KR101749429B1 - 올레산 수화효소 유전자, 상기 유전자를 함유한 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 불포화지방산을 10-하이드록시스테아르 산으로 전환하는 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자 및 그 발현 단백질과 상기 유전자가 도입된 재조합 벡터 및 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명의 올레산 수화효소는 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 팔미톨레산 등의 다양한 불포화지방산을 기질로 하여 10-하이드록시스테아르 산만을 최종산물로 전환시킬 수 있으므로, 본 발명의 올레산 수화효소를 이용하면 부산물의 생성 없이 친환경적으로 10-하이드록시스테아르 산을 고수율로 생산할 수 있다.

Description

올레산 수화효소 유전자, 상기 유전자를 함유한 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체{Oleate Hydratase Gene, Expression Vector Containing the Gene, and Transformant Transformed by the Vector}

본 발명은 올레산 수화효소 유전자, 상기 유전자를 함유한 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 스테노트로포모나스 나이트리티레듀센스(Stenotrophomonas nitritireducens) 균 유래의 올레산 수화효소(Oleate hydratase), 그 형질전환체, 및 이들을 이용한 불포화지방산으로부터 10-하이드록시스테아르 산을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

수산화 지방산은 자연계에 존재하는 물질로서 트리글리세롤, 왁스, 세레브로시드, 그밖에 식물이나 곤충 그리고 미생물에 존재하는 지질 등에서 발견 된다. 미생물이 불포화 지방산을 생물학적인 전환을 통하여 생산하는 수산화 지방산은 일수산화, 이수산화 그리고 삼수산화 지방산의 세 가지 유형이 있다. 수산화 지방산은 향신료를 구성하는 락톤(lactone)의 전구체로서 중요한 산업적인 물질이며, 다른 수산화 지방산이 아닌 지방산에 비하여 반응성이 좋기 때문에 레진, 왁스, 나일론, 플라스틱, 윤활제 그리고 코팅제의 시작 물질로 사용되고 화장품 원료로도 사용된다. 10-하이드록시스테아르 산은 윤활제로 사용되고, 가소체 그리고 레진을 합성하는데 사용되는 세바스산을 생산하는 중요한 물질이다.

기존에 10-하이드록시스테아르 산을 생산하는 미생물로는 플라보박테리움(Flavobacterium. sp. NRRL B-14859), 노카디아 콜레스테로리큠(Nocardia cholesterolicum) 루니말 박테리아(runimal bacteria)가 있지만 이들 미생물은 10-하이드록시스테아르 산을 낮은 수율로 생산할 뿐만 아니라 10-케도스테아르 산과 같은 부산물이 같이 생산되어 산업화시 비경제적인 단점이 있다.

한편, 본 발명자들이 특허 제10-1261002호에서 공개한 바와 같이, 스테노트로포모나스 나이트리티레듀센스(Stenotrophomonas nitritireducens) 균주를 자연에서 분리하여 10-하이드록시스테아르 산을 고농도로 생산한 바 있으나, 반응공정 및 생산 수율에 있어서 상업적인 기대치를 충족시키지 못한 어려움이 있었다. 또한, 최근에는 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 마크로코커스 캐세올리티커스(Macrococcus caseolyticus), 리시니바실러스 푸시포르미스(Lysinibacillus fusiformis) 유래 올레산 수화효소들(oleate hydratases)을 사용하여 고농도 20-하이드록시스테아르 산을 생산하였다는 보고들이 있었지만, 이들 올레산 수화효소들은 기질 특이성이 높아 리놀레 산(Linoleic acid)을 포함하는 다른 불포화지방산에 활성이 낮고, 반응 부산물로 10-하이드록시스테아르 산 이외의 다양한 수산화 지방산을 생산하여 실제 산업에 적용시키는 데 어려움이 있었다.

이에, 본 발명자들은 보다 효과적으로 올레산 수화효소를 이용하여 10-하이드록시스테아르 산을 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 스테노트로포모나스 나이트리티레듀센스(Stenotrophomonas nitritireducens)로부터 유래한 올레산 수화효소가 발현되는 형질전환체를 제조하고, 이를 이용하여 불포화지방산으로부터 부산물의 생성 없이 친환경적으로 10-하이드록시스테아르 산을 고수율로 생산할 수 있는 최적 반응 조건을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 불포화지방산을 10-하이드록시스테아르 산으로 전환하는 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자, 단백질, 재조합 벡터, 및 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 또는 그 형질전환체를 이용하여 불포화지방산을 10-하이드록시스테아르 산으로 전환하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열인 것을 특징으로 한다. 상기 유전자는 스테노트로포모나스 나이트리티레듀센스 (Stenotrophomonas nitritireducens) 균에서 유래한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 올레산 수화효소(Oleate hydratase)를 제공한다. 상기 올레산 수화효소(Oleate hydratase)의 full-length cDNA는 654개 아미노산의 폴리펩타이드를 코딩한다.

본 발명의 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 올레산 수화효소(Oleate hydratase)는 변이체를 포함하며, 변이체는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 올레산 수화효소(Oleate hydratase)와 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 말한다.

"상동성”이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 올레산 수화효소(Oleate hydratase)를 코딩하는 아미노산 서열(서열번호 2)과 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98%이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한 본 발명의 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 또는 이의 상동체는 효소 활성을 가지는 한 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 서열 변이체란 천연의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 변이체 단백질은 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내나, 단백질의 특성이 변형된 변이체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증대될 수 있다. 예를 들어, 천연의 단백질이 효소 활성을 보이지 않는 강산성이나 강알카리에서도 효소활성을 나타낼 수 있고, 저온이나 고온에서도 효소 활성을 나타낼 수 있다. 또한 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 올레산 수화효소(Oleate hydratase)의 기질 특이성을 강화되거나 효소와 반응하는 기질의 종류가 확대된 변이체일 수 있다.

상기 유전자는 올레산 수화효소(Oleate hydratase)를 코딩하는 유전자라면 어떤 염기서열을 가지는 것이라도 포함되나 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 유전자이다.

본원에 사용된 용어, "유전자"는 폴리펩타이드, 전구체, 또는 RNA(예: rRNA, tRNA)를 생산하는데 필요한 코딩서열을 포함하는 핵산(예: DNA) 서열을 언급한다. 폴리펩타이드는 완전한 길이의 코딩 서열에 의해 코딩되거나, 완전한 길이 또는 단편의 목적하는 활성 또는 기능적 특성 (예: 효소적 활성, 리간드 결합, 시그널 도입, 면역원성 등)이 유지되는 한, 코딩 서열의 일부분에 의해 코딩 될 수 있다. 또한, 상기 용어는 구조 유전자의 코딩 영역 및 상기 유전자가 완전-길이의 mRNA의 길이에 상응하도록 말단에서 약 1 kb 이상의 거리로 5' 및 3' 말단의 코딩 영역에 인접하게 위치된 서열을 포함한다. 코딩 영역의 5'에 위치되고 mRNA에 존재하는 서열을 5'-비번역 서열로 언급한다. 코딩 영역의 3' 또는 아래에 위치되고 mRNA에 존재하는 서열을 3'-비번역 서열로 언급한다.

본 발명에서 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA와 게놈 형태 모두를 포함한다. 게놈 형태 또는 유전자의 클론은 "인트론" 또는 "삽입 영역" 또는 "삽입 서열"로 불리는 비-코딩 서열에 의해 방해되는 코딩 영역을 포함한다.

인트론은 핵 RNA (hnRNA)로 전사되는 유전자의 절편이다. 인트론은 조절 요소, 예를 들어 인핸서를 포함할 수 있다. 인트론은 핵 또는 초기 전사물로부터 제거되거나 "스플라이싱"된다. 따라서, 인트론은 mRNA 전사물에는 존재하지 않는다. 번역과정 동안에 mRNA의 기능은 초기 폴리펩타이드의 아미노산의 서열 또는 순서를 특정하는 기능을 한다. 본 발명의 올레산 수화효소(Oleate hydratase)가 분리된 스테노트로포모나스 나이트리티레듀센스(Stenotrophomonas nitritireducens) 균주가 가지고 있는 전체 유전체에 대한 염기서열분석은 본 발명자들에 의해 본 연구수행을 통해 완료된 바 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자를 도입한 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 올레산 수화효소(Oleate hydratase)는 서열번호 2로 나타내는 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 유전공학적 방법을 통해 생산되어질 수 있다. 본 발명에서 상기 재조합 벡터는 상기 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자의 효율적인 발현을 위해 발현벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 적합한 발현벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈 같은 발현조절 요소들을 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

또한, 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

발현벡터는 통상의 모든 발현벡터를 다 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pUC18, pIDTSAMRT-AMP 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 리트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있다. 이러한 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

본 발명에서는 상기 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자를 플라스미드 벡터 pET 28(+)에 도입하여 재조합 발현벡터를 제작하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자가 도입된 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주의 종류로는 에셰리키아(Esherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 모라셀라(Moraxella)속, 니트로조모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바실루스(Bacillus)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스 (Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로서 들 수 있다.

예를 들면, 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명의 재조합 벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율 복제가능 한 동시에, 프로모터, 올레산 수화효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 갖는 것이 바람직하다.

세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl.Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등이 이용가능하다.

또, 재조합벡터에는 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.

본 발명에 관한 올레산 수화효소 효소의 제조는 예를 들면 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 올레산 수화효소를 생성축적시켜, 배양물로부터 올레산 수화효소 효소를 취득함으로써 행하여진다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체의 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지, M9배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 올레산 수화효소 효소를 균체 내에 축적시키고, 회수할 수 있다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스, 맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산 제1칼륨,인산 제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에,카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다. 올레산 수화효소의 취득 및 정제는 얻게 되는 배양물 중으로부터 균체 또는 상층액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔 여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.

얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-[0042] 폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴블로팅 등에 의해 행할 수 있다.

또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 올레산 수화효소 효소의 생산과 균체 내에의 축적, 및, 균체로부터의 올레산 수화효소 효소의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는 상기 본 발명의 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자가 도입된 플라스미드 벡터 pET 28(+)을 대장균 ER 2566 균주에 형질전환하여 형질전환체를 제작하였다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 또는 팔미톨레산에서 선택된 불포화지방산에 제4항의 올레산 수화효소, 또는 제6항의 형질전환체를 처리하여 10-하이드록시스테아르 산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 올레산 수화효소(Oleate hydratase)는 불포화지방산을 기질로 하여 부산물의 생성 없이 10-하이드록시스테아르 산만을 고수율로 생산할 수 있으며, 이때 사용할 수 있는 불포화지방산으로는 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 또는 팔미톨레산 등의 불포화지방산을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 올레산(oleate)를 사용하는 경우 전환 효율이 증가하여 고수율로 10-하이드록시스테아르 산을 생산할 수 있다. 하기 실시예를 참조하면, 본 발명의 올레산 수화효소(Oleate hydratase)는 150g/ℓ의 올레산을 기질로 139.6g/ℓ의 10-하이드록시스테아르 산을 생산하여 시간당 46.5 g/ℓ의 생산성과 85.4%의 전환수율을 나타낸 바 있다.

본 발명의 10-하이드록시스테아르 산을 생산하는 방법에서, 상기 불포화지방산의 10-하이드록시스테아르 산의 전환은 pH 5.5 내지 6.5 및 32℃ 내지 38℃에서 다이메틸설폭사이드를 2 내지 8(g/ℓ)의 용량으로 포함하는 유기용매 조건에서 수행되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 반응 시간은 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 40g/ℓ의 형질전환체의 균체 농도에서는 3시간 정도 반응시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 불포화지방산을 10-하이드록시스테아르 산으로 전환하는 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자, 단백질, 재조합 벡터, 및 형질전환체를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 올레산 수화효소는 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 팔미톨레산 등의 다양한 불포화지방산을 기질로 하여 10-하이드록시스테아르 산만을 최종산물로 전환시킬 수 있다.

(ⅲ) 따라서, 본 발명의 올레산 수화효소를 이용하면 부산물의 생성 없이 친환경적으로 10-하이드록시스테아르 산을 고수율로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명의 올레산 수화효소와 종래 올레산 수화효소 간의 아미노산 서열의 상동성을 비교한 그림이다.
도 2는 본 발명의 올레산 수화효소로 형질전환된 대장균에서 pH 변화가 10-하이드록시스테아르 산 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 올레산 수화효소로 형질전환된 대장균에서 온도 변화가 10-하이드록시스테아르 산 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 올레산 수화효소로 형질전환된 대장균의 10-하이드록시스테아르 산 생산에 있어 유기용매의 종류의 변화에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 첨가된 유기용매의 농도 변화에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 올레산 수화효소로 형질전환된 대장균의 10-하이드록시 스테아르 산을 생산하는데 있어 최적의 균체 농도를 나타내는 그래프이다.
도 7은 기질의 농도 변화에 따른 전환 활성을 나타낸 그래프이다(● : 재조합 대장균 10-하이드록시스테아르 산 ○: 재조합 대장균 10-하이드록시스테아르 산 일드(yield))
도 8은 본 발명의 올레산 수화효소로 형질전환된 대장균과 스테노트로포모나스 나이트리티레듀센스 와일드-타입(wild-type)균을 이용한 10-하이드록시스테아르 산의 시간별 생산량을 나타낸 그래프이다(○ : 재조합 대장균 올레산, ●: 재조합 대장균 10-하이드록시스테아르 산, △: Wild-type 올레산, ▲: Wild-type 10-하이드록시스테아르 산).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 ““는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1. 올레산 수화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조

건국대학교 오덕근 교수의 실험실에서 보유하고 있는 여러 종의 스테노트로포모나스 나이트리티레듀센스(Stenotrophomonas nitritireducens) 균주를 대상으로 Molecular Cloning 방식으로 올레산 수화효소 유전자를 분리하였다.

구체적으로, 스테노트로포모나스 나이트리티레듀센스(Stenotrophomonas maltophilia) 균주들로부터 올레산 수화효소를 분리해내기 위하여 고속 단백질 액상 크로마토그래피(Fast protein liquid chromatography)를 이용하여 올레산 수화효소들을 분리해냈고, 이들로부터 깁슨 조합 방식(Gibson assembly method)을 이용하여 올레산 수화 효소들의 DNA 염기서열 후보군을 도출하고, 서열번호 3의 포워드 프라이머(primer)(F: 5'-CATATGGAAGAAGTGAGTTATCCCAAA-3'와 서열번호 4의 리버스 프라이머(R: 5'-CTCGAGTCAGGCGCCCG-3')를 고안하였다. 이들 프라이머를 이용하여 스테노트로포모나스 나이트리티레듀센스(Stenotrophomonas nitritireducens) 균주들이 cDNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하고 해당 유전자들의 염기서열을 증폭하였다.

상기 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 대량으로 얻은 올레산 수화효소 유전자를 제한효소 NdeⅠ과 Xho Ⅰ을 사용하여 플라스미드 벡터 pET 28(+)(Novagen사 제품)에 삽입하여 재조합 벡터[pET 28(+)a/올레산 수화효소]를 제작하였다.

상기와 같이 제작된 재조합 발현벡터들을 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질전환하였다. 이렇게 제작된 형질전환체들의 올레산 수화효소 활성을 분석한 후, 가장 높은 활성을 보이는 형질전환체를 분리하고, 도입된 유전자의 서열을 분석하여 서열번호 1의 유전자 서열과 서열번호 2의 아미노산 서열을 획득하였다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 단백질은 ClustalW 방법으로 정렬하였으며, 계통 발생적(phylogenetic) 분석은 ClustalW2 Phylogeny tool(EMBL-EBI, UK)으로 수행하였다.

본 발명의 올레산 수화효소의 계통 발생적 분석 결과, 본 발명의 올레산 수화효소는 E. meningoseptica 균주의 수화효소와 아미노산 수준에서 55.3% 수준에서 상동성을 갖는 결과를 보였다(도 1).

상기 서열번호 1의 유전자 서열이 도입된 형질전환체에 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 10-하이드록시스테아르 산의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

실시예 2. 올레산 수화효소의 제조 및 회수

상기 서열번호 1의 올레산 수화효소 유전자가 형질전환된 형질전환체를 500 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 50μg/ml의 카나마이신이 함유된 플라스크에서 37℃, 200rev/min의 통기조건 하에서 배양하였다. 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, 올레산 수화 효소 발현을 유도하기 위하여 IPTG를 최종농도로 0.1mmol/L 첨가한 후, 그 배양액을 12시간 동안 16℃에서 150rev/min로 교반하면서 배양하였다.

배양된 올레산 수화 효소를 생산하는 대장균 형질전환체를 모아서 사용하였다. 또한, 상기와 같이 과발현 되어 생산된 올레산 수화 효소는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 10-하이드록시스테아르 산을 생산하기 위한 효소로 사용하였다.

실시예 3. pH 변화가 10-하이드록시스테아르 산 생산 활성에 미치는 영향

상기 형질전환체의 10-하이드록시스테아르 산 생산에 pH 변화가 미치는 영향을 조사하기 위하여, 기질로 0.14g/L 올레산을 첨가한 50mmol/L 씨트레이트/포스페이트(citrate/phosphate buffer) 완충용액에서 pH 5.0에서부터 8.0 범위까지 10-하이드록시스테아르 산 생산 반응을 조사하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 pH 5.5 내지 6.5이고, pH 6.5에서 활성이 가장 높은 것으로 나타났다.

실시예 4. 온도 변화가 10-하이드록시스테아르 산 생산 활성에 미치는 영향

상기 형질전환체의 10-하이드록시스테아르 산 생산에 대한 온도 변화 효과를 조사하기 위하여, 기질로 0.14g/L 올레산을 첨가한 pH 6.5의 50mM 씨트레이트/포스페이트 완충용액(citrate/phosphate buffer)에서 20-45℃의 온도에서 각각 10분 동안 반응을 실시하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 최적 온도는 32℃ 내지 38℃이고, 35℃에서 활성이 가장 높은 것으로 나타났다.

실시예 5. 유기용매 종류 및 농도에 따른 생물 전환 활성 조사

상기 서열번호 1의 올레산 수화효소 유전자가 형질전환된 형질전환체를 이용하여 올레산으로부터 10-하이드록시스테아르산을 생산하는 활성을 조사하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 과정으로 균주를 배양하였다.

유기용매 종류의 효과를 조사하기 위하여 반응은 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 다이메틸설폭사이드, 부탄올, 헥세인, 아세톤, 톨루엔을 유기용매로 선정하여 0.14g/ℓ 올레산과 0.05g/ℓ 올레산 수화효소를 함유한 50 mM 씨트레이트/포스페이트 완충용액을 pH 6.5 조건에서 각각 10분 동안 반응시켰으며, 이 때 반응액 양과 같은 양의 에틸 아세테이트를 넣어 반응을 종료시킨 다음, 10-하이드록시스테아르산의 생산량을 측정하여 그 상대적인 결과를 도 4에 나타내었다. 그 결과, 다이메틸설폭사이드를 유기용매로 사용한 경우 올레산 수화효소의 활성이 가장 높은 것으로 나타났다.

다이메틸설폭사이드의 농도별 효과를 조사하기 위하여 0%에서 12.5%까지 범위에서 0.14 g/ℓ 올레산과 0.05 g/ℓ 올레산 수화효소를 함유한 50 mM 씨트레이트/포스페이트 완충용액을 pH 6.5 조건에서 각각 10분 동안 반응시켰으며, 반응액 양과 같은 양의 에틸 아세테이트를 넣어 반응을 종료 한 후 10-하이드록시스테아르산의 생산량을 측정하여 상대적인 결과를 도 5에 나타냈었다. 그 결과, 다이메틸설폭사이드의 농도가 2 내지 8g/ℓ인 경우 활성이 높았으며, 5g/ℓ 농도가 가장 최적의 활성을 보임을 확인하였다.

실시예 6. 올레산 수화효소 형질전환체의 기질 특성

상기 서열번호 1의 올레산 수화효소 유전자가 형질전환된 형질전환체를 대상으로 다양한 불포화 지방산을 기질로 하여 기질 특이성을 조사하기 위하여, 상기 실시 예 1과 동일한 과정으로 균주를 배양하였다.

불포화 지방산 종류에 따른 10-수산화 지방산의 생산능력을 비교하기 위하여 불포화지방산으로 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 팔미톨레산을 기질로 사용하였다. 반응 시, 각각 0.14 g/ℓ의 지방산과 0.05g/ℓ의 형질전환체를 포함하는 50 mM 씨트레이트/포스페이트 완충용액을 pH 6.5 조건에서 각각 10분 동안 반응시켰다. 10 경과 후, 반응액 양과 같은 양의 에틸 아세테이트를 넣어 반응을 종료 시키고, 생산된 10-하이드록시스테아르산의 생산량을 측정하여 그 상대적인 결과를 아래 표 1에 나타내었다.

[표 1]

그 결과, 본 발명의 올레산 수화효소는 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 및 팔미톨레산을 모두 기질로 하여 10-하이드록시스테아르산을 생성하여 기질 스펙트럼이 넓은 것으로 나타났다.

한편, 다양한 불포화지방산으로부터 10-하이드록시스테아르 산을 생산하는 상대적인 활성은 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 팔미톨레산의 순서로 높았다.

실시예 7. 형질전환체의 농도 및 올레산의 농도 변화에 따른 활성 조사

상기 서열번호 1의 올레산 수화효소 유전자가 형질전환된 형질전환체의 균체 농도 및 기질인 올레산 농도 변화에 따른 활성을 조사하기 위해, 상기 실시예 1과 동일한 과정으로 균주를 배양하였다.

배양된 균주의 다양한 농도의 균체량 및 기질 조건 하에서 균체와 기질을 반응시키고 10-하이드록시스테아르 산의 생산량을 각각 비교하였다.

먼저, 본 발명의 형질전환체의 농도에 따른 효과를 조사하기 위하여, 30g/ℓ 올레산을 기질로 하고, 5% 다이메틸설폭사이드가 함유된 pH 6.5의 50 mM 씨트레이트/포스페이트 완충용액에서 10g/ℓ에서부터 50g/ℓ 범위의 형질전환된 균체 농도를 첨가하여 반응시켰다. 상기의 반응양은 1㎖로 15㎖ 용량의 플라스틱 용기에서 혐기조건으로 이루어졌다. 이 때 반응 온도는 35 ℃이고, 반응 시간은 3시간으로 조정하였다. 그 다음 10㎖의 에틸아세테이트 용액을 첨가하여 전환 반응을 종료하고, 생산된 10-하이드록시스테아르산의 양을 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 그 결과, 균체 농도가 40g/ℓ 이상으로 첨가되면 최대전환 효율을 보였다.

기질 농도에 따른 전환 효율을 조사하기 위하여, 올레산의 농도를 30g/ℓ에서 300g/ℓ까지의 범위에서 40g/ℓ 균체, 5% 다이메틸설폭사이드가 함유된 pH 6.5의 50mM 씨트레이트/포스페이트 완충용액을 질소 치환한 후 반응시켰다. 10㎖의 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료시킨 다음, 10-하이드록시스테아르 산 생산량을 측정하여 도 7에 나타내었다. 그 결과, 기질인 올레산의 농도 250g/ℓ인 경우 85.4%의 비율로 올레산이 10-하이드록시스테아르 산으로 전환됨을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 올레산 수화효소 형질전환체의 10-하이드록시스테아르 산 생산 효율

상기 서열번호 1의 올레산 수화효소 유전자가 형질전환된 형질전환체의 10-하이드록시스테아르 산의 생산 효율을 확인하기 위하여, 효소의 최적 활성 조건인 pH 6.5, 35℃ 조건에서 150g/ℓ의 올레산을 기질로 하여 10-하이드록시스테아르 산의 시간별 생산량을 측정하였다. 대조군으로는 종래 10-하이드록시스테아르 산 생성능이 가장 좋은 것으로 알려진 스테노트로포모나스 나이트리트리더센스(수탁번호 KACC91585P) 균주를 사용하였다.

그 결과, 올레산 수화효소가 도입된 본 발명의 형질전환체는 139.6g/ℓ의 10-하이드록시스테아르 산을 생산하여 시간당 46.5 g/ℓ를 생산하였고, 85.4%의 전환수율을 나타내었다. 반면, 스테노트로포모나스 나이트리트리더센스(수탁번호 KACC91585P) 균주를 사용한 대조군의 경우, 99.7g/ℓ의 10-하이드록시스테아르 산을 생산하여 시간당 33.1g/ℓ를 생산하였고, 66.4%의 전환수율을 나타내었다(도 8).

상기와 같은 결과로 본 발명의 올레산 수화효소 유전자가 형질전환된 형질전환체는 종래 균주에 비해 10-하이드록시스테아르 산 생산 효율이 대략 1.4배 개선된 우수한 균주임을 알 수 있었다.

SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Biological Resources KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Oleate hydratase gene, expression vector containing the gene, and transformant transformed by the vector <130> acase151128 <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1962 <212> DNA <213> Stenotrophomonas nitritireducens <400> 1 atggaagaag tgagttatcc caaagctgga ccgagcattg aagcgaacgt aggggatggg 60 cactggcgaa aggggccctc ggatacgctg ccgcctccgg acactgttgg accctatatg 120 cgcaaccgcc ccctgcctgt ggatcaagtg gaaggcagga aagcatggat catcggaagt 180 ggaatcgcgg gtctggcctc tgccttttac ttgatccgcg acgggcggat gaaggggcag 240 gacataacca tcctcgatgc cgtgggcact ccaggcggat cactggacgg ctcagggaac 300 gccgaagatg gctacctgat ccgaggcggg cgcgagatga actggaacta cgatcacttt 360 tgggatctct tccaggacat tcccgcgctg gagtacccgt ccccttactc ggtcttggat 420 gagtatcggg cggtgaacga caatgatcct aattggtcca agtcccgatt gatgcacaag 480 caaggccaaa ttcgggattt cagcaccttg gggctttctt ccgcccacca atgggaattg 540 atcaagcttc tcctgaagcg caaggaggac ctcgatgaca tcaccatcga acagtacttc 600 agcgatagct ttctggagac caacttctgg tacctctggc gctcgatgtt tgcgttccag 660 aactggcaaa gtctgctgga agtgaagttg tacatgcatc gctttttgga tgcaatcgac 720 ggcttgacgg atatgtcagc gctcgtgttc ccaaaataca accagtacga cagcttcgtc 780 gtccccctgg tcaactacct caagggccaa ggcgtcaacg tagaattcgg cacgcgcgtc 840 tacgacctgg acatgacgga caacaacggc gagcgtaccg tgacctccat tcttgcgaag 900 gtagacgggc gggatcagaa gattgacatc ggcgcgaagg acgtggtttt tgccctgact 960 ggatcgatga cggagggtac agcctacggc gatctggata ctgctcccga cctcactcga 1020 gccaccacgc cccctggcga ctcaagcgat tgggcgttgt ggcagaacct ggccaagaag 1080 tcccacgtct ttggtaagcc tgaaaagttc tgcgggcaac ccagtcgctc gatgtgggag 1140 tctgccaccc tgacgtgcaa gccttcgccg ttgaccgagc gcctcaaaga tctctcaatc 1200 aatgaccctt attcgggaaa aacggtgacc ggtggaatca tcacctttac cgactcgaac 1260 tgggttctca gcttcacctg caatcgtcaa ccgcatttcc ccacacaacc agacgacgta 1320 ctggtgcttt gggtctatgc cttggtcatg gacagcaaag gcaaccatgt actaaaacca 1380 atgcctgagt gtacgggccg cgaaattctt gctgagcttt gctaccacct cggcattgtg 1440 gatcaggtgg atgaagtggc cagacagacc aaggttcgcc ttgccctgat gccattcatc 1500 acggctcaat ttatgccacg agctgctgga gatcgaccgc gtgttgttcc agccgggtgc 1560 accaatctcg ctctgctggg ccaattcgtg gagacgtcta atgacatcat cttcaccatg 1620 gagagttccg tcaggactgc gcggattggc gtgtacacgc ttctggggct acgaaagcag 1680 gtcgccgata tcagccccac gcaatacgac gtccgaaatc tgatcaaggg tgctcgtgcc 1740 ctgaacaaca acgagccgtt catgggcgag cggctgctcc atcgactgct cgacaacacc 1800 tacttcgccc acatcctccc gccgctgcca gcaggagacg gtggatccag cgatcaagcg 1860 gcaagctcgc gtatgaaggc caaccacact gcggcggcgg cacttggagc ggtgtctgat 1920 tggatccatc atgttcggga taaactgaag ccgggcgcct ga 1962 <210> 2 <211> 654 <212> PRT <213> Stenotrophomonas nitritireducens <400> 2 Met Glu Glu Val Ser Tyr Pro Lys Ala Gly Pro Ser Ile Glu Ala Asn 1 5 10 15 Val Gly Asp Gly His Trp Arg Lys Gly Pro Ser Asp Thr Leu Pro Pro 20 25 30 Pro Asp Thr Val Gly Pro Tyr Met Arg Asn Arg Pro Leu Pro Val Asp 35 40 45 Gln Val Glu Gly Arg Lys Ala Trp Ile Ile Gly Ser Gly Ile Ala Gly 50 55 60 Leu Ala Ser Ala Phe Tyr Leu Ile Arg Asp Gly Arg Met Lys Gly Gln 65 70 75 80 Asp Ile Thr Ile Leu Asp Ala Val Gly Thr Pro Gly Gly Ser Leu Asp 85 90 95 Gly Ser Gly Asn Ala Glu Asp Gly Tyr Leu Ile Arg Gly Gly Arg Glu 100 105 110 Met Asn Trp Asn Tyr Asp His Phe Trp Asp Leu Phe Gln Asp Ile Pro 115 120 125 Ala Leu Glu Tyr Pro Ser Pro Tyr Ser Val Leu Asp Glu Tyr Arg Ala 130 135 140 Val Asn Asp Asn Asp Pro Asn Trp Ser Lys Ser Arg Leu Met His Lys 145 150 155 160 Gln Gly Gln Ile Arg Asp Phe Ser Thr Leu Gly Leu Ser Ser Ala His 165 170 175 Gln Trp Glu Leu Ile Lys Leu Leu Leu Lys Arg Lys Glu Asp Leu Asp 180 185 190 Asp Ile Thr Ile Glu Gln Tyr Phe Ser Asp Ser Phe Leu Glu Thr Asn 195 200 205 Phe Trp Tyr Leu Trp Arg Ser Met Phe Ala Phe Gln Asn Trp Gln Ser 210 215 220 Leu Leu Glu Val Lys Leu Tyr Met His Arg Phe Leu Asp Ala Ile Asp 225 230 235 240 Gly Leu Thr Asp Met Ser Ala Leu Val Phe Pro Lys Tyr Asn Gln Tyr 245 250 255 Asp Ser Phe Val Val Pro Leu Val Asn Tyr Leu Lys Gly Gln Gly Val 260 265 270 Asn Val Glu Phe Gly Thr Arg Val Tyr Asp Leu Asp Met Thr Asp Asn 275 280 285 Asn Gly Glu Arg Thr Val Thr Ser Ile Leu Ala Lys Val Asp Gly Arg 290 295 300 Asp Gln Lys Ile Asp Ile Gly Ala Lys Asp Val Val Phe Ala Leu Thr 305 310 315 320 Gly Ser Met Thr Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Asp Leu Asp Thr Ala Pro 325 330 335 Asp Leu Thr Arg Ala Thr Thr Pro Pro Gly Asp Ser Ser Asp Trp Ala 340 345 350 Leu Trp Gln Asn Leu Ala Lys Lys Ser His Val Phe Gly Lys Pro Glu 355 360 365 Lys Phe Cys Gly Gln Pro Ser Arg Ser Met Trp Glu Ser Ala Thr Leu 370 375 380 Thr Cys Lys Pro Ser Pro Leu Thr Glu Arg Leu Lys Asp Leu Ser Ile 385 390 395 400 Asn Asp Pro Tyr Ser Gly Lys Thr Val Thr Gly Gly Ile Ile Thr Phe 405 410 415 Thr Asp Ser Asn Trp Val Leu Ser Phe Thr Cys Asn Arg Gln Pro His 420 425 430 Phe Pro Thr Gln Pro Asp Asp Val Leu Val Leu Trp Val Tyr Ala Leu 435 440 445 Val Met Asp Ser Lys Gly Asn His Val Leu Lys Pro Met Pro Glu Cys 450 455 460 Thr Gly Arg Glu Ile Leu Ala Glu Leu Cys Tyr His Leu Gly Ile Val 465 470 475 480 Asp Gln Val Asp Glu Val Ala Arg Gln Thr Lys Val Arg Leu Ala Leu 485 490 495 Met Pro Phe Ile Thr Ala Gln Phe Met Pro Arg Ala Ala Gly Asp Arg 500 505 510 Pro Arg Val Val Pro Ala Gly Cys Thr Asn Leu Ala Leu Leu Gly Gln 515 520 525 Phe Val Glu Thr Ser Asn Asp Ile Ile Phe Thr Met Glu Ser Ser Val 530 535 540 Arg Thr Ala Arg Ile Gly Val Tyr Thr Leu Leu Gly Leu Arg Lys Gln 545 550 555 560 Val Ala Asp Ile Ser Pro Thr Gln Tyr Asp Val Arg Asn Leu Ile Lys 565 570 575 Gly Ala Arg Ala Leu Asn Asn Asn Glu Pro Phe Met Gly Glu Arg Leu 580 585 590 Leu His Arg Leu Leu Asp Asn Thr Tyr Phe Ala His Ile Leu Pro Pro 595 600 605 Leu Pro Ala Gly Asp Gly Gly Ser Ser Asp Gln Ala Ala Ser Ser Arg 610 615 620 Met Lys Ala Asn His Thr Ala Ala Ala Ala Leu Gly Ala Val Ser Asp 625 630 635 640 Trp Ile His His Val Arg Asp Lys Leu Lys Pro Gly Ala Glx 645 650 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 catatggaag aagtgagtta tcccaaa 27 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctcgagtcag gcgcccg 17

Claims (9)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자.
2. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자.
3. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 스테노트로포모나스 나이트리티레듀센스 (Stenotrophomonas nitritireducens) 균 유래인 것을 특징으로 하는 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자.
4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 올레산 수화효소(Oleate hydratase).
5. 제1항 또는 제2항의 올레산 수화효소(Oleate hydratase) 유전자를 도입한 재조합 벡터.
6. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
7. 제6항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균 ER 2566 균주에 상기 제5항의 재조합 백터가 형질전환된 형질전환체인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
8. 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 또는 팔미톨레산에서 선택된 불포화지방산에 제4항의 올레산 수화효소, 또는 제1항의 올레산 수화효소 유전자를 도입한 재조합 백터가 형질전환된 형질전환체를 처리하여 10-하이드록시스테아르 산을 생산하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 불포화지방산의 10-하이드록시스테아르 산으로의 전환은 pH 5.5 내지 6.5, 32℃ 내지 38℃, 및 2 내지 8(g/ℓ)의 다이메틸설폭사이드 유기용매 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

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