WO2004078951A1 - ラクトナーゼの製法およびその利用 - Google Patents

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WO2004078951A1
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lactonase
producing
transformant
sequence
recombinant
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PCT/JP2004/002643
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Sakayu Shimizu
Michihiko Kataoka
Keiji Sakamoto
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Daiichi Fine Chemical Co., Ltd.
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a lactonase having D-pantolactone hydrolase activity.
  • the present invention relates to the expression and secretory production of lactase having D-pantolactone hydrolase activity in microorganisms.
  • the present invention also relates to a method for producing the optically active ⁇ -lactone and its related compounds using the enzyme and a system for producing the enzyme.
  • D-pantolactone is known as an intermediate in the production of D-pantothenic acid, D-panthenol, and pantethine. These are useful as medically or physiologically important vitamins, as pharmaceuticals, food additives, feed additives, and cosmetic ingredients.
  • D pantolactone is produced by optically resolving chemically synthesized D and leptolactone.
  • this method requires expensive resolving agents such as quinine and pulsin, and has drawbacks such as difficulty in recovering D-pantolactone.
  • the present inventors have presented the optical resolution method by enzymatic asymmetric hydrolysis of D, L pantolactone in Patent Document 1 and Patent Document 2.
  • Patent Document 3 International publication pamphlet ffO, A, 97/10341 Disclosure of the invention
  • the enzyme produced by a transformant obtained using Escherichia coli or the like has no sugar chain added, has a smaller molecular weight than the natural type (wild type), and lacks stability. Was required.
  • An object of the present invention is to produce a system for efficiently producing an enzyme using natural lactonase gene and having excellent productivity. Further, the present invention further provides an optical activity that is more efficient and more productive by using the enzyme and a system for producing the enzyme. '-In building a lactone production system.
  • D-pantolactone hydrolase (hereinafter referred to as "lactonase") having D-pantolactone hydrolase activity, especially lactonase cloned and identified from Fusarium oxysporum, is results of the analysis of Yadenko includes five intron: 53 by chromosomal gene consisting of the base pairs are co one de, enzyme twenty Ryo consisting amino acid residue NH 2 -terminal signal base peptide
  • the mature enzyme encoded by cMA complementary to mMA transcribed from the chromosomal gene is a protein consisting of 380 amino acids.
  • wild type is the one with a sugar chain added.
  • the present inventors have conducted intensive studies to develop a system in which a sugar chain is added even to a recombinant enzyme, and as a result, a gene sequence encoding the lactonase gene with a signal peptide
  • the enzyme was introduced into a host cell and expressed, whereby large-scale expression of the enzyme to which a natural type sugar chain was added was successful, and the present invention was completed.
  • the signal peptide region is an amino acid sequence consisting of the -20th to 11th amino acids of SEQ ID NO: 9 or a partial sequence thereof, or an Alp signal peptide region;
  • a lactonase-producing transformant according to any one of [1] to [4] above is cultured to produce recombinant lactonase, and the obtained recombinant lactonase is obtained.
  • R 1 and B 2 are the same or different and each independently represents hydrogen or a lower alkyl group.
  • a lactonase-producing transformant which has been introduced with lactonase having D-pantolactone hydrolase activity and DNA encoding a signal peptide region, or a vector into which the lactase has been inserted;
  • the vector is characterized in that one or more of the Enhancer sequences on the Aspergillus oryzae darcosidase gene (agdA) motor are introduced into a promoter region that functions in filamentous fungi.
  • the lactonase-producing transformant according to any one of the above [1] to [4] and [7] to [9];
  • the vector has a marker gene suitable for selecting a transformant of a host filamentous fungus, has a terminator, has a DM region capable of replicating in Escherichia coli, and has a polypeptide in a filamentous fungus.
  • the lactonase-producing transformant according to any one of the above [7] to [12], which is an expression plasmid;
  • the nitrile reductase gene derived from a filamentous fungus The lactonase-producing transformant of the above-mentioned [13], which is a translase gene, a tryptophan synthase gene, or an acetoamidase gene;
  • signal peptide region is an amino acid sequence comprising the -20th to 11th amino acids of SEQ ID NO: 9 in the sequence listing or a Fusarium filamentous fungus Alp signal peptide region.
  • R represents a hydroxyl group or an amino group
  • R 1 and ⁇ 2 are the same or different and each independently represents hydrogen or a lower alkyl group.
  • a salt thereof according to the above [1] to [4] and a culture of the lactonase-producing transformant according to any one of [7] to [24], a cell thereof, a cell processed product thereof, or an immobilized bacterial cell, or a recombinant obtained from the transformant Contacting with a member selected from the group consisting of lactone and immobilized recombinant lactonase, unreacted general formula (II)
  • R represents a hydroxyl group or an amino group
  • R 1 and R 2 are the same or different and each independently represents hydrogen or a lower alkyl group.
  • R, R 1 and R 2 are the same as defined above, or a salt thereof, which is represented by the general formula (IV)
  • a DM comprising a sequence encoding a lactonase and a signal peptide region
  • the present invention provides a method comprising:
  • the lactonase-producing transformant according to any one of (1) to (4), (7) to (24), (30), and (31) is immobilized. Immobilized cells;
  • the recombinant lactonase obtained from the lactonase-producing transformant according to any one of [1] to [7, [7] to [24], [30], and [31] is immobilized.
  • the invention relates to
  • the invention's effect Selected from the group consisting of cultures of lactonase-producing transformants, their cells, cell-treated products, or immobilized cells, recombinant lactonase obtained from the transformants, and immobilized recombinant lactonase Or the use of the MA according to any one of the above [27] to [29].
  • the present invention provides a technology for utilizing a natural lactonase gene to produce a system for producing the enzyme efficiently and with excellent productivity.
  • the present invention enables the construction of an optically active 7-lactone production system that is efficient and more productive using the enzyme and a system that produces the enzyme.
  • an expensive resolving agent is not required, and it is suitable for industrial production with a simple operation, has no environmental problems, is useful as a pharmaceutical intermediate in an efficient manner, and is useful for amino acids and pantothenic acid.
  • Optically active 7-lactone derivatives as starting materials can be produced.
  • a method for easily and industrially producing an optically active ⁇ -lactone derivative is provided.
  • D-pantolactone and its derivatives for example, pantothenic acid, calcium pantothenate, panthenol, pantethine, coenzyme A (CoA), pantothenyleethyl ether, pantethine or a salt thereof are efficiently and economically excellent. Can be manufactured.
  • FIG. 1 shows an electrophoresis photograph of the result of examining the expression of a foreign lactonase gene in A. oryzae.
  • Lane 1 shows a gel stained with Coomassie Brilliant Blue for proteins separated by electrophoresis.
  • Lane 1 has molecular weight (Daiichi Chemicals, Tokyo, Japan): phosphorylase b (97 kDa), pericyserum albumin (66 ld) a), aldolase U2 kDa), and carbonic anhydrase (30 kDa) ) 0
  • Lane 2 is Serufuri one extract of A. oryzae transformed with pMN_PC
  • Lane 3 is Serufuri one extract of A. oryzae transformed with PMN XG. 25, u is applied to each Lane.
  • Lane 4 is purified lactonase obtained from F. oxysporum. 0.5 is applied.
  • Lane 1 is a molecular g marker iprestained SDS-PAGE standards low range, Bio-ad, Hercules, USA J: Phosphorylase b (97 kDa), Pserum serum albumin (66 kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic Anhydrase (31 kDa), trypsin inhibitor (22 kDa).
  • Figure 2 shows the asymmetric hydrolysis of racemic pantolactone using F. oxysporum and recombinant A. oryzae. The result of decomposition is shown.
  • A shows the results using the wet cells
  • B shows the results using the immobilized cells.
  • White circles are A. oryzae transformed with pNAN-PC, black circles are / L oryzae transformed with pMN-XG, and white squares are F. oxysporum.
  • FIG. 3 shows the structure of a plasmid for secretion expression of lactonase.
  • the fusion gene was constructed by combining PCE, cut with Sal I and Xbal, and subcloned into Bluescript II SK +.
  • FIG. 4 shows an electrophoresis (SDS-PAGE) photograph of lactonase secreted by an Ac. Chrysogenum transformant. Uses 10% polyacrylamide gel.
  • Lane 1 was purified wild-type lactonase obtained from F. oxysporum (0.5, Lane 2 was Ac. Chrysogenum (containing 3 g protein) transformed with pAlpS, Lane 3 was transformed with pLacS
  • Lane 4 shows the molecular weight markers: phosphorylase b (97 ld) a), Pseudoplasmic serum alpmin (66 kDa octaldolase (42 kDa), and carbonic acid). Hydraulase (30 kDa) 0
  • FIG. 5 shows an electrophoresis (SDS-PAGE) photograph of lactonase that has been subjected to sugar chain cleavage.
  • Purified recombinant lactonase (Lane 8-11) from Ac. Chrysogenum transformed with wild-type lactonase (Lane 2-5) and pAlpS was treated with EndoH £ and treated with 10% polylactone. It was electrophoresed on an acrylamide gel (0.8 g per lane).
  • Lane 2 and Lane 8 are for 1 minute sugar chain cleavage
  • Lane 3 and Lane 9 are for 5 minute sugar chain cleavage
  • Lane 4 and Lane 10 are for 15 minute sugar chain cleavage
  • Lane 5 and Lane 11 Is a sugar chain cleavage treatment for 60 minutes.
  • Lane 1 and Lane 7 show the wild-type lactonase and the recombinant lactonase that have not been subjected to glycolytic cleavage.
  • Lane 6 is a mole
  • FIG. 6 shows the results of asymmetric hydrolysis of racemic pantolactone by the immobilized enzyme.
  • the ratio of D- and pantoic acid was determined by HPLC. Black circles indicate D-pantoic acid, white circles indicate L-pantoic acid, and white squares indicate DL-pantolactone (racemic pantolactone).
  • FIG. 7 shows the nucleotide sequence of chromosomal DNA (genomic gene) encoding a lactase derived from a filamentous fungus of the genus Fusarium.
  • the sequence of the 20 amino acid residues at the NH 2 -terminal (base sequence of 1 to 60) is shaded in the signal peptide region.
  • the five introns are shown in lower case letters, the predicted N-glycosylated asparagine residues are diamond-marked, and the relevant stop codons are shown with an asterisk. .
  • a lactonase enzyme having a natural D-pantolactone hydrolytic activity for example, a wild-type (natural) lactonase derived from Fusarium oxysporum ( ⁇ pantolactone hydrolase) or an activity substantially equivalent thereto
  • the present invention provides a recombinant expression technology of a gene encoding a protein having Preparation, culture and propagation of host cells transformed with MA containing the base sequence encoding the lactonase, production of the protein using the host cell, and further uses of the protein and the host cell.
  • the present invention provides various useful means utilizing the gene encoding the above lactonase.
  • D-pantolactone which is more efficient and more productive is provided.
  • a production system is provided.
  • the present invention D, L-Pantoraku in tons D - relates Raku Tonaze characterized by having a body selectively asymmetric hydrolysis allowed to activity, click ⁇ Ra contain NH 2 -terminal signal peptide region Tonaze
  • the resulting transformant When transformed using a gene encoding the full length, the resulting transformant not only expresses and produces a recombinant enzyme having a molecular weight almost equal to the wild-type enzyme, but also has a stable enzyme activity.
  • the technology utilizes knowledge that is satisfactory in the field of lactonase. By using recombinant technology, it is possible to obtain transformed cells that retain higher catalytic activity and stable enzyme activity.
  • the present invention provides a technique for expression and secretory production of lactonase having activity as a D-pantolactone hydrolase in a microorganism.
  • a gene encoding the full length lactonase
  • the gene is introduced into a filamentous fungus, for example, a bacterium such as Aspergillus or Acremonium, in a form containing an N-terminal signal peptide region, the resulting transformant is added with a sugar chain having the same molecular weight as the wild-type enzyme.
  • the enzyme has better enzyme stability than an enzyme that does not undergo glycosylation, and furthermore, the transformant A.
  • the oryzae strain also improved the hydrolysis rate compared to Fusarium oxysporum.
  • Ac. Chrysogenum platform ratatonase can be secreted in large amounts outside the cells, and DL-pantolactone hydrolysis at the enzyme level (crude, purified or immobilized enzyme) is possible.
  • the gene recombination technology used in the present invention is described in, for example, T.
  • the PCK method involves repeating a cycle of performing primer extension synthesis using two oligonucleotide primers that can preferentially hybridize with a type I nucleic acid.
  • a primer complementary to the nucleotide sequence to be amplified inside Type I can be used.
  • Those that are complementary at both ends or adjacent to the nucleotide sequence to be amplified can be preferably used.
  • the 5'-end primer should contain at least a start codon, or be selected so that it can be amplified including the start codon, and the 3'-end primer contains at least a stop codon Alternatively, it is preferable to select so as to enable amplification including the stop codon.
  • Primers include oligonucleotides consisting of preferably 5 or more bases, more preferably 10 or more bases, more preferably: oligonucleotides consisting of 18 to 25 bases.
  • the PCR reaction can be performed by a method known in the art or a method substantially similar to or a modification thereof.
  • a method known in the art for example, R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et. , Science, 239: 487, 1988; HA Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989; DM Glover et al. ed., "MA Cloning", 2nd ed., Vol. Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); MA Innis et al. Ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); MJ McPherson, P.
  • PCR a practical approach, IEL Press, Oxford (.1991); MA Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988), etc.
  • the method can be carried out according to the method described in, or by modifying or modifying the method.
  • the PCR method can be performed using a commercially available kit suitable for the PCR, and can also be performed according to a protocol specified by a kit manufacturer or kit distributor.
  • ⁇ oligonucleotide J '' is a relatively short single-stranded or double-stranded polynucleotide, preferably a polydeoxynucleotide, and Angew. Chem. Int. Ed. , Vol. 28, p. 716-734 (1989), such as the phosphotriester method, the phosphodiester method, the phosphite method, the phosphoramidite 'method, the phosphoramidite method, and the like. It can be chemically synthesized by a method such as the phonate method, etc. Usually, it is known that synthesis can be conveniently performed on a modified solid support.
  • the oligonucleotide may contain one or more modified bases, such as those commonly found in nature such as inosine. It may contain no bases or tritylated bases, and in some cases, may contain a base with a marker.
  • a hybridization technique may be used. The hybridization can be performed by the method described in the literature that discloses the above-mentioned “gene recombination technique”, or a method substantially similar to or a modification thereof.
  • Hydride is a method in which a sample containing nucleic acid such as MA is transferred to a carrier including a membrane such as a nylon filter, and then subjected to denaturation treatment, immobilization treatment, washing treatment, etc. as necessary.
  • the reaction is carried out by reacting the DNA transcribed on the carrier (for example, a membrane) with a denatured labeled probe DNA fragment, if necessary, in a hybridization buffer.
  • the hybridization process is usually performed at about 35 to about 80 ° C, more preferably about 50 to about 65 ° C, for about 15 minutes to about 36 hours, more preferably about 1 to about 24 hours.
  • the optimal conditions can be selected appropriately.
  • the hybridization treatment is performed at about 55 ° C. for about 18 hours.
  • the buffer for the hybridization can be selected from those commonly used in this field, and for example, Kapid hybridization buffer (Amersham) or the like can be used.
  • Examples of denaturation treatment of the transferred carrier include a method using an alkali denaturing solution, and after the treatment, treatment with a neutralizing solution or a buffer is preferable.
  • the immobilization treatment of the carrier is usually performed at about 40 to about 100, more preferably at about 70 to about 90 ° C, for about 15 minutes to about 24 hours, more preferably at about 1 hour. It is carried out by baking for about 4 hours, but it can be carried out by appropriately selecting preferable conditions. For example, immobilization is performed by baking a carrier such as a filter at about 80 ° C for about 2 hours.
  • Washing of the transferred carrier includes washing solutions commonly used in the art, for example, 50 mM Ti'is-HC1 containing 1 M NaCl, ImM EDTA and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS). It can be performed by washing with a buffer solution, pH 8.0 or the like.
  • the carrier including the membrane such as a nylon filter can be selected from those commonly used in this field.
  • alkali denaturing solution, neutralizing solution and buffer solution those commonly used in the art can be selected and used. Examples of the alkali denaturing solution include 0.5M NaOH and 1.5M NaCl.
  • the neutralizing solution includes, for example, a 1.5 M NaCl-containing 0.5 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, and the like.
  • X SSPE (0. 36M NaCl, 20mM NaH 2 P0 4 and 2 ⁇ EDTA) and the like.
  • the transferred carrier for example, a membrane
  • a prehybridization treatment if necessary, in order to prevent a nonspecific hybridization reaction.
  • This pre-hybridization treatment is performed, for example, using a pre-hybridization solution [50% formamide, 5 x Denhardfs solution (0.2% ⁇ serum alumin, 0.2% polyvinyl pyrrolidone), 5 x SSPE, 0.1% SDS ⁇ 100 ⁇ g / ml heat-denatured salmon sperm A], etc., at about 35 to about 50 ° C, preferably about 42 ° C, for about 4 to about 24 hours, preferably about 6
  • the reaction can be carried out for about 8 hours, but such conditions can be determined by those skilled in the art by repeating appropriate experiments.
  • the denaturation of the NA fragment may be carried out, for example, by heating at about 70 to about 100 ° C, preferably about 100 ° C, for about 1 to about 60 minutes, preferably for about 5 minutes. Can be done.
  • the high The blidization can be carried out by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the stringent condition is, for example, about 15 to about 50 mM, preferably about 19 to About 40 mM, more preferably about 19 to about 20 mM, and the temperature is about 35 to about 85 ° C, preferably about 50 to about 70 ° C, more preferably about 60 to about 65 ° C.
  • the washing treatment of the carrier such as a filter can be performed by selecting from those commonly used in the field, for example, 0.1% SDS containing 0.5 X SSC (0.15M NaCl, It can be carried out by washing with a solution.
  • the hybridized nucleic acid can be typically detected by autoradiography, but can be appropriately selected from methods used in the art and used for the detection.
  • a suitable buffer for example, SM solution (lOOmM NaCl and 10 mM MgSO 4 containing 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7. 5) was suspended in like, then moderate the suspension
  • SM solution lOOmM NaCl and 10 mM MgSO 4 containing 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5
  • the desired nucleic acid can be isolated, purified, and subjected to further amplification.
  • the screening of the target nucleic acid from the nucleic acid sample including the gene library and the cDNA library by the hybridization treatment can be performed repeatedly.
  • the lactonase used in the present invention is, for example, Fusarium sp. Genus Ndrocarbone, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volterra, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Mio Cesium, Neirosbora, Acremonium Or a microorganism belonging to the genus Tuberculina, the genus Absizia, the genus Sporostrix, the genus Verti-Silium or the genus Arsloderma.
  • Representative examples include, for example, Fusarium oxysporum IF0 5942, Fusarium-Semictatum IF0 30200, Silindrocarbon Tonkinens IF0 30561, Zipperella fuzicroi IF0 6349, Aspergillus oryzae ATCC 91002, Alpergillus olisperifos Chrysogenum IF0 4266, Rhizopus oryzae IF0 4706, Volterra Buxi IF0 6003, Gliocladium 'force tenuratam IF0 6121, ⁇ urotim' Chevalier IF0 4334, Nexus 0187. Komune IF0 4928, MI ROCESIUM.
  • the gene encoding the lactonase used in the present invention can be obtained by using a gene recombination technique according to TO, A, 97/10341; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 12787-92, 1998. Can be obtained.
  • the cultured Fusarium oxysporum cells are disrupted, the chromosome DM is centrifuged by a conventional method, A is decomposed and removed, and the protein is removed to purify the MA component.
  • the whole ENA was extracted from the disrupted cells according to the method, and then purified using an appropriate method, for example, using an oligo dT cellulose column to purify ml-NA.
  • CDNA may be synthesized using a transcriptase (reverse transcriptase) or the like.
  • it can be obtained by the PCE method and the reverse transcription PCR (polymerase chain reaction coupled reverse transcription; RT-PCR) method using an already constructed gene library and an appropriate primer. It can also be obtained by using the already obtained lactone gene as a probe. Labeling of a probe or the like with a radioisotope can be performed using a commercially available labeling kit, for example, a random prime MA labeling kit (Boehringer Mannheim).
  • random - priming kit (Pharmacia LKB, Inc., Uppsala) using such an MA probe [a - 3 2 P] dCTP (Amersham Co.) was labeled with a, it is possible to obtain a probe with radioactivity.
  • a phage particle, a recombinant plasmid, a recombinant vector, etc. having a predetermined nucleic acid can be purified and separated by a method commonly used in the relevant field. For example, glycerol gradient ultracentrifugation It can be purified by a separation method (Molecular Cloning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed.
  • the DM in the manner commonly used in the art can isolate made fine, for example, resulting phage TM solution (10 mM MgSO 4 containing 50 mM T ris-HCl buffer, pH 7 8), treat with Mase I and RNase A, add 20mM EDTA, 50 ⁇ g / ml Proteinase and 0.5,% 'SDS mixed solution, etc., about 65 ° C ⁇ about 1 hour After keeping it warm, it was extracted with phenol and extracted with getyl ether, and precipitated by ethanol precipitation. Then, the obtained DM was washed with 70% ethanol and dried, and then TE solution (10 mM EDTA containing 10 mM EDTA) was added.
  • the desired DM can also be obtained in large quantities by subcloning or the like.
  • subcloning can be performed using Escherichia coli as a host and a plasmid vector.
  • DM obtained by such subcloning can be purified and separated by methods such as centrifugation, phenol extraction, and ethanol precipitation in the same manner as described above.
  • the nucleotide sequence can be determined using the Didoxy method, for example, the MaxanrGilbert method, such as the M13 Didoxy method, but a commercially available sequencing kit, for example, a Taq die primer cycle sequencing kit, etc. Or an automatic base sequencer, for example, a fluorescent DM sequencer.
  • a nucleic acid is a nucleic acid such as a single-stranded DM, a double-stranded A, RNA, DNA: RNA hybrid, or synthetic DNA, and a genomic M (chromosomal gene MA), genomic
  • the DNA may be any of a DNA library, cDM, and synthetic MA.
  • the base sequence of the nucleic acid can be modified (eg, added, removed, substituted, etc.), and such modifications can be included.
  • the nucleic acid may encode the peptide described in the present invention or a part thereof, and preferred is DNA. Nucleic acids can also be obtained by chemical synthesis. In such a case, the fragments may be chemically synthesized and ligated with an enzyme.
  • the obtained nucleic acid such as a PCR product (including MA) is usually cut out from the gel as a specific band by subjecting the gel to gel electrophoresis, for example, gene clean kit (Bio101). Extract using a commercially available extraction kit such as).
  • the extracted DM is cleaved with an appropriate restriction enzyme, purified if necessary, and further, if necessary, phosphorylated at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase, etc., and then pUC-based such as pUC18.
  • Ligation into a suitable plasmid vector, such as a vector is used to transform suitable competent cells.
  • the cloned PCR product may be analyzed for its nucleotide sequence.
  • Plasmid vectors can be used.
  • Plasmid vectors calcium method, rubidium / calcium method, calcium / manganese method, high-efficiency TFB method, FSB freezing cell method, rapid colony method, It can be carried out by a method known in the art such as electroporation or a method substantially similar thereto. Hanahan, J. Mol. Biol., 166: 557, 1983).
  • a codon suitable for expression in a selected host cell can be introduced, or a restriction enzyme site can be provided.
  • control sequences and facilitating sequences to facilitate expression of the target gene It can control linkers, adapters, etc., as well as antibiotic resistance and metabolism, and can contain sequences useful for selection and the like.
  • Plasmid vectors suitable for expression in E. coli also include pAS, pKK223 (Pharmacia), pMC1403, pMC931, pKC30, and the like.
  • the host cell in the case of Escherichia coli, for example, those derived from Escherichia coli K12 strain can be mentioned.
  • a restriction enzyme, reverse transcriptase, or an enzyme for modifying or converting a DM fragment into a structure suitable for cloning is known or widely used in the art.
  • Certain DM modification / degrading enzymes, DM polymerase, terminal nucleotidyltransferase, DNA ligase, and the like can be used.
  • the lactase may be expressed as a fusion protein and converted and processed into a substance having substantially the same biological activity as the wild-type enzyme in vivo or in vitro. .
  • a fusion production method commonly used in genetic engineering can be used, and such a fusion protein can be purified by affinity chromatography using the fusion portion.
  • Modification and alteration of the protein structure should be performed by methods widely known in the art, such as by using site-directed mutagenesis (site-directed mutagenesis) using synthetic oligonucleotides, etc., or by using PCBs. Can be.
  • a DM encoding the lactonase and the signal peptide is constructed and suitably used to prepare a transformant expressing the lactonase.
  • the MA encoding the lactose a MA derived from a filamentous fungus of the genus Fusarium can be suitably used. It shall recombinant Lac Tonaze expression nucleotide sequence for utilization in the present invention, for example having a DM sequence NH 2 -terminal signal peptide region co one de the A array and the ease Tonaze encoding easy Tonaze full length .
  • recombinant easy Tonaze expression for nucleotide sequences (a) Fusarium fungi from La click toner Ichize cMA sequence or chromosomal gene encoding the full length]) NH 2 terminal signal base peptide of M sequence and the Lac Tonaze It may contain a MA sequence encoding the region.
  • the sequence having the Fusarium-derived filamentous lactase and a sequence encoding a signal peptide region can be incorporated into an appropriate expression vector.
  • Examples of the expression vector include one having one or more of the Enhansa mononucleotide sequence of a filamentous fungus, and a promoter for expression of an alkaline protease (Alp) produced by a filamentous fungus of the genus Fusarium (FusariuDi).
  • Alpha alkaline protease
  • One having a single region one having one or more of the Enhansa single nucleotide sequence of a filamentous fungus introduced into a region of a promoter that functions in the filamentous fungus, and a signal peptide region having a signal sequence region related to secretion of the Alp or the same.
  • Those that can be configured to be a signal sequence region of tonase are included.
  • Expression vectors suitable for expression in filamentous fungi include those having an enhancer sequence on the ⁇ -glucosidase gene (agdA) promoter of Aspergillus oryzae and a promoter region.
  • the promoter for introducing the enhancer sequence is not particularly limited as long as it functions in a filamentous fungus. Specific examples thereof include ⁇ -amylase, glucoamylase, ⁇ -glucosidase, and protease.
  • Suitable promoters can be isolated from Aspergillus ⁇ -amylase, glucoamylase, and ⁇ -darcosidase genes. More preferably, the promoter of the ⁇ -glucosidase gene of Aspergillus oryzae is used.
  • an expression plasmid that can be suitably used in the present invention includes a promoter that functions in an improved filamentous fungus as described above, and a terminator, which is suitable for selection of a host transformant. It has a single gene and a DM region that can be replicated in E. coli.
  • the introduction site of the promoter of the enhancer sequence is not particularly limited as long as it is a promoter region.
  • the evening terminator is not particularly limited as long as it functions in a filamentous fungus.
  • a terminator of Aspergillus oryzae-glucosidase gene or a terminator containing a partial sequence thereof is more preferably used.
  • Preferred selection markers include the genes for nitrate reductase (niaD), orditin rubamoyltransferase (argB), tryptophan synthase (trp, acetate amidase (amdS)).
  • a suitable selection marker gene is the nitrate reductase gene (niaD), which expresses the present invention using a restriction enzyme recognition site provided between the promoter and terminator.
  • a DNA fragment encoding the desired protein to be used is introduced.
  • expression vectors suitable for use include those disclosed in, for example, JP-A-09-9968 and JP-A-5-268972.
  • plasmids pNLH2, pNAN8142, etc. can be preferably used.
  • synthetic MA may be used as the adapter DNA, and any synthetic MA may be used as long as the frames of both genes match and the activity of the gene of interest is not lost.
  • Expression of the target gene using thease gene promoter and the translation initiation site and a no or secretion signal is performed by preparing a fusion gene so that the frame of the target gene matches the site of the target gene.
  • the target substance can be secreted and produced outside the cells, as long as the function of the promoter is not lost. May delete some of the DM fragments, and may alter the function of the promoter and translation initiation site, eg, For example, even if the DNA base sequence of the region including the promoter and the translation initiation site is modified so that the expression power is increased, it can be conveniently used, and the region not related to the functions of the promoter and the translation initiation site can be used.
  • the host for introducing the target gene constructed as described above can be used as long as the organism operates and expresses the gene.
  • a representative host may be appropriately selected from eukaryotes such as yeasts, filamentous fungi, and plants.
  • eukaryotes such as yeasts, filamentous fungi, and plants.
  • Representative examples include, for example, Fusarium Oxysporum IF0 5942, Fusarium Semitectum IF0 30200, Cylindrocarbon Tonkinens IF0 30561, Giperera phujikuroi IF0 6349, Aspergillus oryzae ATCC 91002, Alpergillus sulzer 5 Armory IF0 4033, Penicillium Krysogenum IF04626, Rhizopus Oryzae IF04706, Volterra Buxi IF0 6003, Gliocladium 'Catenumratum IF0 6121, Eurotium Shevalier IF0 4334, Nexus 0 G7 Lam Komune IF0 4928, Milosecium Mouth Redam IF0 9531, Neurosbora Classa IF0 6067, Acremonium Fucidioides IF06813, Hubbell Clinna Persicina IF0 6464, Absizia Rihisei Mi IF0 4009,
  • any organism can be used as long as the gene operates and expresses.
  • it is appropriately selected from eukaryotic microorganisms such as yeasts and filamentous fungi.
  • yeast include bacteria of the genus Saccharomyces, genus Schizosaccharomyces, and genus Pichia.
  • +)-calomyces Selechi-> (.Saccharomyces cerevisiaeJ ⁇ Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris (Pichia pastoris), etc.
  • the filamentous fungi include the genus Acremonium, Aspergillus sperg Genus, Fusarium genus, Penicillium genus, Mucor genus, Neurospora genus, Trichoderma genus and the like.
  • Transformation methods for introducing a gene into these hosts include, for example, protoplast transformation method, etc.
  • protoplast cells prepared using an appropriate cell wall lysing enzyme can be used to transform In the presence of calcium chloride, polyethylene dalicol, etc.
  • Transformation can be performed by, for example, contacting with M. Transformation methods include the electoral poration method (for example, E. Neumann et al.). al., " ⁇ ⁇ , Vol. 1, pp. 841 (1982), etc.) Microphone port Print We transfection method, and a method of implanting a gene gun.
  • the fusion gene may be inserted into a plasmid having a gene for an appropriate selection marker that functions in the host, and then the host may be transformed with the plasmid.
  • Any gene can be used as the selectable marker-transmitting gene as long as it can selectively separate transformed cells. Typical examples include a hygromycin B resistance gene.
  • the host must use a strain that does not have a functional gene for the selected selection force.
  • Various conditions for culturing the transformed cells obtained by the present invention vary depending on the type of cells such as the strain used, but generally, as for the medium, the transformed cells are assimilated or assimilated. A medium containing a carbon source, a nitrogen source, and the like that can be used.
  • the carbon source may be any as long as the transformed cell can assimilate or assimilate the cells, for example, glucose, sucrose, starch, soluble starch, dextrin, etc. Saccharides, paraffins, etc., and organic acids such as acetic acid, citric acid, butyric acid, fumaric acid, and benzoic acid; alcohol amounts such as methanol, ethanol, butanol, and glycerin; oleic acid; and stearic acid. And their esters, and oils and fats such as soybean oil, rapeseed oil, lard oil and the like, and these can be used alone or in combination.
  • ammonium salts such as ammonium sulfate and ammonium nitrate, nitrates such as sodium nitrate and potassium nitrate, urea, peptone, and casamino.
  • Acid corn stay Corn gluten meal, bran, yeast extract, dried yeast, soybean flour, cottonseed flour, meat extract, other organic or inorganic nitrogen-containing substances, etc., which can be used alone or in combination .
  • Nutrients such as inorganic salts, minerals, vitamins, and trace metal salts can be optionally added to the medium.
  • inorganic salts examples include magnesium sulfate, sodium chloride, calcium carbonate, phosphates such as potassium hydrogen phosphate and potassium hydrogen phosphate, and manganese salts. Extracts and the like are also included. In addition, those commonly used in the relevant field can be appropriately selected and used.
  • the culture time is usually about 1 to 20 days, preferably about 3 to 14 days, and more preferably about 3 to 14 days. In about 10 days, the culture is performed at pH 3-9 of the medium, at the culture temperature of 10-50 ° C.
  • Enzymes produced by the transformed cells obtained in the present invention can be obtained from various known materials, for example, enzyme-producing materials such as transformed cells, including cell culture solutions and cell culture crushed products, by methods known in the art. Can be obtained according to For example, when accumulated in a medium, a supernatant containing the target substance is obtained by centrifugation or filtration.
  • the target substance accumulates in cells such as bacterial cells
  • the cells are collected by a known method such as centrifugation or filtration, and the cells are buffered with a protein denaturant such as guanidine hydrochloride. Suspended in a liquid, stirred in a cold place, and then centrifuged to obtain a supernatant containing the target protein, or after suspending the cells in a buffer, pulverizing with glass beads, French pressing, ultrasonic waves
  • a method in which cells are disrupted by treatment or enzyme treatment, and then a supernatant is obtained by centrifugation or the like is used as appropriate.
  • the target protein can be separated and purified from the supernatant by appropriately combining known separation and purification methods, for example, salting-out such as ammonium sulfate precipitation, or solvent such as using ethanol.
  • Precipitation method, gel filtration method using Sephadex, etc. for example, ion-exchange chromatography method using a carrier having a basic or acidic group such as getylaminoethyl group or carboxymethyl group, for example, butyl group, octyl group, phenyl group, etc.
  • solubilization treatment for example, treatment with a denaturing agent such as guanidine hydrochloride or urea and, if necessary, a reducing agent such as 2-mercaptoethanol or dithiothreitol It can also be used as an active enzyme.
  • a denaturing agent such as guanidine hydrochloride or urea
  • a reducing agent such as 2-mercaptoethanol or dithiothreitol
  • an enzyme-producing cell can be used as it is.
  • the immobilized enzyme include those in which an enzyme or an enzyme-producing cell is immobilized by a method known in the art. .
  • immobilization of microbial cells on an alginate gel can also be suitably used.
  • a condensing agent such as glutaraldehyde, hexamethylene diisothiocyanate, or hexamethylene diisothiocyanate can be used and immobilized as necessary.
  • a monomer method in which a monomer is gelled by a polymerization reaction a prepolymer method in which a molecule larger than a normal monomer is polymerized, a polymer method in which a polymer is gelated, and the like, are exemplified. Immobilization using natural polymers such as alginic acid, collagen, gelatin, agar, and Ichiragi ginnan, immobilization using synthetic polymers such as photocurable resins and urethane polymers And the like.
  • transformants cultured with shaking in a liquid medium are collected, and an aqueous solution of D, L-pantractone (2 to 60% concentration) is added to the obtained cells, and the temperature is adjusted to 6 to 8 while adjusting the pH to 6 to 8. Incubate at 10-40 ° C for several hours to one day. After completion of the reaction, the cells are separated, and unreacted L pantratatone in the reaction solution is converted into an organic solvent (esters such as ethyl acetate, aromatic hydrocarbons such as benzene, and halogenated compounds such as chloroform). (Preferably hydrocarbons and the like).
  • the D-pantoic acid remaining in the aqueous layer is lactonized by heating under acidic hydrochloric acid, and is produced by extraction with the above organic solvent! )-You can get Pantoracton.
  • a compound of the general formula (I) or a salt thereof is prepared by introducing a lactonase derived from a filamentous fungus belonging to the genus Fusarium and a lactonase into which DM encoding a signal peptide region or a vector into which the vector is inserted.
  • the transformant obtained as described above, in particular, the transformed microorganism is preferably used to selectively asymmetrically hydrolyze the compound of the general formula (I) in the R form.
  • it can be represented by the following reaction formula.
  • R represents a hydroxyl group or an amino group
  • E 1 and E 2 are the same or different, and each independently represents hydrogen or a lower alkyl group.
  • Examples of the lower alkyl group of E 1 and R 2 include linear or branched alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, t -Butyl group and the like.
  • R is a hydroxyl group and U 1 and E 2 are both methyl groups, in which case the racemic pantolactone of the general formula (I) or a salt thereof is Active pantolactone or a salt thereof, for example, D-pantolactone or a salt thereof of the general formula (IV), or L-pantolactone or a salt thereof of the general formula (II) can be produced.
  • the transformant to be used in particular, the transformed microorganism is treated with a culture obtained by culturing the strain in a liquid medium, a cell isolated from the culture solution, or a cell or culture. Any form such as a dried cell obtained by the above method or an immobilized cell can be used.
  • the enzyme isolated from the transformant may be a crude or purified enzyme, Any form such as a fixed one can be used.
  • the operation can be batch, semi-batch, or continuous.
  • the concentration of single rat used is usually between 10 and 500 g / L.
  • the reaction temperature is usually from 10 to 50 ° C, but is more preferably from 20 to 30 ° C.
  • the reaction time is usually several hours to one day for a batch system.
  • the pH of the reaction system is usually about 3 to 9, but is more preferably 6 to 8.
  • the inorganic salt for maintaining the pH a hydroxide or a carbonate of an alkali metal or an alkaline earth metal, as well as ammonia water and the like are used.
  • Organic solvents include halogenated hydrocarbons such as ethylene chloride, chloroform, and trichloroethane, aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene, ethers such as getyl ether, and 1-butylmethyl ether.
  • halogenated hydrocarbons such as ethylene chloride, chloroform, and trichloroethane
  • aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene
  • ethers such as getyl ether
  • 1-butylmethyl ether 1-butylmethyl ether.
  • ethyl acetate or the like is used, and more preferably, ethyl acetate.
  • Separation methods other than extraction include column chromatography and the like. It is also possible to separate the compound of the general formula (II) from the compound of the general formula (II) with water, an alcohol such as methanol or ethanol, or a mixture thereof, using a reversed phase column. It is.
  • the compound of the general formula (III) remaining in the reaction solution can be converted into the compound of the general formula (IV) by making it acidic as it is.
  • As the acid hydrochloric acid, sulfuric acid or the like is used, and sulfuric acid is more preferable.
  • the pH, the reaction temperature, and the reaction time may be set so that the compound of the general formula ( ⁇ ) can be converted into the compound of the general formula ( ⁇ ) by ring closure, but more preferably, the pH is 1 or more.
  • the reaction temperature is 80-130 and the reaction time is 1-6 hours.
  • the resulting compound of the general formula (IV) is recovered by extraction with an organic solvent.
  • the organic solvent used here is the same as the solvent used for the extraction of the compound of the general formula (II), as well as halogenated hydrocarbons such as ethylene chloride, chloroform and trichloroethane, benzene and toluene.
  • halogenated hydrocarbons such as ethylene chloride, chloroform and trichloroethane, benzene and toluene.
  • aromatic hydrocarbons such as acetylene
  • ethers such as dimethyl ether and t-butyl methyl ether, ethyl acetate and the like are used, and more preferably ethyl acetate. Recovery by column chromatography is also possible.
  • the compound of the general formula (II) remaining in the reaction solution is treated with an alkali metal hydroxide or carbonate, the reaction solution is distilled off under reduced pressure, and the dried product is recrystallized with a solvent. By doing so, it can be isolated as a metal salt of carboxylic acid.
  • hydroxides or carbonates of alkali metal used include lithium hydroxide, sodium hydroxide, sodium hydroxide, lithium carbonate, sodium carbonate, carbonated carbonate, and the like.
  • sodium hydroxide is used. It is.
  • methanol, ethanol, isopropanol, chloroform, and the like are used, and preferably, methanol is used.
  • D-pantolactone having high optical purity can be obtained in high yield.
  • D-pantolactone can be condensed with a Ca salt or ester of alanine in an alcoholic solvent to obtain calcium D-pantothenate.
  • D-pantolactone can be obtained in an organic solvent such as alcohol.
  • Condensed with alanine or its ester to form D-pantothenic acid After that, a method of reacting calcium compounds such as calcium carbonate (E. Stiller, et al., J. Am. Chem.
  • D-pantolactone is reacted with a-aminopropionitrile in an organic solvent such as alcohol to give D-pantothenitrile, and further added with cysteamine, and reacted to give 2- (2-D-pantoamidoethyl) -2.
  • -Thiazoline then hydrolyzed to D-pantethine, and then condensed in the presence of hydrogen peroxide to produce pantethine (M, Shimizu, et al., Chem. ⁇ harm. Bull., 13, 180 U965)).
  • D-pantothenic acid and / or a salt thereof, or D-panthenol can be efficiently obtained.
  • the present invention provides a simple and efficient method for producing an optically active arractone derivative useful as a pharmaceutical intermediate diamino acid derivative.
  • the terms are based on the meaning of the terms according to the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or as commonly used in the art. The meanings of typical terms are shown below.
  • Cystine N Asparagine (Asn)
  • G Glycine (Gly) S: Serine (Ser)
  • Aspergillus oryzae A. oryza e / pNAN-XG transformed with pNAN-XG described in Example 1 described below, 1-1-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki Prefecture since February 4, 2003 1 Chuo 6 (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan, former address notation: 1-3-1, Higashi Tsukuba, Ibaraki Prefecture) (Postal code 305) -8566) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (IP0D) (former name: Ministry of Economy, Trade and Industry) Research Institute (NIBH)) and deposited (Accession No.
  • IP0D International Patent Organism Depositary
  • Plasmid PFLC40E containing mature lactonase cDNA derived from Fusarium oxysporum (containing no N-terminal signal peptide and intron) was treated with the restriction enzymes EcoM and Xbal to isolate a fragment containing the lactone cDNA. After blunting this, the expression plasmid pNAN8142 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 09-9968, Biosci. Biotec nol. Biochem., 60: 383-389, 1996) was transferred to the PmaCI site downstream of the ⁇ - ⁇ 8142 promoter. And obtained pNAN-PC.
  • pNAN-XC introduced the sequence of the cMA and signal peptide of the lactonase gene, and was constructed as follows.
  • the whole was extracted from F. oxysporum by the AGPC method (method using phenol and guanidine thiocyanate) (kit name: IS0GEN, Futatsubon Gene).
  • AGPC method method using phenol and guanidine thiocyanate
  • a 1.3 kb MA fragment was amplified using the RT-PCR (a method of amplifying DNA from ENA using PCR) [Access RT-PCR System; Promega].
  • Two oligonucleotides, FusLacl (with Xhol cleavage sequence underlined) and FusLac2 (with Xbal cleavage sequence underlined) were used as primers.
  • PCR width conditions were in accordance with the instruction manual of the above kit.
  • the PCR product was purified by low melting point agarose gel, cut with restriction enzymes Xhol and Xbal, and then inserted into the same cleavage site of plasmid: PNAN8142.
  • the full-length lactonase gene on the genome was amplified from all DM of F. oxysporum using PCR with FusLacl and FusLac 2 as primers.
  • the amplified MA fragment is composed of the restriction enzymes Xhol and Xbal After cleavage with, plasmid: inserted into the similar cleavage site of PMN8142, this was designated as pMN-XG
  • the above plasmids were individually transformed into Aspergi llus oryzae (ATCC91002) and Aspergi llus oryzae niaD mutant AON-2 paco prepared by Unkles SE et al. (Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989). Lactonase activity was measured.
  • the method for measuring lactonase activity is as follows.
  • Transformants of pNAN-XG showed the highest lactonase activity (approximately 7.4 times that of F.030!), and NAN-XC also showed equivalent activity. In the body, the activity was one-fourth that of pMN-XG (Table 1).
  • the signal peptide Since only the pNAN_PC transformant without the addition of the signal peptide region produced a deglycosylated enzyme, the signal peptide is located in the ER where transglycosylation occurs after translation. It was considered necessary to be transported.
  • F. oxysporum and A. oryzae transformants (CpNAN-PC and pMN-XG) were reacted with a 35% DL-pantolactone solution while controlling the pH to 6.8 to 7.5.
  • the initial reaction rate was high, but the stability of the enzyme was poor, and the reaction hardly progressed after 2 hours.
  • the hydrolysis rate of DL-pantolactone was 8.523 ⁇ 4, which was lower than 14.6% of F. oxysporum (Fig. 2A).
  • the enzyme of the pNAN-XG transformant is pN It was more stable than the enzyme of the AN-PC transformant and the hydrolysis rate was 19.8 19 ..
  • the transformant was suspended in 1% sodium alginate and dropped into a 2% calcium chloride solution to immobilize the transformant.
  • the stability of both pNM-XG and pNM-PC transformants was improved, and the hydrolysis rate of DL-pantolactone was significantly improved.
  • the optical purity was 953 ⁇ 4e.e. Or higher.
  • the Alp promoter followed by the Alp signal peptide and propeptide were amplified by PCE using plasmid pNLH 2 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-268972) as type III.
  • the primers used are as follows.
  • Sense primer AlpPS (The underlined part is the synthesized Sail cleavage sequence)
  • Antisense primer AlpPA (underlined part anneals to a part of LacS primer).
  • LacS 5'-CATCAGCATCAACATGGCTAA6CTAAGCTTCCTTCTACG6CTC-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • the lactonase gene without the N-terminal signal peptide can be obtained by using ⁇ X-XG as a ⁇ type and using sense primer LacS (the underlined part anneals with a part of the AlpPA primer) and antisense primer FusLac2 (SEQ ID NO: 2). Amplified by PCR. Each PCB product was mixed, and the second PCE was performed using AlpPS and FusLac2 as primers. The obtained PCE fragment (2.3 kb) was cut with Sall and Xbal and introduced into pBluescript to construct lpS.
  • pLacS places the signal peptide of lactonase itself under the control of the Alp promoter and was also constructed using Combined PCE.
  • the Alp promoter was amplified by PCR using the primers AlpPS and AlpPA2 (underlined part anneals to a part of the LacS2 primer), and the full-length gene having the signal peptide of lactonase itself was primer LacS2; (The underlined part can be annealed with a part of the AlpAP2 primer.) Amplification was performed by PCR using the primer FusLac2.
  • a I pPA2 5'-T6GAAGAAGGCATCTT6TCAGGGAGTATGAAGGTTG-3 '[SEQ ID NO: 6]'
  • LacS2 5'-TACTCCCTGACAAGATGCCTTCTTCCTTTCTGTA-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • the above plasmids were individually transformed into Ac. Chrysogenum (ATCC11550).
  • the genomic MA of the transformant was designated as a prominent type, and the oligonucleotides at the 3 'and 5' end regions of the lactonase gene were used as primers.
  • PCE analysis was performed. When the PCB product was subjected to agarose gel electrophoresis, a 1.2 kb band corresponding to the lactonase gene was detected in about 80% of the 80 transformants tested.
  • Each transformant was pre-cultured at 28 ° C for 3 days in a medium containing 30 g Sucrose, 5 g DL-methionine, 32 g soy bean Hour, 1.5 g calcium carbonate (pH 6.8) per liter, and further cultured in 500 mL medium.
  • Main culture was performed at 28 ° C for 5 days at 120 strokes / min. Lactonase activity of the culture supernatant was measured. Lactonase activity was determined by reacting 0.5 mL of a reaction solution containing 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 7.4), 0.61 mM (80 mg) D-pantolactone and an appropriate amount of enzyme at 30 ° C for 15 minutes.
  • pantolactone and pantoic acid in the reaction solution were analyzed by HPLC. As a result, a large amount of lactonase was observed in the culture supernatant of the transformants of pAlpS and pLacS (Table 2).
  • end glycosidase that cleaves high mannose and hybrid oligosaccharides derived from N-linked glycoprotein was isolated from F. oxysporum and pAlpS transformants, respectively. After reacting with the purified enzyme for 1, 5, 15, and 60 minutes, SDS-PAGE was performed. Three different molecular weight bands of 60, 56, and 51 kDa were detected ( Figure 5), indicating that they had at least two N-linked glycosides.
  • the enzyme immobilized resin (15 g) and 35 mL (w / v) DL-pantolactone (75 mL) were reacted at 30 ° C. while maintaining the pH at 6.8 to 7.5 with gentle stirring. Asymmetric hydrolysis proceeded efficiently, and no by-product L-pantoic acid was detected (Fig. 6).
  • the hydrolysis rate increased to 40%, that is, the hydrolysis rate of the D-form increased to 80%, and reached 24% after 24 hours.

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Abstract

光学活性なパントラクトンなどのγ-ラクトン誘導体は医薬品などの有用物質の合成中間体としてその大量且つ安価な生産が求められている。この目的には、酵素的不斉加水分解を行う酵素ラクトナーゼを利用する技術が優れているが、その酵素の調製や該酵素産生微生物の利用には依然として問題点がある。組換え技術による場合も、十分な且つ安定した酵素活性を得ることが困難である。ラセミパントラクトンなどのγ-ラクトン誘導体を選択的に不斉加水分解するラクトナーゼを組換え技術で産生させるにあたり、成熟ラクトナーゼDNAとシグナルペプチド領域DNAとの両方を宿主に導入することで、天然のラクトナーゼに劣らない安定性ある活性を得ることができ、高い酵素活性を持ち且つそれを安定的に保持する形質転換を得ることができ、効率的且つ工業上有利なγ-ラクトン誘導体の不斉合成が可能となる。

Description

明 細 書
ラク トナーゼの製法およびその利用 技術分野
本発明は、 D -パントラク トン加水分解酵素活性を有するラク トナーゼの製法に関する。 本発明は、 D-パントラク トン加水分解酵素活性を有するラク トナーゼの微生物での発現及 び分泌生産に関する。 また、 本発明は、 該酵素および該酵素を生産するシステムを用いた 光学活性 Ύ - ラク トン及びその関連化合物の製法に関する。 背景技術
D-パントラク トンは D -パントテン酸、 D-パンテノール、 パンテチンの製造における中間 体として知られている。 これらは医学上または生理学上重要なビタミ ンとして医薬品の他 、 食品添加物、 飼料添加物の他、 化粧品原料としても有用である。 従来、 D パントラク ト ンは化学的に合成された D，レパントラク トンを光学分割することにより製造されている。 しかしながら、 この方法は、 キニーネ、 プルシン等の高価な分割剤を必要とするものであ り、 D -パントラク トンの回収も容易でない等の欠点を有している。 このような問題点を解 決するため本発明者らは D，L パントラク トンの酵素的不斉加水分解による光学分割法を特 許文献 1および特許文献 2各公報に提示した。 すなわち、 フサリウム属、 シリンドロカルポン属、 ジべレラ属、 ァスペルジラス属、 ぺ ニシリウム属、 リゾプス属、 ボルテラ属、 グリオクラディウム属、 ユーロティゥム属、 ネ ク トリァ属、 シゾフィ ラム属、 ミ口セシウム属、 ノィロスボラ属、 ァクレモニゥム属、 ッ ベルクリナ属、 アブシジァ属、 スポロスリクス属、 バ一テイシリゥム属またはァルスロダ —マ属に属する微生物より選ばれたラク トン加水分解能を有する微生物を用いて D, L -パン トラク トン中の D -体を選択的に不斉加水分解せしめることにより、 D-パントイン酸を生成 せしめ、 その D -パントイン酸を分離し、 D -パントラク トンに変換することを特徴とする!) - パントラク トンの製造法および上記した属に属する微生物による])-パントラク トン加水分 解酵素の製造法である。 し力、し、 これらの開示されている微生物の多くが直ちに工業的に利用可能なほどの加水 分解活性を有しているとは必ずしもいえず、 当該微生物がもつ酵素活性を工業可能なレべ ルまでに上昇させるためには、 培養条件や活性誘導条件等について長時間を要する煩雑で 難しい検討が必要とされる。 またこれらの当該微生物は真菌であるため、 菌体が様々な形 態をもつ菌糸状を呈し、 単一な形態を有する細菌などに比べ、 工業的生産に有利な固定化 菌体の調製がかなり難しいという問題がある。 さらに酵素を菌体から精製する際にも、 D - パントラク トン加水分解酵素に関してはかなり回収率が悪いなどの問題がある。 これらの問題点を解決し、 さらに D-パントラク トン加水分解酵素そのものの改変により 酵素活性の飛躍的な上昇を可能ならしめることを目指して、 天然の D -パントラク トン加水 分解酵素、 例えば、 フサリゥム 'ォキシスポルム由来の天然の D-パントラク トン加水分解 酵素またはそれと実質的に同等な活性を有するタンパク質をコ一ドする遗伝子を明らかに し、 該タンパク質をコ一ドする塩基配列を含有する DMで形質転換せしめた宿主細胞が作 製された （特許文献 3 ) が、 該形質転換宿主細胞で得られる酵素活性もそれを直ちに工業 的に利用可能とするにはさらに効率のよい方法が求められていた。
【特許文献 1】 特開平 3- 65198号
【特許文献 2】 特開平 4-144681号
[特許文献 3】 国際公開パンフレッ ト ffO, A, 97/10341 発明の開示
従来、 大腸菌などを使用して得られた形質転換体が生産する酵素は糖鎖の付加がなく、 天然型 （野生型） よりも分子量が小さく、 安定性に欠けるという問題がありこれを解決す ることが求められていた。
本発明は、 天然のラク トナーゼ遺伝子を利用し、 効率よく且つ生産性に優れた該酵素を 生産するシステムを作製することにある。 また、 本発明は、 さらに該酵素および該酵素を 生産するシステムを用い、 効率よく且つより生産性に優れた光学活性？' - ラク トン生産シ ステムの構築にある。
D -パントラク トン加水分解酵素活性を有する D -パントラク トン加水分解酵素 （以下、 Γ ラク トナーゼ」 とする） 、 特には、 フサリウム 'ォキシスポルム（Fusarium oxysporum)よ りクローニングされ同定されたラク トナーゼは、 その遣伝子の解析の結果、 5つのイント ロンを含む: 53塩基対からなる染色体遺伝子によってコ一ドされており、 該酵素は 20個の 了ミノ酸残基からなる NH2末端シグナルべプチドを有するもので、 その染色体遺伝子から 転写された mMAに相捕的な cMAによりコ一ドされる成熟酵素は 380個のアミノ酸からなる タンパク質である。
そして野生型のものは、 糖鎖が付加しているものである。
上記課題に鑑み、 本発明者等は組換え型酵素においても糖鎖付加がなされるシステムを 開発すべく鋭意研究を進めた結果、 該ラク トナーゼ遺伝子をシグナルぺプチドをコ一ドす る遺伝子配列とともに宿主細胞に導入し、 発現させることにより天然型の糖鎖が付加した 該酵素の大量発現に成功し、 本発明を完成させるに至った。 本発明は、
〔1〕 D パントラク トン加水分解酵素活性を有するラク トナーゼおよびシグナルぺプ チド領域をコードする MA を導入されたことを特徴とするラク トナーゼ産生形質転換体；
〔 2〕 ラク トナーゼがフサリゥム属由来のものであることを特徴とする上記 〔1〕 記 載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔3〕 配列表の配列番号： 9 の第 1 ~380番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有 するラク トナーゼをコードする MA あるいはその一部配列とシグナルペプチド領域をコ一 ドする]) NA とからなる MA を導入されたことを特徴とするラク トナーゼ産生形質転換体；
〔 4〕 シグナルペプチド領域が配列表の配列番号： 9 の第— 20〜一 1番目のアミノ酸 からなるアミノ酸配列又はその一部配列、 あるいは Alp シグナルペプチド領域であること を特徴とする上記 〔3〕 記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔5〕 上記 〔 1〕 〜 〔4〕 のいずれか一記載のラク トナーゼ産生形質転換体を培養し 、 組換えラク トナーゼを産生せしめ、 得られた組換えラク トナーゼを得ることを特徴とす る D-パントラク トン加水分解酵素活性を有する組換えラク トナーゼの製法；及び
〔6〕 一般式（I)
Figure imgf000003_0001
( はヒ ドロキシル基、 アミノ基を表し、 R1及び B2はそれぞれ同一または異なり、 互いに 独立に、 水素又は低級アルキル基を表す。 ） で示される化合物又はその塩を、
上記 〔1〕 〜 〔4〕 のいずれか一記載のラク トナーゼ産生形質転換体の培養物、 その細 胞、 細胞処理物、 または固定化菌体、 該形質転換体から得られた組換えラク トナーゼ、 及 び固定化組換えラク トナーゼから成る群から選ばれたもの
に接触せしめることを特徴とする、 一般式（Π)
Figure imgf000004_0001
(E, R1 及び はそれぞれ前記に同じ。 ） 、 又は一般式（IV)
Figure imgf000004_0002
(R, R1 及び]?2はそれぞれ前記に同じ。 ） で示される光学活性な y—ラク トン誘導体又は その塩の製造方法を提供する。 別の態様では、 本発明は、
〔 7〕 D-パントラク トン加水分解酵素活性を有するラク トナーゼおよびシグナルぺプ チド領域をコードする DNA 又はそれを挿入したベクタ一を導入されたことを特徴とするラ ク トナーゼ産生形質転換体；
〔8〕 ベクタ一が、 糸状菌のェンハンサ一塩基配列の 1個または複数個を有するもの であることを特徴とする上記 〔7〕 記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔 9〕 ベクタ一が、 糸状菌のェンハンサー塩基配列を 1個または複数個、 糸状菌で機 能するプロモーター領域に導入したものであることを特徴とする上記 〔1〕 〜 〔4〕 、 〔 7〕 及び 〔8〕 記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔10〕 ベクタ一が、 ァスペルギルス 'ォリゼの —ダルコシダーゼ遺伝子 （agdA) プ 口モーター上のェンハンサ一配列の 1個または複数個を糸状菌で機能するプロモーター領 域に導入したものであることを特徵とする上記 〔1〕 〜 〔 4〕 及び 〔7〕 〜 〔9〕 のいず れか一記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔11〕 プロモータ一領域が糸状菌由来の加水分解酵素遺伝子、 または、 解糖系酵素遺 伝子のプロモータ一領域であることを特徴とする上記 〔9〕 又は 〔10〕 記載のラク トナー ゼ産生形質転換体；
〔12〕 プロモータ一領域がァスペルギルス ·ォリゼ （Aspergillus oryzae) 由来の α 一ダルコシダ一ゼ遗伝子のプロモーター領域、 あるいは、 その部分配列を含むプロモ一夕 —領域であることを特徴とする上記 〔9〕 〜 〔11〕 のいずれか一記載のラク トナーゼ産生 形質転換体；
〔13〕 ベクターが、 宿主糸状菌の形質転換体の選択に好適なマーカー遣伝子を有し、 ターミネータ一を有し、 大腸菌で複製可能な DM領域を有し、 且つ糸状菌におけるポリべ プチド発現用プラスミ ドであることを特徴とする上記 〔7〕 〜 〔12〕 のいずれか一記載の ラク トナーゼ産生形質転換体；
〔14〕 マ一力一遺伝子が糸状菌由来の硝酸還元酵素遺伝子、 オル二チン力ルバモイル トランスフヱラーゼ遺伝子、 トリブトファンシンタ一ゼ遺伝子、 またはァセトアミダーゼ 遺伝子であることを特徴とする上記 〔13〕 記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔15〕 マーカ一遺伝子がァスペルギルス属由来の硝酸還元酵素遺伝子であることを特 徴とする上記 〔13〕 又は 〔14〕 記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔16〕 ターミネータ一がァスペルギルス ·ォリゼ由来の α—ダルコシダ一ゼ遺伝子の 夕一ミネ一ター、 あるいは、 その部分配列を含むターミネータ一であることを特徴とする 上記 〔13〕 記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔17〕 ベクターが、 フサリウム （Fusarium ) 属糸状菌の産生するアルカリプロテア一 ゼ（Alp) の発現に係るプロモーター領域を有するものであることを特徴とする上記 〔 7〕 記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔18〕 シグナルべプチド領域が、 該 Qp の分泌に係るシグナル配列領域又は該ラク ト ナ一ゼのシグナル配列領域であることを特徴とする上記 〔1〕 又は 〔7〕 記載のラク トナ 一ゼ産生形質転換体；
〔19〕 (a) D-パントラク トン加水分解酵素活性を有するラク トナーゼ全長をコ一ドす る DM 配列及び（b) 該ラク トナーゼの NH2末端シグナルべプチド領域をコードする DM 配 列を含有する MA を導入されたことを特徴とするラク トナーゼ産生形質転換体；
〔20〕 (a) ラク トナーゼ全長をコ一ドする cMA配列（i) 又は染色体遺伝子 MA 配列（i i)及び（b) 該ラク トナーゼの NH2末端シグナルべプチド領域をコ一ドする DM 配列を含有 する DM を導入されたことを特徴とする前記 〔19〕 記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔21〕 (a) D-パントラク トン加水分解酵素活性を有するラク トナーゼ全長をコ一ドす る MA 配列及び（b) フサリウム属糸状菌の産生する Alp シグナルべプチド領域をコ一ドす る MA配列を含有する MA を導入されたことを特徴とするラク トナーゼ産生形質転換体；
〔22〕 (a) ラク トナーゼ全長をコードする cMA配列（i) 又は染色体遺伝子 DM 配列（i i)及び（b) 該 Alp シグナルべプチド領域をコ一ドする MA配列を含有する MA を導入され たことを特徴とする前記 〔21〕 記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔23〕 配列表の配列番号：8の第 61〜1453番目の塩基配列をコードする MA とシグナル ペプチド領域をコードする]) NA とからなる DM を導入されたことを特徴とするラク トナー ゼ産生形質転換体；
〔24〕 シグナルペプチド領域が配列表の配列番号： 9 の第—20〜一 1番目のアミノ酸 からなるアミノ酸配列あるいはフサリウム属糸状菌 Alp シグナルべプチド領域であること を特徴とする上記 〔23〕 記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔25〕 -般式（I)
Figure imgf000005_0001
(R はヒ ドロキシル基、 アミノ基を表し、 R1及び β2はそれぞれ同一または異なり、 互いに 独立に、 水素又は低級アルキル基を表す。 ) で示される化合物又はその塩を、 上記 〔1〕 〜 〔 4〕 及び 〔7〕 〜 〔24〕 のいずれか一記載のラク トナーゼ産生形質転換体の培養物、 その細胞、 細胞処理物、 または固定化菌体、 該形質転換体から得られた組換えラク トナー ゼ、 及び固定化組換えラク トナーゼから成る群から選ばれたものに接触せしめ、 未反応で ある一般式（II)
Figure imgf000006_0001
(E, R 1 及び はそれぞれ前記に同じ。 ) の化合物又はその塩を反応系から分離すること ：こよる（S)— γ —ラク トン誘導体又はその塩の製造方法；
〔26〕 一般式（I)
Figure imgf000006_0002
(R はヒ ドロキシル基、 アミノ基を表し、 R1及び R2はそれぞれ同一または異なり、 互いに 独立に、 水素又は低級アルキル基を表す。 ） で示される化合物又はその塩を、 上記 〔1〕 〜 〔 4〕 及び 〔7〕 〜 〔24〕 のいずれか一記載のラク トナーゼ産生形質転換体の培養物、 その細胞、 細胞処理物、 または固定化菌体、 該形質転換体から得られた組換えラク トナー ゼ、 及び固定化組換えラク トナーゼから成る群から選ばれたものに接触せしめ、 一般式（I II)
( I)
Figure imgf000006_0003
(R, R 1 及び R2はそれぞれ前記に同じ。 ） の化合物又はその塩を得、 これを一般式（IV)
Figure imgf000006_0004
a, R1 及び E2はそれぞれ前記に同じ。 ） の化合物又はその塩に変換することによる、 （E )ー7—ラク トン誘導体又はその塩の製造方法；
〔27〕 ラク トナーゼおよびシグナルペプチド領域をコードする配列を含有することを 特徴とする DM ；
〔28〕 (a) ラク トナーゼ全長をコ一ドする DM 配列及び（b) 該ラク トナーゼの NH2末 端シグナルペプチド領域をコードする DM 配列を含有することを特徴とする DNA ；及び
〔29〕 (a) ラク トナーゼ全長をコ一ドする cMA配列（i) 又は染色体遺伝子 MA 配列（i i)及び（b) 該ラク トナーゼの NH2末端シグナルべプチド領域をコードする DNA 配列を含有 することを特徴とする DM を提供する。
更なる態様では、 本発明は、
〔30〕 宿主微生物として、 ァスペルギルス属、 アクレモニゥム属、 フサリウム属に属 する微生物に導入することを特徴とする上記 〔1〕 〜 〔4〕 、 〔 7〕 及び 〔18〕 〜 〔24〕 のいずれか一記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔31〕 宿主微生物として、 ァスペルギルス ·ォリゼ、 ァクレモニゥム · クリソゲナム 、 フサリウム .ォキシスポルムに属する微生物に導入することを特徴とする上記 〔 1〕 〜 〔4〕 、 〔 7〕 及び 〔18〕 〜 〔24〕 のいずれか一記載のラク トナーゼ産生形質転換体；
〔32〕 一般式（II)又は（IV)の光学活性な 7 - ラク トン誘導体の製造法において、 ラク トナーゼ産生形質転換体、 その培養物、 その細胞、 その細胞処理物、 及び該形質転換体か ら得られた組換えラク トナーゼを固定化し繰り返し反応させることを特徴とする製造方法
[33] 一般式（D において R がヒ ドロキシル基であり、 E1及び R2が共にメチル基であ る光学活性なパントラク トン又はその塩の製造方法；
〔34〕 一般式（I) で示される化合物又はその塩を、 上記 〔1〕 〜 〔4〕 、 〔7〕 〜 〔 24) 、 〔30〕 及び 〔31〕 のいずれか一記載のラク トナーゼ産生形質転換体の培養物、 その 細胞、 細胞処理物、 または固定化菌体、 該形質転換体から得られた組換えラク トナーゼ、 及び固定化組換えラク トナーゼからなる群から選ばれたものに接触せしめて得られた]) -パ ントラク トンを用いることを特徴とするパントテン酸又はその塩、 パンテノール、 あるい はパンテチンの製造方法；
〔35〕 上記 〔1〕 〜 〔4〕 、 〔 7〕 〜 〔24〕 、 〔30〕 及び 〔31〕 のいずれか一記載の ラク トナーゼ産生形質転換体が固定化されていることを特徴とする固定化菌体；及び
〔36〕 上記 〔1〕 〜 〔 、 〔7〕 ~ [24] 、 〔30〕 及び 〔31〕 のいずれか一記載の ラク トナーゼ産生形質転換体から得られた組換えラク トナーゼが固定化されていることを 特徴とする固定化組換えラク トナーゼを提供する。 さらなる態様では、 本発明は
〔37〕 上記一般式（I) で示される化合物又はその塩を、 上記 〔1〕 〜 〔 4〕 、 〔 7〕 〜 〔24〕 、 〔30〕 、 〔31〕 、 〔35〕 及び 〔36〕 のいずれか一記載のラク トナーゼ産生形質 転換体の培養物、 その細胞、 細胞処理物、 または固定化菌体、 該形質転換体から得られた 組換えラク トナーゼ、 及び固定化組換えラク トナーゼから成る群から選ばれたものに接触 せしめ、 上記一般式（III) で示される光学活性な化合物又はその塩を製造し、 次に該光学 活性な一般式（III) で示される化合物又はその塩を出発物質 άして使用して公知の方法あ るいはそれと均等な方法又はその改変方法を適用して、 一般式（IV)で示される化合物、 パ ントテン酸、 パントテン酸カルシウム、 パンテノール、 パンテティン、 コェンザィム A (C oA)、 パントテニールェチルエーテル、 パンテチンなどの D-パントラク トン誘導体又はそ の塩を製造することを特徴とする!) -パントラク トン誘導体又はその塩の製造方法；
〔38〕 (a) D -パントラク トンを -ァラニンの Ca塩又はエステルとを縮合させて、 D - パントテン酸カルシゥムを製造すること、
b ) D -パントラク トンを ァラニン又はそのエステルと縮合させ、 D -パン トテン酸と した後、 カルシウム化合物を反応させて、 D_パントテン酸カルシウムを製造すること、
(c) D-パントラク トンと^ -ァラニンを第二級又は第三級ァミンの存在下に反応せしめ 、 得られた反応混合物に酸化カルシウムを加えて]) -パントテン酸カルシウムを製造するこ と、
(d) D-パントラク トンと 3 -ァミノプロパノ一ルを縮合させて D-パンテノールを製造する こと、
(e) D-パントラク トンと ァミノプロピオ二トリルと反応させて D -パントテノ二トリ ルとし、 さらにシステアミ ンを反応させ、 2 -（2-D-パントアミ ドエチル） - 2-チアゾリンと した後、 加水分解して D-パンテティンを製造すること、 又は
(f) 上記（e) 工程で得られた D-パンテティンを過酸化水素の存在下縮合させてパンテチ ンを製造することを特徴とする上記 〔37〕 記載の製造方法；
〔39〕 一般式（III) で示される化合物、 一般式（IV ')で示される化合物、 パントテン酸 、 パントテン酸カルシウム、 パンテノール、 パンテティン、 コェンザィム A CoA八 パン トテニールェチルエーテル、 パンテチンなどの D -パントラク トン誘導体又はその塩を製造 するにあたり、 上記 〔1〕 〜 〔4〕 、 〔7〕 〜 〔24〕 、 〔30〕 、 〔31〕 、 〔35〕 及び 〔36 のいずれか一記載のラク トナーゼ産生形質転換体の培養物、 その細胞、 細胞処理物、 ま たは固定化菌体、 該形質転換体から得られた組換えラク トナーゼ、 及び固定化組換えラク トナーゼから成る群から選ばれたもの、 あるいは上記 〔27〕 〜 〔29〕 のいずれか一記載の MAを使用することが提供される。 発明の効果
本発明は、 天然のラク トナーゼ遺伝子を利用し、 効率よく且つ生産性に優れた該酵素を 生産するシステムを作製する技術を提供する。 また、 本発明は、 該酵素および該酵素を生 産するシステムを用い、 効率よく且つより生産性に優れた光学活性 7 - ラク トン生産シス テムの構築を可能にする。
本発明により、 高価な分割剤を必要とせず、 また簡単な操作で工業的生産に適し、 環境 上も問題の少ない、 そして効率よい方法で、 医薬品中間体として有用な、 またアミノ酸や パントテン酸の出発原料である光学活性 7—ラク トン誘導体を製造できる。 光学活性なァ —ラク トン誘導体を簡便に、 かつ、 工業的に製造する方法が提供される。 さらに、 D-パン トラク トン並びにその誘導体、 例えば、 パントテン酸、 パントテン酸カルシウム、 パンテ ノール、 パンテティン、 コェンザィム A (CoA)、 パントテニールェチルエーテル、 パンテ チン又はその塩の効率的且つ経済的に優れた製造が可能となる。
本発明のその他の目的、 特徴、 優秀性及びその有する観点は、 以下の記載より当業者に とっては明白であろう。 しかしながら、 以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた 本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、 説明のためにのみ示されて いるものであることを理解されたい。 本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、 種 々の変化及びノ又は改変 （あるいは修飾） をなすことは、 以下の記載及び本明細書のその 他の部分からの知識により、 当業者には容易に明らかであろう。 本明細書で引用されてい る全ての特許文献及び参考文献は、 説明の目的で引用されているもので、 それらは本明細 書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 A. oryzae における外来ラク トナーゼ遺伝子の発現について調べた結果の電気 泳動写真を示す。
Aは、 電気泳動で分離処理したタンパクを Coomassie Brilliant Blue染色したゲルを示 す。 Lane 1は分子量マ一力一 （Daiichi Chemicals, Tokyo, Japan)： ホスホリラーゼ b ( 97 kDa)、 ゥシ血清アルプミン（66 ld)a)、 アルドラ一ゼ U2 kDa)、 そしてカルボニックァ ンハイ ドラーゼ（30 kDa) 0 Lane 2は、 pMN_PC で形質転換された A. oryzae のセルフリ一 抽出液、 Lane 3は pMN- XG で形質転換された A. oryzae のセルフリ一抽出液。 各 Laneには 25 ,u を適用。 Lane 4は F. oxysporumから得た精製ラク トナーゼ。 0. 5 を適用。
Bはウエスタンプロッ トの結果を示すもので、 野生型ラク トナーゼに特異的な抗体によ り免疫染色したもので、 Aと同様のゲルについてのものである。 Lane 1は分子 gマーカー iprestained SDS-PAGE standards low range, Bio- ad, Hercules, USA J： ホスホリラ一 ゼ b (97 kDa)、 ゥシ血清アルプミン（66 kDa〕、 卵白アルブミ ン（45 kDa)、 カルボニック アンハイ ドラーゼ（31 kDa)、 トリプシンインヒビター（22 kDa)。
図 2は、 F. oxysporumと組換体 A. oryzae を用いてのラセミパントラク トンの不斉加水 分解の結果を示す。 Aは、 湿潤細胞を使用して結果を、 Bは固定化細胞を使用した結果を 示す。 白の丸印は pNAN- PC で形質転換された A. oryzae 、 黒の丸印は pMN- XG で形質転換 された/ L oryzae 、 白の四角印は F. oxysporumである。
図 3は、 ラク トナーゼの分泌発現用プラスミ ドの構造を示す。 融合遺伝子は、 PCE を組 み合わせて行って構築し、 Sal Iおよび Xbalで切断し、 Bluescript II SK+中にサブクロ一 ニングした。
図 4は、 Ac. chrysogenum形質転換体により分泌されたラク トナーゼの電気泳動（SDS - P AGE)写真を示す。 10% ポリアクリルアミ ドゲル使用。 Lane 1は F. oxysporumから得た精製 野生型ラク トナーゼ（0. 5 を、 Lane 2は、 pAlpS で形質転換された Ac. chrysogenum (3 g のタンパク含有） を、 Lane 3は、 pLacS で形質転換された Ac. chrysogenum (3 z g の タンパク含有） を示す。 Lane 4は分子量マーカ一： ホスホリラーゼ b (97 ld)a)、 ゥシ血 清アルプミ ン（66 kDa八 アルドラーゼ（42 kDa)、 そしてカルボニックアンハイ ドラ一ゼ（3 0 kDa)0
図 5は、 糖鎖切断処理されたラク トナーゼの電気泳動（SDS - PAGE)写真を示す。 野生型ラ ク トナーゼ（Lane 2- 5)および pAlpS で形質転換された Ac. chrysogenum から得た精製組換 え型ラク トナーゼ（Lane 8 - 11) は EndoH £ で処理されたもので、 10% ポリアクリルアミ ド ゲル上で電気泳動処理されたものである （各 Lane当たり 0. 8 g)。 Lane 2および Lane 8は 、 1 分間の糖鎖切断処理、 Lane 3および Lane 9は、 5 分間の糖鎖切断処理、 Lane 4および Lane 10 は、 15分間の糖鎖切断処理、 Lane 5および Lane 11 は、 60分間の糖鎖切断処理。 糖齄切断処理をしていない野生型ラク トナーゼおよび組換え型ラク トナーゼは、 Lane 1お よび Lane 7に示す。 Lane 6は、 分子量マーカーで詳細は図 4と同様のものである。
図 6は、 固定化酵素によるラセミパントラク トンの不斉加水分解の結果を示す。 D -及び パント酸の比率は HPLCで測定した。 黒い丸印は、 D-パント酸を、 白い丸印は L -パント酸 を、 白い四角印は、 DL-パントラク トン （ラセミパントラク トン） を示す。
図 7は、 フサリウム属糸状菌由来ラク トナーゼをコードする染色体 DNA (ゲノ ミ ック . ジーン） の塩基配列を示す。 NH2-末端の 20個のアミノ酸残基の配列（1〜60の塩基配列.） が シグナルペプチド領域で影を付して表示してある。 また、 5個のイントロンは小文字（low ercase letter)で表記されており、 予測される N-グリコシル化ァスパラギン残基はダイヤ 印が付してあり、 関連ストップコ ドンはァスタリスクを付して示してある。 発明を実施するための最良の形態
本発明では、 天然の D -パントラク トン加水分解能をもつラク トナーゼ酵素、 例えば、 フ サリウム ·ォキシスポルム由来の野生型 （天然型） ラク トナーゼ （^パントラク トン加水 分解酵素） またはそれと実質的に同等な活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の組 換え発現技術並びにその利用技術を提供する。 該ラク トナーゼをコードする塩基配列を含 有する MAを用いて形質転換せしめた宿主細胞の作成及び培養 ·増殖、 該宿主細胞を用い る該タンパク質の製造、 さらにはそれらタンパク質および宿主細胞の用途等が提供される 。 また本発明では上記ラク トナーゼをコードする遺伝子を利用する有用な各種の手段が提 供され、 さらにこうしてデザィンされた発現ベクターなどを利用して、 効率よく且つより 生産性に優れた D-パントラク トン生産システムが提供される。
本発明は、 D, L-パントラク トン中の D -体を選択的に不斉加水分解せしめる活性を有する ことを特徴とするラク トナーゼに関し、 NH2末端シグナルペプチド領域を含んでいる該ラ ク トナーゼ全長をコードする遺伝子を使用して形質転換せしめると、 得られた形質転換体 は、 野生型酵素とほぼ等しい分子量の組換え酵素を発現産生するばかりでなく、 得られる 酵素活性についてもその安定性において満足できるものであるとの知見を利用する技術で あり、 当該ラク トナーゼに関し、 組換え技術によっても、 より高い触媒能と安定的な酵素 活性を保持する形質転換された細胞を取得し、 それを利用する技術に関する。 本発明は、 D -パントラク トン加水分解酵素としての活性を持つラク トナーゼの微生物で の発現及び分泌生産の技術を提供する。 代表的には、 該ラク トナーゼ全長をコードする遺 伝子を、 N 末端シグナルペプチド領域を含む形態として、 糸状菌、 例えばァスペルギルス 属ゃアクレモニゥム属などの菌に導入すると、 得られた形質転換体は、 野生型酵素と一致 する分子量の糖鎖が付加された組換え酵素を産生し、 該酵素は DL- パントラク トンなどの ァーラク トン類の加水分解反応において、 糖鎖付加を受けない酵素に比べて酵素安定性に 優れ、 さらに当該形質転換体 A. oryzae 菌株は、 Fusarium oxysporumに比べて加水分解率 も向上した。 さらに Ac. chrysogenum の場台、 ラタ トナーゼを菌体外大量分泌可能となり 、 酵素レベル （粗酵素、 精製酵素または固定化酵素） での DL-パントラク トン加水分解反 応が可能になったなど優れたものであった。 本発明で利用される遺伝子組換え技術は、 例えば T. Maniatis et al. , "Molecular Clon ing" , 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. T. (1989 ； 日本生化学会編、 「続生化学実験講座 1、 遺伝子研究法 II」 、 東京化学同人 1986) ; 日本 生化学会編、 「新生化学実験講座 2、 核酸 III (組換え DM技術） 」 、 東京化学同人（199 2 ) ； E. u ed. , "Methods in Enzymology" , Vol. 68, Academic Press, New York (1980 ) ； E. Wu et al. ed. , "Methods in Enzymology" , Vol. 100 & 101， Academic Press, N ew York (1983) ； E. l?u et al. ed. , "Methods in Enzymology" , Vol. 153， 154 & 155, Academic Press, New York (1987) などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載 の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。 それらの 手法は、 本発明の目的に合わせて公知の手法に独自の改変改良を加えたものであることも できる。 本明細書中、 「ポリメラ一ゼ 'チェイン ' リアクション（polymerase chain reaction) 」 又は 「PCR」 とは、 一般的に、 米国特許第 4， 683, 195号明細書などに記載されたような 方法を指し、 例えば、 所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方 法を指している。 一般に、 PCK 法は、 鎳型核酸と優先的にハイブリダィズすることのでき る 2個のオリゴヌクレオチドプライマ一を使用して、 プライマ一伸長合成を行うようなサ イクルを繰り返し行うことを含むものである。 典型的には、 PCR 法で用いられるプライマ —は、 铸型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補的なプライマ一を使用す ることができ、 例えば、 該増幅されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的で あるか、 あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用 することができる。 5'端側のプライマーとしては、 少なく とも開始コ ドンを含有するか、 あるいは該開始コ ドンを含めて増幅できるように選択し、 また 3'端側のプライマーとして は、 少なくともストップコ ドンを含有するか、 あるいは該ストップコ ドンを含めて増幅で きるように選択することが好ましい。 プライマ一は、 好ましくは 5個以上の塩基、 さらに 好ましくは 10個以上の塩基からなるォリゴヌクレオチド、 より好ましくは: 18〜25個の塩基 からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
PCR 反応は、 当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により 行うことができるが、 例えば R. Saiki, et al. , Science, 230： 1350, 1985 ; R. Saiki, et al. , Science, 239： 487, 1988 ； H. A. Erlich ed. , PCR Technology, Stockton Pr ess, 1989 ； D. M. Glover et al. ed. , "MA Cloning" , 2nd ed. , Vol. 1， (The Practi cal Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ； M. A. Innis et al. ed. , "PCR Protocols： a guide to methods and applications" , Academic Press, New York (1990 ) ) ; M. J. McPherson, P. Qui rice and G. E. Taylor (Ed. ), PCR : a prac tical approach, IEL Press, Oxford (.1991)； M. A. Frohman et al. , Proc. Natl. Acad . Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、 改 変した方法に従って行うことができる。 また、 PCR 法は、 それに適した市販のキッ トを用 いて行うことができ、 キッ ト製造業者あるいはキッ ト販売業者により明らかにされている プロトコルに従って実施することもできる。 本明細書中、 「ォリゴヌクレオチド J とは、 比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレ ォチドで、 好ましくはポリデォキシヌクレオチドが挙げられ、 Angew. Chem. Int. Ed. En gl. , Vol. 28, p. 716-734 (1989) に記載されているような既知の方法、 例えば、 フォスフ ォ トリエステル法、 フォスフォジエステル法、 フォスファイ ト法、 フォスフォアミダイ ト '法、 フォスフォネート法などの方法により化学合成されることができる。 通常合成は、 修 飾された固体支持体上で合成を便利に行うことができることが知られており、 例えば、 自 動化された合成装置を用いて行うことができ、 該装置は市販されている。 該オリゴヌクレ ォチドは、 一つ又はそれ以上の修飾された塩基を含有していてよく、 例えば、 イノシンな どの天然においては普通でない塩基あるいはトリチル化された塩基などを含有していてよ いし、 場合によっては、 マーカ一の付された塩基を含有していてよい。 所定の核酸を同定したりするには、 ハイプリダイゼ一ション技術を利用することができ る。 該ハイプリダイゼ一シヨンは、 上記 「遺伝子組換え技術」 を開示する文献記載の方法 あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。 例えば、 ハイプリ ダイゼ一シヨンは、 MA などの核酸を含有しているサンプルをナイロンフィルタ一などの 膜を含めた担体に転写せしめ、 必要に応じ変成処理、 固定化処理、 洗浄処理などを施した 後、 その担体 （例えば、 膜など） に転写せしめられたものを、 必要に応じ変成させた標識 プローブ DNA 断片と、 ハイブリダィゼ一シヨン用緩衝液中で反応させて行われる。 ハイブリダィゼ一シヨン処理は、 普通約 35〜約 80°C、 より好適には約 50〜約 65°Cで、 約 15分間〜約 36時間、 より好適には約 1〜約 24時間行われるが、 適宜最適な条件を選択して 行うことができる。 例えば、 ハイブリダィゼ一シヨ ン処理は、 約 55°Cで約 18時間行われる 。 ハイプリダイゼ一シヨン用緩衝液としては、 当該分野で普通に使用されるものの中から 選んで用いることができ、 例えば、 Kapid hybridization buffer (Amersham社） などを用 いることができる。 転写した担体 （例えば、 膜など） の変成処理としては、 アルカリ変性 液を使用する方法が挙げられ、 その処理後中和液や緩衝液で処理するのが好ましい。 また 担体 （例えば、 膜など） の固定化処理としては、 普通約 40〜約 100で、 より好適には約 70 〜約 90°Cで、 約 15分間〜約 24時間、 より好適には約 1〜約 4時間べ一キングすることによ り行われるが、 適宜好ましい条件を選択して行うことができる。 例えば、 フィルタ一など の担体を約 80°Cで約 2時間べ一キングすることにより固定化が行われる。 転写した担体 （ 例えば、 膜など） の洗浄処理としては、 当該分野で普通に使用される洗浄液、 例えば 1M N aCl 、 ImM EDTAおよび 0. 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) 含有 50mM Ti'is- HC1緩衝液 , pH8. 0 などで洗うことにより行うことができる。 ナイロンフィルタ一などの膜を含めた 担体としては、 当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができる。 上記アルカリ変性液、 中和液、 緩衝液としては、 当該分野で普通に使用されるものの中 から選んで用いることができ、 アルカリ変性液としては、 例えば、 0. 5M NaOH および 1. 5M NaCl を含有する液などを挙げることができ、 中和液としては、 例えば、 1. 5M NaCl 含有 0. 5M Tris - HCl 緩衝液， pH8. 0 などを挙げることができ、 緩衝液としては、 例えば、 2 X SSPE (0. 36M NaCl、 20mM NaH2P04および 2πιΜ EDTA) などを挙げることができる。 またハ ィプリダイゼーション処理に先立ち、 非特異的なハイブリダイゼ一ション反応を防ぐため に、 必要に応じて転写した担体 （例えば、 膜など） はプレハイブリダィゼーシヨン処理す ることが好ましい。 このプレハイプリダイゼ一シヨン処理は、 例えば、 プレハイプリダイ ゼ一ション溶液 [50% formamide、 5 x Denhardf s溶液 （0. 2 %ゥシ血清アルプミ ン、 0. 2 % polyvinyl pyrrolidone) 、 5 x SSPE、 0. 1 % SDSヽ 100 ^ g/ml 熱変性サケ精子 A ] などに浸し、 約 35〜約 50°C、 好ましくは約 42°Cで、 約 4〜約 24時間、 好ましくは約 6 〜約 8 時間反応させることにより行うことができるが、 こうした条件は当業者であれば適 宜実験を繰り返し、 より好ましい条件を決めることができる。 ハイブリダィゼ一シヨ ンに 用いる標識プローブ]) NA 断片の変性は、 例えば、 約 70〜約 100 °C、 好ましくは約 100 °Cで 、 約 1〜約 60分間、 好ましくは約 5分間加熱するなどして行うことができる。 なお、 ハイ ブリダィゼ一ションは、 それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で行うことができ るが、 本明細書でストリ ンジヱントな条件とは、 例えばナトリゥム濃度に関し、 約 15〜約 50mM、 好ましくは約 19〜約 40mM、 より好ましくは約 19〜約 20mMで、 温度については約 35〜 約 85°C、 好ましくは約 50〜約 70°C、 より好ましくは約 60〜約 65°Cの条件を示す。 ハイプリダイゼーション完了後、 フィルターなどの担体を十分に洗浄処理し、 特異的な ハイプリダイゼーション反応をした標識プロ一ブ丽 A 断片以外の標識プロ一プを取り除く などしてから検出処理をすることができる。 フィルターなどの担体の洗浄処理は、 当該分 野で普通に使用されるものの中から選んで用いて行うことができ、 例えば、 0. 1 % SDS含 有 0. 5 X SSC ( 0. 15M NaCl、 l5mM クェン酸） 溶液などで洗うことにより実施できる。 ハイプリダイズした核酸は、 代表的にはォ一トラジオグラフィ一により検出することが できるが、 当該分野で用いられる方法の中から適宜選択して検出に用いることもできる。 検出したシグナルに相当する核酸バンドを、 適切な緩衝液、 例えば、 SM溶液（lOOmM NaCl および 10mM MgS04含有 50mM Tris-HCl 緩衝液、 pH7. 5)などに懸濁し、 ついでこの懸濁液を 適度に希釈して、 所定の核酸を単離 ·精製、 そしてさらなる増幅処理にかけることができ る。
ハイプリダイゼ一ション処理により遺伝子ライブラリ一や cDNAライブラリ一などを含め た核酸サンプルから目的核酸をスク リーニングする処理は、 繰り返して行うことができる 本発明で用いられる当該ラク トナーゼは、 例えば、 フサリウム属、 シリ ンドロカルボン 属、 ジべレラ属、 ァスペルギルス属、 ぺニシリウム属、 リゾプス属、 ボルテラ属、 グリオ クラディ ゥム属、 ユーロティ ゥム属、 ネク トリァ属、 シゾフィ ラム属、 ミ 口セシウム属、 ノィロスボラ属、 アクレモニゥム属、 ッベルク リナ属、 アブシジァ属、 スポロスリクス属 、 バーティ シリゥム属またはァルスロダーマ属に属する微生物などから得ることができる 。 代表的なものとしては、 例えばフサリゥム ·ォキシスポルム IF0 5942 、 フサリウム - セミテクタム IF0 30200、 シリ ンドロカルボン · トンキネンス IF0 30561、 ジペレラ . フ ジクロイ IF0 6349 、 ァスペルギルス ·ォリゼ ATCC 91002 、 アルペルギルス ·ォリゼ I F0 5240 、 ァスペルギルス · ァヮモリ IF0 4033 、 ぺニシリゥム . クリソゲナム IF0 462 6 、 リゾプス ·ォリザェ IF0 4706 、 ボルテラ · ブクシ IF0 6003 、 グリオクラディ ウム ' 力テヌラタム IF0 6121 、 ュ一ロティゥム ' シェバリエリ IF0 4334 、 ネク トリア .ェ レガンス IF0 7187 、 シゾフィ ラム · コムネ IF0 4928 、 ミ ロセシウム . 口リダム IF0 9 531 、 ノィロスボラ · クラッサ IF0 6067 、 ァクレモニゥム · フシディオイデス IF06813 、 ッベルク リナ ·ペルシシナ IF0 6464 、 アブシジァ · リ ヒセイ ミ IF0 4009 、 スポロス リクス · シエンキ IF0 5983 、 バーティ シリゥム · マルトウセィ IF0 6624 、 またはアル スロダーマ · ゥンシナトウム IF0 7865 などが挙げられる。
本発明で利用される当該ラク トナーゼをコードする遺伝子は、 TO， A, 97/10341 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 12787 - 92, 1998 に準じて遺伝子組換え技術を利用して得る ことができる。 例えば、 培養したフサリウム .ォキシスポルムの菌体を破砕し、 常法によ り染色体 DMを遠心分離後、 Aを分解除去し、 除タンパク操作をおこなって、 MA成分 を精製する。 これらの操作については 「植物バイオテクノロジー実験マニュアル：農村文 化社、 2 5 2頁」 を参照して行うことができる。 同様に、 破砕した菌体から、 法に従 つて全 ENAを抽出し、 ここから適当な方法、 例えばオリゴ dTセルロースカラムを用いて ml? NAを精製し、 ついで得られた mENAを鎳型として逆転写酵素 （リバース . トランスク リプタ —ゼ） などを用いて cDNAを合成してもよい。 また、 既に構築された遺伝子ライプラリーを 使用し、 適当なプライマ一を使用して PCE 法、 逆転写 PCR (polymerase chain reaction c oupled reverse transcription; RT-PCR) 法で得ることができる。 既に得られているラク トナ一ゼ遗伝子をプロープとして利用して得ることもできる。 プローブなどを放射性同位 体などによって標識するには、 市販の標識キッ ト、 例えばランダムプライム MAラベリ ン グキッ ト （Boehringer Mannheim社） などを使用して行うことができる。 例えば、 random - primingキッ ト （Pharmacia LKB社， Uppsala)などを使用して、 プローブ用 MA を [ a - 3 2P] dCTP (Amersham社）などで標識し、 放射活性を持つプローブを得ることができる。 所定の核酸を保有する、 ファージ粒子、 組換えプラスミ ド、 組換えべクタ一などは、 当 該分野で普通に使用される方法でそれを精製分離することができ、 例えば、 グリセロール グラジェン卜超遠心分離法 (Molecular Cloning, a laboratory manual, ed. T. Maniati s, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989) 、 電気泳動法などにより精製す ることができる。 ファージ粒子などからは、 当該分野で普通に使用される方法で DM を精 製分離することができ、 例えば、 得られたファージなどを TM溶液 （10mM MgS04含有 50mM T ris-HCl 緩衝液、 pH7. 8)などに懸濁し、 Mase I および RNase A などで処理後、 20mM EDT A、 50 ^ g/ml Proteinase 及び 0. 5 ,%'SDS 混合液などを加え、 約 65°Cヽ 約 1 時間保温し た後、 これをフエノール抽出ジェチルエーテル抽出後、 エタノール沈殿により を沈殿 させ、 次に得られた DM を 70%エタノールで洗浄後乾燥し、 TE溶液 （10mM EDTA含有 10mM
Tris-HCl 緩衝液、 pH8. 0)に溶解するなどして得られる。 また、 目的としている DM は、 サプクローニングなどにより大量に得ることも可能であり、 例えばサプクローニングは、 宿主として大腸菌を用いプラスミ ドベクタ一などを用いて行うことができる。 こうしたサ プクローニングにより得られた DM も、 上記と同様にして遠心分離、 フヱノール抽出、 ェ タノ一ル沈殿などの方法により精製分離できる。 塩基配列の決定は、 ダイデォキシ法、 例 えば M l 3ダイデォキシ法など、 MaxanrGilbert 法などを用いて行うことができるが、 市 販のシークェンシングキッ ト、 例えば Taqダイプライマーサイクルシークェンシングキッ トなどを用いたり、 自動塩基配列決定装置、 例えば蛍光 DMシーケンサ一装置などを用い て行うことができる。 本明細書において、 核酸 （又はポリヌクレオチド） は、 一本鎖 DM 、 二本鎖 A、 RNA 、 DNA : RNA ハイプリ ッ ド、 合成 DNA などの核酸であり、 またゲノム M (染色体遺伝子 MA) 、 ゲノミ ック DNA ライブラリ一、 cDM、 合成 MA のいずれであってもよい。 核酸の塩基配 列は、 修飾 （例えば、 付加、 除去、 置換など） されることもでき、 そうした修飾されたも のも包含されてよい。 核酸は、 本発明で記載するペプチドあるいはその一部をコードする ものであってよく、 好ましいものとしては DNA が挙げられる。 核酸は、 化学合成によって 得ることも可能である。 その場合断片を化学合成し、 それらを酵素により結合することに よってもよい。 本明細書において、 得られた PCR産物などの核酸（MAを含む）は、 通常 1~2¾ァガ口一 スゲル電気泳動にかけて、 特異なバンドとしてゲルから切り出し、 例えば、 gene clean k it (Bio 101 )などの市販の抽出キッ トを用いて抽出する。 抽出された DM は適当な制限酵 素で切断し、 必要に応じ精製処理したり、 さらには必要に応じ 5'末端を T4ポリヌクレオチ ドキナ一ゼなどによりリ ン酸化した後、 pUC18 などの pUC 系べクタ一といった適当なブラ スミ ドベクタ一にライゲ一シヨンし、 適当なコンビテント細胞を形質転換する。 クロ一二 ングされた PCR 産物はその塩基配列を解析されてよい。 PCE 産物のクローニングには、 例 えば、 -Direct (Clorrtech社）, CR-Script™ SK(+) (Stratagene社）， pGEM - T (Promega 社）， pAnipTM(Gibco - BEL社） などの市販のプラスミ ドベクタ一を用いることが出来る。 宿 主細胞の形質転換をするには、 例えばファージベクターを使用したり、 カルシウム法、 ル ビジゥム /カルシウム法、 カルシウム./マンガン法、 TFB 高効率法、 FSB 凍結コンビテン ト細胞法、 迅速コロニー法、 エレク トロポレーシヨンなど当該分野で知られた方法あるい はそれと実質的に同様な方法で行うことができる . Hanahan, J. Mol. Biol. , 166 : 55 7, 1983 など） 。 当該プラスミ ドの配列内には、 例えば選択した宿主細胞で発現するのに好適なコ ドンを 導入することや、 制限酵素部位を設けることも可能である。 また、 目的とする遺伝子の発 現を容易にするための制御配列、 促進配列など、 目的とする遺伝子を結合するのに役立つ リ ンカ一、 アダプタ一など、 さらには抗生物質耐性などを制御したり、 代謝を制御したり し、 選別などに有用な配列等を含ませることが可能である。
大腸菌を宿主とするプラスミ ドとしては、 例えば PBE322, pUC18, pUC19, pUC118, pUCl 19, pSP64, pSP65, pTZ-18E/-18U, pTZ- 19E/- 19ϋ, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf (-) , pBluescript S™ ( Stratagene ) などが挙げられる。 大腸菌での発現に適 したプラスミ ドベクタ一としては、 pAS, pKK223 (Pharmacia ), pMC1403, pMC931， pKC30 なども挙げられる。
宿主細胞としては、 大腸菌の場合、 例えば大腸菌 K12株に由来するものが挙げられ、 例 えば匪 533 XL1- Blue, C600, Ml, HB101, JM109などが挙げられる。 本発明の遺伝子工学 的手法においては、 当該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、 逆転写酵素、 DM断片をクローン化するのに適した構造に修飾したりあるいは変換するための酵素であ る DM修飾 ·分解酵素、 DMポリメラ一ゼ、 末端ヌクレオチジルトランスフヱラーゼ、 DN Aリガーゼなどを用いることが出来る。 本発明に従えば、 該ラク トナーゼは融合タンパク質として発現させ、 生体内あるいは生 体外で野生型酵素と実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換 ·加工してもよ い。 また、 遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、 こうした融合 夕ンパク質はその融合部を利用してァフィ二ティクロマトグラフィ一などで精製すること も可能である。 タンパク質の構造の修飾 ·改変などは、 例えば合成ォリゴヌクレオチドな どを利用する位置指定変異導入法 （部位特異的変異導入法） あるいは PCB を使用するなど 当該分野で広く知られた方法で行うことができる。
本発明では、 当該ラク トナーゼを発現する形質転換体を作製するのに、 該ラク トナーゼ およびシグナルべプチドをコ一ドする DM が構築され、 好適に利用される。 該ラク トナー ゼをコードする MA は、 フサリウム属糸状菌由来のものを好適に利用できる。 本発明で利 用される組換えラク トナーゼ発現用塩基配列は、 例えばラク トナーゼ全長をコードする A 配列及び該ラク トナーゼの NH2末端シグナルぺプチド領域をコ一ドする DM 配列を有す るもの。 また、 該組換えラク トナーゼ発現用塩基配列は、 （a) フサリウム属糸状菌由来ラ ク トナ一ゼ全長をコードする cMA配列又は染色体遺伝子]) M 配列と該ラク トナーゼの NH2 末端シグナルべプチド領域をコードする MA 配列を含有するものであることができる。 好ましい例では、 該フサリウム属糸状菌由来ラク トナ一ゼとシグナルペプチド領域をコ ードする配列とを持つ配列は、 適切な発現用ベクター内に組み込むことができる。 該発現 用べクタ一としては、 糸状菌のェンハンサ一塩基配列の 1個または複数個を有するもの、 フサリウム （FusariuDi) 属糸状菌の産生するアルカリプロテア一ゼ（Alp) の発現に係るプ 口モータ一領域を有するもの、 糸状菌のェンハンサ一塩基配列の 1個または複数個を糸状 菌で機能するプロモータ一領域に導入したもの、 シグナルペプチド領域が、 該 Alp の分泌 に係るシグナル配列領域又は該ラク トナーゼのシグナル配列領域であるように構成できる ものなどが挙げられる。
糸状菌での発現に適した発現用べクタ一としては、 ァスペルギルス 'ォリゼの α —グル コシダ一ゼ遣伝子 （agdA) プロモータ一上のェンハンサ一配列とプロモータ一領域をもつ ものが挙げられる。 該ェンハンサ一配列を導入するプロモータ一としては、 糸状菌におい て機能するものであれば特に制限されないが、 具体的には、 α —アミラーゼ、 グルコアミ ラ一ゼ、 α —グルコシダ一ゼ、 プロテア一ゼ、 リパーゼ、 セルラーゼ、 セロピオハイ ドラ —ゼ、 ァセトアミダーゼ等の加水分解酵素遺伝子、 3—ホスホグリセレートキナーゼ、 グ リセルアルデヒ ドー 3—ホスフヱ一トデヒ ドロゲナ一ゼ、 アルコールデヒ ドロゲナ一ゼ、 エノラーゼ等の解糖系酵素遗伝子のプロモータ一が挙げられる。 好適なプロモーターは、 ァスペルギルス属の α —アミラーゼ、 グルコアミラーゼ、 . α— ダルコシダーゼの遺伝子から単離することができる。 より好適には、 ァスペルギルス ·ォ リゼの α —グルコシダ一ゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる。 そのプロモータ一は、 部 分配列であっても糸状菌におけるプロモータ一としての機能を有する限り含まれる。 さら に、 本発明で好適に使用できる発現プラスミ ドは、 上述の如く改良された糸状菌で機能す るプロモータ一と、 ターミネータ一を有し、 宿主の形質転換体の選択に好適なマ一力一遺 伝子を有し、 大腸菌で複製可能な DM領域を有するものである。 当該ェンハンサ一配列の プロモータ一^、の導入部位は、 プロモー夕一領域であれば特に制限されるものではない。 夕一ミネーターは、 糸状菌において機能するものであれば特に制限されないが、 例えば、 ァスペルギルス .ォリゼのな—グルコシダーゼ遺伝子のターミネータ一、 あるいは、 その 部分配列を含むターミネータ一がより好適に用いられる。 好ましい選択マーカ一としては 、 硝酸還元酵素 （niaD) 、 オル二チン力ルバモイルトランスフヱラ一ゼ （argB) 、 トリプ トフアンシンターゼ （trp 、 ァセトアミダ一ゼ （amdS) の遺伝子が挙げられる。 より好 適な選択マーカ一遺伝子は、 硝酸還元酵素遺伝子 （niaD) である。 これらのプラスミ ドは 、 プロモーターとターミネータ一の間に設けられた制限酵素認識サイ トを利用して、 本発 明の発現させるべき目的のタンパク質をコードする DNA断片を揷入される。 使用するに好適な発現用べクタ一としては、 例えば特開平 09 - 9968号公報、 特開平 5 - 26 8972号公報などに開示のもの、 あるいはそれから公知の技術で誘導されたものが挙げられ る。 例えば、 プラスミ ド pNLH2 、 pNAN8142などが好適に使用できる。 遺伝子を連結する場 合、 遺伝子間にアダプタ一 DNAとして合成 MAを用いることもできる。 該合成 MAとして は、 両遺伝子のフレームが一致し、 目的とする遺伝子の活性が失われないものであればい かなるものでもよい。 例えば、 ァーゼ遺伝子プロモーターと、 翻訳開始部位およびノま たは分泌シグナルを用いた目的遺伝子の発現は、 該 ァ一ゼ遺伝子由来部位と目的とする 遺伝子のフレームが一致するように融合遺伝子を作製することによって行われる。 APァ一 ゼの分泌シグナルを翻訳開始コ ドンの下流にフレームを合わせて連結されることにより、 目的物質を菌体外に分泌生産させることができる。 プロモーターの機能が失われない限り は、 一部の DM断片を欠失させても差し支えない。 また、 プロモータ一および翻訳開始部 位の機能を変化させるように、 例えば、 発現力が増加するようにプロモーターおよび翻訳 開始部位を含む領域の DNA塩基配列を改変したものであっても好都合に用いることができ るし、 プロモータ一および翻訳開始部位の機能に関係しない領域の MA塩基配列を改変さ せて用いることも可能である。 以上のようにして構築された目的遺伝子を導入するための宿主としては、 その遺伝子が 作動、 発現する生物ならばどのようなものであってもよい。 代表的な宿主としては、 例え ば、 酵母、 糸状菌、 植物などの真核生物より適宜選択されてよい。 例えば、 フサリウム属 、 シリンドロカルポン属、 ジペレラ属、 ァスペルギルス属、 ぺニシリウム属、 リゾプス属 、 ボルテラ属、 グリオクラディゥム属、 ユーロティゥム属、 ネク トリァ属、 シゾフィラム 属、 ミロセシウム属、 ノィロスボラ属、 アクレモニゥム属、 ッベルクリナ属、 アブシジァ 属、 スポロスリクス属、 バーテイシリゥム属またはァルスロダーマ属に属する微生物が挙 げられる。
代表的なものとしては、 例えばフサリゥム ·ォキシスポルム IF0 5942 、 フサリゥム · セミテクタム IF0 30200、 シリンドロカルボン · トンキネンス IF0 30561、 ジペレラ · フ ジクロイ IF0 6349 、 ァスペルギルス ·ォリゼ ATCC 91002 、 アルペルギルス ·ォリゼ I F0 5240 、 ァスペルギルス · ァヮモリ IF0 4033 、 ぺニシリゥム · ク リソゲナム IF0 462 6 、 リゾプス ·オリザェ IF0 4706 、 ボルテラ · ブクシ IF0 6003 、 グリオクラディゥム 'カテヌラタム IF0 6121 、 ユーロティゥム · シェバリェリ IF0 4334 、 ネク トリア ·ェ レガンス IF0 7187 、 シゾフィ ラム · コムネ IF0 4928 、 ミ ロセシウム · 口リダム IF0 9 531 、 ノィロスボラ · クラッサ IF0 6067 、 ァクレモニゥム · フシディオイデス IF06813 、 ッベルクリナ ·ペルシシナ IF0 6464 、 アブシジァ · リ ヒセイ ミ IF0 4009 、 スポロス リクス · シエンキ IF0 5983 、 バーティシリゥム · マルトウセィ IF0 6624 、 またはアル スロダーマ · ゥンシナトウム IF0 7865 などが挙げられる。 さらに、 APァ一ゼ遺伝子のプロモータ一有しており且つ翻訳開始部位およびノまたは分 泌シグナルをコ一ドする領域の下流に連結した目的ラク トナーゼ遺伝子を有するベクター を導入するための宿主としては、 その遺伝子が作動、 発現する生物ならばどのようなもの であってもよい。 好ましくは、 例えば酵母、 糸状菌などの真核微生物より適宜選択される 。 具体的には、 酵母菌として、 例えば、 サッカロミセス（Saccharomyces 属、 シゾ卄ッカ 口ミセス（Schizosaccharomyces)属、 ピキア（Pichia )属菌などである。 より具体的には、 +)-ッカロ ミセス · セレヒッ -> (.Saccharomyces cerevisiaeJヽ シゾサッカロミセス · ホン ベ (Schizosaccharomyces pombe) 、 ピキア ·パス卜リス（Pichia pastoris) などを挙げる ことができる。 また糸状菌としては、 アクレモニゥム（Acremonium)属、 ァスペルギルス spergillus)属、 フサリウム（Fusarium)属、 ぺニシリウム Penicillium)属、 ムコール（M ucor)属、 ノイロスポラ（Neurospora )属、 トリコデルマ（Trichoderma) 属菌などが挙げら れる。 より具体的には、 ァクレモニゥム · ク リソゲナム cremonium chrysogen腿）、 ァス ぺノレギノレス ·二ガー（Aspergillus niger 、 ァスぺノレギノレス ·ォリゼ（Aspergillus oryza e)、 ァスペルギルス · ァヮモリ（Aspergillus awamori) 、 フサリウム · ォキシスボルム (、F usarium oxysporun ゝ フサ1リウム - セミテクタム (Fusarium semitectum ヽ ぺニシリヮム • ク リ ソケナム (Penicillium chrysogenum) ヽ ムコーノレ · ジヤノ '二カス (Mucor j avanicus ) ノイロスポラ · クラッサ（Neurospora crassa) ヽ 卜リコァノレマ · ビリア一（Trichoder ma viridae) などを挙げることができる。 これらの中で特にアクレモニゥム · クリソゲナ ムが好ましい。 さらに具体的には、 サッカロミセス 'セレビッシェ AH22R -、 アクレモニゥ ム . ク リ ソゲナム ATCC11550株、 ATCC14553株、 ァスペルギルス ·ォリゼ IF05240、 ァス ペルギルス · ァヮモリ IF04033、 フサリウム ·ォキシスポルム IF05942 、 フサリウム ' セ ミテクタム IF030200、 ムコール ' ジャバニカス IF04570、 トリコデルマ ' ビリデ一 IF0311 37などを挙げることができる。 これらの中で特にアクレモニゥム . クリソゲナム ATCC1155 0 株などを挙げることができる。 これら宿主に遺伝子を導入する形質転換法としては、 例えばプロ トプラスト形質転換法 などが挙げられる。 例えば、 適当な細胞壁溶解酵素を用いて調製したプロ トプラスト化し た細胞に、 塩化力ルシゥム、 ポリエチレンダリコールなどの存在下]) Mを接触させるなど の方法で形質転換を行うことができる。 また、 形質転換法としては、 エレク ト口ポレーシ ョン法 （例えば、 E. Neumann et al. , "ΕΜΒΟ Γ , Vol. 1, pp. 841 (1982)など） 、 マイク 口インジヱクション法、 遺伝子銃により打ち込む方法などが挙げられる。
形質転換された細胞を効率良く分離するためには、 宿主内で機能する適切な選択マーカ 一遺伝子を持つプラスミ ドに該融合遺伝子を挿入した後、 該プラスミ ドで宿主を形質転換 してよい。 該選択マーカ一遣伝子としては、 形質転換された細胞を選択的に分離できるも のであるならどのようなものも使用可能である。 代表的なものとしては、 例えばハイグロ マイシン B耐性遺伝子などを挙げることができる。 普通、 宿主は、 選定された選択マ一力 —についての機能的遺伝子を有しない株を用いなければならない。 本発明で得られる形質転換された細胞を培養する場合の各種条件は、 使用する菌株など 細胞の種類により異なるが、 一般的には培地に関しては、 該形質転換細胞が同化したり、 資化することが可能な炭素源や窒素源などを含有する培地を使用する。 炭素源としては、 該形質転換細胞が同化したり、 資化することができるものであればどのようなものでもよ いが、 例えば、 グルコース、 シュクロース、 でんぷん、 可溶性でんぷん、 デキス トリ ンな どの糖類、 パラフィ ン類などが挙げられ、 さらに、 酢酸、 クェン酸、 酪酸、 フマール酸、 安息香酸などの有機酸類、 メタノール、 エタノール、 ブタノール、 グリセリ ンなどのァル コール額、 ォレイン酸、 ステアリ ン酸などの脂肪酸およびそのエステル類、 大豆油、 菜種 油、 ラード油などの油脂類などが挙げられ、 それらは単独又は混合して用いることができ る。 窒素源としては、 資化することができるものであればどのようなものでもよいが、 例 えば、 硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥムなどのアンモニゥム塩類、 硝酸ナトリウム、 硝酸カリウムなどの硝酸塩類、 尿素、 ペプトン、 カザミノ酸、 コーンスティ一プリカ一、 コーングルテンミール、 ふすま、 酵母エキス、 乾燥酵母、 大豆粉、 綿実粉、 肉エキス、 そ の他の有機または無機の窒素含有物などが挙げられ、 それらは単独又は混合して用いるこ とができる。 培地には、 無機塩類、 ミネラル、 ビタミン、 微量金属塩などの栄養素を任意 に適宜加えることもできる。 無機塩類としては、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 炭 酸カルシウム、 リン酸一水素力リゥム、 リ ン酸ニ水素力リゥムなどのリン酸塩類、 マンガ ン塩類などが挙げられ、 他の栄養源として、 麦芽エキスなども挙げられる。 その他、 当該 分野で一般的に使用されるものを適宜選択して用いることができる。
培養は好気条件下で深部培養するのが一般に有利で、 好気的に行なう場合、 通常、 培養 時間 1〜20日程度であり、 好ましくは 3〜14日程度であり、 さらに好ましくは 3〜10日程 度で、 培地の pH 3〜9 、 培養温度、 10〜50°Cで行なう。 本発明で得られる形質転換された細胞により産生される酵素は、 各種原料、 例えば細胞 培養液、 細胞培養破砕物などを含めた、 形質転換体細胞などの酵素産生材料から、 従来公 知の方法にしたがって得ることができる。 例えば、 培地中に蓄積された場合には、 遠心分 離または濾過によって目的物質を含む上澄液をうる。 一方、 目的物質が菌体など細胞中に 蓄積される場合には、 培養後、 遠心分離または濾過などの公知の方法で菌体などを集め、 菌体を塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液に懸濁し、 冷所で撹拌したのち遠 心分離等により目的物質の蛋白質を含む上澄液を得たり、 菌体を緩衝液に懸濁したのち、 ガラスビーズによる粉砕、 フレンチプレス、 超音波処理あるいは酵素処理等で細胞を破砕 したのち遠心分離等により上澄液を得るなどの方法が適宜用いられる。
前記上澄液から目的蛋白質を分離 ·精製するには、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組 合わせて行うことができ、 例えば硫酸アンモニゥム沈殿法などの塩析、 エタノールを使用 するなどの溶媒沈澱法、 セフアデックスなどによるゲルろ過法、 例えばジェチルアミノエ チル基あるいはカルボキシメチル基などの塩基性基あるいは酸性基を持つ担体などを用い たイオン交換クロマトグラフィー法、 例えばプチル基、 ォクチル基、 フエニル基など疎水 性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフィ一法、 色素ゲルクロマトグラフィ一 法、 電気泳動法、 透析、 限外ろ過法、 ァフィ二ティ · クロマトグラフィ一法、 高速液体ク ロマトグラフィ一法などにより精製して得ることができる。 また封入体として得られた場 合には、 可溶化処理、 例えば、 塩酸グァニジン、 尿素といった変成剤、 さらには必要に応 じ、 2 _メルカプトエタノール、 ジチオスレイ ト一ルなどの還元剤存在下に処理して活性 型酵素とすることもできる。 酵素としては酵素産生細胞をそのまま用いることが出来る。 固定化酵素としては、 当該 分野で知られた方法で酵素又は酵素産生細胞などを固定化したものが挙げられ、 共有結合 法や吸着法といった担体結合法、 架橋法、 包括法などにより固定化できる。 また、 微生物 菌体のアルギン酸ゲルへの固定化も好適に用いることができる。 例えばグルタルアルデヒ ド、 へキサメチレンジイソシァネート、 へキサメチレンジイソチオシァネートなどの縮合 剤を必要に応じて使用し、 固定化できる。 またモノマ一を重合反応でゲル化させて行うモ ノマ一法、 通常のモノマーよりも大きな分子を重合させるプレボリマー法、 ポリマ一をゲ ル化させて行うポリマー法などが挙げられ、 ポリアクリルアミ ドを用いた固定化、 アルギ ン酸、 コラーゲン、 ゼラチン、 寒天、 一力ラギ一ナンなどの天然高分子を用いた固定化 、 光硬化性樹脂、 ウレタンポリマ一などの合成高分子を用いた固定化などが挙げられる。 酵素や微生物菌体の固定化技術及びその利用は、 例えば、 千畑一郎編 「固定化酵素」 、 p7 5 、 講談社サイェンティ フィ ック (:1975年）；千畑一郎編 「固定化生体触媒」 、 p67、 社サイェンティ フィ ック（1986年）；鈴木智雄監修 「微生物工学技術ハンドプック」 、 書店（1990 年 5月）；今中忠行編 「Maruzen Advanced Technology く生物工学編〉 微生物ェ 学」 、 pl80〜； 194 、 丸善株式会社 （平成 5年 9月 30日） 、 日本生化学会編 「新生化学実験 講座 13バイオテクノロジ一」 、 p50〜54、 東京化学同人（ISBN : 4-8079-1079-5) などに記 載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法 や改変法により行うことができる。 それらの手法は、 本発明の目的に合わせて公知の手法 に独自の改変改良を加えたものであることもできる。 微生物の培養、 酵素を用いた D -パン トラク トン加水分解をはじめとしたラク トン加水分解酵素利用の酵素的不斉加水分解によ るラク トン系化合物の光学分割反応及び生成物の処理は特開平 3 - 65198号および特開平 4 - 144681号に記載のようにして行うことができる。 例えば、 液体培地で振盪培養した形質転換菌を集菌し、 得られた菌体に D, L -パントラク ト ン水溶液（2〜60% 濃度） を加え、 pHを 6〜 8に調整しながら温度 10〜40°Cで数時間から 1 日反応させる。 反応終了後、 菌体を分離し、 反応液中の未反応 L パントラタ トンを有機 溶媒 （酢酸ェチルのようなエステル類、 ベンゼンのような芳香族炭化水素類、 クロ口ホル ムのようなハロゲン化炭化水素等などが好ましい） を用いて抽出分離する。 水層に残存し ている D -パントイン酸を塩酸酸性下、 加熱することによりラク トン化をおこない、 上記し た有機溶媒で抽出することにより生成した！) -パントラク トンを得ることができる。
かく して、 本発明では、 一般式（I ) の化合物又はその塩を、 フサリウム属糸状菌由来ラ ク トナーゼおよびシグナルペプチド領域をコードする DM 又はそれを揷入したベクタ一を 導入されたラク トナーゼ産生形質転換体の培養物、 その細胞、 または細胞処理物、 及び該 形質転換体から得られた組換えラク トナーゼなどに接触せしめ、 一般式（II )で示される S 体の未加水分解物又はその塩を反応系から分離することにより、 また、 得られた一般式（I II)で示される加水分解物又はその塩は次にラク トン化を行うことにより一般式（IV)又は その塩に変換することにより、 効率的な光学活性なァーラク トン誘導体又はその塩の製造 法が提供されるのである。 本発明においては、 上記のようにして得られた形質転換体、 特には形質転換された微生 物が、 好適に、 一般式（I) の化合物を R体選択的に不斉加水分解するのに使用され、 工業 的に一般式（II )の化合物、 または一般式（III )の化合物を経て一般式（Π)の化合物を製造 するために用いられる。 例えば、 以下の反応式で表すことができる。
Figure imgf000018_0001
）
*は光学活性炭素を示し、 R はヒドロキシル基、 アミノ基を表し、 E 1及び E2はそれぞれ 同一または異なり、 互いに独立に、 水素又は低級アルキル基を表す。 ）
E 1及び R2の低級アルキル基としては、 直鎖状あるいは分岐状の炭素数 1〜 5個のアルキ ル基が挙げられ、 例えばメチル基、 ェチル基、 プロピル基、 イソプロピル基、 プチル基、 t-ブチル基などが挙げられる。 代表的には、 R がヒドロキシル基であり、 U 1及び E2が共に メチル基であるもので、 その場合一般式（I) のラセミパントラク トン又はその塩から光学 活性なパントラク トン又はその塩、 例えば一般式（IV)の D -パントラク トン又はその塩、 あ るいは一般式（II)の L -パントラク トン又はその塩が製造できる。 本製造法において、 使用する形質転換体、 特には形質転換された微生物は、 液体培地に 菌株を培養して得られた培養物、 培養液から分離した菌体、 あるいは菌体または培養物を 処理して得られる乾燥菌体、 もしくは固定化菌体などのいずれの形態のものも用いること ができ、 さらに該形質転換体から単離された酵素はそれを粗製のものも、 精製したものも 、 また固定化されたものなどのいずれの形態のものも用いることができる。
操作は回分式、 半回分式、 または、 連続式のいずれでも行なうことができる。 使用する Ί一ラ ウ トンの濃度は、 通常、 10〜500 g/L である。 反応温度は、 通常、 10〜50°Cである が、 より好ましくは 20〜30°Cである。 反応時間は、 回分式の場合、 通常、 数時間から 1 日 間である。 反応系の pHは、 通常、 3〜 9程度であるがより好ましくは 6〜8である。 形質転換体微生物による一般式（I ) の選択的不斉加水分解の結果、 一般式（III )の化合 物が生成し、 反応液の pHが低下するとともに、 反応速度も低下する。 反応速度を大きくす るため、 反応液の pHを各微生物のラク トン加水分解酵素の至適 pHに保持することが好まし い。 その際、 pHを保持するための無機塩として、 アルカリ金属またはアルカリ土類金属の 水酸化物または炭酸塩のほか、 ァンモニァ水などが用いられる。
反応終了後、 加水分解をうけていない反応液中の一般式（II)の化合物を有機溶媒による 抽出などの操作により分離する。 有機溶媒としては、 塩化エチレン、 クロ口ホルム、 トリ クロロェタンのようなハロゲン系炭化水素、 ベンゼン、 トルエンのような芳香族系炭化水 素、 ジェチルエーテル、 1；-プチルメチルエーテルのようなエーテル類の他、 酢酸ェチル等 が用いられ、 より好ましくは、 酢酸ェチルである。
また抽出以外の分離方法としては、 カラムクロマトグラフィー等が挙げられる。 逆相力 ラムを用い、 溶離液としては、 水、 メタノールまたはエタノールのようなアルコール類、 またはそれらの混合物で一般式（II)の化合物と一般式（ΙΠ)の化合物を分離することも可 能である。
反応液中に残存している一般式（III )の化合物は、 そのまま酸性にすることにより、一 般式（IV)の化合物に変換することができる。 酸としては、 塩酸、 硫酸等が用いられ、 より 好ましくは硫酸である。 pHや反応温度、 反応時間は、 一般式（ΙΠ) の化合物が閉環し、一 般式（Π)の化合物に変換することができる条件でよいが、 より好ましくは、 pHは 1以上の 強酸性、 反応温度は 80〜130 で、 反応時間は 1〜 6時間である。 生成した一般式（IV)の化合物は有機溶媒を用いて抽出することにより回収する。 ここで 用いられる有機溶媒は、 先に一般式（II)の化合物の抽出に用いた溶媒と同様に、 塩化ェチ レン、 クロ口ホルム、 トリクロロェタンのようなハロゲン系炭化水素、 ベンゼン、 トルェ ンのような芳香族系炭化水素、 ジェチルェ一テル、 t一プチルメチルエーテルのようなェ —テル類の他、 酢酸ェチル等が用いられ、 より好ましくは、 酢酸ェチルである。 また、 力 ラムクロマトグラフィーでの回収も可能である。
一方、 反応液中に残存している一般式（ΠΙ )の化合物は、 アルカリ金属の水酸化物また は炭酸塩等で処理後、 反応液を減圧留去し、 乾固物を溶媒で再結晶することにより、 カル ボン酸のアル力リ金属塩とし単離することもできる。 用いられるアル力リ金属の水酸化物 または炭酸塩としては、 水酸化リチウム、 水酸化ナトリゥム、 水酸化力リゥム、 炭酸リチ ゥム、 炭酸ナトリウム、 炭酸力リゥム等があり、 好ましくは、 水酸化ナトリゥムである。 また、 再結晶溶媒としては、 メタノール、 エタノール、 イソプロパノール、 クロ口ホルム 等が用いられ、 好ましくは、 メ夕ノ一ルである。
特に、 本発明においては高い光学純度の D-パントラク トンを高収率で得ることができる 。 D-パントラク トンからは、 -ァラニンの Ca塩又はエステルとアルコール系溶媒中縮合 させて、 D -パントテン酸カルシゥムを得ることができ、 例えば、 D-パントラク トンをアル コール等の有機溶媒中、 -ァラニン又はそのエステルと縮合させ、 D-パントテン酸とし た後、 炭酸カルシウムなどのカルシウム化合物を反応させる方法（E. Stiller, et al. , J . Am. Chem. Soc. , 62, 1785 (1940))、 D-パントラク トンと /3 -ァラニンを第二級又は第 三級アミンの存在で煮沸し、 その反応液に酸化カルシウムを加えて D -パントテン酸カルシ ゥムを製する方法（E. H. ffilson, et al. , J. Am. Chem. Soc. . 76, 5177 1954))などに より製造することができる。 また、 3-ァミノプロパノールをアルコ一ル系溶媒中縮合させ て]) -パンテノールを得ることができる（.USP No. 2, 413, 077 ; Brit. Patent No. 568, 355 ) 。 また、 D -パントラク トンをアルコール等の有機溶媒中、 ァ-ァミノプロピオ二トリルと 反応させ D -パントテノニトリルとし、 さらにシステアミ ンを加え反応させ、 2- (2- D -パン トアミ ドエチル） - 2 -チアゾリ ンとした後、 加水分解して D-パンテティンとした後、 過酸化 水素の存在下縮合させパンテチンを製造することができる（M, Shimizu, et al. , Chem. Ρ harm. Bull. , 13, 180 U965) ) 。 本発明で得られる!)-パントラク トンを使用することによ り、 D-パントテン酸及びまたはその塩、 あるいは D -パンテノールを効率よく得ることがで さる。
このように、 本発明は医薬品中間体ゃァミノ酸誘導体として有用な光学活性なァーラク トン誘導体の簡便で、 効率的な製造方法を提供するものである。 明細書及び図面において、 用語は、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatu reによるか、 あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づく ものであ る。 代表的な用語の意味を以下に示す。
A :ァラニン （Ala) M :メチォニン （Met)
C :システィン （Cys) N :ァスパラギン （Asn)
D :ァスパラギン酸 （Asp) P :プロリ ン （Pro)
E :グルタミ ン酸（Glu) Q：グルタミ ン (Gin)
F :フェニルァラニン（Phe) R :アルギニン （Arg)
G :グリシン（Gly) S :セリ ン （Ser)
H :ヒスチジン（His) T :スレオニン （Thr)
I：イソロイシン（lie) V：バリ ン (Val)
K :リ ジン（Lys) トリブトファン （Trp)
L :口イシン（Leu) Y :チロシン （Tyr)
ヌクレオチド配列に関しては：
了デニン G : グァニン
C：シ 卜シン T : チミ ン
(1) 後述の実施例 1に記載の pNAN-XGで形質転換された Aspergillus oryzae : A. oryza e/pNAN- XGは、 平成 15年 2月 4日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (AIST Ts ukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan, 旧住所表記：茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） （郵便番号 305- 8566)の独立行政法人産 業技術総合研究所特許生物寄託センター （National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary : IP0D) (旧名称： 経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（NIBH))に寄託されて保管されて おり （受託番号 FERM P- 19199)、 平成 16年 2月 2 日に原寄託よりブダペスト条約に基づく 寄託への移管請求がなされ、 受託番号 FEM BP-08608として IP0Dに保管されている。 また 、 後述の実施例 2に記載の pAlpSで形質転換された/ lcremonium chrysogenum : Ac. chryso genum/pAlpS は、 平成 15年 2月 4日から IP0Dに寄託されて保管されており （受託番号 FEK M P- 19200 )、 平成 16年 2月 2 日に原寄託よりブダぺスト条約に基づく寄託への移管請求が なされ、 受託番号 FEM BP- 08609として IP0Dに保管されている。
(.2 ) また、 後述の実施例 1で使用されたラク トナーゼの造伝子を導入したベクタ一 FL C40E) を保有する大腸菌 JM109(EJM - ESE- 1)は、 平成 7年 8月 30日 （原寄託日） から IP0Dに 寄託されており （受託番号 FEM P- 15141) 、 平成 8年 8月 28日に原寄託よりブダペスト条 約に基づく寄託への移管請求がなされ、 受託番号 FEM BP- 5638として IP0Dに保管されてい る。 以下に実施例を掲げ、 本発明を具体的に説明するが、 この実施例は単に本発明の説明の ため、 その具体的な態様の参考のために提供されているものである。 これらの例示は本発 明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、 本願で開示する発明の範囲を限 定したり、 あるいは制限することを表すものではない。 本発明では、 本明細書の思想に基 づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、 他に詳細に記載するもの以外は、 標準的な技術を用いて実施したもの 、 又は実施することのできるものであり、 これは当業者にとり周知で慣用的なものである 。 以下の実施例における通常慣用される分子生物学的技術としては、 標準的な実験マニュ ァノレ、 例えは J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis ed. ), "Molecular Cloning :
A Laboratory Manual (2nd edition)" , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold S pring Harbor, New York (1989) ; D. M. Glover et al. (ed. , "DM Cloning" , 2nd ed. , Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series) , IRL Press, Oxford University Pre ss ( 1995 ) ; H. A. Erlich (ed. ), PCE Technology, Stockton Press, 1989 ； D. M. Glov er- et al. (ed. ), "DNA Cloning" , 2nd ed. , Vol. 1， (The Practical Approach Series) , IRL Press, Oxford University Press (1995) ; M. A. Innis et al. (ed. )， "PCE Prot ocols : a guide to methods and applications" , Academic Press, New York (1990) ) ; M . J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (ed. ), PCR : a practical approach, IRL
Press, Oxford ( 1991 ) などに記載の方法に準じて行っているし、 また市販の試薬あるい はキッ トを用いている場合はそれらに添付の指示書（protocols) や添付の薬品等を使用し ている。 実施例 1
[Fusarium oxysporum由来フク 卜ナ一ゼの Aspergillus oryzaeにおける発？ I〕
(1) プラスミ ドの構築
Fusarium oxysporum由来成熟ラク トナーゼ cDNA(N末のシグナルぺプチドおよびィントロ ン不含） を組み入れたプラスミ ド PFLC40E を制限酵素 EcoM, Xbal で処理し、 ラク トナー ゼ cDNAを含む断片を単離した。 これを blunting処理した後、 発現用プラスミ ド pNAN8142 ( 特開平 09- 9968号公報、 Biosci. Biotec nol. Biochem. , 60： 383-389， 1996)の ρ- Νο8142 プロモータ一下流の PmaCIサイ トに揷入し、 pNAN- PCを得た。
pNAN-XC はラク トナーゼ遺伝子の cMAとシグナルペプチドの配列を導入してあり、 以下 のように構築された。
F. oxysporumから全 を AGPC法 （フヱノールとチォシアン酸グァニジンを用いた方法 ) で抽出した （キッ ト名 ： IS0GEN、 二ツボンジーン） 。 この全 RNA を铸型として、 RT - PCR (PCR 使い、 ENA から舰 を増幅する方法） 法 [Access RT-PCR System ; Promega社製] を 用いて、 1. 3 kbの MA 断片を增幅した。 2つのォリゴヌクレオチド、 FusLacl (下線部に Xhol切断配列を含む） と FusLac2 (下線部に Xbal切断配列を含む） をプライマ一として使 用した。
FusLad ； 5' -AACTC6A6AT6CCTTCTTCCATTTCT6TA-3' 〔配列番号 1〕
FusLacZ ； 5' -AATCTA6ACTAATCATAGA6CTTGGGAC-3' 〔配列番号 2〕
PCR增幅条件は上記キッ トの instruction manualに従った。 PCR 産物は低融点ァガ口一 スゲルで精製し、 制限酵素 Xholと Xbalで切断した後にプラスミ ド： PNAN8142の同様の切断 部位に挿入した。
ゲノム上の完全長ラク トナーゼ遺伝子を、 FusLacl と FusLac 2をプライマ一として PCR を用いて F. oxysporumの全 DM から増幅した。 増幅した MA 断片は、 制限酵素 Xholと Xbal で切断した後にプラスミ ド： PMN8142の同様の切断部位に揷入し、 これを pMN - XG とした
(2) A. oryzae におけるラク トナーゼ遺伝子の発現
前記プラスミ ドを個別に Aspergi llus oryzae ( ATCC91002 )を、 Unkles SE ら （Mol. Gen . Genet. 218, 99-104, 1989 ) の方法により調製した Aspergi llus oryzae niaD mutant AON - 2パこ形質転換し、 ラク トナーゼ活性を測定した。 ラク トナーゼ活性測定方法は下記の 通りである。
湿菌体 50mg、 0. 5Mトリス塩酸緩衝液（pH7. 4) および 0. 61mM (80mg) パントラク トンを 含む反応液 2mL を 30°C！、 15分間、 300rpmで振とうした。 遠心により菌体を除き、 その上清 中のパントラク トンおよびパント酸を HPLCにより解析した。 酵素 111は、 1分間で 1 mol D -パントラク トンの加水分解を触媒する酵素量とした。
pNAN-XG の形質転換体が最も高いラク トナーゼ活性 （F. 0 3 0!"冊の約7. 4 倍） を示し 、 NAN-XC もまた同等の活性を示した。 PMN-PC の形質転換体においては pMN- XG のそれ の 4分の 1の活性であった （表 1 ) 。 表 1 ラク トナーゼ活性
ベクター 調べた形質転換された [mU/mg (湿重量)細胞]
宿主の数
平均 最大値
pNAN-PC 4 . 57. 0 69. 2
pNAN-XC 7 195 255
pNAN-XG 6 21 1 388
(3) 組換え酵素の比較
pNAN-XG および pNAN- XC の形質転換体の粗抽出液を SDS- PAGEに供したところ、 F. oxysp orum由来生成ラク トナーゼの分子量に相当する 60kDa の位置に発現タンパク質が認められ た （図 1 A ) 。 一方、 pMN- PC の場合は 51kDa に発現タンパク質が認められた。 ラク トナ —ゼ抗血清を用いたウェスタンプロッティ ングを行ったところ、 pNAN - XG は 60kDa に、 pN AN- PC は 51kDa に陽性バンドが検出された （図 1 B ) 。 同様に、 pNM-XC においても 60kD a の陽性バンドが検出された。
PNAN-XG および pNAN-PC形質転換体からの各組換え酵素の N末を解析したところ、 両方と も天然型と同じアミノ酸配列（Ala- Lys - Leu-Pro - Ser) を示し、 正しくプロセッシングを受 けていることが確認された。 従って、 組換え酵素間の分子量の差異は糖鎖付加の有無によ るものであると考えられた。
シグナルべプチド領域を付加しなかった pNAN_PC の形質転換体のみが脱糖鎖型の酵素を 生産したことから、 シグナルべプチドは翻訳後のポリぺプチドが糖鎖付加が起こる場所、 すなわち小胞体に輸送されるために必要なものであると考えられた。
(4 ) ラセミパントラク トンの不斉加水分解
F. oxysporumおよび A. oryzae 転換体 CpNAN - PCおよび pMN- XG )を 35% DL-パントラク トン溶液と pHを 6. 8〜7. 5 にコントロールしながら反応を行った。
pNM- PC形質転換体では、 反応初速は高いものの酵素の安定性が悪く、 2時間後にはほ とんど反応が進まなくなつた。 24時間後では DL -パントラク トンの加水分解率は 8. 52¾ で あり、 F. oxysporumの 14. 6% に比べて低かった （図 2 A ) 。 pNAN- XG 転換体の酵素は、 pN AN-PC 形質転換体の酵素よりも安定性がよく加水分解率は 19. 8¾ であった。
さらに加水分解率 50%を目指して、 酵素の安定性を高めるために、 湿菌体 5gを 115mL の
1%アルギン酸ナトリゥムに懸濁し、 2%塩化カルシウム溶液に滴下して形質転換体の固定化 を行った。 固定化菌体を用いた反応において pNM-XG および pNM- PC形質転換体の酵素ど ちらも安定性がよくなり DL -パントラク トンの加水分解率は格段に向上した。 反応 24時間 後の加水分解率は、 pNAN- XG および pMN- PC形質転換体においてそれぞれ 49. 1¾ および 21 % に達した （図 2 B ) 。 光学純度は 95¾e. e. 以上であった。 実施例 2
(Fusarium oxysporum由来ラク 卜ナーセの Acremonium chrysogenumによる分泌生産〕 (1 ) プラスミ ドの構築
Combined PCRを用いて、 Fusarium alkaline protease (Alp)プロモーター、 そのシグナ ル配列、 ラク トナーゼ遺伝子の融合遺伝子を構築した （図 3 ) 。
Alp プロモーターとそれに続く Alp シグナルペプチド、 プロペプチドをプラスミ ド pNLH 2 (特開平 5-268972号公報） を銪型にして PCE で増幅した。 使用したプライマーは以下の とおりである。
センスプライマ一 AlpPS (下線部分は合成した Sail切断配列である）
アンチセンスプライマー AlpPA (下線部は LacSプライマ一の一部とアニーリングする） 。
Al pPS: 5' -TTGTCGACGGATCCGAAA6ATGAGACCGCT-3' 〔配列番号 3〕
Al pPA; 5-GAA6CTTAGCCATGTTGATGCTGATGATGGCATCC-3' 〔配列番号 4〕
LacS; 5' -CATCAGCATCAACATGGCTAA6CTAAGCTTCCTTCTACG6CTC-3' 〔配列番号 5〕
N 末のシグナルペプチドを無く したラク トナーゼ遺伝子は ρΝΑΝ-XG を铸型にしてセンス プライマ一 LacS (下線部は AlpPA プライマーの一部分とアニーリングする） と、 アンチセ ンスプライマー FusLac2 (配列番号 2 ) を用いて PCR で増幅した。 それぞれの PCB 産物を 混合して、 AlpPS と FusLac2 をプライマ一にしてセカンド PCE を行った。 得られた PCE 断 片 （2. 3 kb) を Sall、 Xbalで切断し pBluescript に導入し lpS を構築した。
もうひとつの発現プラスミ ド pLacS はラク トナーゼ自身のシグナルペプチドを Alp プロ モーターの制御下に置くものであり、 やはり、 Combined PCEを用いて構築した。 Alp プロ モータ一はプライマ一 AlpPS と AlpPA2 (下線部は LacS2 プライマ一の一部分とァニーリ ン グする） を用いて PCRで増幅し、 ラク トナーゼ自身のシグナルペプチドをもった全長遣伝 子はプライマー LacS2 ; (下線部は AlpAP2プライマ一の一部分とァニーリ ングすることがで きる） とプライマ一 FusLac2 を用いて PCR で増幅した。
A I pPA2： 5' -T6GAAGAAGGCATCTT6TCAGGGAGTATGAAGGTTG-3' 〔配列番号 6〕'·
LacS2 : 5' -TACTCCCTGACAAGATGCCTTCTTCCTTTCTGTA-3' 〔配列番号 7〕
両方の PCB 産物を混合しプライマ一 AlpPS とプライマ一 FusLac2 を用いてセカンド PCB を行い増幅産物を Sail, Xbalで切断し pBluescript にサブクローニングした。 Ac. C ryso genum © glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GDPH) プロモーターとハイクロマ イシン B 脱リ ン酸化酵素をもつ 3. 0 kbの断片が Morita, S らにより開発された pNLH2( J. B iotechenol. 42, 1-8, 1995)から Hindlll で切り出すことができる。 この Hindlll 切断断 片を pBluescript に導入し、 pHmR とした。
( 2) Ac. chrysogenum におけるラク トナーゼ遺伝子の発現
前記プラスミ ドを個別に Ac. Chrysogenum ( ATCC11550 ) に形質転換した。 ラク トナーゼ 遺伝子が形質転換体の染色体 DM に揷入されていることを確認するために、 形質転換体の ゲノム MAを錚型とし、 ラク トナーゼ遺伝子 3'および 5'末端領域のオリゴヌクレオチドを プライマ一として PCE解析を行った。 PCB 産物をァガロースゲル電気泳動に供したところ 、 試験した 80の形質転換体の約 80% にラク トナーゼ遺伝子に相当する 1. 2kb のバンドが検 出された。
各形質転換体を 1L当り 30g Sucrose, 5g DL -メチォニン， 32g soy bean Hour, 1. 5g炭 酸カルシウム（pH6. 8 ) を含む培地で 28°C、 3日間前培養し、 さらに 500mL の培地で 28°C、 5 日間、 120strokes/minで本培養した。 その培養上清のラク トナーゼ活性を測定した。 ラク トナーゼ活性は、 0. 5Mトリス塩酸緩衝液（pH7. 4 ) 、 0. 61mM ( 80mg) D -パントラク ト ンおよび適当量の酵素を含む反応液 0. 5mL を 30°C、 15分間反応後、 反応液中のパントラク トンおよびパント酸を HPLCにより解析した。 その結果、 pAlpS および pLacS の形質転換体 の培養上清で大量のラク トナーゼが認められた （表 2 ) 。
表 2 細胞外ラク トナーゼ
ベクター 調べた形質転換された (mg/ l )
宿主の数
平均 最大値
pA l pS 1 0 57. 9 1 90
pし acS 10 43. 4 88. 8
( 3) 分泌酵素の性質
pAlpS および pLacS の形質転換体の培養上清を SDS - PAGEに供したところ、 60kDa の位置 にメジャーなバンドが認められた （図 4 ) 。 この分子量は天然の酵素に相当する。 これら のバンドを PVDFメンプレンに写し、 N 末端のアミノ酸配列を解析したところ、 両方とも天 然型と同じアミノ酸配列 (Ala-Lys-Leu-Pro-Ser-Thr-Ala-) を示した。
酵素に付加されている糖鎖の解析を行うために、 N - linked糖タンパク質由来の高マンノ —スタイプおよびハイプリッ ドオリゴサッ力ライ ドを切断するェンドグリコシダ一ゼを F. oxysporumおよび pAlpS の形質転換体からそれぞれ精製した酵素と 1, 5, 15， 60分間反応 させ、 SDS - PAGEを行った。 60, 56， 51 kDaの異なる 3種の分子量のバンドが検出された （ 図 5 ) ことから、 少なくとも 2つの N- linked糖鎮をもつことが示された。
(4) 固定化酵素の調製
pAlpS の形質転換体の培養液 500mL を 20 mM トリス塩酸緩衝液 H7. 4) に透析し、 Amic on YM - 10メンプレンを用い l OOmL に濃縮し、 酵素溶液とした。 一方、 支持体として Deol i t e A-568 を 0. 1M NaOH で洗浄し、 pHが 8. 2 になるまで精製水で洗浄した。 酵素溶液 100mL に乾燥重量 15g の洗浄 Deolite A-568 を加え、 4 °C、 24時間撹拌を行った。 酵素吸着後、 精製水で洗浄し、 2 グルタルアルデヒ ドを含む 20DIMトリス塩酸緩衝液（pH7. 4 ) 100mL で 4 °C、 24時間架橋した。
約 13. 6!¾ のタンパク質が培養液中に残り、 固定化されなかった。 固定化された酵素の D - ラク トナーゼ活性は 60. 4 U/g wet resin と見積もられ、 活性収率は 14. 8% であった （表 3 ) 表 3 投入活性 投入タンパク 吸 M ώれた 活性収率 吸〕5タンパク ' タンパク収率
(U/g-樹脂 (mg/g-榭脂 活性 (U/g) (¾) (mg/g; (¾)
(乾燥 as)) (乾燥 2 ))
008 9. 07 12了 14. 8 7. 83 86. 4
(5) 固定化酵素によるラセミパン トラク トンの不斉加水分解
酵素が固定化された resin湿重量 15g と 35¾(w/v) DL -パントラク トン 75mL を 30°Cで pH を 6. 8~7. 5 に保ち、 穏やかに撹拌しながら反応させた。 不斉加水分解は効率よく進み、 副生物である L-パント酸は検出されなかつた （図 6 ) 。 反応 9時間後、 加水分解率が 40% 、 すなわち D体の加水分解率が 80% まで進み、 24時間後では 45¾ までに達した。 産業上の利用可能性
本発明により、 天然のラク トナーゼ遺伝子を利用し、 効率よく且つ生産性に優れた該酵 素を生産するシステムを作製できる技術が開発可能となり、 また、 該酵素および該酵素を 生産するシステムを用い、 効率よく且つより生産性に優れた光学活性ァ- ラク トン生産シ ステムの構築が可能となる。 さらに、 医学上または生理学上重要なビタミ ンである D-パン トテン酸、 D -パンテノール、 パンテチンなどを製造するすぐれたシステムを構築でき、 医 薬品の他、 食品添加物、 飼料添加物、 化粧品の生産において有用である。
本発明は、 前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、 実行できることは明らかであ る。 上述の教示に鑑みて、 本発明の多くの改変及び変形が可能であり、 従ってそれらも本 件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
[配列表フリ一テキスト】
SEQ ID NO : 1， Description of Artificial Sequence : Oligonucleotide to act as a primer for PCE
SEQ ID NO : 2, Description of Artificial Sequence : Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO : 3， Description of Artificial Sequence : Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO : 4, Description of Artificial Sequence： Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO : 5, Description of Artificial Sequence : Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO : 6, Description of Artificial Sequence : Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ D NO : 7, Description of Artificial Sequence : Oligonucleotide to act as a primer for PCR

Claims

請 求 の 範 囲
1 . D-パントラク トン加水分解酵素活性を有するラク トナーゼおよびシグナルぺプ チ I、"領域をコ一ドする NA を導入されたことを特徴とするラク トナーゼ産生形質転換体。
2 . ラク トナーゼがフサリウム属由来のものであることを特徴とする請求項 1記載 のラク トナーゼ産生形質転換体。
3 . 配列表の配列番号： 9 の第 1〜38 0番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有 するラク トナーゼをコ一ドする MA ド領域をコ一ドする DNA とからなる 舰 を導入されたことを特徴とするラク トナ—ゼ産生形質転換体。
4 . シグナルぺプチド領域が配列表の配列番号： 9 の第一 20〜一 1番目のアミノ酸 からなるアミノ酸配列あるいは Alp ド領域であることを特徴とする請求項 3記載のラク トナーゼ産生形質転換体。
5 . 請求項 1〜 4のいずれか一記載のラク トナーゼ産生形質転換体を培養し、 組換 ぇラク トナーゼを産生せしめ、 得られた組換ぇラク トナーゼを得ることを特徴とする!)-パ ントラク トン加水分解酵素活性を有する組換ぇラク トナーゼの製法。
6 . —般式（I)
Figure imgf000026_0001
(R はヒドロキシル基、 アミノ基を表し、 R 1及び はそれぞれ同一または異なり、 互いに 独立に、 水素又は低級アルキル基を表す。 ） で示される化合物又はその塩を、
請求項 1〜 4のいずれか一記載のラク トナーゼ産生形質転換体の培養物、 その細胞、 細 胞処理物、 または固定化菌体、 該形質転換体から得られた組換えラク トナーゼ、 及び固定 化組換えラク トナーゼから成る群から選ばれたもの
に接触せしめることを特徴とする、 一般式（II)
Figure imgf000026_0002
(R, R 1 及び R2はそれぞれ前記に同じ。 ） 、 又は一般式（IV)
Figure imgf000026_0003
(E, R1 及び K2はそれぞれ前記に同じ。 ） で示される光学活性なァーラク トン誘導体又は その塩の製造方法。
7 . 上記一般式（I) で示される化合物又はその塩を、 請求項 1〜 4のいずれか一記 載のラク トナーゼ産生形質転換体の培養物、 その細胞、 細胞処理物、 または固定化菌体、 該形質転換体から得られた組換えラク トナーゼ、 及び固定化組換えラク トナーゼから成る 群から選ばれたものに接触せしめ、 上記一般式（IV)で示される光学活性な化合物又はその 塩を製造し、 次に該光学活性な一般式（Π)で示される化合物又はその塩を使用して公知の 方法あるいはそれと均等な方法又はその改変方法を適用して、 パントテン酸、 パントテン 酸カルシウム、 パンテノール、 パンテティン、 パントテニールェチルエーテル、 パンテチ ンなどの D-パントラク トン誘導体又はその塩を製造することを特徴とする D-パントラク ト ン誘導体又はその塩の製造方法。
8 . —般式（Π)で示される化合物、 パントテン酸、 パントテン酸カルシウム、 パン テノール、 パンテティン、 パントテニールェチルエーテル、 パンテチンなどの D-パントラ ク トン誘導体又はその塩を製造するにあたり、 請求項 1〜 4のいずれか一記載のラク トナ 一ゼ産生形質転換体の培養物、 その細胞、 細胞処理物、 または固定化菌体、 該形質転換体 から得られた組換えラク トナーゼ、 及び固定化組換えラク トナーゼから成る群から選ばれ たもの、 あるいは（1)ラク トナーゼおよびシグナルペプチド領域をコードする配列を含有 することを特徴とする MA ; (2) (a)ラク トナーゼ全長をコードする MA 配列及び（b)該ラ ク トナーゼの NH2末端シグナルべプチド領域をコ一ドする DM 配列を含有することを特徴 とする DM ;及び（3) (a)ラク トナーゼ全長をコ一ドする cDNA配列（i )又は染色体遺伝子 MA 配列（ii)及び（b) 該ラク トナーゼの NH2末端シグナルべプチド領域をコ一ドする DM 配列 を含有することを特徴とする A から成る群から選ばれた DMの使用。
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