KR102033217B1

KR102033217B1 - 생물전환을 이용한 이타콘산의 생산방법

Info

Publication number: KR102033217B1
Application number: KR1020170114638A
Authority: KR
Inventors: 양영헌; 김준영; 서형민; 사시아나라야난 가네산; 홍주원; 홍윤기; 사시 칸트 바티아; 김현중; 전종민; 송헌석
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2019-10-16
Also published as: KR20190027631A

Abstract

본 발명은 (a) 아코니타아제(Aconitase, acn) 및 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA) 유전자가 삽입된 재조합벡터를 포함하는 형질전환체를 시트르산이 포함된 배지에 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 이타콘산을 수득하는 단계; 를 포함하는 이타콘산의 생산방법에 관한 것이다.

Description

생물전환을 이용한 이타콘산의 생산방법{Method for manufacturing Itaconic acid by whole-cell bioconversion}

본 발명은 (a) 아코니타아제(Aconitase, acn) 및 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA)를 발현하는 재조합벡터를 포함하는 형질전환체를 시트르산이 포함된 배지에 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 이타콘산을 수득하는 단계; 를 포함하는 이타콘산의 생산방법에 관한 것이다.

이타콘산염(itaconate)는 탄소수 5개의 불포화 디카르복시산으로써, 생합성을 통해 생산되며, 고부가가치 생물-기반 화합물에서 널리 이용될 수 있다. 이타콘산염은 합성 라텍스, 불포화 폴리에스터 수지(unsaturated polyester resins, UPR) 및 고흡수성수지(super absorbent polymers, SAP) 및 아크릴산의 대체물과 같은 중합체의 생산에 산업적으로 사용된다. 이타콘산염에 대한 전체 시장 수요는 매년 증가하고 있는 추세이며, 2014년에 이타콘산염의 세계 시장 시장은 126.4 백만 달러로 평가되었고 2023년까지 204.6 백만 달러로 증가할 것으로 예상된다.

아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)를 이용한 이타콘산염의 생합성은 1931년 Kinosita에 의해 발견되었다. 그 이후로, 이타콘산염의 생산 역가(tilter)를 높이기 위한 시도가 많이 있었으며, 1945년에 Kane et al.의 보고에 따르면, 아스퍼질러스 테레우스를 이용한 이타콘산염의 합성은 27g/L의 역가에 도달하였다. 아스퍼질러스 테레우스와는 별도로, 다른 종 역시 이타콘산염을 생산하는데 사용되어 왔다. Tabuchi et al.의 보고에 따르면, 칸다디아 균(Candida sp.)은 35g/L의 이타콘산염을 생산할 수 있으며, 깜부기병 균(Ustilago sp.) 및 슈도지마 균(Pseudozyma sp.) 또한 이타콘산염을 생산할 수 있는 것으로 알려졌다. 현재, 이타콘산은 포도당을 기질로 한 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)를 사용하여 생산되며, 생산 역가 및 생산성은 각각 129g/L 및 1.15g/L/h에 도달한다. 그러나, 상기 생산 역가는 Aspergillus niger가 생산할 것으로 예상되는 240g/L의 이론적 최대 역가보다 여전히 낮으며, 당의 높은 소비, 말레산의 장기간 발효 및 말레산, α-케토글루타르산, 옥살산 및 기타 확인되지 않은 2차 대사 산물 등과 같이 통제할 수 없는 부산물의 정제로 인하여 생산비용 역시 높다. 또한, 곰팡이의 섬유상의 사상성 생육은 발효 중에 산소 공급을 차단하여 이타콘산염의 생성을 방해한다. 산소 공급 문제를 해결하고 안정적이며 연속적인 시스템을 만들기 위하여, 아스퍼질러스 테레우스를 사용하여 멤브레인 생물반응기에서 시트르산염을 이타콘산염으로 생물 전환시키고, 고정화된 아스퍼질러스 테레우스를 사용하는 발효는 이타콘산염을 생산하기 위한 방법으로 사용되었다. 그러나, 생산 역가 및 생산성은 다른 통상적인 발효 방법에 비해 경쟁력이 없었다. Aspergillus niger이 이타콘산염 생산균주로써 개발되었지만, 그 생산량은 26.2g/L에 밖에 도달하지 못하였다. 이타콘산염 생산을 위해 박테리아 숙주를 사용하는 것은 급속 성장 및 제어 용이성과 같은 몇 가지 이점이 있으나, 대장균(E. coli)은 cis-aconitate를 itaconate로 전환시키는 cis-aconitate decarboxylase(cadA)를 가지고 있지 않다는 문제점이 있다. 이타콘산염 생산에서 핵심 효소인 CadA의 발견 이후, 이타콘산염을 생산할 수 있는 cadA 유전자의 이종 발현(Heterologous expression)을 하는 대장균 균주가 개발되었으며, 상기 대장균 균주를 이용하였을 때의 생산 역가는 690㎎/L이다. 무작위 동의 코돈 치환(random synonymous codon substitutions)을 통해 더 높은 활성의 CadA를 사용하는 또 다른 대장균 균주는 7.23g/L의 이타콘산염을 생산하며, 대장균의 모델-기반 대사 공학은 이타콘산염의 생산량을 32g/L로 증가시켰다. 그런, 대장균 발효는 생산 역가 및 생산성 측면에서 아스퍼질러스 테레우스 발효와 비교하여 여전히 경제적으로 경쟁력이 없다. 따라서, 추가적인 전략을 개발할 필요가 있다.

본 발명은 (a) 아코니타아제(Aconitase, acn) 및 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA)를 발현하는 재조합벡터를 포함하는 형질전환체를 시트르산이 포함된 배지에 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 이타콘산을 수득하는 단계; 를 포함하는 이타콘산의 생산방법 등을 제공한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 (a) 아코니타아제(Aconitase, acn) 및 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA) 유전자가 삽입된 재조합벡터를 포함하는 형질전환체를 시트르산이 포함된 배지에 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 이타콘산을 수득하는 단계;를 포함하는 이타콘산의 생산방법을 제공한다.

상기 생산방법은 형질전환체의 생물전환(bioconversion)에 의한 것일 수 있다.

상기 형질전환체는 대장균일 수 있다.

상기 아코니타아제는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum, 수탁번호 ATCC 13032)으로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 cis-아코니트산 디카르복시라아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 함유할 수 있다.

상기 cis-아코니트산 디카르복시라아제는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 함유할 수 있다.

상기 (a) 단계는 pH 4.5 내지 7.5에서 수행될 수 있다.

상기 (a) 단계는 25 내지 50℃의 온도에서 수행될 수 있다.

상기 (a) 단계는 계면활성제(surfactant)를 추가로 첨가하여 수행될 수 있다.

상기 계면활성제는 Tween 80(polyoxyethylene sorbitan monooleate), SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 현질전환체는 아스퍼질러스 이타코니쿠스(Aspergillus itaconicus)로부터 유래된 cis-아코니트산 디카르복시라아제를 발현하는 재조합 벡터가 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 일구현예로, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 생산방법에 의해 생산된 이타콘산을 제공한다.

본 발명의 다른 일구현예로, 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum, 수탁번호 ATCC 13032)으로부터 유래된 아코니타아제(Aconitase, acn) 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 함유하는 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA) 유전자가 삽입된 재조합벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일구현예로, 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum, 수탁번호 ATCC 13032)으로부터 유래된 아코니타아제(Aconitase, acn) 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 함유하는 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA) 유전자가 삽입된 재조합벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.

본 발명은 아코니타아제(Aconitase, acn) 유전자 및 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터 유래된 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA) 유전자가 삽입된 재조합벡터를 포함하는 대장균을 시트르산이 포함된 배지에 배양하여 이타콘산을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 대장균의 전세포 생물전환에 의하여 이타콘산을 제조할 수 있는바, 발효 시스템을 이용한 종래 방법에 비하여 생산성을 증대시킬 수 있다.

또한, 기질로 사용되는 시트르산염을 저렴한 가격으로 구입할 수 있으므로 원가절감의 효과가 있으며, 버퍼를 필요로 하지 않으므로 정제 과정을 생략할 수 있는바, 생산비용의 절감을 도모할 수 있다는 이점이 있다.

도 1은 (a) 본 발명에 따른 대장균의 전세포 생물전환의 모식도 및 (b) A. terreus의 발효에 의한 이타콘산염 합성 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 이중 벡터 시스템을 사용한 시트르산염의 이타콘산염으로의 전환율을 나타낸 것이다.
도 3은 (a) 유전자 발현용 배지의 선택 (b) 시트르산의 농도에 따른 이타콘산의 전환율로, 시트르산의 최적 농도를 나타낸 것이다.
도 4는 상대적 활성을 나타내는 (a) 최적의 pH (b) 온도를 나타낸 것이다.
도 5는 계면활성제(Tween 80)의 % 농도에 따른 이타콘산으로의 전환율을 나타낸 것이다.
도 6은 이타콘산염 생산성을 시간에 따라 모니터링한 결과를 나타낸 것이다.

이타콘산의 생산방법에 대하여 지난 수십 년 동안 많은 연구가 진행되었고, 최근에는 A. terreus 또는 E. coli와 같은 균주를 이용한 발효 시스템에 기반을 둔 연구가 진행되었다. 그러나, 통상적인 발효는 장 시간의 발효 기간, 높은 당 소비 및 불가피한 부산물이 생성되는바, 이타콘산의 생산성을 감소시키고 생산비용을 증가시킨다는 문제점이 있었다.

따라서, 본 발명자들은 재조합 대장균이 시트르산염을 이타콘산으로 전환시킴으로써, 이타콘산을 생산하는 방법, 즉 생물전환법을 밝혀내고 발효에 의해 발생할 수 있는 문제점을 극복할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 내 "생물전환(bioconversion)"이란, 생물의 생리적 기능을 이용해 첨가된 물질을 화학적으로 변형된 형태로 전환시키는 과정으로서, 본 발명 따른 형질전환체는 시트르산을 기질로 사용하여 생물전환에 의해 이타콘산을 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이타콘산의 생산방법

먼저, 본 발명에 따른 생산방법은 아코니타아제(Aconitase, acn) 및 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA) 유전자가 삽입된 재조합벡터를 포함하는 형질전환체를 시트르산이 포함된 배지에 배양하는 단계[(a) 단계]를 포함한다. 구체적으로, 상기 생산방법은 형질전환체의 생물전환(bioconversion)에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 형질전환체는 대장균, 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp .) 또는 바실러스 속(Bacillus sp .)으로부터 선택될 수 있으며, 대장균인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 대장균은 일반적으로 전세포 반응에 사용되며, 생물전환에 의한 반응속도는 종래 발효에 의한 이타콘산 제조방법과 비교하여 반응속도가 현저하게 빠르므로(19시간 미만), 본 발명에 따른 형질전환체는 아스퍼질러스 테레우스 또는 대장균의 발효 시스템을 이용한 종래 방법에 비하여 높은 생산성을 나타낸다.

더 나아가, 상기 아코니타아제는 시트르산, cis-아코니트산 및 L-이소시트르산의 상호 변화를 가역적으로 접촉하는 가수 효소로서, 시트르산 순환 과정의 중요한 효소로서, 본 발명에 따른 아코니타아제는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum, 수탁번호 ATCC 13032)으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 아스퍼질러스 이타코니쿠스로부터 유래된 상기 cis-아코니트산 디카르복시라아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 함유할 수 있으며, cis-아코니트산 디카르복시라아제는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 대장균에 코돈-최적화(codon-optimization)된 것으로서, 대장균 내에서 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자의 발현량이 증가함에 따라, cis-아코니트산 디카르복시라아제 효소 활성도 증가하므로, 이타콘산의 생산성이 증대된다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상을 방법을 사용할 수 있다. 또한, 상기 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지, NB배지 등을 들 수 있다.

본 발명의 형질전환체의 증식에 필요한 탄소원을 이용할 수 있는데, 상기 탄소원으로는 예를 들어 글루코스, 프락토스, 슈크로스, 말토스, 갈락갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 있으며, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산을 이용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 형질전환체는 시트르산을 기질로 하여 이타콘산을 생물전환에 의해 합성하는바, 상기 형질전환체의 배양에 있어서, 시트르산을 첨가하여 수행하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

생물전환에 의한 이타콘산 생산의 중요한 요인 중 하나는 반응 조건이다. 이탄콘산 생산은 2 단계 반응을 거치기 때문에 최적의 반응 조건을 찾는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체의 배양은 pH 4.5 내지 7.5에서 수행될 수 있으며, pH 5 내지 6에서 수행되는 것이 바람직하고, pH 5.5에서 수행되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, pH가 상기 범위 미만인 경우, 효소의 구조 변형으로 인하여 효소 활성을 잃게 되는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 시트르산의 이타콘산으로의 전환율이 감소되어 이타콘산의 생산성이 저하되는 문제점이 있다. 상기 형질전환체의 배양은 25 내지 50℃에서 수행될 수 있으며, 30 내지 40℃에서 수행되는 것이 바람직하고, 35℃에서 수행되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 배양 온도가 상기 범위 미만인 경우, 효소의 구조 변형으로 인하여 효소 활성을 잃게 되는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 시트르산의 이타콘산으로의 전환율이 감소되어 이타콘산의 생산성이 저하되는 문제점이 있다.

더 나아가, 본 발명의 형질전환체의 배양은 형질전환체의 세포 막 투과성을 증가시기키 위하여, 계면활성제를 추가로 첨가하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 계면활성제로서, Tween 80(polyoxyethylene sorbitan monooleate), SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, Tween 80인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 계면활성제로서 Tween 80을 추가로 첨가하는 경우, 상기 Tween 80의 농도는 0.1 내지 1%일 수 있으며, 0.3 내지 0.5%인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, Tween 80의 농도가 상기 범위를 초과하는 경우, 형질전환체의 전세포가 파괴되는 문제점이 있다.

마지막으로, 본 발명에 따른 생산방법은 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 이타콘산(itaconic acid)를 수득하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.

본 발명의 이타콘산 생산방법에 있어서, 상기 형질전환체는 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터 유래된 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA) 유전자가 삽입된 재조합 벡터가 추가로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 형질전환체는 시트르산을 아코니타아제에 의해 cis-아코닉산(cis-aconitic acid)으로 전환시킨 후, cis-아코니트산 디카르복시라아제에 의해 이타콘산을 합성할 수 있는데, 이 때, 상기 cis-아코니트산 디카르복시라아제는 이타콘산 합성에 있어서 매우 중요한 효소이다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 cis-아코니트산 디카르복시라아제를 발현할 수 있는 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 본 발명에 따른 아코니타아제(aconitase, acn) 유전자 및 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터 유래된 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자가 삽입된 재조합 백터를 대장균에 형질전환시킴으로써, 이타콘산의 생산성을 확인하였다. 그 결과, 상기 cis-aconitate decarboxylase의 발현이 증가할수록, 즉, 상기 형질전환체에 상기 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 추가로 포함할수록 이타콘산의 생산성이 증대되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자가 삽입된 재조합 벡터는 1 내지 5개가 추가로 포함될 수 있으며, 2 내지 4개인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 추가로 포함되는 재조합 벡터의 수가 상기 범위 미만인 경우, 상기 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자의 발현량이 부족하여 시트르산으로부터 이타콘산의 전환율이 감소되는 바, 이타콘산의 생산성이 저하되는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 형질전환 세포에 유전적 부담(genetic burden)이 발생하여 상기 cis-아코니트산 디카르복시라아제의 발현율이 감소하는 문제점이 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 이타콘산의 제조방법은 아코니타아제 유전자 및 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터 유래된 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자가 삽입된 재조합 백터로 형질전환된 형질전환체가 시트르산을 생물전환에 의해 이타콘산을 효율적으로 생산할 수 있다. 또한, 상기 생물전환은 전세포 시스템으로서 버퍼 없이도 이타콘산의 생산에 이용될 수 있는바, 별도의 정제가 필요 없으므로 제조 비용을 감소시킬 수 있다는 이점이 있다.

따라서, 본 발명에 따른 이타콘산의 제조방법 즉, 시트르산염의 이타콘산으로의 생물전환은 종래 아스퍼질러스 테레우스의 발효에 의해 생산되는 이타콘산의 생산성과 비교하여, 현저하게 높은 생산성을 나타내는 바, 이타콘산 생산의 대체가 될 수 있을 것이다.

이타콘산

본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 이타콘산을 제공한다. 구체적으로, 상기 이타콘산은 불포화 디카르복실산과 공액 이중결합을 가지고 있어 화학적으로 활용하기 쉬운 특성이 있으며, 섬유(fiber), 수지(resin), 플라스틱 고무(plastic rubber), 페인트(paint), 계면활성제(surfactant), 이온교환수지(ion-exchange resins) 및 윤활유(lubricant) 등의 다양한 제품의 원료로 활용되고 있다. 뿐만 아니라, 이타콘산은 석유화학 유래의 원료인 아크릴산(acrylic acid), 아세톤 시아노히드린(acetone cyanohydrin), 무수말레산(maleic anhydride) 및 트리폴리인산 나트륨(sodium tripolyphosphate)를 대체할 수 있어 그 활용성이 매우 높은 물질이다. 그러나 원료로 활용되기에는 생산단가가 높아 활용 범위가 제한되고 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 이타콘산은 기질로 사용되는 시트르산염을 저렴한 가격으로 구입할 수 있으므로 원가절감의 효과가 있는바, 산업적 활용 가치가 높다는 이점이 있다.

재조합벡터

본 발명은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum, 수탁번호 ATCC 13032)으로부터 유래된 아코니타아제(Aconitase, acn) 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 함유하는 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA) 유전자가 삽입된 재조합벡터를 제공한다. 상기 재조합벡터의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

본 발명의 재조합 벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.

형질전환 대장균

코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum, 수탁번호 ATCC 13032)으로부터 유래된 아코니타아제(Aconitase, acn) 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 함유하는 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA)를 발현하는 재조합벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다. 상기 형질전환 대장균의 구제적인 내용은 전술된 바와 같다.

따라서, 본 발명에 따른 형질전환체는 아코니타아제(aconitase, acn) 유전자 및 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터 유래된 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자가 삽입된 재조합 백터로 형질전환된 것으로서, 상기 형질전환체에 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자가 삽입된 재조합 백터를 추가로 포함함으로써, 이타콘산의 생산성을 증대시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[준비예] 시약(reagents)

시트르산나트륨 수화물(Sodium citrate dehydrate)(Dae-Jung, Korea)과 시트르산(cirtic acid) (Duk-San Pure Chemical Co., Korea)을 사용하여 1M 시트르산 용액(citrate solution)을 제조하였다. 시트르산(citric acid), 이타콘산(itaconic acid)(Sigma-Aldrich, USA) 및 cis-aconitic acid(Alfa Aesar, USA)는 기준 커브(standard curve)의 준비를 위해 사용하였으며, nPfu-Forte polymerase (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 DNA 및 플라스미드를 MG Plasmid SV Miniprep Kit (Doctor Protein, Seoul, Korea)를 이용하여 정제하고, 모든 endonucleases (NdeI, EcoRV, BamHI, SacI, XhoI, and NotI)는 New England Biolabs (USA)에서 구입하여 준비하였다.

[실험방법]

1. 박테리아 균주(bacterial strains), 플라스미드, 프라이머 및 배지

사용된 E. coli strain 및 플라스미드는 표 1 및 표 2에 나타난 바와 같다. 모든 E. coli strain을 카나마이신(kanamycin) 50 ㎍/mL, 스트렙토마이신(spectinomycin) 100 ㎍/mL, 및 클로람페니콜(chloramphenicol) 25 ㎍/mL이 함유된 5 mL Luria-Bertani(LB) 배지(10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract 및 5 g/L NaCl)에서 37℃, 16시간 동안 전-배양(pre-culture)하였다. 사용된 벡터에 따라 적절한 항생제가 첨가 되었으며, 그 농도는 다음과 같다. 카나마이신(kanamycin) 50 ㎍/mL, 스트렙토마이신(spectinomycin) 100 ㎍/mL, 및 클로람페니콜(chloramphenicol) 25 ㎍/mL.

전배양된 세포의 총 2%를 발현 배지(induction medium) 50mL에 접종하였다. LB 배지, Terrific Broth(TB) 배지(트립톤(tryptone) 12 g/L, 효모추출물(yeast extract) 24 g/L, K₂HPO₄ 72 mM, KH₂PO₄ 17 mM 및 0.4%v/v 글리세롤(glycerol)) 및 2x YT Broth 배지(트립톤 16 g/L, 효모추출물 10 g/L, 및 NaCl 5 g/L)를 유도배지로써 비교하였다. 플라스미드를 유지시키기 위하여, 적절한 항생제를 배지에 추가하였다. 초기시점에 isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG) 0.5mM를 30℃에서 24시간 동안 유도하였다. 효소 봉입체(enzyme inclusion bodies)의 형성을 방지하기 위해 유도 온도 및 시간을 48시간 동안 25℃로 조절하였다. 듀오 배양(induction culture)은 25℃, 200rpm에서 진탕배양기(shaking incubator)(HB-201SL, Han-Baek, Korea)에서 250mL baffled Erlenmeyer flask에서 수행하였다.

균주	관련 정보
DH5α	F^- 80lacZ M15 endA recA hsdR(r_k ^-m_k ^-)supE thi gyrA relAΔ(lacZYA-argF)U169
BL21(DE3)	F- ompT hsdS _B (r_B ^-m_B ^-)gal dcm
JY001	BL21(DE3) carrying pHMS01 & pHMS05
JY001	BL21(DE3) carrying pHMS01 & pHMS06

플라스미드	관련 정보
pACYC-duet1	Co-expression vector, Cmr. 2 MCS site with T7 promoter, lac operator, RBS. P15A replicon. copy number 10 내지 12.
pCDF-duet1	Co-expression vector, Specr. 2 MCS site with T7 promoter, lac operator, RBS. CloDF13 replicon. copy number 20 내지 40.
pRSF-duet1	Co-expression vector, Kmr. 2 MCS site with T7 promoter, lac operator, RBS. RSF1030 replicon(NTP1. copy number 100 이상.
pHMS01	pCDF- duet1, Specr, cadA (MCS1) 및 acn (MCS2).
pHMS02	pACYC-duet1, Cmr, cadA (MCS1).
pHMS03	pRSF-duet1, Kmr, cadA (MCS1).
pHMS04	pACYC-duet1, Cmr, 2 cadA (MCS1,2).
pHMS05	pRSF-duet1, Kmr, 2 cadA (MCS1,2).
pHMS06	pRSF-duet1, Kmr, 2 cadA (MCS1,2), citT (MCS1).

2. 유전적 방법(genetic method)

유전자 복제는 일반적인 분자 생물학적 방법으로 수행하였다. A. terreus의 본래 cis-aconitate decarboxylase 서열에 기초하여, cadA를 코돈 최적화하였고, Cosmogenetech(Seoul, Korea)에서 유전자 합성을 수행하였다. acn 유전자는 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032S로부터 유래하였다. PCR에 사용된 acn , cadA 및 citT 프라이머 서열을 하기 표 3에 나타냈다. 증폭된 DNA를 정제하고 endonucleases로 절단하였다. 즉, acn은 NdeI 및 EcoRV로 절단하였고, cadA는 MCS1에서 BamHI 및 SacI로, MCS2에서는 NdeI 및 XhoI로 절단하였으며, citT는 SacI 및 NotI로 절단하였다. 절단된 PCR 산물은 동일한 endonucleases로 절단한 벡터에 ligation시켰다. Ligation시킨 플라스미드를 열 충격 방법(heat-shock method)를 이용하여 E. coli DH5α 수용체 세포로 형질전환 시켰다. 제작된 플라스미드는 시퀀싱(Cosmogenetech, Seoul, Korea)을 이용하여 확인하였고, 추가 실험에 사용하였다.

각 효소의 발현은 전환 반응(conversion reaction) 및 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)로 시험하였다. 총 1mL의 배양액을 세포 수확을 위해 원심 분리하고, pH 6.8의 PBS(phosphate-buffed saline) 50mM로 세척하였다. 수확된 세포를 제조사가 권장하는 조건 하에서, BugbusterTM (Novagen, Madison, WI, USA)로 처리하였다. 15,184ⅹg에서 3분 동안 원심분리 한 후, 상등액을 가용성 분획으로 추출하였다. 불용성 분획의 pellet을 3회 세척하고 동일한 부피의 PBS에 재 현탁시켰다. SDS-PAGE는 120v에서 2시간 동안 수행되었다.

프라이머		서열 정보
acn	Forward	CTCTAT CATATG ATGGAGCTCACTGTGACTGA
acn	Reverse	CTCT GATATC TTACTTAGAAGAAGCAGCCATC
cadA (MCS1)	Forward	CTCT GGATCC AATGACCAAGCAGAGCGCAG
cadA (MCS1)	Reverse	CTCT GAGCTC TTAAACCAGCGGGGATTTAAC
cadA (MCS2)	Forward	ATCGTC CATATG ATGACCAAGACGAGCGCAG
cadA (MCS2)	Reverse	CTCT CTCGAG TTAAACCAGCGGGGATTTAAC
citT	Forward	CTCT GAGCTC GCACTTGATAAATTTGGAAA
citT	Reverse	CTCTCT GCGGCCGC TTAGTTCCACATGGCGAG

3. 전-세포 반응(whole-cell reaction)

단일세포 전체 생체 촉매(single whole-cell biocatalysts)인 acn 및 CadA의 활성을 측정하였다. 먼저, 35℃ 및 pH 7에서 24시간 동안 반응을 수행하였다. 최적화를 위한 총 반응 부피는 시트르산 500mM 및 세포 43.5㎎을 함유한 500μL 이다. 시간에 따른 전환율을 확인하기 위하여, 총 부피를 200mL로 최적화하고, 샘플링을 위하여 반응용액을 간헐적으로 혼합하였다. 샘플을 올릴 때마다 반응기의 덮개를 들어올렸다. 90℃에서 5분 동안 가열시킴으로써, 반응을 정지하였다. 반응 용액을 1:50으로 희석하고, HPLC로 분석하였다. trisodium citrate dihydrate(pH 8.7) 1M 및 citric acid(pH 1.5) 1M을 사용하여 최적 pH를 결정하였다. 이타콘산염의 생산에 의해 각 유전자의 활성을 조사하였다.

4. 생물전환 반응의 추가적인 효과

cofactor로서의 FeSO₄, 및 polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80) 및 세포막 약화제로서 Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)를 시험하였다. FeSO₄를 10mM의 농도로 제조하고, Tween 80 및 SDS를 10%로 사용하였다. 각 시약에 반응 용액을 첨가하였다. FeSO₄의 최종 농도는 0, 5, 10, 15 또는 20 μM 이고, Tween 80 및 SDS는 0.01, 0.1 또는 1%였다. Tween 80이 증가된 전환을 일으키기 때문에, Tween 80의 최적 농도는 0.1 내지 0.5% 범위의 농도에서 시험하였다.

5. 분석적 방법

Citrate, isocitrate, itaconate, 및 cis-aconitate를 고성능액체크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)로 정량화 하였다. 반응 용액을 90℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시키고, 단백질을 응집시킨 후, 15,314ⅹg 에서 원심분리하여 세포 파편(cell debris)를 제거하였다. 상등액을 1:50으로 희석하고, Whatman syringe filter(0.2 ㎛, PVDF, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 사용하여 여과시켰다. 여과액을 Aminex HPX-87H column(300 ? 7.8 ㎜, 9 ㎛, Bio-Rad, Hercules, California, USA)이 장착된 HPLC(Prominence-i LC-2030, Shimadzu, Japan)로 분석하였다. 용액을 0.6mL/분의 유속으로 0.004M H₂SO₄의 이동상을 사용하여 용리 시켰다. 오븐 온도를 60℃로 설정하고, UV 검출기를 사용하여 210㎚에서 분석물을 모니터링 하였다. 각 유기산의 농도는 표준 곡선으로 계산하였고, citrate, isocitrate, itaconate, 및 cis-aconitate은 각각 7.6, 7.7, 12.0, 및 6.8 시간 동안 유지하였다.

[ 실시예 ]

실시예 1. acn 및 cadA 를 발현하는 E. coli 전-세포 생체촉매의 제조

E. coli 전세포 생체촉매를 제조하기 위하여, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032로부터 유래된 acn 유전자 및 A. terreus의 cadA(cis-aconitate decarboxylase) 유전자의 합성, 코톤 최적화된 합성 유전자를 pCDF-duet1(pHMS01)에 클로닝하였다. 상기 acn 유전자는 다른 원핵 생물 종 중에서 시트르산염(citrate)에 대한 Km 값이 가장 낮기 때문에 선택되었다. 단백질 합성에 사용되는 전형적인 E. coli 균주인 BL21(DE3)을 pHMS01로 형진전환 시켰다. 각 유전자의 발현은 SDS-PAGE를 실행하고 전세포 전환 반응을 시험하였다. 먼저, pHMS01을 함유한 BL21은 시트르산염 100mM 중 3.4mM 만이 이타콘산염(itaconate)으로 전환되었으며(3.4%), SDS-PAGE 분석 결과, CadA 일부가 봉입체를 형성한다는 것을 확인하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 유도 시간 및 온도의 변화는 cadA의 발현에 영향을 미쳤다. pHMS01을 함유한 BL21에 의한 시트르산염 전환율은 이전 조건에 비하여 2.1배 증가하였다(7.2%). 유도 조건의 변화가 전세포 활성을 증가시켰으나, 전환율을 여전히 낮았다. CadA는 이탄콘산염 생산의 주요한 효소이며, cis-aconitate decarboxylase의 과발현을 증가시키기 위해 cadA 유전자 복제 수(copy neuber)를 증가시켰다. CadA 유전자를 다른 듀엣 벡터(duet vector)로 클로닝하였다. 추가적인 cadA 발현을 위하여 pACYC-duet1 및 pRSF-duet1을 시험하였다. cadA 유전자 복제 수의 증가는 시트르산염의 전환을 향상시켰다. cadA 유전자를 포함하는 pHMS02(pACYC-duet1::cadA) 및 pHMS03(pRSF-duet1::cadA)의 추가는 pHMS01 단일-벡터 시스템과 비교하여 citrate 전환율이 증가하였다. 상기 pHMS02 플라스미드는 7.2%에서 10.2%로 전환율이 증가하였고, pHMS03 플라스미드는 15.9%로 증가하였다. 또한, 두 개의 cadA 유전자 사본을 포함하는 pHMS04(pACYC-duet1::cadA::cadA) 및 pHMS05(pRSF-duet1::cadA::cadA)의 경우, 상기 전환율이 현저히 증가하였다. 시험에 이용된 모든 플라스미드는 pHMS01 단일-벡터 시스템과 비교하여 우수한 전환율을 보였다. pHMS02와 pHMS03 및 pHMS04와 pHMS05를 비교하여, pRSFduet1은 pACYC-duet1보다 우수한 발현을 나타냈는데, 그 이유는 상기 pRSFduet1은 유전자 복제 개수가 100개 이상이며, 상기 pACYC-duet1은 10개 정도이기 때문으로 사료된다. pHMS01 및 pHMS05(JY001)을 포함하는 BL21은 시트르산염 25.7mM을 이타콘산염으로 전환시켰으며, 이러한 수치는 결과적으로 7.6배 증가된 25.7%에 해당한다. 따라서, 생체 촉매로서 JY001을 추가 실험에 사용하였다.

실시예 2. 유도배지 및 기질 농도의 선택

최적의 반응 조건을 결정하기 위해, 몇 가지 요인들을 평가하였다. acn 및 cadA의 발현을 최대화 하고 생체 촉매의 질량을 증가시키도록 유도 배지 및 유도 시간을 선택하였다. TB 및 2x YT broth는 질소원의 농도가 더 높았고, LB broth 의 수율을 향상시켰기 때문에, 상기 세 가지 배지의 수율을 비교하여 가장 높은 단백질 발현 및 세포 성장을 결정하였다. LB 배지에서 배양된 세포는 다른 두 가지 배지에서 배양된 세포보다 높은 생산 수율을 보였다. LB broth에서 전-세포 생체촉매 1㎎은 시간당 citrate 10.5mM을 itaconate로 전환시켰고, TB broth 및 2x YT broth는 각각 0.69mM 및 0.52mM의 citrate를 itaconate로 전환시켰다. 그러나, TB broth의 dry cell weight(DCW)는 5.05g/L로 가장 높았으며, LB broth와 비교하여 7.2배 높았다. 또한, 2x YT broth의 dry cell weight(DCW)는 1.71g/L로 LB broth와 비교하여 2.4배 높았다. 이러한 특성은 유도 후 더 길고 보단 안정한 성장을 가져왔으며, TB broth에서 가장 높은 dry cell weight(DCW)를 나타냈다. 그러므로, TB broth는 시험된 다른 두 broth와 비교하여 더 높은 전환율(3.4mM/L)을 나타내기 때문에, 유도 배지로 선택하였다. 유도 시기에 대하여는, 유도 초기에 IPTG를 첨가함으로써, 가장 높은 생산을 유도하는 것으로 나타났다. 시트르산염의 최적 농도와 관련하여, 시트르산염 500mM로부터 이타콘산염 81.9mM이 생산되었고, 전환율은 16.3% 였다. 상기 농도에서의 전환율은 다른 농도에서보다 낮지만, 시험된 다른 시트르산염의 농도에 비해 이타콘산염의 양이 가장 많았으며, 시트르산염 농도 500mM을 선택하여 추가 실험에 사용하였다.

실시예 3. pH, 온도 및 전세포의 투과성 효과

acn 및 cadA에 대한 최적 pH는 각각 7.5~7.75 및 6.2로 보고되었다. 그러나, 전반적인 반응은 주로 초기 세포외 pH에 의해 영향을 받기 때문에, 전세포 전환 반응에 대한 최적 pH를 평가하였다. 전세포 반응을 위한 최적 pH는 5.5이며, 이는 각 개별 효소에 대한 pH와 상이하다.

Acn 및 CadA의 최적 온도는 각각 50℃ 및 37℃로 보고된 바 있다. 그러나, 본 발명에 따른 제조방법에서는, 35℃에서 이타콘산의 최대 생산성을 나타냈다. 최적의 pH 및 온도에서, 시트르산염 500mM로부터 이타콘산염 239mM가 생성되었다(47.8%). pH 및 온도 외에, 보조인자(cofactor) 및 FeSO₄ 또한, 아코니타제(aconitase)의 활성을 결정하였으나, 전세포 시스템에서 현저한 효과를 나타내지는 않았다. Fe² ⁺는 아코니타아제 활성에 긍정적인 영향을 미치지만, cis-aconitate dearboxylase를 억제하는 금속 이온이다. 따라서, 이타콘산 생산에 FeSO₄가 현저한 영향을 미치는 어떠한 결과도 관찰하지 못했다.

투과성은 기질과 생성물이 세포막을 통해 전달되어야 하기 때문에 전세포 반응에서 중요한 또 다른 요소이다. 급속한 시트르산염의 섭취와 이타콘산염의 신속한 배설은 전환율을 상당히 증가시킨다. E. coli의 막 투과성을 증가시키기 위하여, 시트르산염 운반 단백질(carrier protein) 및 dicarboxylic acid transporter citT 가 JY002에서 과발현됨으로써, 이타콘산염의 생산에 미치는 영향을 평가하였다; 그러나, 생산성의 현저한 증가를 관찰할 수는 없었다. 세포 투과성을 증가시키기 위하여, 계면활성제를 적용하였다. 비-이온성(non-ionic) 계면활성제인 polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80) 및 sodium dodecyl sulfate(SDS)의 2 가지 계면활성제를 평가하였다. 0.01% 농도의 SDS는 유의한 효과가 없었으며, 0.1% 이상의 SDS는 세포 용해 및 단백질 파괴로 인한 전환 활성을 나타내지 않았다. 대조적으로, 0.1% 농도의 Tween 80은 전환활성을 약간 증가시켰다. Tween 80의 최적 농도는 0.5%로 나타났고, 결과적으로 260.5 mM의 이타콘산염이 생산되었다(52.1%)

실시예 4. 이타콘산염 생성의 시간-의존적인 모니터링

상기 실시예 1 내지 3에서 설정한 최적 조건(pH 5.5, 시트르산염 500mM, Tween 80 0.5%, JY001 cell, 및 35℃) 하에서, 전세포 전환 시스템을 사용하여 이타콘산의 생산을 수행하였다. 전환율은 6시간까지 지속적으로 증가하였고, 6시간 후에 감소하였다. 반응은 약 13시간 후에 포화되었고, 19시간 후에 완료하였다 전환 패턴과 유사한 방식으로 pH 값이 7.9로 일정하게 증가하였다. pH 값을 지족적으로 조절하기 위하여 버퍼를 적용하였으나, 현저한 효과는 나타나지 않았다. 2 단계 반응에서 중간체인 cis-aconitate의 농도는 아코니타아제 활성으로 인해 3시간에서 23.6mM로 증가하였다. 3시간 후, cis-aconitate의 수준은 cis-aconitate decarboxylase에 의해 이타콘산염으로 전환됨에 따라 12.7mM로 지속적인 감소를 보였다. 19시간 후, 생성된 다른 부산물은 없었고, 시트르산염의 이타콘산염으로의 전환율은 100%로 나타났으며, 이는 소비된 시트르산염/이소시트르산염(isocitrate) 및 생산된 이타콘산염의 농도가 동일한 것을 의미한다. 반응이 종료되었을 때, 이타콘산염의 농도는 319.23mM(41.3g/L)를 나타냈고, 이는 64.0%의 전환율과 동일함을 의미한다. 전반적인 생산성은 2.19 g/L/h이었으며, 최대 생산성은 4~6시간 내에 5.43g/L/h인 것으로 나타났다.

[ 비교예 ] 종래 발효에 의한 이타콘산의 생산 역가 및 생산성

종래 균주의 발효에 의한 이타콘산의 생산 역가 및 생산성을 하기 표 4에 나타냈다.

균주	초기 기질 농도	생산 역가	생산성
A. itaconicus	수크로즈 또는 글루코스 250g/L	데이터 없음	데이터 없음
A. terreus	몰라세스(Molasses) 98 g/L	27 g/L	0.08 g/L/h
Candida sp .	글루코스 100 g/L	35 g/L	0.28 g/L/h
U. maydis	글루코스 120 g/L	53 g/L	데이터 없음
Pseudozyma sp .	글루코스 또는 글리세롤80 g/L	16.7 g/L	0.11 g/h
A. terreus	글루코스 180 g/L	129 g/L	1.15 g/L/h
A. niger	글루코스 100 g/L	26.2 g/L	0.35 g/L/h
E. coli	글루코스 9.01 g/L	0.69 g/L	0.01 g/L/h
E. coli	글리세롤 70 g/L	7.23 g/L	0.08 g/L/h
E. coli	글루코스 27 g/L	32 g/L	0.45 g/L/h

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 발효 시스템을 이용한 종래 방법의 경우, 부산물 생성 등으로 인하여 생산 역가 및 생산성이 저하되는 문제점이 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 이타콘산의 생산방법은 형질전환된 대장균의 전세포 생물전환에 의하여, 이타콘산을 생산할 수 있는 바, 이타콘산의 생상성을 증대시킬 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Method for manufacturing Itaconic acid by whole-cell bioconversion <130> 1062413 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cis-aconitate decarboxylase from Codon-optimized A. terreus <400> 1 atgaccaagc agagcgcaga tagcaacgca aagagcggtg tcacgagcga aatctgccat 60 tgggcaagca acctggcaac ggatgatatc ccaagcgacg tactggaacg tgcaaagtac 120 ctgatcctgg acggtatcgc atgcgcttgg gtaggtgcac gtgtcccttg gtctgaaaag 180 tacgtccagg caactatgtc cttcgagccg cctggtgctt gtcgtgtaat cggttacggc 240 cagaaactgg gtcctgtggc agccgccatg actaacagcg cattcatcca ggcaactgag 300 ctggacgact accatagcga ggctccactg catagcgcta gcatcgtcct gccagctgtt 360 ttcgctgctt ctgaggtact ggctgagcaa ggtaaaacca tctccggtat cgacgtcatc 420 ctggctgcta tcgtgggttt cgagagcggt ccgcgtatcg gtaaagctat ctacggcagc 480 gacctgctga acaacggttg gcattgcggt gctgtgtacg gtgctccggc gggtgcactg 540 gcgactggta aactgctggg tctgactccg gattctatgg aagatgccct gggtattgcc 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ctgaactgcc cggttaaatc cccgctggtt 1470 <210> 2 <211> 490 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cis-aconitate decarboxylase from Codon-optimized A. terreus <400> 2 Met Thr Lys Gln Ser Ala Asp Ser Asn Ala Lys Ser Gly Val Thr Ser 1 5 10 15 Glu Ile Cys His Trp Ala Ser Asn Leu Ala Thr Asp Asp Ile Pro Ser 20 25 30 Asp Val Leu Glu Arg Ala Lys Tyr Leu Ile Leu Asp Gly Ile Ala Cys 35 40 45 Ala Trp Val Gly Ala Arg Val Pro Trp Ser Glu Lys Tyr Val Gln Ala 50 55 60 Thr Met Ser Phe Glu Pro Pro Gly Ala Cys Arg Val Ile Gly Tyr Gly 65 70 75 80 Gln Lys Leu Gly Pro Val Ala Ala Ala Met Thr Asn Ser Ala Phe Ile 85 90 95 Gln Ala Thr Glu Leu Asp Asp Tyr His Ser Glu Ala Pro Leu His Ser 100 105 110 Ala Ser Ile Val Leu Pro Ala Val Phe Ala Ala Ser Glu Val Leu Ala 115 120 125 Glu Gln Gly Lys Thr Ile Ser Gly Ile Asp Val Ile Leu Ala Ala Ile 130 135 140 Val Gly Phe Glu Ser Gly Pro Arg Ile Gly Lys Ala Ile Tyr Gly Ser 145 150 155 160 Asp Leu Leu Asn Asn Gly Trp His Cys Gly Ala Val Tyr Gly Ala Pro 165 170 175 Ala Gly Ala Leu Ala Thr Gly Lys Leu Leu Gly Leu Thr Pro Asp Ser 180 185 190 Met Glu Asp Ala Leu Gly Ile Ala Cys Thr Gln Ala Cys Gly Leu Met 195 200 205 Ser Ala Gln Tyr Gly Gly Met Val Lys Arg Val Gln His Gly Phe Ala 210 215 220 Ala Arg Asn Gly Leu Leu Gly Gly Leu Leu Ala His Gly Gly Tyr Glu 225 230 235 240 Ala Met Lys Gly Val Leu Glu Arg Ser Tyr Gly Gly Phe Leu Lys Met 245 250 255 Phe Thr Lys Gly Asn Gly Arg Glu Pro Pro Tyr Lys Glu Glu Glu Val 260 265 270 Val Ala Gly Leu Gly Ser Phe Trp His Thr Phe Thr Ile Arg Ile Lys 275 280 285 Leu Tyr Ala Cys Cys Gly Leu Val His Gly Pro Val Glu Ala Ile Glu 290 295 300 Asn Leu Gln Gly Arg Tyr Pro Glu Leu Leu Asn Arg Ala Asn Leu Ser 305 310 315 320 Asn Ile Arg His Val His Val Gln Leu Ser Thr Ala Ser Asn Ser His 325 330 335 Cys Gly Trp Ile Pro Glu Glu Arg Pro Ile Ser Ser Ile Ala Gly Gln 340 345 350 Met Ser Val Ala Tyr Ile Leu Ala Val Gln Leu Val Asp Gln Gln Cys 355 360 365 Leu Leu Ser Gln Phe Ser Glu Phe Asp Asp Asn Leu Glu Arg Pro Glu 370 375 380 Val Trp Asp Leu Ala Arg Lys Val Thr Ser Ser Gln Ser Glu Glu Phe 385 390 395 400 Asp Gln Asp Gly Asn Cys Leu Ser Ala Gly Arg Val Arg Ile Glu Phe 405 410 415 Asn Asp Gly Ser Ser Ile Thr Glu Ser Val Glu Lys Pro Leu Gly Val 420 425 430 Lys Glu Pro Met Pro Asn Glu Arg Ile Leu His Lys Tyr Arg Thr Leu 435 440 445 Ala Gly Ser Val Thr Asp Glu Ser Arg Val Lys Glu Ile Glu Asp Leu 450 455 460 Val Leu Gly Leu Asp Arg Leu Thr Asp Ile Ser Pro Leu Leu Glu Leu 465 470 475 480 Leu Asn Cys Pro Val Lys Ser Pro Leu Val 485 490 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of acn <400> 3 ctctatcata tgatggagct cactgtgact ga 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of acn <400> 4 ctctgatatc ttacttagaa gaagcagcca tc 32 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of cadA (MCS1) <400> 5 ctctggatcc aatgaccaag cagagcgcag 30 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of cadA (MCS1) <400> 6 ctctgagctc ttaaaccagc ggggatttaa c 31 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of cadA (MCS2) <400> 7 atcgtccata tgatgaccaa gacgagcgca g 31 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of cadA (MCS2) <400> 8 ctctctcgag ttaaaccagc ggggatttaa c 31 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of citT <400> 9 ctctgagctc gcacttgata aatttggaaa 30 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of citT <400> 10 ctctctgcgg ccgcttagtt ccacatggcg ag 32

Claims

아코니타아제 (Aconitase, acn) 유전자 및 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA) 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및
2개의 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터;가 도입된 대장균(E.coli)을 시트르산이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하고,
상기 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것인, 이타콘산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 대장균은 cis-아코니트산 디카르복시라아제를 과발현하는 형질전환체인 것을 특징으로 하는, 이타콘산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 염기서열은 코돈 최적화된 것을 특징으로 하는, 이타콘산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 아코니타아제는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum, 수탁번호 ATCC 13032)으로부터 유래된 것을 특징으로 하는
이타콘산의 생산방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 cis-아코니트산 디카르복시라아제는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는
이타콘산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 배양은 pH 4.5 내지 7.5에서 수행되는 것을 특징으로 하는
이타콘산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 배양은 25 내지 50℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는
이타콘산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 배양은 계면활성제(surfactant)를 추가로 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 하는
이타콘산의 생산방법.
제9항에 있어서,
상기 계면활성제는 Tween 80(polyoxyethylene sorbitan monooleate), SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는
이타콘산의 생산방법.
삭제
삭제
코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum, 수탁번호 ATCC 13032)으로부터 유래된 아코니타아제 (Aconitase, acn) 유전자 및 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA) 유전자가 삽입된 재조합 벡터; 및
2개의 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자가 삽입된 재조합 벡터;를 포함하는, 이타콘산 생산용 이중벡터 조성물.
코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum, 수탁번호 ATCC 13032)으로부터 유래된 아코니타아제 (Aconitase, acn) 유전자 및 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 cis-아코니트산 디카르복시라아제(cis-aconitate decarboxylase, cadA) 유전자가 삽입된 재조합 벡터; 및
2개의 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 cis-아코니트산 디카르복시라아제 유전자가 삽입된 재조합 벡터;를 포함하는 이중벡터 조성물로 형질전환된 대장균.