO 6003、链孢胶霉IFO 6121、Eurotium chevalieri IFO 4334、Nectria elegans IFO 7187、群交裂褶菌IFO 4928、露湿漆斑菌IFO 9531、粗糙链孢菌IFO 6067、Acremonium fusidioides IFO 6813、柄锈生座孢IFO 6464、李克氏梨头霉IFO 4009、Sporothrix schenckii IFO 5983、VerticilliumMalthousei IFO 6624、钩骨节皮病IFO 7865等属的生物。
而且,作为导入含有目的内酯酶基因的载体的宿主只要是能使该基因复制、表达的即可,其中所述载体上具有AP酶基因的启动子,并且在编码翻译起始部位和/或者分泌信号肽区域的下游连接有目的内酯酶基因。优选从酵母、丝状菌等真核生物中适当加以选择。具体而言,酵母菌可列举:酿酒酵母菌属、裂殖酵母菌属、毕赤氏属菌等。更具体而言,可列举Saccharomyes cerevisiae、Schiizosaccharomyces pombe、Pichia pastoris等。此外,丝状菌可列举:支顶孢霉属、曲霉菌属、镰孢霉属、青霉菌属、毛霉菌属、脉孢菌属、Trichoderma属菌等。更具体可以列举:顶头孢霉、黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、尖孢镰孢、半裸镰孢、产黄青霉、Mucorjavanicus、粗糙链孢霉、Trichoderma viridae等。其中特别优选顶头孢霉。更具体可以列举:Saccaromyces cerevisiaw AH22R-、顶头孢霉ATCC 11550株、ATCC14533株、米曲霉IFO5240、泡盛曲霉IFO4033、尖孢镰孢IFO 5942、半裸镰孢IFO30200、Mucor javanicusIFO4570、Trichoderma viride IFO31137等。其中最优选顶头孢霉ATCC 11550。
可以用原生质体细胞转化法等作为向上述宿主中导入基因的转化方法。例如:在氯化钙、聚乙二醇等存在的条件下,将经过用适当的细胞壁溶解酶制造的原生质化的细胞与DNA接触等方法进行转化。此外,转化方法可列举:电穿孔法(例如:E.Neumann等人,“EMBO J”,Vol.1,pp.841(1982)等)、显微注射法、基因枪打入法等。
为了有效地分离转化的细胞,向含有在宿主内具有功能的适当选择标记基因的质粒上插入该融合基因,将该质粒转化到宿主中。只要能选择性地分离转化的细胞,可以使用任何基因作为该选择性标记基因。代表性的基因可列举潮霉素B耐药基因等。通常必需选用没有选择性功能标记基因的细胞株作为宿主。
培养本发明所得到的转化细胞的各种条件根据所使用的菌株等细胞的种类而有所不同,通常关于培养基,可以使用含有可以让该转化细胞同化吸收的碳源或者氮源等的培养基。可以使用任何可被该转化细胞同化吸收的物质作为碳源,可列举:葡萄糖、蔗糖、淀粉、可溶性淀粉、糊精等糖类;石蜡类等,此外,可列举:醋酸、柠檬酸、丁酸、延胡索酸、苯甲酸等有机酸类;甲醇、乙醇、丁醇、甘油等醇类;油酸、硬脂酸等脂肪酸或者其酯类;大豆油、菜籽油、猪油等油脂类等,可以单独使用或者混合使用上述物质。只要能被吸收的物质就可以用作氮源。可列举:硫酸铵、硝酸铵等铵类;硝酸钠、硝酸钾等硝酸盐类;尿素、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米浆、玉米蛋白粉、麸皮、酵母提取物、干酵母、大豆粉、棉子粉、肉粉、其它的有机或者无机的含氮物质,可以单独或者混合使用上述物质。可以适当地向培养基中加入任何无机盐类、矿物质、维生素、微量金属盐等营养素。作为无机盐可列举:硫酸镁、氯化钠、碳酸钙、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾等磷酸盐类、锰盐类等,作为其它营养素,可列举:麦芽提取物等。此外,可以适当选择使用本领域内通常使用的物质。
在好氧条件下进行深部培养通常有利于培养,好氧性培养时,通常培养1~20天左右,优选3~14天左右,更优选3~10天左右,培养基的pH3~9,在培养温度10~50℃下进行培养。
可以按照公知的方法从各种原料如:包括细胞培养液、细胞培养破碎物等在内的转化细胞等的产生酶的材料中得到本发明的转化细胞产生的酶。例如:当积累到培养基中时,通过离心分离或过滤得到含有目的物质的上清液。另一方面,目的物质积累在菌体等细胞中时,用培养后、离心分离或过滤等公知的方法收集菌体,适当采用将菌体重悬到含有盐酸胍等的蛋白质变性剂的缓冲液中,冷却搅拌,通过离心得到含有目的物质的蛋白质上清液,在缓冲液中重悬菌体,用磁珠进行粉碎,经过压釜、超声波处理或酶处理等破碎细胞,通过离心分离等得到上清液等的方法。
为了从上述上清液中分离、纯化目的蛋白质,可以适当组合本身公知的分离、纯化方法,例如:使用硫酸铵沉淀法等盐析、乙醇等的溶媒沉淀法、SephadexTM等凝胶过滤法,例如:采用具有二乙基氨基乙基或羧甲基等的碱性基团或酸性基团的载体等的离子交换层析法,例如:使用丁基、辛基、苯基等疏水性基团的载体的疏水性层析法、色素凝胶层析法、电泳法、透析、超滤法、亲和层析法、高效液相法等进行纯化。此外,得到包涵体时,可以进行溶解处理,例如:使用盐酸胍、尿素这样的变性剂,或根据需要在2-巯基乙醇、二硫苏糖醇等还原剂存在的情况下进行处理得到活性型的酶。
可以直接用酶产生细胞作为酶使用。用本领域内公知的方法固定酶或酶产生细胞等以此作为固定化酶,可列举:用共价结合法或吸附法这类载体结合法、交联法、包埋法等进行固定。此外,也可以将微生物菌体固定到海藻酸凝胶上。例如:根据需要使用戊二醛、环己烷二异氰酸酯、环己烷二异硫氰酸酯等缩合剂进行固定。此外,用通过单体聚合反应进行凝胶化的单体法、聚合成比通常单体大的分子的预聚物(prepolymer)法、将共聚物凝胶化的共聚法等。例如:用聚丙烯酰胺固定;用褐藻酸、胶原、明胶、琼脂和к-角叉菜聚糖等天然高分子固定等;用光固化树脂、氨基甲酸乙酯聚合物等合成高分子固定。酶或微生物菌体的固定化技术及其应用可以参照如Ichiro CHIBATA编《固定化酶》,p75,讲谈社科学(1975年);Ichiro CHIBATA编《固定化生物催化剂》,p67,讲谈社科学(1986年);铃木智雄监修《微生物工程技术手册》、朝仓书店(1990年5月);今中忠行编《Maruzen Advanced Technology[生物工程学编]微生物工程学》,p180~194,丸善株式会社(1993年9月30日);日本生化学会编《新生化学实验讲座13生物工程版》,p50~54,东京化学同人(ISBN:4-8079-1079-5)等中记载的方法或其中引用的文献中记载的方法或与之等价的方法或其改进方法。也可以使用和本发明目的一致的加以单独地改变改良的公知方法。可以按照特开平3-65198号和特开平4-144681号中记载的方法培养微生物、进行包括用酶对D-泛解酸内酯水解在内的利用内酯水解酶的酶不对称水解进行内酯类化合物的光学拆分反应和生成物处理。
例如:收集用液体培养基振摇培养的转化菌,向得到的菌体中加入D,L-泛解酸内酯水溶液(2~60%浓度),调整到pH6~8,同时在10~40℃下反应数小时以至1天。反应结束后,分离菌体,用有机溶剂(优选如乙酸乙酯的酯类、如苯的芳香族烃类、如氯仿的卤代烃类等)提取分离未反应的L-泛解酸内酯。在盐酸酸性环境下,通过加热等,将水层中残留的D-泛解酸内酯进行内酯化,用上述有机溶剂抽提得到生成的D-泛解酸内酯。
并且,在本发明中提供了下述方法,用通式(I)的化合物或其盐与导入有编码来自镰孢属丝状菌的内酯酶和信号肽区域的DNA或导入插入了上述DNA的载体的内酯酶转化子的培养物、其细胞、或细胞处理物和由该转化子得到的重组的内酯酶等接触,从反应体系中分离通式(II)所示的S构型的未水解物或其盐,然后将通式(III)所示的水解物或其盐进行内酯化,转换成通式(IV)或其盐,有效地制造了具有光学活性的γ-内酯衍生物或其盐。
在本发明中,优选使用对通式(I)的化合物R构型选择性地不对称水解的如上所述得到的转化子、特别是转化微生物,此外,经过通式(II)的化合物或通式(III)的化合物工业化地制造通式(IV)化合物,例如:可以用下面的反应式表示:
Figure A20048000757600281
(*表示光学活性碳原子,R表示羟基、氨基,R1和R2相同或不同,各自独立表示氢或低级烷基)。
R1和R2作为低级烷基,可列举:碳原子数1~5个的直链状或分支状的烷基,例如:甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基等。代表性的分子是R为羟基、R1和R2同为甲基,这种情况下,可以用通式(I)的外消旋泛解酸内酯或其盐制造光学活性的泛解酸内酯或其盐,例如:制造通式(IV)的D-泛解酸内酯或其盐,或通式(II)的L-泛解酸内酯或其盐。
在本制造方法中使用的转化子,特别是转化微生物可以采用在液体培养基中培养菌株得到的培养物、从培养液中分离的菌体、或处理菌体或培养物得到的干燥菌体或固定化菌体等中的任何一种。此外,还可以采用从该转化子分离的酶或其粗制品、纯化品或固定化物等任何一种。
可以采用全批次、半批次或连续式中的任何一种操作。所用的γ-内酯的浓度通常为10~500g/L。反应温度通常为10~50℃,更优选20~30℃。反应时间在全批次生产时,通常为数小时至1天。反应体系的pH通常为3~9左右,更优选6~8。
用转化微生物对通式(I)的选择性不对称水解,其结果生成通式(III)的化合物,随着反应液pH的降低,反应速度也降低。为了提高反应速度,优选将反应液的pH保持在各种微生物的内酯水解酶的最适pH。此时,除了可以用碱金属或碱土金属的氢氧化物或碳酸盐外,还可以用氨水等作为维持pH的无机盐。
反应结束后,通过有机溶剂抽提等操作分离反应液中未水解的通式(II)的化合物。可以使用卤代烃类如:氯乙烯、氯仿、三氯乙烷;芳香族烃类,如:苯、甲苯;醚类,如:二乙基醚、叔丁基甲基醚;和醋酸乙酯等,更优选醋酸乙酯作为有机溶剂。
抽提之外的分离方法,还可以列举:柱层析等,可以使用反相柱,用水、甲醇或乙醇等醇类或它们的混合物作为洗脱溶液,以此分离通式(II)和通式(III)的化合物。
可以将反应液中残存的通式(III)的化合物直接通过酸化转变成通式(IV)的化合物。可以用盐酸、硫酸等作为使用的酸,更优选硫酸。用pH或反应温度、反应时间只要能使通式(III)的化合物开环,转化成通式(IV)的化合物的条件即可,更优选pH1以上的强酸性、反应温度80~130℃、反应时间1~6小时。
可以用有机溶剂提取回收所生成的通式(IV)的化合物。这里所用的有机溶剂和前面提取通式(II)的化合物所用的溶剂一样,除了使用如氯乙烯、氯仿和三氯乙烷的卤代烃类、如苯、甲苯的芳香族烃类、如二乙基醚、叔丁基甲基醚的醚类以外,还可以使用醋酸乙酯等,更优选醋酸乙酯。此外,可以用柱层析进行回收。
另一方面,用碱金属的氢氧化物或碳酸盐等处理反应液中残存的通式(III)的化合物后,减压蒸馏反应液,用溶剂重结晶干燥固形物,分离碳酸的碱金属盐。所用的碱金属的氢氧化物或碳酸盐为氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾等,优选氢氧化钠。此外,可以用甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿等作为重结晶溶剂,优选甲醇。
特别是,本发明能够高收率地得到高光学纯度的D-泛解酸内酯。可以按照下述方法进行制造:在醇类溶剂中,D-泛解酸内酯和β-丙氨酸的钙盐或其酯缩合,得到D-泛酸钙,例如:在醇等的有机溶剂中,将D-泛解酸内酯和β-丙氨酸或其酯缩合,得到D-泛酸后,使之与碳酸钙等钙化合物反应的方法(E.Stiller等人,J.Am.Chem.Soc.,62,1785(1940))。仲胺或叔胺存在的条件下,煮沸D-泛解酸内酯和β-丙氨酸,向该反应液中加入氧化钙,制造D-泛酸钙的方法(E.H.Wilson等人,J.Am.Chem.Soc.76,5177(1954))等。此外,在醇类溶剂中,和3-氨丙醇缩合,得到D-泛醇(USP No.2413077;Brit.Patent No.568355)。此外,在醇等有机溶剂中,使D-泛解酸内酯和γ-氨丙腈反应,得到D-泛酰腈(D-pantothenonitrile),然后和半胱氨酸反应,得到2-(2-D-泛酸酰氨乙基)-2-噻唑啉、即2-(2-D-pantoamidoethyl)-2-thiazoline后,水解,得到D-泛酰巯基乙胺,在过氧化氢存在的条件下,使之缩合,制造双泛酰巯基乙胺(M.Shimizu等人,Chem.Pharm.Bull.,13,180(1965))。使用本发明中得到的D-泛解酸内酯,可以有效地得到D-泛酸和其盐,或D-泛醇。
本发明提供了简便、有效地制造医药品中间体或氨基酸衍生物的有用的光学活性的γ-内酯衍生物的方法。
在说明书和附图中的用语是以IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature或本领域中惯用的用语的含意为基准的。代表性的用语的含意如下所示:
A:丙氨酸(Ala)        M:甲硫氨酸(Met)
C:半胱氨酸(Cys)      N:天冬酰氨(Asn)
D:天冬氨酸(Asp)      P:脯氨酸(Pro)
E:谷氨酸(Glu)        Q:谷胺酰胺(Gln)
F:苯丙氨酸(Phe)      R:精氨酸(Arg)
G:甘氨酸(Gly)      S:丝氨酸(Ser)
H:组氨酸(His)      T:苏氨酸(Thr)
I:异亮氨酸(Ile)    V:缬氨酸(Val)
K:赖氨酸(Lys)      W:色氨酸(Trp)
L:亮氨酸(Leu)      Y:酪氨酸(Tyr)
关于核苷酸序列:
A:腺嘌呤   G:鸟嘌呤
C:胞嘧啶   T:胸腺嘧啶
(1)后述实施例1中记载的pNAN-XG转化的米曲霉:A.oryzae/pNAN-XG是2003年2月4日寄存到茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(AIST Tsukuba Central 6,1-1,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566 Japan,旧地址为:茨城县筑波市东1丁目1番3号)(邮政编码305-8566)的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄存中心(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology,International PatentOrganism Depositary:IPOD)(旧名称:经济产业省产业技术综合研究所生命工程工业技术研究所(NIBH))保管(委托号为FERM P-19199)。根据布达佩斯条约,依据在2004年2月2日提出的原保藏的保藏转移申请,其委托号FERM BP-08608,保存在IPOD。此外,在后述实施例2中记载的pAlpS转化的顶头孢霉:Ac.chrysogenum/pAlpS在2003年2月4日保存在IPOD(委托号FERM P-19200)、2004年2月2日根据布达佩斯条约提出原保藏的保藏转移申请,其委托号为FERMBP-08609,保存在IPOD。
(2)此外,后述的实施例1中使用的带有导入的内酯酶基因的载体(pFLC40E)的大肠杆菌JM109(EJM-ESE-1)在1995年8月30日(原始保藏日)保藏在IPOD(委托号FERM P-15141),根据布达佩斯条约,在1996年8月28日提出保藏转移申请,保藏号为FERM BP-5638,保存在IPOD。
下面,通过实施例具体说明本发明,这些实施例仅用于说明本发明,为了参考而提供了具体的实施方案。这些例子是为了说明本发明的特定的具体实施方案,不限定本申请所公开的发明范围或不具有限定性。在本发明中,根据本说明书的思想能够理解为多种可行的实施方案。
在整个实施例中,除了特别详细记载的之外,实施的或能用标准的技术实施的均采用本领域的技术人员公知的惯用的方式方法。作为在下面的实施例中通常惯用的分子生物学技术,可以按照标准的实验操作例如:J.Sambrook,E.F.Fritsch & T.Maniatis(ed.)“MolecularClonig:A Laboratory Manual(2nd edition)”,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989);D.M.Glover等,(ed),“DNA Cloning”,2nd ed.,Vol.1-4(The PracticalApproach Series),IRL Press,Oxford University Press(1995);H.A.Erlich(ed.)PCR Technology,Stockton Press,1989;D.M.Glover等人,(ed),“DNA Cloning”,2nd ed.,Vol.1,(The PracticalApproach Series),IRL Press,Oxford Universtiy Press(1995);M.A.Innis等人,(ed.),“PCR Protocols:a guide to methodsand applications”,Academic Press,New Youk(1990);M.J.McPherson,P.Quirke and G.R.Taylor(ed.),PCR:a practicalapproach,IRL Press,Oxford(1991)等中记载的方法进行,或在用市售试剂或试剂盒时,使用其中添加的说明书或添加的药品等。
实施例1
〔源自镰孢尖孢的内酯酶在米曲霉中的表达〕
(1)质粒的构建
用限制性酶EcoRI、XbaI处理重组有镰孢尖孢的成熟内酯酶的cDNA(不含N末端的信号肽和内含子)的pFLC40E质粒,分离含有内酯酶片段的cDNA。将其blunting处理后,插入到表达用质粒pNAN8142(特开平09-9968号公报,Biosci.Biotechnol.Biochem.,60:383-389,1996)的p-No8142启动子下游的PmaCI位点,得到pNAN-PC。
导入内酯酶基因的cDNA和信号肽序列的pNAN-XC是按照下面的方法构建的。
用AGPC法(使用酸-硫氰酸胍-苯酚的方法)从尖孢镰孢中提取总RNA(试剂盒名:ISOGEN,Nippon Gene),以总RNA为模板,用(AccessRT-PCR Syestem,Promega公司制造)根据RT-PCR(用PCR从RNA扩增DNA的方法)法,扩增1.3kb的DNA片段。用FusLac1(下划线部分含有XhoI酶切序列)和FusLac2(下划线部分含有XbaI酶切序列)着2个寡核苷酸作为引物。
FusLac1:5’-AA CTCGAGATGCCTTCTTCCATTTCTGTA-3’(序列号1)
FusLac2:5’-AA TCTAGACTAATCATAGAGCTTGGGAC-3’(序列号2)
PCR扩增条件以上述试剂盒的说明为基准。用低融点琼脂糖凝胶纯化PCR产物,用XhoI和XbaI切割后,插入到pNAN8142的进行同样切割的部位。
用FusLac1和FusLac2作为引物,从尖孢镰孢的总DNA中经过PCR扩增基因组全长内酯酶基因。扩增的DNA片段用限制性酶XhoI和XbaI切割后,插入到质粒pANA8142的经过同样切割的位点,得到pANA-XG。
(2)内酯酶基因在米曲霉中的表达
将上述质粒分别转化到用Unkles SE等(Mol.Gen.Genet.218.99-104,1989)的方法从米曲霉(ATCC91002)制造得到的米曲霉niaD突变体(AON-2)中,测定内酯酶的活性。内酯酶活性测定方法如下所述:
将50mg湿菌体在2mL含有0.5M Tris盐酸缓冲液(pH7.4)和0.61mM(80mg)的D-泛解酸内酯的反应液中于30℃下,300转/分钟振摇15分钟。通过离心去除菌体,用HPLC分析上清中的泛解酸内酯和泛酸。1U酶表示在1分钟催化1μmol的D-泛解酸内酯水解的酶量。
pANA-XG转化子表现出最高的内酯酶活性(大约是尖孢镰孢的7.4倍),pNAN-XC也表现出同等活性,pNAN-PC转化子的活性为pNAN-XG的四分之一(表1)。
                         表1
  载体   调查的转化的宿主个数   内酯酶活性[mU/mg(湿重)细胞]
  平均   最大值
  pNAN-PCpNAN-XCpNAN-XG   476   57.0195211   69.2255388
(3)重组酶的比较
将pNAN-XG和pNAN-XC的转化子的粗提取液提供给SDS-PAGE时,在与尖孢镰孢生成的内酯酶的分子量相当的60kDa的位置上发现表达的蛋白质(图1A)。另一方面,在pNAN-PC时,在51kDa发现表达的蛋白质。用内酯酶抗血清进行Western印记时,在pNAN-XG的60kDa、pNAN-PC的51kDa检测到阳性条带(图1B)。同样在pNAN-XC的60kDa处检测到阳性条带。
分析来自pNAN-XG和pNAN-PC的各重组酶的N末端,二者都表现出和天然型相同的的氨基酸序列(Ala-Lys-Leu-Pro-Ser),确定均经过了正确的加工过程。所以,认为重组酶间的分子量差异是由是否添加糖链造成的。
只有未添加信号肽区域的pNAN-PC的转化子产生脱糖链型的酶,认为因为信号肽是在翻译后将多肽输送到糖链添加位置,即,内质网所必须的。
(4)外消旋内酯的不对称水解
将镰孢尖孢和米曲霉转化子(pNAN-PC和pNAN-XG)和35%的DL-泛解酸内酯溶液的pH控制为6.8~7.5,进行反应。
pNAN-PC转化子的反应初速度高,但酶的稳定性差,2小时后几乎不再进行反应。24小时后,DL-泛解酸内酯的水解率为8.52%,和镰孢尖孢的14.6%相比,较低(图2A)。pNAN-XG转化子的酶比pNAN-PC转化子的酶稳定性好,水解率为19.8%。
为了使水解率达到50%,提高酶的稳定性,将5g湿菌体悬浮在115mL的1%藻酸钠盐中,滴入2%的氯化钙,固定转化子。用固定化菌体进行反应时,pNAN-XG和pNAN-PC的转化子的酶的稳定性更好,并且对DL-泛解酸内酯的水解率显著提高。pNAN-XG和pNAN-PC反应24小时后的水解率分别达到49.1%和21%(图2B)。光学纯度达到95%e.e.以上。
实施例2
〔用顶头孢霉分泌生产镰孢尖孢的内酯酶〕
(1)用Combined PCR构建镰孢属碱性蛋白酶(Alp)启动子、其信号肽序列、内酯酶基因的融合基因(图3)。
使用下述引物,以质粒pNLH2(特开平5-268972号公报)为模板用PCR扩增Alp启动子及其与之相连的Alp信号肽、前导肽(propeptide)。
有义链引物AlpPS(下划线部分表示合成的SalI切断序列)
反义链引物AlpPA(下划线部分表示能和LacS引物的一部分退火反应的部分)。
AlpPS:5’-TT GTCGACGGATCCGAAAGATGAGACCGCT-3’(序列号3)
AlpPA:5’- GAAGCTTAGCCATGTTGATGCTGATGATGGCATCC-3’(序列号4)
LacS:5’- CATCAGCATCAACATGGCTAAGCTAAGCTTCCTTCTACGGCTC-3’(序列号5)
用正义链引物LacS(下划线部分为能和AlpPA引物的一部分退火的部分)和反义链引物FusLac2(序列号2)以pNAN-XG为模板,扩增无N末端信号肽的内酯酶基因。将各自的PCR产物混合,用AlpPS和FusLac2为引物进行二次PCR。用SalI、XbaI切割得到PCR片段(2.3kb),导入到pBluescript中,构建得到pAlpS。
另外的一个表达质粒pLacS是将内酯酶本身的信号肽置于Alp启动子的控制下的质粒,还是采用Combined PCR构建的。用AlpPS和AlpPA2(下划线部分为能和LacS2引物的一部分退火的部分)通过PCR扩增Alp启动子,用引物LacS2(下划线部分能和AlpPA2引物的一部分退火)和引物FusLac2通过PCR扩增含有内酯酶自身信号肽的全长基因。
AlpPA2:5’- TGGAAGAAGGCATCTTGTCAGGGAGTATGAAGGTTG-3’(序列号6)
LacS2:5’- TACTCCCTGACAAGATGCCTTCTTCCTTTCTGTA-3’(序列号7)
混合两种PCR产物,用引物AlpPS和引物FusLac2进行二次PCR,用SalI、XbaI切割扩增产物,亚克隆到pBluescript中。用HindIII切割Morita,S等人开发的pNLH2(J.Biotechenol.42,1-8,1995)释放出含有顶头孢霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GDPH)启动子和潮霉素B脱磷酸酶的3.0kb的片段,将该HindIII切割片段导入到pBluescript中,得到pHmR
(2)内酯酶基因在顶头孢霉中的表达
将上述质粒分别转化到顶头孢霉(ATCC 11550)中,为了检测内酯酶基因是否插入到转化子的染色体DNA中,以转化子基因组DNA为模板,内酯酶基因3’和5’末端的寡核苷酸为引物,进行PCR分析。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳时,在检验的80个转化子中检测出大约89%具有和内酯酶基因相当的1.2kb的条带。
将各种转化子在每升中含有30g蔗糖、5g DL-甲硫氨酸、32g大豆粉、1.5g碳酸钙(pH6.8)的培养基中于28℃下,培养3天,然后再在500mL的培养基中,于28℃,120转/分钟下培养5天。测定该培养上清的内酯酶活性。
用0.5mL含有0.5M Tirs盐酸缓冲液(pH7.4)、0.61mM(80mg)D-泛解酸内酯和适量酶的反应液在30℃下反应15分钟后,用HPLC分析反应液中的泛解酸内酯和泛酸,以此测定内酯酶的活性。结果发现在pAlpS和pLacS的转化子的培养上清中具有大量的内酯酶(表2)。
               表2
  载体   调查的转化的宿主数目   细胞外内酯酶(mg/l)
  平均   最大值
  pAlpSpLacS   1010   57.943.4   19088.8
(3)分泌的酶的性质
将pAlpS和pLacS的转化子的培养上清进行SDS-PAGE时,在60kDa的位置上检测到主要条带(图4)。该分子量和天然酶相当。将该条带转移到PVDF膜上,分析N末端的氨基酸序列,结果显示二者都具有和天然氨基酸相同的序列(Ala-Lys-Leu-Pro-Ser-Thr-Ala-)。
为了分析酶上是否添加了糖链,用只酶切糖蛋白质上N-糖苷键的高甘露糖类型和几种混合的低聚糖的内切糖苷酶与从镰孢尖孢和pAlpS转化子中分别纯化的酶反应1、5、15、60分钟,进行SDS-PAGE。检测到60、56、51kDa三种不同分子量的条带(图5),因此表明至少含有2个N-糖苷键。
(2)固定化酶的制造
将500mL pAlpS转化子的培养液在20mM Tris盐酸缓冲液(pH7.4)中透析,用Amicon YM-10膜浓缩到100mL,得到酶溶液。一方面,用0.1M NaOH洗涤Deolite A-568载体,用纯化水洗涤至pH为8.2。向100mL酶溶液中加入干重为15g的洗涤后的Deolite A-568。在4℃搅拌24小时。在酶吸附后,用纯化水洗涤,用100mL含有2%的戊二醛的20mM Tris盐酸缓冲液(pH7.4)在4℃下交联24小时。
大约有13.6%蛋白质残留在培养液中,没有被固定。测定固定化的酶的D-泛解酸内酯酶活性为60.4U/g湿树脂。活性收率为14.8%(表3)。
                                 表3
  投入活性(U/g-树脂(干燥重量))   投入蛋白质(mg/g-树脂(干燥重量))   吸附后活性(U/g)   活性收率(%)   吸附蛋白质(mg/g)   蛋白质收率(%)
  858   9.07   127   14.8   7.83   86.4
(5)固定化酶对外消旋泛解酸内酯的不对称水解
将固定了酶的湿重量为15g的树脂和75mL的35%(w/v)DL-泛解酸内酯在30℃下,保持pH为6.8~7.5,平稳地搅拌使之反应。结果有效地促进了不对称水解的进行,没有检测到副产物L-泛酸(图6)。反应9小时后,水解率为40%,即,D构型的水解率达到80%,到24小时后达到45%。
产业上的可利用性
本发明提供了下述生产技术,即,利用天然的内酯酶基因,可以制造有效地并且生产性优异生产该酶的系统,此外,用该酶和生产该酶的系统,可以构建有效地并且生产性更优异地光学活性γ-内酯生产系统。而且,可以构建可制造在医学上或生理学上重要的维生素,如:D-泛酸、D-泛醇,泛酰巯基乙胺等优异的系统,除了应用于医药品之外,还应用于食品添加剂、饲料添加剂、化妆品的生产。
本发明,除了在上述说明书和实施例中特别说明的之外,还包括其他可以实行的方案。鉴于上述解释,本发明的多种改变和变形形式也包括在本发明的权利要求的保护范围内。
(序列表内容)
SEQ ID NO:1,人工序列描述:作为PCR引物的寡核苷酸;
SEQ ID NO:2,人工序列描述:作为PCR引物的寡核苷酸;
SEQ ID NO:3,人工序列描述:作为PCR引物的寡核苷酸;
SEQ ID NO:4,人工序列描述:作为PCR引物的寡核苷酸;
SEQ ID NO:5,人工序列描述:作为PCR引物的寡核苷酸;
SEQ ID NO:6,人工序列描述:作为PCR引物的寡核苷酸;
SEQ ID NO:7,人工序列描述:作为PCR引物的寡核苷酸;
序列表
<110>DAIICHI FINE CHEMICAL公司
<120>内酯酶的制造方法及其应用
<130>FC-101PCT
<150>JP 2003-55233
<151>2003-03-03
<150>JP 2003-371750
<151>2003-10-31
<160>9
<170>Microsoft Windows XP Notepad
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列表述:用于作为PCR引物的寡核苷酸
<400>1
aactcgagat gccttcttcc atttctgta                                        29
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列表述:用于作为PCR引物的寡核苷酸
<400>2
aatctagact aatcatagag cttgggac                                         28
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列表述:用于作为PCR引物的寡核苷酸
<400>3
ttgtcgacgg atccgaaaga tgagaccgct                                       30
<210>4
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列表述:用于作为PCR引物的寡核苷酸
<400>4
gaagcttagc catgttgatg ctgatgatgg catcc                                 35
<210>5
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列表述:用于作为PCR引物的寡核苷酸
<400>5
catcagcatc aacatggcta agctaagctt ccttctacgg ctc                        43
<210>6
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列表述:用于作为PCR引物的寡核苷酸
<400>6
tggaagaagg catcttgtca gggagtatga aggttg                                36
<210>7
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列表述:用于作为PCR引物的寡核苷酸
<400>7
tactccctga caagatgcct tcttcctttc tgta                                  34
<210>8
<211>1453
<212>DNA
<213>尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)
<220>
<221>生物来源
<222>1..1453
<223>/生物=″尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)″
<220>
<221>mRNA
<222>join(1..153,203..545,597..704,757..966,1015..1191,1242..1453)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>join(1..153,203..545,597..704,757..966,1015..1191,1242..1453)
<223>
<220>
<221>信号肽编码序列
<222>(1)..(60)
<223>
<220>
<221>成熟肽或蛋白质编码序列
<222>join(61..153,203..545,597..704,757..966,1015..1191,1242..1450)
<223>
<220>
<221>外显子
<222>(1)..(153)
<223>
<220>
<221>外显子
<222>(203)..(545)
<223>
<220>
<221>外显子
<222>(597)..(704)
<223>
<220>
<221>外显子
<222>(757)..(966)
<223>
<220>
<221>外显子
<222>(1015)..(1191)
<223>
<220>
<221>外显子
<222>(1242)..(1453)
<223>
<220>
<221>内含子
<222>(154)..(202)
<223>
<220>
<221>内含子
<222>(546)..(596)
<223>
<220>
<221>内含子
<222>(705)..(756)
<223>
<220>
<221>内含子
<222>(967)..(1014)
<223>
<220>
<221>内含子
<222>(1192)..(1241)
<223>
<400>8
atg cct tct tcc att tct gta ctt gcg ggg gtt ctc gtg cct gtt ttg     48
Met Pro Ser Ser Ile Ser Val Leu Ala Gly Val Leu Val Pro Val Leu
-20                 -15                 -10                 -5
ggc gcg gtg gct gct aag ctt cct tct acg gct cag att att gat cag     96
Gly Ala Val Ala Ala Lys Leu Pro Ser Thr Ala Gln Ile Ile Asp Gln
            -1  1               5                   10
aag tcg ttc aat gtc ttg aag gat gtg cca cct cct gca gtg gcc aat    144
Lys Ser Phe Asn Val Leu Lys Asp Val Pro Pro Pro Ala Val Ala Asn
        15                  20                  25
gac tct ctg gtatgtcact gcagcctcgt tgctgattgt tactaataat tatgagtag  202
Asp Ser Leu
    30
gtg ttc act tgg cct ggt gta act gag gag tct ctt gtt gag aag cct    250
Val Phe Thr Trp Pro Gly Val Thr Glu Glu Ser Leu Val Glu Lys Pro
            35                  40                  45
ttc cat gtc tac gat gaa gag ttt tac gat gta att gga aaa gac ccc    298
Phe His Val Tyr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Val Ile Gly Lys Asp Pro
        50                  55                  60
tct ttg acc ctc atc gca aca tcg gac acc gac cca atc ttc cat gag    346
Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ser Asp Thr Asp Pro Ile Phe His Glu
    65                  70                  75
gct gtc gta tgg tat cct cct act gaa gag gtg ttc ttt gtg cag aat    394
Ala Val Val Trp Tyr Pro Pro Thr Glu Glu Val Phe Phe Val Gln Asn
80                  85                  90                  95
gct ggc gct cct gcc gca ggc act ggc ttg aac aag tct tcc atc att    442
Ala Gly Ala Pro Ala Ala Gly Thr Gly Leu Asn Lys Ser Ser Ile Ile
                100                 105                 110
cag aag att tcc ctc aag gag gcc gat gct gtt cgc aag ggc aag cag    490
Gln Lys Ile Ser Leu Lys Glu Ala Asp Ala Val Arg Lys Gly Lys Gln
            115                 120                 125
gat gag gtc aag gtc aca gtt gtt gac tcg aac cct cag gtt atc aac    538
Asp Glu Val Lys Val Thr Val Val Asp Ser Asn Pro Gln Val Ile Asn
        130                 135                 140
cca aat g gtatgtttaa cgggtgatat gacttaaacg agcctaacct tttgatctca   595
Pro Asn
    145
g gt  ggt act tac tac aag ggc aac atc atc ttc gct ggt gag ggc caa  643
  Gly Gly Thr Tyr Tyr Lys Gly Asn Ile Ile Phe Ala Gly Glu Gly Gln
                  150                 155                 160
ggc gac gat gtt ccc tct gcg ctg tac ctc atg aac cct ctc cct cct    691
Gly Asp Asp Val Pro Ser Ala Leu Tyr Leu Met Asn Pro Leu Pro Pro
            165                 170                 175
tac aac acc acc a gtaagtcaca agaatcccta agagcacaat tctttgagct      744
Tyr Asn Thr Thr
        180
aaccttaacc ag cc  ctt ctc aac aac tac ttc ggt cgc cag ttc aac tcc  794
              Thr Leu Leu Asn Asn Tyr Phe Gly Arg Gln Phe Asn Ser
                          185                 190
ctc aac gac gtc ggt atc aac ccc agg aac ggt gac ctg tac ttc acc    842
Leu Asn Asp Val Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Asp Leu Tyr Phe Thr
195                 200                 205                 210
gat acc ctc tac gga tat ctc caa gac ttc cgt cct gtt cct ggt ctg    890
Asp Thr Leu Tyr Gly Tyr Leu Gln Asp Phe Arg Pro Val Pro Gly Leu
                215                 220                 225
 cga aac cag gtc tat cgt tac aac ttt gac act ggc gct gtc act gtt   938
 Arg Asn Gln Val Tyr Arg Tyr Asn Phe Asp Thr Gly Ala Val Thr Val
             230                 235                 240
gtc gct gat gac ttt acc ctt ccc aac g gtatgtcttt tattgaatgg         986
Val Ala Asp Asp Phe Thr Leu Pro Asn
        245                 250
taaagtacaa gcaactcata ttgatcag gt  att ggc ttt ggc ccc gac ggc     1037
                               Gly Ile Gly Phe Gly Pro Asp Gly
                                           255
aag aag gtt tat gtc acc gac act ggc atc gct ctc ggt ttc tac ggt    1085
Lys Lys Val Tyr Val Thr Asp Thr Gly Ile Ala Leu Gly Phe Tyr Gly
260                 265                 270                 275
cgc aac ctc tct tct ccc gct tct gtt tac tct ttc gac gtg aac cag    1133
Arg Asn Leu Ser Ser Pro Ala Ser Val Tyr Ser Phe Asp Val Asn Gln
                280                 285                 290
gac ggt act ctt cag aac cgc aag acc ttt gct tat gtt gcc tca ttc    1181
Asp Gly Thr Leu Gln Asn Arg Lys Thr Phe Ala Tyr Val Ala Ser Phe
            295                 300                 305
atc ccc gat g gtaagtcctg tatgttgtgc ctctgtcgtg ttatatactg          1231
Ile Pro Asp
        310
 acctctccag gt  gtc cac act gac tcc aag ggt cgt gtt tat gct ggc    1279
            Gly Val His Thr Asp Ser Lys Gly Arg Val Tyr Ala Gly
                            315                 320
tgc ggt gat ggt gtc cat gtc tgg aac ccc tct ggc aag ctc atc ggc    1327
Cys Gly Asp Gly Val His Val Trp Asn Pro Ser Gly Lys Leu Ile Gly
    325                 330                 335
aag atc tac acc gga acg gtt gct gct aac ttc cag ttt gct ggt aag    1375
Lys Ile Tyr Thr Gly Thr Val Ala Ala Asn Phe Gln Phe Ala Gly Lys
340                 345                 350                 355
gga agg atg ata att act gga cag acg aag ttg ttc tat gtc act cta    1423
Gly Arg Met Ile Ile Thr Gly Gln Thr Lys Leu Phe Tyr Val Thr Leu
                360                 365                 370
 ggg gct tcg ggt ccc aag ctc tat gat tag                           1453
 Gly Ala Ser Gly Pro Lys Leu Tyr Asp
             375                 380
<210>9
<211>400
<212>PRT
<213>尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)
<400>9
Met Pro Ser Ser Ile Ser Val Leu Ala Gly Val Leu Val Pro Val Leu
-20                 -15                 -10                 -5
Gly Ala Val Ala Ala Lys Leu Pro Ser Thr Ala Gln Ile Ile Asp Gln
            -1  1               5                   10
Lys Ser Phe Asn Val Leu Lys Asp Val Pro Pro Pro Ala Val Ala Asn
        15                  20                  25
Asp Ser Leu Val Phe Thr Trp Pro Gly Val Thr Glu Glu Ser Leu Val
    30                  35                  40
Glu Lys Pro Phe His Val Tyr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Val Ile Gly
45                  50                  55                  60
Lys Asp Pro Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ser Asp Thr Asp Pro Ile
                65                  70                  75
Phe His Glu Ala Val Val Trp Tyr Pro Pro Thr Glu Glu Val Phe Phe
            80                  85                  90
Val Gln Asn Ala Gly Ala Pro Ala Ala Gly Thr Gly Leu Asn Lys Ser
        95                  100                 105
Ser Ile Ile Gln Lys Ile Ser Leu Lys Glu Ala Asp Ala Val Arg Lys
    110                 115                 120
Gly Lys Gln Asp Glu Val Lys Val Thr Val Val Asp Ser Asn Pro Gln
125                 130                 135                 140
Val Ile Asn Pro Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Lys Gly Asn Ile Ile Phe
                145                 150                 155
Ala Gly Glu Gly Gln Gly Asp Asp Val Pro Ser Ala Leu Tyr Leu Met
            160                 165                 170
Asn Pro Leu Pro Pro Tyr Asn Thr Thr Thr Leu Leu Asn Asn Tyr Phe
        175                 180                 185
Gly Arg Gln Phe Asn Ser Leu Asn Asp Val Gly Ile Asn Pro Arg Asn
    190                 195                 200
Gly Asp Leu Tyr Phe Thr Asp Thr Leu Tyr Gly Tyr Leu Gln Asp Phe
205                 210                 215                 220
Arg Pro Val Pro Gly Leu Arg Asn Gln Val Tyr Arg Tyr Asn Phe Asp
                225                 230                 235
Thr Gly Ala Val Thr Val Val Ala Asp Asp Phe Thr Leu Pro Asn Gly
            240                 245                 250
Ile Gly Phe Gly Pro Asp Gly Lys Lys Val Tyr Val Thr Asp Thr Gly
        255                 260                 265
Ile Ala Leu Gly Phe Tyr Gly Arg Asn Leu Ser Ser Pro Ala Ser Val
    270                 275                 280
Tyr Ser Phe Asp Val Asn Gln Asp Gly Thr Leu Gln Asn Arg Lys Thr
285                 290                 295                 300
Phe Ala Tyr Val Ala Ser Phe Ile Pro Asp Gly Val His Thr Asp Ser
                305                 310                 315
Lys Gly Arg Val Tyr Ala Gly Cys Gly Asp Gly Val His Val Trp Asn
            320                 325                 330
Pro Ser Gly Lys Leu Ile Gly Lys Ile Tyr Thr Gly Thr Val Ala Ala
        335                 340                 345
Asn Phe Gln Phe Ala Gly Lys Gly Arg Met Ile Ile Thr Gly Gln Thr
    350                 355                 360
Lys Leu Phe Tyr Val Thr Leu Gly Ala Ser Gly Pro Lys Leu Tyr Asp
365                 370                 375                 380

Claims (8)

1.产生内酯酶的转化子,其特征是,其中导入了编码具有D-泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶和信号肽区域的DNA。
2.权利要求1中记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,内酯酶来自属于镰孢属的微生物。
3.产生内酯酶的转化子,其特征是,其中导入的DNA是编码具有序列表编号9中的第1~第380个氨基酸的氨基酸序列的内酯酶的DNA和信号肽区域的DNA。
4.权利要求3记载的产生内酯酶的转化子,其特征是,信号肽区域是序列表编号9中的第-20~第-1个氨基酸所组成的氨基酸序列,或Alp信号肽区域。
5.具有D-泛解酸内酯水解活性的重组内酯酶的制造方法,其特征是,培养权利要求1~4中任一项记载的产生内酯酶的转化子,使之产生并得到重组内酯酶。
6.通式(II)或通式(IV)所示的光学活性的γ-内酯衍生物或其盐的制造方法,其特征是,使用通式(I)所示的化合物或其盐与选自权利要求1~4中任一项记载的内酯酶转化子的培养物、细胞、细胞处理物或固定化菌体、由该转化子得到的重组内酯酶和固定化重组内酯酶相接触,以产生光学活性的γ-内酯衍生物(II)或(IV),或其盐,
其中通式(I)
Figure A2004800075760002C1
(R表示羟基或氨基,R1和R2相同或不同,各自独立表示氢或低级烷基)
通式(II)
Figure A2004800075760003C1
(R、R1和R2分别和上述相同)
式(IV)
Figure A2004800075760003C2
(R、R1和R2分别和上述相同)。
7.D-泛解酸内酯衍生物或其盐的制造方法,其特征是,用上述通式(I)所示化合物或其盐接触选自权利要求1~4中任一项记载的产生内酯酶的转化子的培养物、细胞、细胞处理物或固定化菌体、由该转化子得到的重组内酯酶和固定化重组内酯酶,制造上述通式(IV)所示的光学活性化合物或其盐,然后采用公知的方法或与之等价的方法或其改变的方法,使用通式(IV)所示的光学活性化合物或其盐制造选自包括泛酸、泛酸钙、泛醇、泛酰巯基乙胺、泛酰乙基醚、双泛酰硫乙胺等的D-泛解酸内酯衍生物或其盐。
8.DNA的应用,其特征是,该DNA选自下述DNA,在制造通式(IV)所示的化合物、包括泛酸、泛酸钙、泛醇、泛酰巯基乙胺、双泛酰硫乙胺等的D-泛解酸内酯衍生物或其盐时,从权利要求1~4中任一项记载的产生内酯酶的转化子的培养物、细胞、细胞处理物和固定化菌体、由该转化子得到的重组内酯酶和固定化的重组内酯酶中的DNA、或(1)以含有编码内酯酶信号肽区域序列为特征的DNA;(2)(a)编码全长内酯酶的DNA序列和(b)以含有编码该内酯酶和该内酯酶的NH2末端信号肽区域DNA为特征的DNA;和(3)以含有(a)编码全长内酯酶的cDNA序列(i)、或染色体基因DNA序列(ii)和(b)编码该内酯酶的NH2末端信号肽区域的DNA序列的DNA。
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