KR20170104015A - 올레산 수화효소 2 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스테노트로포모나스 말토필리아 유래 올레산 수화효소 2 및 이를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 불포화지방산으로부터 하이드록시지방산들을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법을 통해 종래의 올레산 수화효소와 비교하여 하이드록시지방산들을 높은 속도와 수율로 생산할 수 있으며, 상기 생산된 하이드록시지방산들은 다양한 향료 생산에 이용될 수 있고, 고분자의 합성 및 유화제 생산에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

올레산 수화효소 2 및 이의 용도{Novel oleate hydratase 2 and uses thereof}
본 발명은 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래 올레산 수화효소 2 및 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 불포화지방산으로부터 하이드록시지방산들을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 올레산 수화효소, 상기 올레산 수화효소 2를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 올레산 수화효소 2를 제조하는 방법 및 상기 올레산 수화효소 2 또는 상기 형질전환체를 이용하여 불포화지방산으로부터 하이드록시지방산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
수산화 지방산(하이드록시지방산, hydroxy fatty acid)은 자연계에 존재하는 물질로서 트리글리세롤, 왁스, 세레브로시드, 그밖에 식물이나 곤충 그리고 미생물에 존재하는 지질 등에서 발견된다. 수산화 지방산은 향신료를 구성하는 락톤(lactone)의 전구체로서 중요한 산업적인 물질이며, 수산화 지방산이 아닌 다른 지방산에 비하여 반응성이 좋기 때문에 레진, 왁스, 나일론, 플라스틱, 윤활제 그리고 코팅제의 시작 물질로 사용되고 화장품 원료로도 사용된다. 특히, 수산화 지방산 중 하나인 10-하이드록시스테아르 산(10-hydroxystearic acid)은 윤활제로 사용되고, 가소체 그리고 레진을 합성하는데 사용되는 세바스산, 아젤레산 등을 생산하는 중요한 물질임이 알려져 있다(Biotechnology Advances 31, 2013, 1473-1485).
상기와 같이 다양한 분야에 이용될 수 있는 수산화 지방산은 미생물을 이용한 생물학적인 전환을 통하여 생산될 수 있는데, 그 예로, 올레산 수화효소 및 그 효소 함유 재조합 미생물을 이용한 10-하이드록시스테아르 산 제조방법(대한민국 특허출원번호 제10-2011-0061911호), 지방산 수화효소에 의한 리시놀레산으로부터 10,12-이수산화스테아르산의 제조방법 및 그 조성물(대한민국 특허출원번호 제10-2012-0108758호), 고정화된 지방수화효소 및 이를 이용한 수산화 지방산의 제조방법(대한민국 특허출원번호 제10-2014-0054686호), 락토바실러스 에시도필러스 유래 13-리놀레산 수화효소에 의한 13-수산화 지방산의 생산 및 월토마이세스 리포퍼를 이용한 델타-데카락톤의 제조방법 및 그 조성물(대한민국 특허출원번호 10-2015-0127223호)등이 있다.
그러나, 하이드록시지방산 중 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산(10-hydroxyoctadec-12-enoic acid), 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산(10-hydroxyoctadec-6,12-dienoic acid), 10-하이드록시스테아르 산 등을 포함하는 10-하이드록시지방산은 낮은 수율로 생산될 뿐만 아니라, 대량생산 시 경제성이 떨어진다고 알려져 있다. 예를 들어, 상기 10-하이드록시지방산을 생산하는 기존의 미생물로는 플라보박테리움 (Flavobacterium sp . NRRL B-14859), 노카디아 콜레스테로리큠 (Nocardia cholesterolicum), 젖산균 등이 알려져 있지만, 이들 미생물은 상기의 10-하이드록시지방산을 낮은 수율로 생산할 뿐만 아니라, 10-케도스테아르 산과 같은 부산물이 생산되어 대량생산 시 경제성이 떨어진다. 최근에는 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia), 마크로코커스 캐세올리티커스 (Macrococcus caseolyticus), 리시니바실러스 푸시포르미스 (Lysinibacillus fusiformis) 유래 올레산 수화효소들(oleate hydratases)을 사용하여 10-하이드록시스테아르 산을 고농도로 생산할 수 있다는 보고가 있지만, 하이드록시옥타데크-12-에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산의 생산 수율은 매우 낮은 것으로 알려져 있다.
이러한 배경하에, 불포화지방산으로부터 하이드록시지방산을 고수율로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 스테노트로포모나스 말토필라아 균주로부터 종래의 올레산 수화효소보다 우수한 활성을 나타내는 신규한 올레산 수화효소 2를 발굴하고, 상기 발굴된 효소를 이용할 경우, 하이드록시지방산을 높은 수율과 속도로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 올레산 수화효소 2를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 올레산 수화효소 2를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 올레산 수화효소 2를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 올레산 수화효소 2 또는 상기 형질전환체를 이용하여 불포화지방산으로부터 하이드록시지방산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 올레산 수화효소 2(oleate hydratase 2)를 이용하여 하이드록시지방산을 고수율로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 스테노트로포모나스 말토필라아(Stenotrophomonas maltophilia) 균주 유래 신규한 올레산 수화효소인 올레산 수화효소 2를 규명하였고, 상기 올레산 수화효소 2 또는 이를 발현하는 형질전환된 재조합 대장균을 이용하여 불포화지방산 또는 대두유로부터 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산(10-hydroxyoctadec-12-enoic acid), 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산(10-hydroxyoctadec-6,12-dienoic acid), 10-하이드록시옥타데크-12,15-디에노익 산(10-hydroxyoctadec-12,15-dienoic acid), 10-하이드록시팔미톨레산(10-hydroxypalmitic acid) 또는 10-하이드록시스테아르 산(10-hydroxystearic acid) 등의 10-하이드록시지방산 또는 9-하이드록시노난 산(9-hydroxynonanoic acid)을 포함하는 하이드록시지방산을 높은 수율과 속도로 얻을 수 있음을 확인하였다. 상기 올레산 수화효소 2는 신규한 것으로, 종래에 사용되고 있는 스테노트로포모나스 말토필리아 유래 올레산 수화효소와 비교하여, 반응활성 및 생산속도가 현저히 높다는 점에서 본 발명이 가지는 의의가 크다고 볼 수 있다. 또한, 상기 올레산 수화효소 2 및 이를 이용하여 불포화지방산으로부터 하이드록시지방산을 높은 속도와 수율로 제조하는 방법은 지금까지 전혀 알려지지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 올레산 수화효소 2를 제공한다.
본 발병에서 용어, "올레산 수화효소"는 지방산 수화효소 중 하나로, 기질로써 사용하는 올레산을 10-하이드록시스테아르 산으로 전환되는 반응을 촉매시키는 효소로 알려져 있다. 상기 올레산 수화효소는 올레산을 포함한 다양한 불포화지방산을 기질로써 사용하여, 다양한 히드록시지방산을 생산할 수 있다. 본 발명에서는 종래의 올레산 수화효소와 구별되는 신규한 올레산 수화효소 2를 규명하였다.
본 발명에 있어서, 상기 올레산 수화효소 2는 스테노트로포모나스 말토필리아 균주로부터 유래된 것일 수 있고, 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 불포화지방산을 기질로 사용하여 대량의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-12,15-디에노익 산, 10-하이드록시팔미톨레산 또는 10-하이드록시스테아르 산 등의 10-하이드록시지방산, 또는 9-하이드록시노난 산을 생산할 수 있는 신규한 올레산 수화효소로 해석될 수 있는데, 상기 하이드록시지방산을 대량으로 생산하는 효소활성을 나타낼 수 있는 한, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 올레산 수화효소 2는 불포화지방산으로부터 하이드록시지방산을 생산한다는 점에서 종래의 올레산 수화효소와 유사하지만, 상기 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-12,15-디에노익 산, 10-하이드록시팔미톨레산 또는 10-하이드록시스테아르 산 등의 10-하이드록시지방산을 보다 빠르게 생산할 수 있다는 점에서 종래의 올레산 수화효소와 구별된다.
본 발명자들이 규명한 바에 의하면, 본 발명에서 제공하는 올레산 수화효소 2가 올레산(oleic acid)으로부터 10-하이드록시스테아르 산, 팔미톨레산(palmitoleic acid)으로부터 10-하이드록시팔미톨레산, 리놀레산(linoleic acid)으로부터 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산, 알파-리놀렌산(α-linolenic acid)으로부터 10-하이드록시옥타데크-12,15-디에노익 산, 감마-리놀렌산(γ-linolenic acid)으로부터 10-하이드록시옥타데크 6.12-디에노익 산을 생산함에 있어, 상기 올레산 수화효소 2의 반응활성 및 생산 속도가 각 올레산, 팔미톨레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산 또는 감마-리놀레산에 대해서 종래의 올레산 수화효소와 비교하여, 45 %, 10%, 80 %, 90 %, 130 % 높은 것을 확인하였다(표 1).
또한, 올레산 수화효소 또는 올레산 수화효소를 포함하는 대장균를 이용하여 올레산을 기질로 한 10-하이드록시스테아르 산의 생산속도가 종래의 올레산 수화효소보다 20 % 이상 높은 것을 확인하였고(도 4), 리놀레산을 기질로 한 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산의 생산속도가 종래의 올레산수화효소보다 5배 이상 높은 것을 확인하였으며 (도 5), 대두유로부터 유래된 지방산 분해산물인 리놀레산을 기질로 한 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산의 생산속도가 종래의 올레산 수화효소보다 4배 이상 높음을 확인하였다. 이러한 특성을 갖는 올레산 수화효소 2는 지금까지 어떠한 균주로부터 공지되지 않았으며, 본 발명자에 의하여 최초로 밝혀진 것이다.
지금까지 알려진 바에 의하면, 스테노트로포모나스 말토필리아 균주로부터 유래된 올레산 수화효소는 다른 균주로부터 유래된 올레산 수화효소에 비하여 상대적으로 우수한 효소활성을 나타낸다고 보고되었고(J Biotechnol., 158:17-23), 본 발명의 올레산 수화효소 2는 스테노트포모나스 말토리필리아 균주로부터 유래된 종래의 올레산 수화효소에 비하여 상대적으로 우수한 활성을 나타내므로 본 발명의 올레산 수화효소 2는 다른 균주로부터 유래된 종래의 올레산 수화효소에 비하여 상대적으로 우수한 활성을 나타낼 것으로 분석되었다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 상기 올레산 수화효소 2를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열 또는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열 5'-말단 또는 3'말단에 부가된 형태가 될 수 있고, 구체적으로 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 서열번호 1의 염기서열 또는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 1의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
또한, 올레산 수화효소 2를 나타낼 수 있는 단백질을 코딩할 수 있는 한, 상기 염기서열과 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있는데, 구체적으로, 90% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 보다 구체적으로, 95% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.
또한, 올레산 수화효소 2를 나타내는 수 있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 염기서열을 가지거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있다. 상기 "가지는, 필수적으로 구성되는, 또는 구성되는"의 표현은 서열번호 1의 염기서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 단백질로 발현시 서열번호 1의 염기서열에 의해 코딩되는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 발명의 "서열번호 1의 염기서열을 가지거나, 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는" 경우에 해당될 수 있다.
한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "발현벡터"는, 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
상기 "작동가능하게 연결(operably linked)"는, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 올레산 수화효소 2의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다. 아울러, 상기 발현벡터는 올레산 수화효소 2의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 올레산 수화효소 2 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 본 발명에서 제공하는 올레산 수화효소 2를 제조할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는데, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 구체적으로 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP, pET 28(+)a 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, ), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50), λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 배큘로바이러스(baculovirus) 등이 될 수 있다. 가장 구체적으로 pET 28(+)a 플라스미드 벡터일 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입될 수 있는 숙주세포는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 발현벡터를 발현하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 용어 "형질전환체"는, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현벡터를 이용하여 숙주세포의 내부로 도입된 후, 상기 목적 단백질을 발현시키도록 변이된 세포, 미생물을 의미한다. 구체적으로, 상기 형질전환체는 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균일 수 있다. 보다 구체적으로, 대장균 ER 2566 pET28(+)a-OhyA2 또는 대장균 BL21(DE3) pET28(+)a-OhyA2일 수 있다.
상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 올레산 수화효소 2를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 형질전환체를 이용하여 본 발명의 올레산 수화효소 2를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 올레산 수화효소 2를 제조하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 올레산수화효소 2를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 용어, "배양물"은 균주의 배양 결과 얻어지는 물질로, 배지, 배양되는 균주, 및 배양되는 미생물로부터 분비되는 물질을 모두 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어 균체를 배양하기 위해 필요한 영양 공급원, 예를 들어 탄소원, 질소원 등 이외에 무기염 성분, 아미노산, 비타민, 핵산 및/또는 기타 일반적으로 배양 배지에 함유될 수 있는 성분들이 포함되어 있을 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 올레산 수화효소 2 또는 이를 발현하는 형질전환체에 불포화지방산을 처리하여 수화반응시키는 단계를 포함하는 하이드록시지방산의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "수화반응"은 탄소-탄소 이중결합에 히드록시기와 수소 이온이 끼어들어가는 반응을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 수화반응은 올레산 수화 효소 2 또는 이를 발현하는 형질전환체에 의해 일어날 수 있다.
상기 올레산 수화효소 2의 수화반응은 pH 5.0 내지 pH 6.8의 산도조건에서 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 수화반응은 pH 5.5 내지 pH 6.5, 보다 구체적으로, pH 5.8 내지 pH 6.2에서 수행되는 것일 수 있다. 본 발명자들은 pH 5.0 내지 pH 6.8의 산도조건에서 수화반응을 수행하였을 때, 약 80 % 이상의 올레산 수화효소 2의 반응활성이 나타나는 효과를 확인하였다(도 1a). 반면, pH 5.0 미만으로 pH가 감소할수록 또는 pH 6.8 초과되어 pH가 증가할수록 올레산 수화효소 2의 반응활성이 감소하는 문제가 있다.
상기 올레산 수화효소 2의 수화반응은 30 ℃ 내지 45 ℃의 온도조건에서 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 32 ℃ 내지 42 ℃의 온도조건에서 수행되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 32 ℃ 내지 38 ℃의 온도조건에서 수행되는 것일 수 있다. 본 발명자들은 30 ℃ 내지 45 ℃의 온도조건에서 수화반응을 수행하였을 때, 약 80 % 이상의 올레산 수화효소 2의 반응활성이 나타나는 효과를 확인하였다(도 1b). 반면, 30 ℃미만으로 온도가 감소할수록 또는 45 ℃ 초과되어 온도가 증가할수록 올레산 수화효소 2의 반응활성이 감소하는 문제가 있다.
상기 수화반응을 수행할 경우, 반응물에 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 부탄올, 아세톤 또는 톨루엔을 추가할 수 있다.
상기 다이메틸설폭사이드는 최종 반응물의 12 %(v/v)이하의 농도를 추가로 첨가하여 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 1 % 내지 10 %(v/v)의 농도를 추가로 첨가하여 수행되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 2 % 내지 8 %의 농도를 추가로 첨가하여 수행되는 것일 수 있고, 보다 더 구체적으로 4 내지 6 %의 농도를 추가로 첨가하여 수행되는 것일 수 있다. 본 발명자들은 다이메틸설폭사이드를 12 % 이하의 농도로 추가로 첨가하여 수화반응을 수행하였을 때 약 80 % 이상의 올레산 수화효소 2의 반응활성이 나타나는 효과를 확인하였다(도 2b). 반면, 다이메틸설폭사이드를 12 % 농도 초과하여 추가로 첨가하여 수화반응 수행하였을 때, 반응활성이 점점 감소하는 문제가 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 다양한 종류의 유기용매를 첨가한 후 수화반응을 수행하여, 다이메틸설폭사이드를 추가하였을 때, 다른 유기용매와 비교하여 반응상물을 가장 많이 생산함을 알 수 있었고(도 2a), 상기 다이메틸설폭사이드의 농도를 다르게 추가한 후 수화반응을 수행하여, 다이메틸설폭사이드 5 %를 첨가하였을 때 반응활성이 가장 높음을 알 수 있었다(도 2b).
상기 수화반응은 올레산 수화효소 2의 농도가 1.5 g/L 내지 3.0 g/L에서 수행되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 수화반응은 올레산 수화효소 2의 농도가 2.0 g/L 내지 3.0 g/L에서 수행되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 2.3 g/L 내지 2.7 g/L에서 수행되는 것일 수 있고, 가장 구체적으로 2.5 g/L에서 수행되는 것일 수 있다. 본 발명자들은 올레산 수화효소 2의 농도가 1.5 g/L 내지 3.0 g/L에서 수화반응을 수행하였을 때, 5 g/L의 10-하이드록스테아르 산을 생산하는 효과를 확인하였다. 반면 3.0 g/L 초과하여 수화반응을 수행하였을 때, 10-하이드록시스테아르 산의 생산량이 증가하지 않음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 다양한 농도의 올레산 수화효소 2로 올레산 수화반응을 수행하여, 올레산 수화효소 2의 농도가 2.5 g/L일 때, 10-하이드록시지방산을 생산량이 가장 높은 것을 알 수 있었다.
본 명세서에서 용어, "불포화 지방산(Unsaturated fatty acids)"은 한 분자 속에 탄소-탄소의 불포화결합과 카르복시기를 가지는 사슬 모양 화합물로 탄소간 이중결합이 존재하는 지방산을 말한다. 이중결합을 1개 갖는 것을 모노엔산(monoenoic acid)이라고 하며 천연에는 디엔산, 트리엔산, 테트라엔산, 펜타엔산, 헥사엔산이 존재한다. 디엔산 이상을 총칭하여 폴리엔산이라고 하며, 어유에 많은 테트라엔산 이상의 산을 과불포화지방산이라고 한다. 이중결합의 위치는 카르복시기로부터 몇 번째의 탄소에 붙어 있느냐로 나타내지만, 천연에 존재하는 지방산은 일정한 배치를 나타낸다.
본 발명에서 있어서, 상기 불포화지방산은 올레산(oleic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 알파-리놀렌산(α-linolenic acid), 감마-리놀렌산(γ-linolenic acid) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 불포화지방산인 것 일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 불포화지방산은 대두유에 지방산 가수분해 효소(TLL)를 처리하여 수득한 지방산 분해산물일 수 있다. 구체적으로 상기 지방산 분해산물은 리놀레산 또는 올레산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "하이드록시지방산(hydroxy fatty acid)"은 수산화지방산이라고 하며, 자연계에서 주로 식물체 내에 소량 존재하며 동물에서는 지방산의 중간 분해 물질로서 존재한다. 본 발명에서 있어서, 상기 하이드록시지방산은 10-하이드록시스테아르 산, 10-하이드록시팔미톨레산, 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-12,15-디에노익산 또는 9-하이드록시지방산(9-hydrxoyfatty acid) 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 올레산 수화효소 2를 이용하여 올레산으로부터 10-하이드록시스테아르산, 팔미톨레산으로부터 10-하이드록시팔미톨레산, 리놀레산으로부터 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산, 알파-리놀렌산으로부터 10-하이드록시옥타데크 12,15-디에노익 산, 감마-리놀렌산으로부터 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산을 종래의 올레산 수화효소와 비교하여 높은 생산속도와 반응 활성으로 생산할 수 있음을 확인하였다(표 1).
본 발명의 다른 일 실시예에서 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 올레산으로부터 10-하이드록시스테아르 산, 리놀레산으로부터 생산되는 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산, 대두유의 분해산물인 리놀레산 및 올레산으로부터 10-하이드록시스테아르 산 및 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산이 높은수율로 생산되고, 종래의 올레산 수화효소를 발현하는 재조합 대장균의 생산속도와 비교하여, 높은 생산속도을 나타내는 것을 알 수 있었다(도 4 내지 도 6).
또한, 본 발명에 있어서, 상기 9-하이드록시지방산은 9-하이드록시노난 산(9-hydroxynonanoic acid)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 대두유를 TLL과 반응시켜 생성된 지방산 분해산물인 리놀레산 및 올레산으로부터 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 10-하이드록시지방산을 생산하였고, 상기 10-하이드록시지방산은 ADH 및 BVMO를 발현하는 대장균을 이용하여 9-하이드록시노난 산을 생산할 수 있음을 알 수 있었다(도 7).
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 올레산 수화효소 2를 발현시켜서 제조할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민, 인원, 무기화합물 등을 함유한 배지를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "생물전환"이란, 효소 또는 상기 효소를 발현시키는 형질전환체를 이용하여 초기 물질을 목적하는 물질로 전환시키는 방법을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 생물전환 공정은 불포화지방산 또는 이를 포함하는 지방산 분해산물에 올레산 수화효소 2 또는 이를 발현하는 재조합 대장균을 처리하여 10-하이드록시스테아르 산, 10-하이드록시팔미톨레산, 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-12,15-디에노익산 또는 9-하이드록시노난 산을 생산하는 공정인 것으로 해석될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 올레산 수화효소 2를 이용한 불포화지방산으로부터 하이드록시지방산을 제조하는 방법을 통해 종래의 올레산 수화효소와 비교하여 하이드록시지방산들을 높은 속도와 수율로 생산할 수 있으며, 상기 생산된 하이드록시지방산들은 다양한 향료 생산에 이용될 수 있고, 고분자의 합성 및 유화제 생산에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1의 a는 반응 pH에 따른 올레산 수화효소 2(oleate hydratase 2)의 반응활성을 나타낸 그래프이다.
도 1의 b는 반응 온도에 따른 올레산 수화효소 2의 반응활성을 나타낸 그래프이다.
도 2의 a는 반응액에 첨가되는 유기용매의 종류에 따른 올레산 수화효소 2의 반응활성을 나타낸 그래프이다.
도 2의 b는 반응액에 첨가되는 유기용매 중 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)의 농도에 따른 올레산 수화효소 2의 반응활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 반응액에 첨가되는 올레산 수화효소 2의 농도에 따른 반응활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 올레산 수화효소 2와 종래의 올레산 수화효소를 이용하여 생물전환 시 올레산(oleic acid)으로부터 생산되는 10-하이드록시스테아르 산(10-hydroxystearic acid)의 생산속도를 비교한 그래프이다(○: 올레산 수화효소 2를 이용할 때 반응액의 올레산 농도, ●: 올레산 수화효소 2를 이용할 때 반응액의 10-하이드록시스테아르 산 농도, △: 종래의 올레산 수화효소를 이용할 때 반응액의 올레산 농도, ▲: 종래의 올레산 수화효소를 이용할 때 반응액의 10-하이드록시스테아르 산 농도).
도 5는 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균과 종래의 올레산 수화효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 생물전환 시 리놀레산(linoleic acid)으로부터 생산되는 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산(10-hydroxyoctadec-12-enoic acid)의 생산속도를 비교한 그래프이다(○: 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용할 때 반응액의 리놀레산 농도, ●: 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용할 때 반응액의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산 농도, △: 종래의 올레산 수화효소를 재조합 대장균을 이용할 때 반응액의 리놀레산 농도, ▲: 종래의 올레산 수화효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용할 때 반응액의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산 농도).
도 6은 지방 가수분해 효소(TTL) 및 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 생물전환 시 대두유로부터 생산되는 10-하이드록시지방산의 생산속도를 나타낸 그래프이다(○: 반응액의 리놀레산 농도, ●: 반응액의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산 농도, △: 반응액의 올레산 농도, ▲: 반응액의 10-하이드록시스테아르 산 농도).
도 7은 TTL, 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균 및 알콜 탈수소화효소(Alcohol dehydrogenase) 및 베이어-빌리거 산화효소(Bayer-Villiger monooxygenase, BVMO)를 발현하는 대장균을 이용하여 생물전환 시 대두유로부터 생산되는 9-하이드록시노난 산(9-hydroxynonanoic acid)의 생산속도를 나타낸 그래프이다(○: 반응액의 리놀레산 농도, ●: 반응액의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산 농도, △: 반응액의 올레산 농도, ▲: 반응액의 10-하이드록시스테아르 산 농도, ■: 반응액의 9-하이드록시노난 산 농도).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 올레산 수화효소 2 유전자( oleate hydratase 2 gene, ohyA2 )를 포함하는 발현벡터 및 형질전환된 재조합 대장균의 제조
올레산 수화효소 2를 포함하는 발현벡터 및 재조합 대장균을 제조하기 위하여, 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 균주 유래 올레산 수화효소 2 유전자를 합성하였고, 상기 합성된 유전자를 이용하여 하기의 방법을 수행하였다.
합성된 올레산 수화효소 2의 DNA 염기서열을 기초로 한 프라이머(정방향(서열번호 3): 5'-CATATGAGCCAGCCCACCGCAC-3', 역방향(서열번호 4): 5'-CTCGAGTCAGGGCGCGCGCCGCCTG-3')를 제작하였고, 제작된 프라이머로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 증폭시킨 올레산 수화효소 2 유전자는 제한효소 NdeⅠ 과 Xho Ⅰ을 사용하여 플라스미드 벡터 pET 28(+)a(Novagen사 제품)에 삽입하여 pET 28(+)a-OhyA2를 제작하였다.
상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터는 대장균 ER 2566 또는 BL21(DE3) 균주에 형질전환하였고, 상기 형질전환 재조합 대장균은 20 % 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
실시예 2. 올레산 수화효소 2의 제조
실시예 1의 방법으로 제조된 재조합 대장균으로부터 올레산 수화효소 2를 제조하기 위하여, 상기 대장균을 배양하고 올레산 수화효소 2를 정제한 후 상기 올레산 수화효소 2가 포함된 샘플을 제조하였다.
상기 실시예 1의 재조합 대장균 ER 2566은 500 mL의 LB (Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 50 ㎍/mL의 카나마이신(kanamycin)을 첨가한 플라스크에서 200 rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6부터 0.8에 도달할 때, IPTG를 최종농도 0.1 mmol/L로 첨가하여 올레산 수화효소 발현을 유도한 후 상기 배양액을 12시간 동안 16 ℃에서 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다.
상기 배양액은 6,000 xg로 4 ℃에서 30분 동안 원심분리 후 0.85 % 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척하였고, 50 mM 제일인산나트륨(NaH2PO4), 300 mM 염화나트륨, 10 mM 이미다졸(immidazole), 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가한 후 상기 세포 용액을 파쇄기 (sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 13,000 xg로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리한 후 세포 상등액만을 분리하였다. 상기 세포 상등액은 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography system; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 적용하여 활성분획을 수득하고, 상기 활성분획을 히스티딘 태그(Histidine tag, His-tag)를 이용한 히스트랩 에이치피 (Histrap HP) 흡착 컬럼에 적용하여 올레산 수화효소 2를 정제하였으며, 상기 정제된 올레산 수화효소 2를 포함하는 샘플을 제조하였다.
실험예 1. 올레산 수화효소 2의 최적반응조건 분석
실험예 1.1: 반응 pH
상기 실시예 2에서 제조된 올레산 수화효소 2의 반응활성에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위하여, 기질로서 올레산(oleic acid)을 이용하여 pH 5 내지 pH 7의 산도조건에서 올레산 수화반응을 수행하였다.
0.14 g/L 올레산은 50 mM 씨트레이트/포스페이트(citrate/phophate buffer) 완충용액에 첨가하여 올레산 수화반응을 진행하였다. 반응활성은 10-하이드록시스테아르 산의 생산량을 측정하여 상대적으로 비교하였다.
실험 결과, 올레산 수화효소 2는 pH 5 내지 pH 6.5까지 약 80 % 이상의 반응활성을 나타내었으며, 특히 pH 6.0에서 최대 반응활성을 나타내었다(도 1a).
실험예 1.2: 반응 온도
상기 실시예 2를 통해 제조된 올레산 수화효소 2의 반응활성에 미치는 반응온도의 영향을 알아보기 위하여, 기질로서 올레산을 이용하여 25 ℃ 내지 50 ℃에서 올레산 수화반응을 수행하였다.
올레산 및 씨트레이트/포스페이트 완충용액은 상기 실험예 1.1에 동일한 농도를 첨가하였고 각각의 온도로 10분 동안 올레산 수화반응을 진행하였다. 반응활성은 10-하이드록시스테아르 산의 생산량을 측정하여 상대적으로 비교하였다.
실험 결과, 올레산 수화효소 2는 30 ℃ 내지 45 ℃에서 80 % 이상의 반응활성을 나타내었으며, 특히 pH 35 ℃에서 최대 반응활성을 나타나내었다(도 1b).
실험예 1.3: 유기용매 종류
올레산 수화효소 2의 반응활성에 미치는 유기용매의 영향을 알아보기 위하여, 반응액에 다양한 유기용매를 첨가한 후 올레산 수화반응을 수행하였다.
올레산 수화반응은 0.14 g/L의 올레산과 0.005 g/L 올레산 수화효소 2를 함유한 50 mM 씨트레이트/포스페이트 완충용액(pH 6.0)에 각각 5 또는 10 %(v/v)의 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 2-프로판올(isopropanol), 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 톨루엔(toluene)을 첨가한 후 각각 10분 동안 진행하였다, 반응액 양과 같은 양의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 넣어 반응을 종료시켰으며, 반응활성은 10-하이드록시스테아르 산의 생산량을 측정하여 상대적으로 비교하였다.
실험 결과, 5 %(v/v)의 메탄올 및 2-프로판올, 5 및 10 %(v/v)의 다이메틸설폭사이드를 첨가한 반응액은 올레산 수화효소 2의 반응활성이 대조군과 비교하여 높음을 확인하였고, 특히 다이메틸설폭사이드를 첨가한 반응액의 반응활성은 다른 유기용매와 비교하여 가장 높음을 알 수 있었다(도 2a).
실험예 1.4: 다이메틸설폭사이드 농도
상기 실험예 1.3에서 유기용매 중 다이메틸설폭사이드를 첨가하였을 때 올레산 수화효소 2의 반응활성이 가장 높았으므로, 올레산 수화효소 2의 반응활성을 최적화 할 수 있는 다이메틸설폭사이드의 농도를 알아보기 위하여, 반응액에 0 % 내지 12.5 %의 다이메틸설폭사이드를 첨가하여 올레산 수화반응을 수행하였다.
올레산 수화반응은 다양한 농도의 다이메틸설폭사이드를 첨가하여 실험예 1.3에서 기재된 방법과 동일하게 수행하였다. 반응활성은 10-하이드록시스테아르 산의 생산량을 측정하여 상대적으로 비교하였다.
실험 결과, 실험예 1.3의 결과와 동일하게, 5 %(v/v)가 되도록 다이메틸설폭사이드를 첨가하였을 때 올레산 수화효소 2의 반응활성이 가장 높음을 알 수 있었다(도 2b).
실험예 1.5: 불포화지방산 종류
상기 올레산 수화효소 2의 반응활성 및 생산속도에 미치는 불포화지방산의 영향을 알아보기 위해, 올레산(oleic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid) 리놀레산(linoleic acid), 알파-리놀렌산(α-linolenic acid) 또는 감마-리놀렌산(γ-linolenic acid)을 기질로서 첨가하여 수화반응을 수행하였다.
상기 수화반응은 실험예 1.3에 기재된 동일한 농도의 기질, 올레산 수화효소 2 및 씨트레이트/포스페이트 완충용액을 사용하여 동일한 방법으로 수행하였다(표 1).
올레산 수화효소 2의 기질에 따른 비활성 비교

기질
생성물		 올레산 수화효소 2의 비활성 (umol/ mg-1 protein min-1) 올레산 수화효소의 비활성 (umol/enzyme-1 min-1)
올레산 10-하이드록시스테아르 산 5.36 ± 0.07 3.69 ± 0.0023
팔미톨레산 10-하이드록시팔미톨레산
(10-hydoroxypalmitic acid)		 2.21 ± 0.03 1.95 ± 0.0018
리놀레산 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산 1.67 ± 0.19 0.91 ± 0.0005
알파-리놀렌산 10-하이드록시옥타데크-12,15-디에노익 산
(10-hydroxyoctadec-12,15-dienoic acid)		 1.05 ± 0.09 0.54 ± 0.0004
감마-리놀렌산 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산
(10-hydroxyoctadec-6,12-dienoic acid)		 0.78 ± 0.04 0.33 ± 0.00008
상기 표 1에서 보듯이, 다양한 불포화지방산을 기질로 사용하여 올레산 수화효소 2의 수화반응활성을 측정한 결과, 기질로서 가장 적합한 불포화지방산은 올레산이고, 이어, 팔미톨레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산의 순서임을 확인하였다.
또한, 표 1에서 보듯이, 상기 올레산 수화효소 2의 비활성(반응시간의 효소량에 따른 생성물의 양)은 Journal of Biotechnology 158:17-23, 2012에 개시된 스테노트로포모나스 말토필리아 유래의 올레산 수화효소의 기질에 따른 비활성과 비교하여, 올레산, 팔미톨레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산 또는 감마-리놀렌산에 대해서 각각 45%, 10%, 80%, 90%, 130% 정도 높은 것을 확인하였다.
따라서. 올레산 수화효소 2의 반응활성 및 생산속도는 올레산을 기질로 사용될 때 가장 높으며, 위의 기질이 사용될 때, 종래의 올레산 수화효소보다 높음을 알 수 있었다.
실험예 1.5: 올레산 수화효소 2의 농도
상기 올레산 수화효소 2의 반응활성을 최적화할 수 있는 올레산 수화효소 2의 농도를 알아보기 위하여, 다양한 효소 농도 조건에서 올레산을 기질로 사용한 올레산 수화반응을 진행하고, 그의 반응산물인 10-하이드록시스테아르 산의 생산량을 비교하였다.
10 g/L의 올레산 및 5 % 다이메틸설폭사이드를 함유한 50 mM 씨트레이트/포스페이트 완충용액(pH 6.0)에 0.5 g/L에서 3.0 g/L 범위의 올레산 수화효소 2를 첨가하여 10-하이드록시스테아르 산을 측정하였다. 상기 반응은 15 mL 플라스틱용기에서 1 mL로, 35 ℃, 3 시간의 조건으로 수행하였고, 1 mL의 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하였다.
실험결과, 올레산 수화효소 2의 농도가 2.5 g/L가 될때까지, 상기 농도가 증가할수록 10-히드록시스테아르산 생산량이 증가함을 확인하였고, 2.5 g/L 이후부터는 증가하지 않았다(도 3).
따라서, 올레산 수화효소 2의 농도가 2.5 g/L일 때, 올레산이 10-히드록시스테아르산으로 최대 전환되므로, 상기 농도일 때 반응활성이 가장 높음을 알 수 있었다.
실험예 2. 올레산 수화효소 2를 이용한 10-하이드록시스테아르 산의 생산
올레산 수화효소 2를 이용하여 10-하이드록시스테아르 산의 생산속도을 확인하기 위하여, pH 6.0 및 35 ℃ 조건에서 10 g/L의 올레산을 기질로 하여 생물전환 시 반응 생성물의 시간별 생산량을 측정하였고 이는 종래의 올레산 수화효소와 비교하였다.
실험 결과, 올레산 수화효소 2는 10 g/L의 10-하이드록시스테아르 산을 생산하였고, 시간당 3.4 g/L의 생산성과 감소된 기질 대비 90% 이상의 전환수율을 나타내었다. 또한, 종래의 올레산 수화효소를 이용한 10-하이드록시스테아르 산의 생산성과 비교하여, 올레산 수화효소 2가 약 20% 이상 높은 생산성을 나타냄을 확인하였다(도 4).
따라서, 상기 결과를 통해 올레산 수화효소 2는 동일 균주 유래의 올레산 수화효소보다 우수한 올레산 수화효소이고 상기 효소를 이용하여 10-하이드록시스테아르 산을 높은 수율로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 3. 올레산 수화효소 2를 포함하는 재조합 대장균을 이용한 10- 하이드록시지방산의 생산
실험예 3.1: 올레산 수화효소 2를 포함하는 재조합 대장균을 이용한 10- 하이 드록시옥타데크-12-에노익 산(10-hydroxyoctadec-12-enoic acid)의 생산
실시예 1의 재조합 대장균을 이용한 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산의 생산속도를 확인하기 위하여, 생물전환 시 반응 생성물의 시간별 생산량을 측정하였고, 이는 종래의 올레산 수화효소와 비교하였다.
상기 재조합 대장균은 리젠버그 배지에서 배양하였고 배양액에 리놀레산을 30 mM (8.4 g/L)로 첨가하여 6시간 반응시켰다.
실험 결과, 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균은 20 mM의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산을 생산하였고 감소된 기질 대비 전환수율은 90% 이상을 나타내었다(도 5). 또한, 종래의 올레산 수화효소를 발현하는 재조합 대장균의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산 생산속도를 비교한 결과, 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균이 5배 이상 높은 생산속도를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 상기 결과를 통해 올레산 수화효소 2는 동일 균주 유래의 올레산 수화효소보다 우수한 올레산 수화효소이고, 상기 효소를 이용하여 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산을 높은 수율로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 3.2: 올레산 수화효소 2를 포함하는 재조합 대장균 및 지방 가수분해 효소를 이용한 10- 하이드록시옥타데크 -12- 에노익 산 및 10-하이드록시스테아르 산 의 생산
실시예 1의 재조합 대장균 및 지방산 가수분해 효소인 TLL(제노포커스, 대전)을 이용하여 대두유로부터 생물전환 시 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산과 10-하이드록시스테아르 산의 생산속도를 확인하기 위하여, 상기 대장균 및 TLL을 이용하여 생물전환 시 반응 생성물의 시간별 생산량을 측정하였고 이를 종래의 올레산 수화효소와 비교하였다.
실험 결과, 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용하였을 때, 7 mM의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산과 5 mM의 10-하이드록시스테아르 산이 생산되었고 감소된 기질 대비 전환수율은 약 80% 이상을 나타내었다(도 6). 또한, 종래의 올레산 수화효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하였을 때와 비교한 결과, 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용하였을 때 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산의 생산속도가 4배 이상 높은 결과를 나타내었다.
따라서, 상기 결과를 통해 올레산 수화효소 2는 동일 균주 유래 올레산 수화효소보다 우수한 올레산 수화효소임을 알 수 있었고 특히, 상기 효소를 이용하여 대두유로부터 상기 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산을 높은 수율로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 4. 올레산 수화효소 2를 포함하는 재조합 대장균, 알콜 탈수소화 효소(Alcohol dehydrogenase ) 및 베이어- 빌리거 산화효소( Bayer - Villiger monooxygenase, BVMO )를 포함하는 대장균, 및 지방 가수분해 효소를 이용한 9- 하이 드록시노난 산의 생산
실시예 1의 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균, ADH 및 BVMO를 발현하는 재조합 대장균(Green Chemistry, 2015)과 지방산 가수분해 효소인 TLL (제노포커스, 대전)을 이용하여 대두유로부터 생물전환시 9-하이드록시노난 산 (9-Hydroxynonanoic acid)의 생산속도을 확인하기 위하여, 실시예 1의 재조합 대장균 및 TLL을 이용하여 생물전환 시 9-하이드록시노난 산의 시간별 생산량을 측정하였다.
재조합 대장균은 각각 리젠버그 배지에서 배양하였고, ADH 및 BVMO를 발현하는 재조합 대장균의 배양액에 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균으로부터 얻은 균체, TLL 및 대두유 5 g/L을 첨가하여 12시간 반응시켰다.
실험 결과, 실시예 1의 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균를 이용하였을 때, 약 8 mM의 9-하이드록시노난 산이 생산되었고, 감소된 기질 대비 전환수율은 약 70% 이상을 나타냄을 확인하였다(도 7).
따라서, 상기 결과를 통해 올레산 수화효소 2는 대두유로부터 9-하이드록노난 산의 생산에도 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Novel oleate hydratase 2 and uses thereof <130> KPA151378-KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1986 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stenotrophomonas maltophilia, oleate hydratase 2 <400> 1 atgagccagc ccaccgcacc gggacgcaac gcaggggcca cgccggcctt cgagcacgag 60 ccggacagca ccggcggcta ctggtccaac cggccggaga acacactgcc accgccggac 120 atgatggggg cctacatgcg caaccggccg ctgccgccgg aggacgtggc gcagcgcaag 180 gcctacatca tcggcaccgg catcgccggg ttggcggcgg cgttctacct gatccgcgac 240 ggcggcatgc cgccggccaa catcacgctg ctggacagcc tggagatcga aggcggttcg 300 ctggatggcg cgggggatgc cgagcagggc tacctgatcc gcggcggccg cgagatgaac 360 tggaactacg acaatttctg ggacctgttc caggatgtgc cggcactcga actgccggcc 420 ggcttcagcg tgctcgacga gtaccgcgcc gtcaacgaca acgatccgaa ctggtccaag 480 gcgcggctgc tgcaccagca gggcaaggtc aaggatttcg ccacgttcgg gttgagccgc 540 ggccagcaat gggagctggt caagctgctg ctcaagcgca aggaagacct ggacgacgtc 600 accatcgagg actacttcag cgaaggcttt ctgcagagca acttctggtt cttctggcgc 660 tcgatgttcg ccttcgagaa ctggcagagc ctgctcgaga tgaagctgta catgcatcgg 720 ttcctggatg ccatcgacgg tctgaacgac atgtccgcgc tggtgtttcc caagtacaac 780 caatacgaga gttttgtggt gccgctgtcg cggatgctgc gcgcgcaggg cgtcaacgtg 840 cagttcgata cccgcgtcca cgacctggag atggcggtgg acgggcagtc acgcaccgtc 900 accgcgctgc gctgccgggt ggccggcaac gagaccacgc tgccggttgc ggcgggcgac 960 ctggtgttcg cgctcaccgg ttcgatgacc gaaggcacgg cgtacggcga catggacacc 1020 gtgccgccgc tggcgcgcga ccgccgggac ccgggcgagg acagtgactg ggcgctgtgg 1080 cgcaatctcg cgcggcagtc gccgatcttc ggcaagccgg agaagttcta cggcgacgtg 1140 gaccgctcga tgtgggagtc ggccacgttg acctgccgcc cctcgccgct ggtggacaag 1200 atccgcacgt tgtcggtcaa cgatccgtac tccgggcgca ccgtgaccgg tggggtcatc 1260 accatcaccg attccaactg ggtgctcagc ttcaccgtca accgccagcc gcatttcgtg 1320 gaccagccca aggacgtgct ggtggtatgg gtctatgccc tgttgatgga tcaggacggc 1380 aaccacatca aaaagccgat gccggcgtgt accggacgcg aggtgctggc cgaactgtgc 1440 caccacctgg gcatcggcga ccagatcgat gcggtggccg ccgcgaccag ggtgcggctg 1500 gcgttgatgc cgtacatcac cgcgcagttc atgccgcgtg ccgctggcga ccgtccgcac 1560 gtggtaccgg ccggctgcac caacctgggc ctgctcggcc agttcgtgga aacgcgcaac 1620 gatgtgatct tcacgatgga aagctcgatc cgcacggcgc gtgtggcggt gtacaccctg 1680 ctggggctgc gcaagcaggt accggacctg agcccgaccc agtacgacat ccgcaatctg 1740 atcaaagcgg cacgggcgtt gaacaacaac gcgccgttcc ccggcgaacg gctgctgcac 1800 cgtctgctcg gcaacagtta ttacgcccac atcctgccgc cgctgccaca gcctgaaaag 1860 ggccgggagg ccttccttga agaggagctg tcgtggttgt caggcaaggg cagcgtggtg 1920 ctgaaggacc tgtctgcacg gctggatcgg cttggcgaaa cgctgggcag gcggcgcgcg 1980 ccctag 1986 <210> 2 <211> 661 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stenotrophomonas maltophilia, oleate hydratase 2 <400> 2 Met Ser Gln Pro Thr Ala Pro Gly Arg Asn Ala Gly Ala Thr Pro Ala 1 5 10 15 Phe Glu His Glu Pro Asp Ser Thr Gly Gly Tyr Trp Ser Asn Arg Pro 20 25 30 Glu Asn Thr Leu Pro Pro Pro Asp Met Met Gly Ala Tyr Met Arg Asn 35 40 45 Arg Pro Leu Pro Pro Glu Asp Val Ala Gln Arg Lys Ala Tyr Ile Ile 50 55 60 Gly Thr Gly Ile Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Tyr Leu Ile Arg Asp 65 70 75 80 Gly Gly Met Pro Pro Ala Asn Ile Thr Leu Leu Asp Ser Leu Glu Ile 85 90 95 Glu Gly Gly Ser Leu Asp Gly Ala Gly Asp Ala Glu Gln Gly Tyr Leu 100 105 110 Ile Arg Gly Gly Arg Glu Met Asn Trp Asn Tyr Asp Asn Phe Trp Asp 115 120 125 Leu Phe Gln Asp Val Pro Ala Leu Glu Leu Pro Ala Gly Phe Ser Val 130 135 140 Leu Asp Glu Tyr Arg Ala Val Asn Asp Asn Asp Pro Asn Trp Ser Lys 145 150 155 160 Ala Arg Leu Leu His Gln Gln Gly Lys Val Lys Asp Phe Ala Thr Phe 165 170 175 Gly Leu Ser Arg Gly Gln Gln Trp Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys 180 185 190 Arg Lys Glu Asp Leu Asp Asp Val Thr Ile Glu Asp Tyr Phe Ser Glu 195 200 205 Gly Phe Leu Gln Ser Asn Phe Trp Phe Phe Trp Arg Ser Met Phe Ala 210 215 220 Phe Glu Asn Trp Gln Ser Leu Leu Glu Met Lys Leu Tyr Met His Arg 225 230 235 240 Phe Leu Asp Ala Ile Asp Gly Leu Asn Asp Met Ser Ala Leu Val Phe 245 250 255 Pro Lys Tyr Asn Gln Tyr Glu Ser Phe Val Val Pro Leu Ser Arg Met 260 265 270 Leu Arg Ala Gln Gly Val Asn Val Gln Phe Asp Thr Arg Val His Asp 275 280 285 Leu Glu Met Ala Val Asp Gly Gln Ser Arg Thr Val Thr Ala Leu Arg 290 295 300 Cys Arg Val Ala Gly Asn Glu Thr Thr Leu Pro Val Ala Ala Gly Asp 305 310 315 320 Leu Val Phe Ala Leu Thr Gly Ser Met Thr Glu Gly Thr Ala Tyr Gly 325 330 335 Asp Met Asp Thr Val Pro Pro Leu Ala Arg Asp Arg Arg Asp Pro Gly 340 345 350 Glu Asp Ser Asp Trp Ala Leu Trp Arg Asn Leu Ala Arg Gln Ser Pro 355 360 365 Ile Phe Gly Lys Pro Glu Lys Phe Tyr Gly Asp Val Asp Arg Ser Met 370 375 380 Trp Glu Ser Ala Thr Leu Thr Cys Arg Pro Ser Pro Leu Val Asp Lys 385 390 395 400 Ile Arg Thr Leu Ser Val Asn Asp Pro Tyr Ser Gly Arg Thr Val Thr 405 410 415 Gly Gly Val Ile Thr Ile Thr Asp Ser Asn Trp Val Leu Ser Phe Thr 420 425 430 Val Asn Arg Gln Pro His Phe Val Asp Gln Pro Lys Asp Val Leu Val 435 440 445 Val Trp Val Tyr Ala Leu Leu Met Asp Gln Asp Gly Asn His Ile Lys 450 455 460 Lys Pro Met Pro Ala Cys Thr Gly Arg Glu Val Leu Ala Glu Leu Cys 465 470 475 480 His His Leu Gly Ile Gly Asp Gln Ile Asp Ala Val Ala Ala Ala Thr 485 490 495 Arg Val Arg Leu Ala Leu Met Pro Tyr Ile Thr Ala Gln Phe Met Pro 500 505 510 Arg Ala Ala Gly Asp Arg Pro His Val Val Pro Ala Gly Cys Thr Asn 515 520 525 Leu Gly Leu Leu Gly Gln Phe Val Glu Thr Arg Asn Asp Val Ile Phe 530 535 540 Thr Met Glu Ser Ser Ile Arg Thr Ala Arg Val Ala Val Tyr Thr Leu 545 550 555 560 Leu Gly Leu Arg Lys Gln Val Pro Asp Leu Ser Pro Thr Gln Tyr Asp 565 570 575 Ile Arg Asn Leu Ile Lys Ala Ala Arg Ala Leu Asn Asn Asn Ala Pro 580 585 590 Phe Pro Gly Glu Arg Leu Leu His Arg Leu Leu Gly Asn Ser Tyr Tyr 595 600 605 Ala His Ile Leu Pro Pro Leu Pro Gln Pro Glu Lys Gly Arg Glu Ala 610 615 620 Phe Leu Glu Glu Glu Leu Ser Trp Leu Ser Gly Lys Gly Ser Val Val 625 630 635 640 Leu Lys Asp Leu Ser Ala Arg Leu Asp Arg Leu Gly Glu Thr Leu Gly 645 650 655 Arg Arg Arg Ala Pro 660 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 catatgagcc agcccaccgc ac 22 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 ctcgagtcag ggcgcgcgcc gcctg 25

Claims (13)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 올레산 수화효소 2(oleate hydratase 2).
  2. 제1항에 있어서, 상기 올레산 수화효소 2는 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래인 것인, 올레산 수화효소 2.
  3. 올레산 수화효소 2를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제3항 또는 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  6. 제5항의 발현벡터가 도입된 형질전환체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 형질전환체는 재조합 대장균인 것인. 형질전환체.
  8. (a) 제6항의 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및,
    (b) 상기 배양물로부터 올레산수화효소 2를 회수하는 단계를 포함하는, 올레산 수화효소 2의 제조방법.
  9. 제1항의 올레산 수화효소 2 또는 이를 발현하는 형질전환체에 불포화지방산을 처리하여 수화반응시키는 단계를 포함하는 하이드록시지방산의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 불포화지방산은 올레산(oleic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 알파-리놀렌산(α-linolenic acid), 감마-리놀렌산(γ-linolenic acid) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 불포화지방산인 것인, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 불포화지방산은 대두유에 지방산 가수분해 효소(TLL)를 처리하여 수득한 지방산 분해산물인 것인, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 하이드록시지방산은 10-하이드록시스테아르 산(10-hydroxystearic acid), 10-하이드록시팔미톨레산(10-hydroxypalmitic acid), 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산(10-hydroxyoctadec-12-enoic acid), 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산(10-hydroxyoctadec-6,12-dienoic acid), 10-하이드록시옥타데크-12,15-디에노익 산(10-hydroxyoctadec-12,15-dienoic acid) 또는 9-하이드록시지방산(9-hydroxy fatty acid)인 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 9-하이드록시지방산은 9-하이드록시노난 산(9-hydroxynonanoic acid)인 것인, 방법.
KR1020160025454A 2016-01-07 2016-03-03 올레산 수화효소 2 및 이의 용도 KR101856308B1 (ko)

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KR20220048140A (ko) * 2020-10-12 2022-04-19 주식회사 그린위치 신규한 스테노트로포모나스 균주 및 이를 이용하는 수산화 지방산의 제조방법

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