KR20220048140A

KR20220048140A - 신규한 스테노트로포모나스 균주 및 이를 이용하는 수산화 지방산의 제조방법

Info

Publication number: KR20220048140A
Application number: KR1020200130938A
Authority: KR
Inventors: 유종현
Original assignee: 주식회사 그린위치
Priority date: 2020-10-12
Filing date: 2020-10-12
Publication date: 2022-04-19
Also published as: KR102527521B1

Abstract

본 발명은 미생물을 이용한 수산화 지방산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 올레산 수화효소를 과발현하도록 유전적으로 재조합된 신규한 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 균주 및 이를 이용한 수산화 지방산의 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규한 스테노트로포모나스 균주 및 이를 이용하는 수산화 지방산의 제조방법{Novel Stenotrophomonas sp. strain and method for manufacturing hydroxy fatty acid by using the same}

수산화 지방산(HFA, Hydroxy fatty Acid)은 하나 이상의 위치에 수산화기(Hydroxyl group)를 함유하고 말단에는 카르복실기(carboxyl group)가 있는 긴 탄소사슬로 구성된 포화 또는 불포화된 지방산을 의미한다. 수산화 지방산(hydroxy fatty acid)은 자연계에 존재하는 물질로서 동물, 식물, 곤충 그리고 미생물 등 여러 생물체의 지질 등에 존재하며, 왁스, 트리글리세롤, 세레브로시드 등에서도 발견된다. 일반적으로 수산화 지방산은 점성이 있고 수산화기를 가지기 때문에 다른 비수산화지방산에 비해 반응성이 커서 레진, 왁스, 나일론, 플라스틱, 윤활제, 화장품, 코팅과 같은 다양한 분야의 산업에서 사용되며 최근에는 생물의학(biomedical)을 위한 생물활성(bioactive)으로도 사용되고, 향장산업과 식품향과 관련된 산업 분야의 출발물질로도 사용된다.

10-하이드록시 스테아르산(10-HydroxyStearic Acid)는 전형적인 수산화 지방산으로서 다양한 장내 미생물과 젖산균에 의해 올레산(OA, Oleic Acid)으로부터 생산된다. Wallen 등은 Pseudomonas sp. strain 3266이 올레산을 10-하이드록시스테아르산으로 전환함을 밝혀냈다(Wallen L.L. et al., Arch Biochem Biophys 99:249-253, (1962)). 다른 불포화지방산과 마찬가지로 올레산은 많은 박테리아에서 세포 성장 저해를 유발하는 독성을 나타내었다. 이는 올레산 내에 있는 이중결합이 킹크(kink) 형성을 유발해 막구조의 안정성을 방해하기 때문이다. 현재, MCRA(Myosin Cross-Reactive Antigen) 단백질을 품은 박테리아의 해독 매커니즘으로 수산화 반응을 이용하여 불포화지방산을 수산화하는 전략이 시도되고 있다.

수산화 반응은 수산화기와 수소이온이 화합물에 첨가되는 화학첨가 반응이다. 2009년에 올레산 수화효소(oleate hydratase)가 수산화 반응을 촉매시키는 효소적 특성을 가짐이 확인되었다. ¹⁸O-표지된 물(labeled water)을 이용한 연구 결과 상기 반응은 10-히드록시 스테아르산의 10번 자리 탄소에 ¹⁸O가 결합하는 가역적인 수화 반응(hydration mechanism)임을 확인했다(도 1 참조).

미생물의 생물전환에 의해 생성된 수산화 지방산은 지방산에 첨가된 수산화기에 의해 다른 비수산화 지방산에 비하여 높은 점성과 반응성 등의 특이한 성질을 가지며, 이러한 특성으로 인해 수지류, 왁스류, 나일론, 플라스틱, 윤활제, 화장료 등에 중요한 전구물질로 사용될 수 있고, 코팅제 및 페인트의 첨가물로서도 사용될 수 있다.

이러한 견지에서 본 발명자들은 미생물의 생물전환에 의해 수산화 지방산을 제조하는 생산 공정 기술 개발을 위해 예의 연구한 결과, 올레산 수화효소를 과발현하도록 유전적으로 재조합된 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 균주를 균접합으로 제조하고, 이를 이용하여 고수율로 올레산을 10-하이드록시 스테아르산으로 전환할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 미생물을 이용하여 수산화 지방산을 고수율로 얻는 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 사용하기 위한 신규 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 또한, 본 발명은 기탁번호 (KCTC18850P)로 수탁된, 수산화 지방산 생산능을 가지는 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 및 불포화 지방산 기질을 이용하는 생물전환 공정으로 수산화 지방산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 신규한 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 균주를 제조하여 고수율로 수산화 지방산을 생산할 수 있다.

도 1은 올레산 수화효소(oleate hydratase)에 의해 올레산(oleic acid)이 10-히드록시 스테아르산(hydroxystearic acid)로 전환되는 반응을 나타낸 것이다.
도 2는 단백질 정제 중에 나온 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332의 올레산 수화효소(oleate hydratase) SDS-PAGE 결과이다. (분획: Ni-affinity chromatography 후. 단백질 활성 측정 전에 10% SDS-PAGE gel에 단백질을 채움)
도 3은 본 발명에서 사용한 pRK415K 플라스미드의 개열지도이다.
도 4는 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332와 재조합된 pRK415K 플라스미드에서 올레산 수화효소의 유전자 서열 비교 결과이다.
도 5는 pRK415K 플라스미드와 본 발명의 접합균주가 포함하는 pSteOH415의 아가로스 겔 전기영동 결과이다(첫 번째 열-size marker, 두 번째 열-pRK415K(12.5kb), 세 번째 열-pSteOH415(14.5kb)). 세 밴드는 1% agarose gel에 넣어졌다. pSteOH415가 pRK415K보다 위쪽에 위치하였다.
도 6은 (A)원균주 (B)본 발명의 접합균주 (C)효소 활성 측정에 의한 올레산 유래 전환 산물의 메틸 에스테르의 GC 결과로서, 표시된 GC 피크는 헥산(RT=2.3min), 올레산(RT=16.4min), 10-히드록시 스테아르산(RT=18.5min)이다.
도 7은 10-히드록시 스테아르산 메틸 에스테르의 전자 충격 질량 분석(Electron-impact mass spectrum)(RT=18.5min) 결과이다.
도 8은 원균주와 본 발명의 접합균주에 의한 올레산으로부터 10-히드록시 스테아르산의 전환 수율에 대한 기질로서 올레산 농도의 효과를 나타낸 것이다. 생물 변형은 pH 6.5, 26℃에서 100ml의 주 배양배지를 함유하는 500ml 플라스크 내에서 48시간 동안 210rpm의 교반과 함께 혐기 조건 하에서 수행되었다. 모든 반응은 3회 수행되었다.
도 9는 원균주와 본 발명의 접합균주에 의해 48시간 동안 8시간마다 10-히드록시 스테아르산을 생산하는 시간 경과 흐름을 나타낸 것이다. 생물전환은 48시간 동안 210rpm으로 교반하며 pH 6.5 및 26℃에서 주 배양배지를 함유하는 500ml 플라스크에서 수행되었다. 기질로서 올레산을 9g/L로 첨가하였다.
도 10은 주 배양 동안 탄소원으로 남아있는 글루코스의 양을 나타낸 것이다. 남아있는 글루코스의 양은 DNS 방법을 이용한 글루코스 표준 곡선(glucose standard curve)로 산출되었다.
도 11은 FAD 유무에 따른 올레산 수화효소의 올레산으로부터 10-히드록시 스테아르산으로의 전환수율 비교 결과이다.
도 12는 원균주와 재조합 균주의 세포추출액을 이용한 올레산으로부터 10-히드록시 스테아르산의 전환수율 비교 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 기탁번호 (KCTC18850P)로 수탁된, 수산화 지방산 생산능을 가지는 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 균주에 관한 것이다.

상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 올레산 수화효소를 포함한다.

상기 수산화 지방산은 10-히드록시스테아르산(10-hydroxystearic acid), 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산[10-hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid], 10-히드록시-12,15(제트,제트)-옥타데카디엔산(10-hydroxy-12,15(Z,Z)-octadecadienoic acid), 10-히드록시-6,12(제트,제트)-옥타데카디엔산(10-hydroxy-6,12(Z,Z)-octadecadienoic acid) 및 10-히드록시팔미트산 (10-hydroxypalmitic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 균주는 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332를 균접합(Bacterial conjugation)에 의해 유전적으로 재조합한 것이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332을 균접합(bacterial conjugation)하여 신규한 균주를 제조하고 상기 균주의 재조합 균주를 이용하여 불포화 지방산인 올레산을 수산화 지방산으로 고수율로 전환할 수 있음을 발견하였다. 상기 균주의 높은 수산화 지방산 생산능을 확인하였으며(도 12), 배지 조성, 성장 시간, 접종 밀도, 기질 농도와 같은 배양 조건을 최적화하여 원균주보다 수산화 지방산으로의 올레산의 전환 수율을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다(도 8 내지 도 11, 및 표 1 내지 표 3). 따라서, 제조한 균주를 기탁기관에 기탁하였다(기탁번호: KCTC18850P),

스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332는 전체 유전자 분석을 통해 올레산 수화효소를 암호화하는 유전자를 가짐이 확인되었다. 본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는, 상기 올레산 수화효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하여, 이를 숙주 세포로 이동시켜 증여세포를 제조한 다음, 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 균주와 균접합(Bacterial conjugation)을 수행하여, 올레산 수화효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 균주를 제조하였다.

상기 발현 벡터는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 pET-28a 플라스미드, pRK415K 플라스미드를 사용하였다.

벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli B21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 숙주세포로 E. coli DH5α, E. coli B21 등을 사용하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 올레산 수화효소를 포함하는 pRK415K 플라스미드(본 발명에서는 pSteOH415로 부르기로 한다)를 포함하는 E.coli S17-1(증여세포)를 제조하였다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 올레산 수화효소를 포함하는 pET-28a 플라스미드(본 발명에서는 pSteOH28로 부르기로 한다)를 포함하는 E.coli BL21를 제조하였다.

상기 "균접합(Bacterial conjugation)"은 두 세포 간의 세포 대 세포 접촉 또는 브릿지 유형의 연결에 의해 박테리아 세포간에 유전 물질이 이동하는 것을 말한다. 본 발명에서는 증여세포를 제조한 다음, 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 균주와 균접합(Bacterial conjugation)을 수행하여, 올레산 수화효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 균주로 이동시켜 형질전환시켰다.

또한, 본 발명은 신규한 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 균주 및 불포화 지방산 기질을 이용하는 생물전환 공정으로 수산화 지방산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 "생물전환(biotransformation)"이란 살아있는 세포, 특히 미생물 세포에 의해 화합물이 대사되는 과정을 가리키는 것이다.

상기 불포화 지방산 기질은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 감마 리놀렌산(γ-linolenic acid) 및 팔미톨레산(palmitoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 수산화 지방산은 10-히드록시스테아르산(10-hydroxystearic acid), 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산[10-hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid], 10-히드록시-12,15(제트,제트)-옥타데카디엔산(10-hydroxy-12,15(Z,Z)-octadecadienoic acid), 10-히드록시-6,12(제트,제트)-옥타데카디엔산(10-hydroxy-6,12(Z,Z)-octadecadienoic acid) 및 10-히드록시팔미트산 (10-hydroxypalmitic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은, 신규한 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 균주를 이용하여 올레산(oleic acid)을 10-하이드록시스테아르산(10-hydroxystearic acid)으로 전환하였다.

10-히드록시 스테아르산(10-hydroxystearic acid)은 올레산의 이성질체로서 윤활제로 많이 사용되고 있고, 가소체 및 레진에 사용되는 세바스산을 생산하는 데 중요한 물질이기도 하다. 그러나 이 물질은 몇몇 과일에 소량으로 존재하기 때문에 유기합성에 의한 합성이 되고 있는데, 세계적으로나 국내의 국민 소득의 증가와 천연 음식 및 향장 소재의 요구, 소비재의 고급화 추세로 인한 천연물질이 안정성과 기호도에서 선호되는 경향으로 생물전환을 이용한 방법이 요구되고 있으며, 고순도의 물질을 얻기 위한 분리정제 방법 또한 요구된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 생물전환 공정은 1) 선배양 및 2) 주배양의 2단계의 배양으로 진행될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 1) 선배양은 하기의 선배양배지에서 수행되었다.

선배양배지: [5g/L 효모 추출물, 4g/L KH₂PO₄, 0.5g/L MgSO₄·7H₂O, 0.02%(v/v) Tween80, 0.25%(w/v) 글루코스, 및 0.14%(v/v) 올레산(유도물질)]

상기 선배양배지의 초기 pH는 7.0로 조절되는 것이 바람직하다.

일 실시예에서, 상기 2) 주배양은 하기의 주배양배지에서 수행되었다.

주배양배지: [10g/L 효모 추출물, 4g/L KH₂·PO₄, 0.5g/L MgSO₄·7H₂O, 5g/L 소이톤, 0.02%(v/v) Tween80, 0.5%(w/v) 글루코스, 및 0.14%(v/v) 올레산(유도물질)]

상기 주배양배지의 초기 pH는 6.5로 조절되는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서는, 올레산으로부터 10-히드록시 스테아르산을 생산하는 생물전환 반응을 주배양배지 중에서 pH 6.5, 26℃, 210rpm의 교반조건에서 48시간 동안 진행하였다. 배지의 최종 pH는 50%(v/v) H₂SO₄를 이용해 2.0으로 조절하였다.

상기 생물전환 공정에서 접종 밀도는 0.01(%, v/v) 내지 0.05(%, v/v)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 10-히드록시 스테아르산 전환 수율은 접종 밀도가 0.05%(v/v)일 때 88%로 가장 높았으나, 접종 밀도가 0.07%(v/v)일 때, 43%로 가장 낮았었다(표 3).

상기 생물전환 공정에서 불포화 지방산 기질 농도는 12g/L 내지 60g/L, 바람직하게는 12g/L 내지 36g/L일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 12g/L 내지 60g/L의 올레산 범위 내에서 본 발명의 재조합 균주는 원균주보다 더 많은 10-히드록시 스테아르산을 생성하였다(도 8).

상기 생물전환 공정에서 공정 시간은 0.1 내지 48시간, 바람직하게는 16 내지 48시간일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 재조합 균주는 16시간 이후에 올레산을 상당하게 전환시키기 시작하여 48시간까지 전환 수율이 상승하였다.

상기 생물전환 공정에서 탄소원으로 글루코스가 사용될 수 있다.

상기 글루코스의 농도는 2.5g/L 내지 5g/L일 수 있다.

상기 생물전환 공정에서 질소원이 사용될 수 있다.

상기 질소원으로 소이톤(soyton), 트립톤(trypton) 또는 펩톤(peptone)을 사용할 수 있으나, 소이톤이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서, 소이톤을 사용했을 때 최대 세포성장은 소이톤을 넣었을 때 4.14±0.01까지 산출되었고, 전환 수율은 82%이었다(표 2).

상기 생물전환 공정에서 조효소로서 FAD(Flavin Adenine Dinucleotide)가 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 생물전환 반응에서 조효소인 FAD(Flavin Adenine Dinucleotide)의 의존성을 확인하였다(도 11).

이하, 본 발명의 실시예와 비교예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 신규한 스테노트로포모나스 속( Stenotrophomonas sp.) 균주의 제조

본 발명의 신규한 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 균주를 균접합(bacterial conjugation)에 의해 제조하였다.

1-1. 균종 및 플라스미드

그람음성균인 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332를 올레산 수화효소(oleate hydratase)의 게놈(genome) DNA의 재료로 사용하였다.

단백질 정제와 접합을 위한 발현벡터로 pET-28a 플라스미드와 pRK415K 플라스미드를 각각 사용하였다.

단백질 정제를 위한 클로닝(cloning)의 숙주 세포로 E.coli BL21(DE3)를 사용하였다.

E.coli S17-1과 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332를 유전적으로 조작된 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 접합의 숙주 세포로 사용하였다.

1-2. 접합을 위한 유전자 재조합(gene cloning)

RBC사의 gDNA mini kit를 이용하여 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332의 gDNA를 분리한 후, PCR 기법으로 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332의 gDNA를 주형으로 사용하여 올레산 수화효소(oleate hydratase)를 암호화하는 유전자를 증폭시켰다.

먼저, 올레산 수화효소(oleate hydratase)의 DNA sequence를 기초로 다음과 같은 pRK415K 플라스미드 유전자 클로닝용 프라이머 서열을 고안하였다.

서열번호 2(정방향 프라이머):

5'-ATACTGCAGATGGAAGAAGTGAGTTATCCCAAAGCTGGA-3'

상기 CTGCAG는 PstⅠ 인식자리이다.

서열번호 3(역방향 프라이머):

3'-GATCTCTAGATCAGGCGCCCGGCTT-5'

상기 TCTAGA는 XbaⅠ 인식자리이다.

Taq. pol.을 이용한 PCR에 의해 DNA 절편을 증폭하고, 얻어진 DNA 절편을 Welgene사의 PCR purification kit를 이용하여 추출하고, pRK415K 플라스미드에 존재하는 PstⅠ과 XbaⅠ 자리와 연결하여 pSteOH415(올레산 수화효소를 포함하는 pRK415K 플라스미드)를 제조하였다. pRK415K 플라스미드에 연결된 올레산 수화효소를 암호화하는 유전자를 확인하기 위해 pSteOH415의 서열분석 결과를 올레산 수화효소(GenBank accession No. CP014274.1) 유전자 서열과 비교하였다. 도 4에서 보는 바와 같이, 올레산 수화효소 유전자의 1962개의 염기쌍은 99%가 일치한 것으로 확인되었다.

pSteOH415를 E.coli DH5α로 이동시킨 후 E.coli S17-1로 재이동시켜 pSteOH415를 포함하는 E.coli S17-1(증여세포)를 제조하였다.

1-3. 스테노트로포모나스 속( Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 유래 올레산 수화효소를 포함하는 E.coli S17-1과 최초 스테노트로포모나스 속( Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332의 접합

pSteOH415를 포함하는 E.coli S17-1(증여세포)과 최초 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332(수용세포) 간의 DNA 전달을 위해 균접합(Bacterial conjugation)을 수행하였다.

구체적으로, 증여세포와 수용세포를 LB broth에서 급속생장기까지 배양한 후 10:1 비율로 혼합시켜 28℃에서 1시간 동안 배양시킨 후 형질전환체, 즉 접합된 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 균주를 선별하였다. 형질전환체의 선별은 증여세포와 수용세포는 자랄 수 없고 접합된 균주만 살아남을 수 있음이 분명한 배지에서 수행되었다. 구체적으로, 배양된 세포를 250㎍/㎖의 kanamycin 농도를 갖는 AB최소한천배지(Agro Bacterium) [1g/L NH₄Cl, 0.3g/L MgSO₄·7H₂O, 0.15g/L KCl, 0.01g/L CaCl₂·2H₂O, 0.0025g/L FeSO₄·7H₂O, 3g/L K₂HPO₄, 1g/L NaH₂PO₄, 0.195g/L MES, 5g/L glucose]에 도말 후 28℃에서 60시간 동안 배양하였다.

그 결과, E.coli S17-1과 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 원균주의 접합이 진행되었고, 250㎍/㎖의 Kanamycin minimal AB배지에는 성공적으로 colony가 형성되었다. E.coli S17-1에 포함되어 있던 pSteOH415가 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 원균주에도 있는지 확인하기 위해 계대배양 colony에서 플라스미드를 추출하여 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다.

도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 접합균주에서 추출된 플라스미드는 pRK415K 플라스미드보다 더 위쪽에 밴드를 형성하였다. 유전자 서열에 따르면, 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332는 다른 DNA 콘티그(contig) 없이 한 개의 원형 유전자로 구성되어 있어서 본 발명의 접합균주에서 추출된 플라스미드는 pSteOH415인 것으로 확인된다. 이러한 결과로부터 E.coli S17-1의 pSteOH415가 균접합에 의해 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 원균주로 성공적으로 옮겨졌음을 알 수 있다.

제조한 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 균주는 국제기탁기관인 한국생명공학연구원(KCTC)에 2020년 9월 24일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC18850P).

실시예 2. 신규한 스테노트로포모나스 속( Stenotrophomonas sp.) 균주의 제조

올레산 수화효소를 암호화하는 유전자를 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332의 게놈(genome) DNA를 주형으로 사용하여 PCR 기법으로 증폭시켰다.

먼저, 올레산 수화효소의 DNA sequence를 기초로 pET-28a 플라스미드 유전자 재조합용 프라이머 서열을 고안하였다.

서열번호 4(정방향 프라이머):

5'-GCCCGCATATGGAAGAAGTGAGTTATCCGAAAGCTG-3'

상기 CATATG는 NdeⅠ 인식자리이다.

서열번호 5(역방향 프라이머):

3'-TATAGTCGACGGCGCCCGGCTTCA-5'

상기 GTCGAC는 SalⅠ 인식자리이다.

Taq pol.을 이용한 PCR에 의해 DNA 절편을 증폭하고, 얻어진 DNA 절편을 Welgene사의 PCR purification kit를 이용하여 추출하고, pET-28a 플라스미드에 존재하는 NdeⅠ과 SalⅠ 자리와 연결하여 pSteOH28(올레산 수화효소를 포함하는 pET-28a 플라스미드)를 제조하였다. pSteOH28를 E.coli BL21(DE3)로 이동시켜 pSteOH28를 포함하는 E.coli BL21(DE3)를 제조하였다.

실시예 3. 올레산에서 10-히드록시 스테아르산으로의 생물전환

실시예 1에서 재조합된 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) KCTC 12332 균주를 LB broth 한천배지에서 2일간 배양시킨 후 배지의 단일군락을 취하여 100ml 선배양배지 [5g/L 효모 추출물, 4g/L KH₂PO₄, 0.5g/L MgSO₄·7H₂O, 0.02%(v/v) Tween80, 0.25%(w/v) 글루코스, 및 0.14%(v/v) 올레산(유도물질)] 에 접종하였다.

배지의 초기 pH는 25%(w/v) KOH를 이용해 7.0으로 조절하였다. 배양배지를 500ml baffled Erlenmeyer flask 중에서 25℃에서 180rpm으로 배양시켰다. 급속생장기의 종단에 가까운 24시간 동안 배양을 지속한 후, HP사의 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 600nm에서의 흡광도를 측정하였다. 600nm에서의 광학밀도(OD₆₀₀)가 0.4일 때 배지의 균을 취하여 4℃에서 13000rpm으로 1분간 원심분리 한 후 선배양배지로 두 번 세척한 다음 0.5㎕/㎖ 농도로 주배양배지에 접종시켰다. 주배양배지의 조성은 다음과 같다: [10g/L 효모 추출물, 4g/L KH₂·PO₄, 0.5g/L MgSO₄·7H₂O, 5g/L 소이톤, 0.02%(v/v) Tween80, 0.5%(w/v) 글루코스, 및 0.14%(v/v) 올레산(유도물질)]

배지의 초기 pH는 25%(w/v) KOH를 이용하여 6.5로 조절하였다. 배양배지를 500ml baffled Erlenmeyer flask 중에서 26℃에서 180rpm으로 글루코스가 완전히 소모될 때까지 배양하였다. 글루코스 농도는 DNS 방법으로 측정하였다.

올레산으로부터 10-히드록시 스테아르산을 생산하는 생물전환 반응을 100ml의 주배양배지를 담고 있는 500ml-baffled flask 중에서 pH 6.5, 26℃, 210rpm의 교반조건에서 48시간 동안 진행하였다. 배지의 최종 pH는 50%(v/v) H₂SO₄를 이용해 2.0으로 조절하였다.

실시예 4. 전환산물의 확인

실시예 3에서 얻은 반응 산물의 확인을 위해, 반응 산물에 동일한 양의 에틸 아세테이트를 첨가한 후 회전 증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 제거한 후, GC(Gas Chromatography) 분석을 위해 0.2ml의 추출물을 Sigma 사의 불소브롬 메탄올(BF₃ 메탈올) 1ml로 90℃에서 5분간 메틸화시켰다. 그 후 시료를 탈염수와 포화 NaCl 용액으로 세척한 후 100% 헥산 2ml로 추출하였다.

Flame ionization detector와 20:1의 비로 분리시키는 Split injection system, 그리고 HP-5MS UI Capillary Column(30m Х 0.25mm Х 0.25㎛)이 달린 Agilent Technologies사의 Agilent 6890N으로 산물의 정체를 확인하였다.

이때, 컬럼 온도는 3단계로 조절하였다: 시작온도는 50℃이고, 50℃에서 150℃까지 20℃/min의 속도로 점진적으로 증가시킨 후 150℃에서 5분간 유지. 다시 150℃에서 250℃까지 20℃/min의 속도로 점진적으로 증가시킨 후 250℃에서 5분간 유지. 또한, 250℃에서 300℃까지 20℃/min의 속도로 점진적으로 증가시킨 후 300℃에서 5분간 유지.

그리고, 인렛(Inlet)과 디텍터(Detector) 온도는 각각 270℃와 275℃로 설정하였다.

원균주와 본 발명의 접합균주에 의해 올레산으로부터 얻어진 메틸화된 산물과 효소 활성 산물을 GC-FID로 분석하였다. 그 결과, 메틸화된 조추출액의 GC분석 결과 RT(Retention time) 16.4분과 18.5분에서의 두 피크를 포함한 다양한 신호들이 관찰되었다(도 5).

실시예 5. 전환산물의 구조 확인

실시예 3에서 얻은 반응 산물의 구조 확인을 위하여, 반응 산물을 메틸 에스테르로 유도체화 하였다. 구체적으로, 반응 산물과 BF₃ 메탄올을 5분 동안 90℃에서 반응시켜 지방산 메틸 에스테르(FAME)를 제조하여 GC-MS로 확인하였다. 이때, FAME 샘플을 1:10의 비로 헥산으로 희석하여 HP-5MS UI capillary column으로 분석하였다.

도 7에서 보는 바와 같이, 메틸 에스테르 유도체의 전자 충격 질량 분석(electron-impact mass spectrum) 결과 용리 화합물(GC RT = 18.5 분)은 3개의 알파 절단(alpha cleavage)에서 히드록실기 부위에 발생하는 m/z 143, 169 및 201에서 fragment를 나타냈다. 이온 [M⁺-C₁₀H₁₉O₂]에 기인한 m/z 143 이온을 갖는 fragment 이온은 메틸 에스테르로 유도체화 된 히드록실기로의 알파 절단(alpha cleavage)을 나타낸다. m/z 169와 201의 fragment 이온은 10번 탄소에서 히드록실기의 존재를 나타내며 FAME에 대한 알파 절단에 해당한다. 이러한 단편화 피크로부터 전환산물은 10-히드록시 스테아르산임을 알 수 있었다.

실시예 6. 기질농도에 따른 효과

원균주 및 본 발명에서 얻은 접합균주의 올레산 유래 10-히드록시 스테아르산 생산에 있어서 기질농도의 영향을 확인하기 위해, 주배양배지의 플라스크에서 12g/L, 16g/L, 24g/L, 30g/L, 36g/L, 42g/L, 48g/L, 54g/L, 60g/L의 올레산 농도에서 평가하였다. 26℃, 210rpm으로 초기 pH 6.5, 산소가 없는 조건에서 48시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 종결을 위해 H₂SO₄로 pH를 2.0까지 낮추고 생산물은 Ethyl Acetate를 1:1 비율로 섞은 후 회전증발농축기(Rotary Evaporator)로 에틸 아세테이트를 증발시켜 추출했다. 모든 반응은 3회 수행하였다.

GC-FID 크로마토그램의 스펙트럼으로 올레산에서 10-히드록시 스테아르산으로의 전환 수율(%)을 산출하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, 10-히드록시 스테아르산의 전환수율은 기질인 올레산의 양이 증가함에 따라 의존적으로 감소하였다. 12g/L에서 60g/L의 올레산 농도 범위에서, 접합균주는 원균주보다 더 많은 10-히드록시 스테아르산을 전환하였다. 원균주의 경우, 올레산이 18g/L 농도 이상으로 첨가될 때 전환 수율이 상당히 감소되었다. 그러나 접합균주의 경우, 전환 수율은 36g/L까지 80% 이상인 것으로 나타났는데, 이는 원균주 18g/L보다 약 2배 높은 기질 용량이다. 이러한 결과로부터 접합균주는 12g/L에서 60g/L의 기질(올레산) 농도 범위에서 원균주보다 더 높은 전환수율로 10-히드록시 스테아르산을 생산할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 7. 시간경과에 따른 효과

본 발명의 10-히드록시 스테아르산 생물전환 반응에서 시간경과에 따른 효과를 확인하기 위해, 원균주와 본 발명의 접합균주에 의한 올레산의 10-히드록시 스테아르산으로의 생물전환 반응을 48시간 동안 8시간마다 종결시키고 생물전환 생산물을 추출하였다. 기질로서 올레산을 주배양배지에 9g/L로 첨가하였다. GC-FID 크로마토그램의 스펙트럼으로 올레산에서 10-히드록시 스테아르산으로의 전환 수율(%)을 산출하였다.

도 9에서 보는 바와 같이, 10-히드록시 스테아르산의 전환수율은 시간에 따라 증가하였고 기질 첨가 후 48시간이 경과하였을 때 최대치에 도달하였다. 특히, 접합균주는 16시간 이후에 10-히드록시 스테아르산의 전환수율이 급격히 증가한 반면, 원균주는 32시간 이후에 올레산을 더 많이 전환시켰다. 접합균주는 원균주보다 높은 전환수율을 나타내며 48시간까지 10-히드록시 스테아르산 생산 수율이 증가하였다. 특히 16시간부터 48시간 동안 접합균주의 전환율이 원균주보다 매우 높음을 알 수 있었다.

실시예 8. 올레산 전환반응 조건의 최적화

8-1. 글루코스 농도의 영향

본 발명의 10-히드록시 스테아르산 생물전환 반응에서 올레산을 10-히드록시 스테아르산으로 전환하기 위해 주배양배지에 탄소원으로 D-glucose를 사용하였다. 글루코스 농도에 따른 영향을 확인하기 위해 DNS 방법을 이용하여 글루코스 표준 곡선으로 남아있는 글루코스 농도를 측정한 후에, 올레산을 투입하여 반응을 수행하였다. GC-FID 크로마토그램의 스펙트럼으로 올레산에서 10-히드록시 스테아르산으로의 전환 수율(%)을 산출하여 도 10 및 표 1에 나타내었다.

세포 성장과 10-히드록시 스테아르산 전환 수율에 대한 탄소원으로서 글루코스의 영향

글루코스(g/L)	세포 성장(h)	잔여 글루코스(g/L)	전환수율(%)
0	24	미검출	82
2.5	24	2.23±0.01	63
2.5	48	미검출	88
5	24	5.13±0.02	50
5	48	미검출	87

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 글루코스를 첨가하지 않았을때(즉, 0g/L인 경우), 전환 수율은 82%이었다. 또한, 글루코스를 2.5g/L로 첨가한 경우, 주 배양배지에서 24시간 동안 배양 후 수율은 63% 이었고, 48시간 동안 배양한 경우 글루코스는 완전히 소모되었고 전환 수율은 88%이었다. 마지막으로, 글루코스 5g/L을 24시간 배양 시간 동안 주 배양배지에 첨가한 경우, 전환 수율은 50%인 반면, 48시간 동안 배양한 경우 글루코스는 완전히 소모되었고 전환 수율은 87%이었다. 이러한 결과로부터 탄소원으로서 글루코스가 첨가되지 않거나 완전히 소모되었을 때, 10-히드록시 스테아르산으로의 올레산 전환수율이 80% 이상으로 높음을 알 수 있다.

8-2. 질소원의 영향

본 발명의 10-히드록시 스테아르산 생물전환 반응에서 올레산을 10-히드록시 스테아르산으로 전환하기 위해 주배양배지에 질소원을 사용하였다. 질소원에 따른 영향을 시험하기 위해 트립톤, 소이톤, 펩톤의 3가지의 다른 질소원을 사용하여 반응을 수행한 후 600nm에서 세포 성장 OD 및 전환 수율(%)을 측정하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.

세포 성장과 10-히드록시 스테아르산 전환 수율에 대한 질소원의 영향

질소원(5g/L)	세포 성장(OD at 600nm)	전환수율(%)
트립톤	2.87 ± 0.01	53
소이톤	4.13 ± 0.01	82
펩톤	3.09 ± 0.02	72

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 질소원에 대해 600nm에서 세포 성장 OD 및 10-히드록시 스테아르산으로의 올레산 전환 수율(%)이 비례함을 알 수 있다.

질소원으로 소이톤을 사용했을 때 10-히드록시 스테아르산으로의 전환 수율이 가장 높았고, 펩톤과 트립톤 순으로 높은 전환 수율을 나타내었다. 특히, 소이톤을 넣었을 때 최대 산물량은 100ml 배양당 1.17g이었다. 최대 세포성장은 소이톤을 넣었을 때 4.14±0.01까지 산출되었고, 전환 수율은 82%이었다.

8-3. 접종 밀도의 영향

본 발명의 10-히드록시 스테아르산 생물전환 반응에서 접종 밀도의 영향을 평가하기 위해 0.01(%), 0.03(%), 0.05(%), 0.07(%)의 접종밀도로 본 발명의 접합균주를 접종하여 10-히드록시 스테아르산 생물전환 반응을 수행하였다. 접종 밀도에 따른 10-히드록시 스테아르산(10-HSA) 전환 수율을 하기 표 3에 나타내었다.

세포 성장과 10-히드록시 스테아르산 전환 수율에 대한 접종 밀도의 영향

세포 성장(OD at 600nm)	접종 밀도(%, v/v)	전환 수율(%)
3.78 ± 0.02	0.01	72
4.13 ± 0.01	0.03	75
3.92 ± 0.01	0.05	88
4.21 ± 0.02	0.07	43

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 10-히드록시 스테아르산 전환 수율은 접종 밀도가 0.05%(v/v)일 때 88%로 가장 높았으나, 접종 밀도가 0.07%(v/v)일 때, 43%로 가장 낮은 10-히드록시 스테아르산 전환수율을 나타냈다. 이는 접종 밀도가 0.07%(v/v)일 때는 올레산을 전환하기 위한 에너지원의 가용성이 낮기 때문인 것으로 보인다.

8-4. 조효소로서 FAD 의존성

본 발명의 생물전환 반응에서 조효소인 FAD(Flavin Adenine Dinucleotide)의 의존성을 확인하였다.

먼저, 올레산 수화효소를 이용하여 FAD 사용에 따른 올레산으로부터 10-히드록시 스테아르산으로의 전환 수율의 영향을 평가하였다.

구체적으로, 정제된 올레산 수화효소를 FAD와 몰비 1:5로 혼합하여 4℃에서 1시간 동안 미리 배양시킨 후, FAD의 첨가가 없을 때의 올레산 수화효소의 실험과 동일한 조건에서 반응을 진행하였다.

도 11에서 보는 바와 같이, 올레산 수화효소에 의한 올레산으로부터 10-히드록시 스테아르산으로의 1시간 동안 전환 수율은 FAD가 없을 때와 있을 때 각각 28.5%와 55.1%로 나타났다. 이러한 결과로부터 FAD를 첨가함으로써 올레산으로부터 10-히드록시 스테아르산으로의 전환 수율을 현저하게 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

도 12에서 보는 바와 같이, 원균주와 본 발명의 접합균주 추출물은 2시간 동안 각각 54.4%와 71.7%로 나타났다. 이러한 결과로부터 본 발명의 접합균주를 사용함으로써 올레산으로부터 10-히드록시 스테아르산으로의 전환 수율을 현저하게 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

한국생명공학연구원

KCTC18850P

20200917

<110> Greenwitch co., ltd <120> Novel Stenotrophomonas sp. strain and method for manufacturing hydroxy fatty acid by using the same <130> DP200147 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1962 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oleate hydratase encoding gene <400> 1 atggaagaag tgagttatcc caaagctgga ccgagcattg aagcgaacgt aggggatggg 60 cactggcgaa aggggccctc ggatacgctg ccgcctccgg acactgttgg accctatatg 120 cgcaaccgcc ccctgcctgt ggatcaagtg gaaggcagga aagcatggat catcggaagt 180 ggaatcgcgg gtctggcctc tgccttttac ttgatccgcg acgggcggat gaaggggcag 240 gacataacca tcctcgatgc cgtgggcact ccaggcggat cactggacgg ctcagggaac 300 gccgaagatg gctacctgat ccgaggcggg cgcgagatga actggaacta cgatcacttt 360 tgggatctct tccaggacat tcccgcgctg gagtacccgt ccccttactc ggtcttggat 420 gagtatcggg cggtgaacga caatgatcct aattggtcca agtcccgatt gatgcacaag 480 caaggccaaa ttcgggattt cagcaccttg gggctttctt ccgcccacca atgggaattg 540 atcaagcttc tcctgaagcg caaggaggac ctcgatgaca tcaccatcga acagtacttc 600 agcgatagct ttctggagac caacttctgg tacctctggc gctcgatgtt tgcgttccag 660 aactggcaaa gtctgctgga agtgaagttg tacatgcatc gctttttgga tgcaatcgac 720 ggcttgacgg atatgtcagc gctcgtgttc ccaaaataca accagtacga cagcttcgtc 780 gtccccctgg tcaactacct caagggccaa ggcgtcaacg tagaattcgg cacgcgcgtc 840 tacgacctgg acatgacgga caacaacggc gagcgtaccg tgacctccat tcttgcgaag 900 gtagacgggc gggatcagaa gattgacatc ggcgcgaagg acgtggtttt tgccctgact 960 ggatcgatga cggagggtac agcctacggc gatctggata ctgctcccga cctcactcga 1020 gccaccacgc cccctggcga ctcaagcgat tgggcgttgt ggcagaacct ggccaagaag 1080 tcccacgtct ttggtaagcc tgaaaagttc tgcgggcaac ccagtcgctc gatgtgggag 1140 tctgccaccc tgacgtgcaa gccttcgccg ttgaccgagc gcctcaaaga tctctcaatc 1200 aatgaccctt attcgggaaa aacggtgacc ggtggaatca tcacctttac cgactcgaac 1260 tgggttctca gcttcacctg caatcgtcaa ccgcatttcc ccacacaacc agacgacgta 1320 ctggtgcttt gggtctatgc cttggtcatg gacagcaaag gcaaccatgt actaaaacca 1380 atgcctgagt gtacgggccg cgaaattctt gctgagcttt gctaccacct cggcattgtg 1440 gatcaggtgg atgaagtggc cagacagacc aaggttcgcc ttgccctgat gccattcatc 1500 acggctcaat ttatgccacg agctgctgga gatcgaccgc gtgttgttcc agccgggtgc 1560 accaatctcg ctctgctggg ccaattcgtg gagacgtcta atgacatcat cttcaccatg 1620 gagagttccg tcaggactgc gcggattggc gtgtacacgc ttctggggct acgaaagcag 1680 gtcgccgata tcagccccac gcaatacgac gtccgaaatc tgatcaaggg tgctcgtgcc 1740 ctgaacaaca acgagccgtt catgggcgag cggctgctcc atcgactgct cgacaacacc 1800 tacttcgccc acatcctccc gccgctgcca gcaggagacg gtggatccag cgatcaagcg 1860 gcaagctcgc gtatgaaggc caaccacact gcggcggcgg cacttggagc ggtgtctgat 1920 tggatccatc atgttcggga taaactgaag ccgggcgcct ga 1962 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atactgcaga tggaagaagt gagttatccc aaagctgga 39 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gatctctaga tcaggcgccc ggctt 25 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcccgcatat ggaagaagtg agttatccga aagctg 36 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tatagtcgac ggcgcccggc ttca 24

Claims

기탁번호(KCTC18850P)로 수탁된, 수산화 지방산 생산능을 가지는 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 균주.
제1항에 있어서,
상기 수산화 지방산은 10-히드록시스테아르산(10-hydroxystearic acid), 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산[10-hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid], 10-히드록시-12,15(제트,제트)-옥타데카디엔산(10-hydroxy-12,15(Z,Z)-octadecadienoic acid), 10-히드록시-6,12(제트,제트)-옥타데카디엔산(10-hydroxy-6,12(Z,Z)-octadecadienoic acid) 및 10-히드록시팔미트산 (10-hydroxypalmitic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 균주.
제1항의 균주 및 불포화 지방산 기질을 이용하는 생물전환 공정으로 수산화 지방산을 제조하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 불포화 지방산 기질은 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 감마 리놀렌산(γ-linolenic acid) 및 팔미톨레산(palmitoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인 방법.
제3항에 있어서,
상기 수산화 지방산은 10-히드록시스테아르산(10-hydroxystearic acid), 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산[10-hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid], 10-히드록시-12,15(제트,제트)-옥타데카디엔산(10-hydroxy-12,15(Z,Z)-octadecadienoic acid), 10-히드록시-6,12(제트,제트)-옥타데카디엔산(10-hydroxy-6,12(Z,Z)-octadecadienoic acid) 및 10-히드록시팔미트산 (10-hydroxypalmitic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인 방법.
제3항에 있어서,
상기 생물전환 공정에서 접종 밀도는 0.01(%, v/v) 내지 0.05(%, v/v)인 것인 방법.
제3항에 있어서,
상기 생물전환 공정에서 접종 밀도는 0.01(%, v/v) 내지 0.05(%, v/v)인 것인 방법.
제3항에 있어서,
상기 생물전환 공정에서 공정 시간은 0.1 내지 48시간인 것인 방법.
제3항에 있어서,
상기 생물전환 공정에서 탄소원으로 2.5g/L 내지 5g/L의 글루코스가 사용되는 것인 방법.
제3항에 있어서,
상기 생물전환 공정에서 질소원으로 소이톤(soyton)이 사용되는 것인 방법.