CN109971803B - 一种l-赤藓酮糖和赤藓糖醇生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种L‑赤藓酮糖和赤藓糖醇生产方法。本发明提供了1)‑3)任一一种应用：1)tktA酶或其相关生物材料在生产L‑赤藓酮糖中的应用，且所述应用的底物不含有羟基丙酮酸；2)GoXDH酶或其相关生物材料生产赤藓糖醇中的应用；3)tktA酶或其相关生物材料和GoXDH酶或其相关生物材料在生产赤藓糖醇中的应用，且所述应用的底物不含有羟基丙酮酸。综上所述，本发明提供了一条羟基乙醛转化为L‑赤藓酮糖或L‑赤藓酮醇的新途径。

Description

一种L-赤藓酮糖和赤藓糖醇生产方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种L-赤藓酮糖和赤藓糖醇生产方法。

背景技术

L-赤藓酮糖(L-(+)-Erythrulose)是一种稀有糖，可作为食品添加剂、化妆品原料、医药前体化合物以及其他稀有糖类生产的起始物质等，用途广泛且使用量大，在工业应用方面具有很高的价值。赤藓糖醇(Erythritol)是一种四碳多元醇，可作为营养型甜味剂应用于食品等领域。赤藓糖醇具有能量值低、耐受量高、无副作用、糖尿病人可食用、非致龋齿性等优点，适合应用于功能性食品中。赤藓糖醇未来有可能取代木糖醇。

L-赤藓酮糖的生产目前主要以赤藓糖醇为原料，经化学法或生物发酵法获得。赤藓糖醇目前主要生产方法是微生物发酵法，以葡萄糖为原料，利用耐高渗酵母，发酵100小时左右获得。在生产过程中，葡萄糖在发酵微生物细胞内转化成6-磷酸-葡萄糖，再通过磷酸戊糖途径的多步反应生成4-磷酸-赤藓糖，进一步转化为赤藓糖，最后还原为赤藓糖醇。

现有赤藓糖醇生产技术中，原料葡萄糖来自粮食作物水解，如果大规模生产对粮食安全会造成威胁。此外，发酵微生物中葡萄糖到赤藓糖醇的转化路径较长，导致发酵周期长，带来成本提高和细菌污染风险。而L-赤藓酮糖的生产是以赤藓糖醇为原料，原料成本较高且受到赤藓糖醇的产能限制，产品规模提升困难。

发明内容

本发明的一个目的是提供如下1)-3)任一一种应用。

本发明提供1)-3)任一一种应用：

1)tktA酶或其相关生物材料在生产L-赤藓酮糖中的应用，且所述应用的底物不含有羟基丙酮酸；

2)GoXDH酶或其相关生物材料生产赤藓糖醇中的应用；

3)tktA酶或其相关生物材料和GoXDH酶或其相关生物材料在生产赤藓糖醇中的应用，且所述应用的底物不含有羟基丙酮酸。

上述应用中，

1)所述应用的底物为羟基乙醛或乙二醇；

2)所述应用的底物为L-赤藓酮糖；

3)所述应用的底物为羟基乙醛；

或，各自酶的相关生物材料为能够表达所述各自酶的编码核酸分子，或含有所述各自核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

或，所述表达各个酶编码核酸的重组菌为将表达各个酶编码核酸导入宿主细胞中得到重组菌；

具体的，所述表达各个酶编码核酸是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的；

更加具体的，所述重组载体为携带有各个酶编码核酸的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。

上述应用中，

所述宿主细胞为原核细胞或低等真核细胞；

具体的，所述原核细胞为细菌；所述低等真核细胞为酵母细胞；

更加具体的，所述细菌为大肠杆菌。

本发明另一个目的是提供一种生产L-赤藓酮糖的方法。

本发明提供的方法，为如下1)或2)：

1)所示的方法包括如下步骤：以羟基乙醛为底物，用tktA酶或表达tktA酶编码核酸的重组菌进行催化反应，得到L-赤藓酮糖；

2)所示的方法包括如下步骤：以乙二醇为底物，先用EgDH酶或表达EgDH酶编码核酸的重组菌进行第一次催化反应，得到第一次催化产物；再以所述第一次催化产物中为底物，用tktA酶或表达tktA酶编码核酸的重组菌进行催化反应，得到L-赤藓酮糖。

上述方法中，

1)所示的方法包括如下步骤：所述用tktA酶或表达tktA酶编码核酸的重组菌进行催化反应还在辅助因子1存在的条件下进行；

或，所述辅助因子1包括镁离子和/或TPP；

或，所述镁离子具体以硫酸镁的形式存在；

2)所示的方法包括如下步骤：所述第一次催化反应还在辅助因子2存在的条件下进行；

或，所述辅助因子2包括NAD+；

或，所述辅助因子2还包括NOX2酶；

所述第二次催化反应还在所述辅助因子1存在的条件下进行。

上述方法中，

1)所示的方法中，

所述羟基乙醛、所述tktA酶、所述TPP和所述硫酸镁的配比为10-2000mM：0.1-5mg/mL：0-5mM且不为0:0-10mM且不为0；

或，所述羟基乙醛、所述tktA酶、所述TPP和所述硫酸镁的配比具体为1600mM：1mg/mL：1mM：5mM；

或，所述羟基乙醛、所述表达tktA酶编码核酸的重组菌(自身合成TPP)和所述硫酸镁的配比为10-1000mM：0.2-20mg/ml：5mM；

或，所述羟基乙醛、所述表达tktA酶编码核酸的重组菌和所述硫酸镁的配比为200mM：8mg/ml：5mM；

或，所述催化反应的pH值为6.5-8；或，所述催化反应的pH值为7；

2)所示的方法中，

所述乙二醇、所述EgDH、所述tktA酶、所述NAD+、所述TPP和所述硫酸镁的配比为100-400mM：20-40mg/mL：1mg/mL：2mM:1mM:5mM；

或，所述乙二醇、所述EgDH、所述tktA酶、所述NAD+、所述TPP和所述硫酸镁的配比为100mM：20mg/mL：1mg/mL：2mM:1mM:5mM；

或，所述乙二醇、所述EgDH、所述tktA酶、所述NAD+、所述TPP、所述硫酸镁和所述NOX2的配比为100-400mM：20-40mg/mL：1mg/mL：2mM:1mM:5mM：10mg/mL；

或，所述乙二醇、所述EgDH、所述tktA酶、所述NAD+、所述TPP、所述硫酸镁和所述NOX2的配比为100mM：20mg/mL：1mg/mL：2mM:1mM:5mM：10mg/mL；

或，所述第一次催化反应的pH值为8.5；

或，所述第二次催化反应的pH值为7。

本发明第3个目的是提供一种生产赤藓糖醇的方法。

本发明提供的方法，为如下3)或4)：

3)所示的方法包括如下步骤：以羟基乙醛为底物，用GoXDH酶和tktA酶或表达GoXDH酶编码核酸和tktA酶编码核酸的重组菌进行催化反应，得到赤藓糖醇；

4)所示的方法包括如下步骤：以L-赤藓酮糖为原料为底物，用GoXDH酶或表达GoXDH酶编码核酸的重组菌进行催化反应，得到赤藓糖醇。

上述方法中，

3)所示的方法包括如下步骤：用GoXDH酶和tktA酶或表达GoXDH酶编码核酸和tktA酶编码核酸的重组菌进行催化反应还在所述辅助因子1存在的条件下进行；

或，用GoXDH酶和tktA酶或表达GoXDH酶编码核酸和tktA酶编码核酸的重组菌进行催化反应还在所述辅助因子1和辅助因子3存在的条件下进行；

所述辅助因子3包括NADH；

或所述辅助因子3包括NADH、FDH酶和甲酸；

4)所示的方法包括如下步骤：用GoXDH酶或表达GoXDH酶编码核酸的重组菌进行催化反应还在所述辅助因子3存在的条件下进行。

上述方法中，

3)所示的方法中，

所述羟基乙醛、所述GoXDH酶、所述tktA酶、所述TPP、所述硫酸镁和所述NADH的配比为10-800mM：0.6mg/mL：0.2mg/mL：1mM：5mM：1mM；

或，所述羟基乙醛、所述GoXDH酶、所述tktA酶、所述TPP、所述硫酸镁和所述NADH的配比为200mM：0.6mg/mL：0.2mg/mL：1mM：5mM：1mM；

或所述羟基乙醛、所述GoXDH酶、所述tktA酶、所述TPP、所述硫酸镁、所述FDH酶、所述甲酸和所述NADH的配比为10-800mM：0.6mg/mL：0.2mg/mL：1mM：5mM：0.4mg/mL：5-400mM：1mM；

或，所述羟基乙醛、所述GoXDH酶、所述tktA酶、所述TPP、所述硫酸镁、所述FDH酶、所述甲酸和所述NADH的配比为200mM：0.6mg/mL：0.2mg/mL：1mM：5mM：0.4mg/mL：100mM：1mM；

或，所述催化反应的pH值为7.0；

4)所示的方法中，

所述L-赤藓酮糖、所述GoXDH酶、所述NADH的配比为10-1000mM：1mg/mL：1mM；

或，所述L-赤藓酮糖、所述GoXDH酶、所述NADH的配比为200mM：1mg/mL：1mM；

或，所述L-赤藓酮糖、所述GoXDH酶、所述NADH、所述甲酸和所述甲酸脱氢酶的配比为10-1000mM：1mg/mL：1mM：10-1000mM：0.4mg/mL；

或，所述L-赤藓酮糖、所述GoXDH酶、所述NADH、所述甲酸和所述甲酸脱氢酶的配比为200mM：1mg/mL：1mM：200mM：0.4mg/mL；

或，所述催化反应的pH值为8-8.5，具体为8.5。

在本发明的实施例中，1)所示的方法中，

若用tktA酶进行催化反应，则所述催化反应的体系由具有如下浓度的各物质组成:

pH为6.5-8的浓度为50mM的磷酸钾缓冲液、0-5且不为0mM TPP、0-10且不为0mM硫酸镁、0.1-5mg/mL tktA酶、10-2000mM羟基乙醛；

或，具体的，所述催化反应的体系具体由具有如下浓度的各物质组成:

pH为7的浓度为50mM的磷酸钾缓冲液、1mM TPP、5mM硫酸镁、0.8mg/mL tktA酶、1600mM羟基乙醛；

若用表达tktA酶编码核酸的重组菌催化，则所述催化反应的体系具体由具有如下浓度的各物质组成:

pH为7的浓度为50mM的磷酸钾缓冲液、5mM硫酸镁、0.2-20mg/ml表达tktA酶编码核酸的重组菌、10-1000mM羟基乙醛；

或具体的，pH为7的浓度为50mM的磷酸钾缓冲液、5mM硫酸镁、8或20mg/ml表达tktA酶编码核酸的重组菌、200mM羟基乙醛；

或，所述催化反应的条件为37℃反应30min-8小时；

或，具体的，所述催化反应的条件为37℃反应6小时或8小时；

2)所示的方法中，

所述第一次催化反应的体系由具有如下浓度的各物质组成:

pH＝8.5且浓度100mM的Tris盐酸缓冲液，2mM NAD+，100-400mM乙二醇，20-40mg/mL EgDH，10mg/mL NOX2；

或，具体的，所述第一次催化反应的体系具体由具有如下浓度的各物质组成:

pH＝8.5且浓度100mM的Tris盐酸缓冲液，2mM NAD+，100mM乙二醇，20mg/mL EgDH，10mg/mL NOX2；

或，所述第一次催化反应的条件为30℃反应8小时；

或，所述第二次催化反应的体系由具有如下浓度的各物质组成:

调整pH为7的第一次催化反应产物、0.8mg/mL tktA酶，1mM TPP，5mM硫酸镁，

或，所述第二次催化反应的条件为30℃反应4小时。

3)所示的方法中，所述催化反应的体系由具有如下浓度的各物质组成:

浓度为50mM pH为7.0的磷酸钾缓冲液、1mM TPP，5mM硫酸镁，0.2mg/mL tktA酶，10-800mM羟基乙醛，1mM NADH，0.6mg/mL GoXDH酶，0.4mg/mL FDH酶，浓度为羟基乙醛摩尔浓度的一半且pH为7的甲酸；

或，具体的，所述催化反应的体系由具有如下浓度的各物质组成:

浓度为50mM pH为7.0的磷酸钾缓冲液、1mM TPP，5mM硫酸镁，0.2mg/mL tktA酶，200mM羟基乙醛，1mM NADH，0.6mg/mL GoXDH酶，0.4mg/mL FDH酶，100mM且pH为7的甲酸；

或，所述催化反应的条件为30℃，反应时间为10小时；

4)所示的方法中，所述催化反应的体系由具有如下浓度的各物质组成:

浓度为100mM pH为8-8.5的tris盐酸缓冲液、1mM NADH，1mg/mL GoXDH酶，10-1000mM L-赤藓酮糖，pH至8.5的浓度与所述L-赤藓酮糖浓度相同或大于所述L-赤藓酮糖浓度的甲酸，0.4mg/mL甲酸脱氢酶；

或，具体的，所述催化反应的体系由具有如下浓度的各物质组成:

浓度为100mM pH为8.5的tris盐酸缓冲液、1mM NADH，1mg/mL GoXDH酶，200mM L-赤藓酮糖，pH至8.5的浓度200mM的甲酸，0.4mg/mL甲酸脱氢酶；

或，所述催化反应的条件为30℃反应4小时。

本发明第4个目的是提供一种生产L-赤藓酮糖的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括羟基乙醛和tktA酶或其相关生物材料；

本发明第5个目的是提供一种一种生产赤藓糖醇的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括L-赤藓酮糖和GoXDH酶或其相关生物材料；

本发明第6个目的是提供一种一种生产赤藓糖醇的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括羟基乙醛、tktA酶或其相关生物材料和GoXDH酶或其相关生物材料。

本发明第7个目的是提供一种一种生产赤藓糖醇的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括乙二醇和tktA酶或其相关生物材料。

本发明发现一个新的反应，以羟基乙醛为原料，在不添加羟基丙酮酸的情况下，经一步反应获得L-赤藓酮糖(图1)。并利用该反应建立了一种新的L-赤藓酮糖的生产方式，包括生物酶催化和生物细胞催化两种类型。该新生产方式以小分子化学品羟基乙醛为原料，不需要添加羟基丙酮酸作为底物，具有成本低、反应快速、过程简单等优势。此外，本发明以新反应为中心，设计了乙二醇转化L-赤藓酮糖的新生产方式和羟基乙醛合成赤藓糖醇的新生产方式。

本发明还披露了一个催化L-赤藓酮糖合成赤藓糖醇的新蛋白质及反应体系。该蛋白质来自氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)，命名为GoXDH，能够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)为辅因子，催化L-赤藓酮糖合成赤藓糖醇(图2)。该酶有三个特点，一是能够以NADH为辅因子，区别于已报道催化L-赤藓酮糖合成赤藓糖醇的醌蛋白(Quinoprotein)；二是在常规pH下几乎没有逆反应活性，即不能催化赤藓糖醇生成L-赤藓酮糖；三是可以与还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的蛋白联合反应，使辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸循环使用、降低用量。已报道催化L-赤藓酮糖合成赤藓糖醇的蛋白质为醌蛋白，是一类以吡咯喹啉醌(PQQ)为辅因子的蛋白质，而PQQ只在细菌中存在，其含量极低、价值过高限制了醌蛋白的应用。本发明所披露GoXDH辅酶为NADH，NADH在自然界中广泛存在，价值远低于PQQ，因此GoXDH具有创新性和实用性。

本发明还披露了一种羟基乙醛合成赤藓糖醇的新生产方式。该生产方式利用tktA酶将羟基乙醛转化为L-赤藓酮糖，并进一步利用GoXDH酶将L-赤藓酮糖转化为赤藓糖醇(图3)。

此外，本发明还披露了一种将乙二醇转化为L-赤藓酮糖的生产方式。根据已有报道，乙二醇可被来源于氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、由Gox0313基因编码的蛋白(命名为EgDH)转化为羟基乙醛，结合tktA酶能催化羟基乙醛转化为L-赤藓酮糖，因此由乙二醇经羟基乙醛转化为L-赤藓酮糖的路径(图4)可行。

综上所述，本发明提供了一条羟基乙醛转化为L-赤藓酮糖或L-赤藓酮醇的新途径。

附图说明

图1为tktA催化新反应示意图。

图2为GoXDH催化新反应示意图。

图3为利用羟基乙醛生产赤藓糖醇新方法反应示意图。

图4为利用乙二醇生产L-赤藓酮糖新方法反应示意图。

图5为pET28a-tktA质粒图谱。

图6为pET28a-GoXDH质粒图谱。

图7为pET32a-EgDH质粒图谱。

图8为pET28a-NOX2质粒图谱。

图9为pET28a-FDH质粒图谱。

图10为tktA、GoXDH和EgDH重组蛋白电泳图谱。

图11为HPLC法分析L-赤藓酮糖标准曲线。

图12为L-赤藓酮糖标准品与tktA反应液HPLC分析图。

图13为L-赤藓酮糖GC-MS分析衍生物化学式。

图14为GC-MS分析色谱图。

图15为tktA反应液和L-赤藓酮糖标准品离子碎片峰对比图(14.708分钟)。

图16为HPLC法分析赤藓糖醇标准曲线。

图17为赤藓糖醇标准品与GoXDH反应液HPLC分析图。

图18为赤藓糖醇GC-MS分析衍生物化学式。

图19为赤藓糖醇标准品与GoXDH反应液GC-MS分析色谱图。

图20为GoXDH反应液和赤藓糖醇标准品离子碎片峰对比图(13.076分钟)。

图21为不同pH下tktA反应生成L-赤藓酮糖柱状图。

图22为不同硫酸镁浓度下tktA反应生成L-赤藓酮糖柱状图。

图23为不同TPP浓度下tktA反应生成L-赤藓酮糖柱状图。

图24为不同tktA酶浓度下反应生成L-赤藓酮糖柱状图。

图25为不同羟基乙醛浓度下tktA反应生成L-赤藓酮糖柱状图。

图26为不同羟基乙醛浓度和细胞量条件下全细胞催化羟基乙醛生成L-赤藓酮糖柱状图。

图27为利用GoXDH酶以不同浓度L-赤藓酮糖为底物反应生成赤藓糖醇柱状图。

图28为利用tktA和GoXDH以不同浓度羟基乙醛为底物反应生成赤藓糖醇柱状图。

图29为利用EgDH和tktA以不同浓度乙二醇为底物反应生成L-赤藓酮糖柱状图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、L-赤藓酮糖和赤藓糖醇的生产所用酶的制备及功能检测

图1为tktA催化新反应示意图。图2为GoXDH催化新反应示意图。图3为利用羟基乙醛生产赤藓糖醇新方法反应示意图。图4为利用乙二醇生产L-赤藓酮糖新方法反应示意图。

一、L-赤藓酮糖和赤藓糖醇的生产所需酶tktA、GoXDH、EgDH、NOX2和FDH的制备1、编码酶的DNA的获取

tktA，氨基酸序列为序列1，来自大肠杆菌(Escherichia coli)K12，编码该蛋白的DNA分子的核苷酸序列为序列6；

GoXDH，氨基酸序列为序列2，来自Gluconobacter oxydans；在不改变GoXDH氨基酸序列的前提下，将上述野生型GoXDH基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后GoXDH基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为序列7；

EgDH，氨基酸序列为序列3，来自Gluconobacter oxydans DSM2003；在不改变EgDH氨基酸序列的前提下，将上述野生型EgDH基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后EgDH基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为序列8。

NOX2，氨基酸序列为序列4，来自Lactobacillus brevis ATCC367；不改变NOX2氨基酸序列的前提下，将上述野生型NOX2基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后NOX2基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为序列9。

FDH,氨基酸序列为序列5，来自Ogataea angusta；不改变FDH氨基酸序列的前提下，将上述FDH基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后FDH基因序列，其核苷酸序列为序列10。

2、表达上述蛋白的载体构建

为利用微生物合成所述多肽，首先需要构建含有上述蛋白编码DNA的质粒(重组质粒)。

表达tktA的重组质粒pET28a-tktA为将序列6所示的tktA基因插入pET28a的NdeⅠ和酶切位点SacⅠ之间得到的质粒(图5)，tktA和载体上的His Tag、thrombin site融合表达得到重组蛋白tktA；

表达GoXDH的重组质粒pET28a-GoXDH为将序列7所示的GoXDH基因插入pET28a的BamHⅠ和酶切位点HindⅢ之间得到的质粒(图6)，GoXDH和载体上的His Tag、thrombin site融合表达得到重组蛋白GoXDH；

表达EgDH的重组质粒pET32a-EgDH为将序列5所示的EgDH基因插入pET32a的BamHⅠ和酶切位点HindⅢ之间得到的质粒(图7)，EgDH和载体上的TrxA、His Tag、thrombin site、S-tag以及enterokinase site融合表达得到重组蛋白EgDH；

表达NOX2的重组质粒pET28a-NOX2为将序列8所示的NOX2基因插入pET28a的BamHⅠ和酶切位点HindⅢ之间得到的质粒(图8)，NOX2和载体上的His Tag、thrombin site融合表达得到重组蛋白NOX2。

表达FDH的重组质粒pET28a-FDH为将序列10所示的FDH基因插入pET28a的NdeI和EcoRI酶切位点之间得到的质粒(图9)，FDH和载体上的His Tag、throbin site融合表达得到重组蛋白FDH。

上述载体可以为pET系列质粒，如pET-28a、pET-32a等。

上述插入位置为载体序列多克隆位点(MCS)，优选的，为酶切位点BamHⅠ和酶切位点HindⅢ之间或NdeⅠ和SacⅠ。

3、表达上述蛋白的重组菌构建

将上述2得到的表达tktA的重组质粒pET/28a-tktA、表达GoXDH的重组质粒

pET28a-GoXDH、表达EgDH的重组质粒pET32a-EgDH、表达NOX2的重组质粒pET28a-NOX2和表达FDH的重组质粒pET28a-FDH分别采用化学质粒转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌BL21(DE3)/pET28a-tktA、BL21(DE3)/pET28a-GoXDH、BL21(DE3)

/pET32a-EgDH、BL21(DE3)/pET28a-NOX2和BL21(DE3)/pET28a-FDH。

4、上述蛋白的表达与纯化

利用商用表达载体所表达的多肽为包含所述多肽的重组多肽，即除所述多肽外，还带有不影响催化功能的少量氨基酸肽段。具体表达过程为：

1)分别挑上述3制备的重组菌BL21(DE3)/pET28a-tktA、BL21(DE3)/pET28a-GoXDH和BL21(DE3)/pET32a-EgDH单克隆至5mL LB液体培养基中(需加入适当抗生素，具体为：BL21(DE3)/pET32a-EgDH需加入氨苄青霉素100mg/L，其余重组菌需加入卡那霉素100mg/L；37℃、220转/分钟培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(加入适当抗生素)，37℃、220转/分钟培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至16℃，加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.3mM，诱导表达16小时；

2)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500转/分钟离心15分钟；弃上清，用35mL蛋白缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液pH7.4,500mM氯化钠)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。

3)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下对于上述3得到的菌体沉淀破菌2次。4℃、10000转/分钟离心45分钟。

4)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析(GE Healthcare，NiSepharose，17-5318-06)纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH₂O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液pH7.4,500mM氯化钠)平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；

b：上样：将上清按0.5mL/分钟流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；

c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液pH7.4,500mM氯化钠)冲洗1个柱体积，再用40mL含20mM咪唑的蛋白缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液pH7.4,500mM氯化钠)去洗脱结合较强的杂蛋白；

d：洗脱目的蛋白：分别用40mL含50mM，250mM咪唑蛋白缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液pH7.4,500mM氯化钠)进行洗脱；

e:电泳：分别取含不同咪唑蛋白缓冲液洗脱后液体进行蛋白质PAGE电泳，染色后观察条带，确认目标蛋白在不同浓度咪唑蛋白缓冲液中的分布。

结果如图10所示，可以看出，得到目标重组蛋白EgDH、目标重组蛋白tktA和目标重组蛋白GoXDH。

5)浓缩换液：将收集到的目标重组蛋白分别用50mL Amicon超滤管(10kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400转/分钟)，浓缩至1mL。加10mL蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复该过程1次，得到纯化重组蛋白EgDH(大小为54.2kd)、纯化重组蛋白tktA(大小为74.4kd)和纯化重组蛋白GoXDH(大小为31.4kd)(图10)。

采用同样的方法，表达纯化BL21(DE3)/pET28a-NOX2和BL21(DE3)/pET28a-FDH菌，得到纯化重组蛋白NOX2(大小为52.5kd)和纯化重组蛋白FDH(大小为42.2kd)。

二、EgDH、tktA和GoXDH的功能验证

1、tktA催化羟基乙醛生成L-赤藓酮糖功能检验

反应体系(各组分及在反应体系中的终浓度)：50mM pH＝7.5的磷酸钾缓冲液(80.2mL 50mM磷酸氢二钾水溶液与19.8mL 50mM磷酸二氢钾水溶液混合)，10mM羟基乙醛，5mM硫酸镁，1mM硫胺素焦磷酸(TPP)水溶液，0.5mg/mL上述一制备的纯化重组蛋白tktA酶。其中，镁离子和TPP是takA催化所需辅因子。

反应条件：37℃，2小时。

得到反应产物。

反应产物检测(HPLC法)：使用色谱柱依利特supersil NH2-S 5μm(4.6mm×250mm)对上述反应产物进行检测，柱温：35℃，流动相：75％乙腈，流速：1mL/min，使用紫外检测器，检测波长为210nm。采取外标定量法(标准品为L-赤藓酮糖标准品)，标准曲线如图11所示，按照“峰面积＝81.954×浓度(mM)”定量。

结果如图12所示，测得L-赤藓酮糖标准品保留时间为4.7分钟；以10mM羟基乙醛为底物反应2小时后检测到生成L-赤藓酮糖的保留时间4.7分钟，产量约9.4mM。

为了进一步确定反应产物的结构，采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对反应产物进行鉴定，具体方法为：50μL反应产物加入10μL微升衍生试剂A(21.1mg O-苄氧胺盐酸盐，40μL水，300μL甲醇，660μL吡啶)，50℃反应1小时，加入等体积正己烷萃取2次，取50μL正己烷萃取相加入30μL吡啶和5μL衍生试剂B(含有1％三甲基氯硅烷的N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺)，50℃反应1小时，进行GC-MS分析。GC-MS分析条件：检测系统是安捷伦气相色谱仪7890A；检测条件为：安捷伦色谱柱19091S-433，30m×250μm×0.25μm；起始温度设定为50℃，保留时间1min，以15℃/min的线性增长速率升温到150℃，然后以30℃/min的线性增长速率升温到300℃，保留时间1min；进样口温度为250℃，GC-MS接口温度280℃。氦气作为载体气体，1.2mL/min流速，进样量1μL。经检测，上述反应产物中含有L-赤藓酮糖衍生物(结构式如图13所示)，保留时间与标准品一致(图14)，离子碎片峰也与标准品一致(图15)。

上述结果表明，tktA催化羟基乙醛生成L-赤藓酮糖。

2、GoXDH催化L-赤藓酮糖生成赤藓糖醇功能检验

反应体系：100mM pH＝8Tris盐酸缓冲液(100mM Tris水溶液，用盐酸调pH至8)，10mM L-赤藓酮糖，1mM NADH，1mg/mL上述一制备的纯化重组蛋白GoXDH酶。NADH为GoXDH酶催化的辅酶。

反应条件：30℃，2小时。

得到反应产物。

反应产物检测(HPLC法)：使用色谱柱依利特supersil NH2-S 5μm(4.6mm×250mm)对反应产物进行检测，柱温：35℃，流动相：75％乙腈，流速：1mL/min，使用示差检测器。采取外标定量法(标准品为赤藓糖醇)，标准曲线如图16所示，按照“峰面积＝10580×浓度(mM)”定量。

结果如图17所示，测得赤藓糖醇标准品保留时间为6.1分钟；以10mM L-赤藓酮糖为底物反应2小时后检测到生成赤藓糖醇的保留时间6.1分钟，产量约1mM。

为了进一步确定上述反应产物的结构，采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对产物进行鉴定，具体方法为：取100μL反应产物冻干，加入100μL吡啶，充分混匀后加入5μL衍生试剂B(含有1％三甲基氯硅烷的N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺)，50℃反应1小时，进行GC-MS分析。GC-MS分析条件：检测系统是安捷伦气相色谱仪7890A；检测条件为：安捷伦色谱柱19091S-433，30m×250μm×0.25μm；起始温度设定为50℃，保留时间1min，以15℃/min的线性增长速率升温到150℃，然后以30℃/min的线性增长速率升温到300℃，保留时间1min；进样口温度为250℃，GC-MS接口温度280℃。氦气作为载体气体，1.2mL/min流速，进样量1μL。经检测，反应产物中含有赤藓糖醇衍生物(结构式如图18所示)，保留时间与标准品一致(图19)，离子碎片峰也与标准品一致(图20)。

上述结果表明，GoXDH催化L-赤藓酮糖生成赤藓糖醇。

实施例2、L-赤藓酮糖和赤藓糖醇的生产方法

一、以羟基乙醛为原料生产L-赤藓酮糖

A、tktA酶催化羟基乙醛生产L-赤藓酮糖

1.配置50mM磷酸钾缓冲液(pH值分别调整到6.5、7.0、7.5、8.0)，加入1mM TPP和5mM硫酸镁，加入0.5mg/mL tktA酶，37℃预热5min，加入原料200mM羟基乙醛开始反应。37℃反应30分钟。取100μL反应产物加入100μL乙腈，充分混合后以12000转/分钟的转速离心30分钟，取100μL上清液进行HPLC分析。结果如图21所示，缓冲液pH＝7时L-赤藓酮糖产量最高。

2、配置50mM磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)，加入1mM TPP和不同浓度硫酸镁(0,0.01,0.1,1,5,10mM)，加入0.5mg/mL tktA酶，37℃预热5min，加入原料200mM羟基乙醛开始反应。37℃反应30分钟。取100μL反应产物加入100μL乙腈，充分混合后以12000转/分钟的转速离心30分钟，取100μL上清液进行HPLC分析。结果如图22所示，硫酸镁浓度为5mM时L-赤藓酮糖产量最高。当硫酸镁浓度为1mM和10mM时，L-赤藓酮糖产量比硫酸镁浓度为5mM时略低，因硫酸镁价格较低，适度过量有利于反应系统的稳定，因此本组实验确定硫酸镁优选浓度为5mM。

3.配置50mM磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)，加入5mM硫酸镁和不同浓度TPP(0,0.01,0.1,1,5mM)，加入0.5mg/mL tktA酶，37℃预热5min，加入原料200mM羟基乙醛开始反应。37℃反应30分钟。取100μL反应产物加入100μL乙腈，充分混合后以12000转/分钟的转速离心30分钟，取100μL上清液进行HPLC分析。结果如图23所示，TPP浓度为5mM时L-赤藓酮糖产量最高。但由于TPP价格较高，所以选择L-赤藓酮糖产量相差不大，但浓度略低的1mM TPP添加量作为优选浓度。

4.配置50mM磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)，加入1mM TPP和5mM硫酸镁，加入不同浓度tktA酶(0.1-5.0mg/mL)，37℃预热5min，加入原料200mM羟基乙醛开始反应。37℃反应30分钟。取100μL反应产物加入100μL乙腈，充分混合后以12000转/分钟的转速离心30分钟，取100μL上清液进行HPLC分析。结果如图24所示，tktA酶5.0mg/mL L-赤藓酮糖产量最高。但因为tktA酶生产成本较高，实际生产中可通过降低酶用量、延长反应时间等措施提高最终L-赤藓酮糖产量，因此选择浓度略低的1mg/mL作为tktA酶的优选用量。

5.配置50mM磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)，加入1mM TPP和5mM硫酸镁，加入1mg/mLtktA酶，37℃预热5min，加入不同浓度羟基乙醛(10,200,400,800，1600和2000mM)羟基乙醛开始反应。37℃反应6小时(因底物浓度较高，所以延长反应时间来使反应充分进行)。取100μL反应产物加入100μL乙腈，充分混合后以12000转/分钟的转速离心30分钟，取100μL上清液进行HPLC分析。

结果如图25所示，羟基乙醛1600mM产量最高。

上述结果表明，当pH为7，TPP 1mM，硫酸镁5mM，tktA酶1mg/mL，羟基乙醛1600mM，37℃反应6小时，获得L-赤藓酮糖产量最高，达到470mM(56g/L)，转化率可达到60％。

B、表达tktA酶的重组菌催化羟基乙醛生产L-赤藓酮糖(微生物转化法)

挑取实施例1构建的表达tktA酶的重组菌BL21(DE3)/pET28a-tktA单克隆至5mLLB液体培养基中(加入卡那霉素100mg/L)，37℃、220r/min培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(加入卡那霉素100mg/L)，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至16℃，加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.3mM，诱导表达16h，收集(转速6000转/分钟，离心10分钟)细胞，即为表达tktA酶的重组菌BL21(DE3)/pET28a-tktA菌体。

在50mM磷酸钾缓冲液pH＝7.0，硫酸镁5mM，表达tktA酶的重组菌BL21(DE3)/pET28a-tktA菌体(0.2，8，20mg/mL)和不同浓度羟基乙醛(10,200,500,1000mM)条件下37℃反应8小时。取100μL反应产物加入100μL乙腈，充分混合后以12000转/分钟的转速离心30分钟，取100μL上清液进行HPLC分析。

结果如图26所示，当羟基乙醛浓度为200mM、8和20mg/mL细胞下，L-赤藓酮糖产量为92mM，转化率为92％。当羟基乙醛浓度为500mM，细胞量为20mg/mL时，虽然最终L-赤藓酮糖浓度略高于上述条件，但转化率大大降低(只有40％左右)，存在严重的原料浪费现象。综合考虑L-赤藓酮糖产量与生产成本，微生物转化法的优选条件为：在50mM磷酸磷酸钾缓冲液pH＝7.0，硫酸镁5mM，表达tktA酶的重组菌BL21(DE3)/pET28a-tktA菌体8mg/mL(量少成本低选择这个浓度)和200mM羟基乙醛条件下，37℃反应8小时，L-赤藓酮糖产量为92mM，转化率为92％。

二、以L-赤藓酮糖为原料合成赤藓糖醇

反应体系为：100mM Tris盐酸缓冲液(100mM Tris水溶液，用盐酸调pH至8.5)pH为8.5，NADH 1mM，GoXDH酶1mg/mL，L-赤藓酮糖10-1000mM，甲酸(氢氧化钠调整pH至8.5，浓度与L-赤藓酮糖浓度相同)，甲酸脱氢酶(FDH)0.4mg/mL。30℃反应4小时。

优选的，在反应体系中加入甲酸脱氢酶FDH和甲酸能够促使NADH循环使用，大幅提高L-赤藓酮糖到赤藓糖醇的转化率。优选的，甲酸脱氢酶加入量为0.1-5mg/mL，甲酸用氢氧化钠预先调整pH到8，调整pH后的甲酸加入浓度等于或略大于底物L-赤藓酮糖的摩尔浓度。取100μL反应产物加入100μL乙腈，充分混合后以12000转/分钟的转速离心30分钟，取100μL上清液进行HPLC分析。

结果如图27所示，可以看出，L-赤藓酮糖200mM，赤藓糖醇产量最高。

因此，L-赤藓酮糖为原料合成赤藓糖醇最优反应条件为100mM Tris盐酸缓冲液pH为8.5，NADH 1mM，GoXDH酶1mg/mL，L-赤藓酮糖200mM，甲酸(氢氧化钠调整pH至8.5，200mM)，甲酸脱氢酶(FDH)0.4mg/mL。30℃反应4小时。

三、以羟基乙醛为原料生产赤藓糖醇

反应体系为：磷酸钾缓冲液50mM pH为7.0，TPP 1mM，硫酸镁5mM，tktA酶0.2mg/mL，羟基乙醛10-800mM，NADH 1mM，GoXDH酶0.6mg/mL，FDH酶0.4mg/mL，甲酸(氢氧化钠调pH到7)5-400mM(浓度为羟基乙醛摩尔浓度的一半)。反应温度为30℃，反应时间为10小时。取100μL反应产物加入100μL乙腈，充分混合后以12000转/分钟的转速离心30分钟，取100μL上清液进行HPLC分析。

结果如图28所示，羟基乙醛浓度为200mM时，赤藓糖醇产量为100mM，即12.2g/L，转化率达到100％。虽然当羟基乙醛浓度为400mM和800mM时生成的赤藓糖醇浓度更高一些，但同时也存在严重的原料浪费情况(400mM羟基乙醛时底物转化率为34％，800mM羟基乙醛时底物转化率仅为18％)。综合考虑原料成本因素，羟基乙醛优选浓度为200mM。

因此，以羟基乙醛为原料生产赤藓糖醇最优条件：磷酸钾缓冲液50mM pH为7.0，TPP 1mM，硫酸镁5mM，tktA酶0.2mg/mL，羟基乙醛200mM，NADH 1mM，GoXDH酶0.6mg/mL，FDH酶0.4mg/mL，甲酸(氢氧化钠调pH到7)100mM。反应温度为30℃，反应时间为10小时。

四、以乙二醇为原料生产L-赤藓酮糖

反应体系：100mM Tris盐酸缓冲液(100mM Tris水溶液，用盐酸调整pH＝8.5)，加入2mM NAD+，乙二醇100-400mM，EgDH 20-40mg/mL，NOX2 10mg/mL。30℃反应8小时后用盐酸调整pH为7，加入tktA酶1mg/mL，TPP 1mM，硫酸镁5mM，30℃反应4小时。NAD+作为EgDH催化的辅助因子，NOX2促进辅助因子NAD+再生。

结果如图29所示，乙二醇100mM，EgDH 20mg/mL条件下L-赤藓酮糖产量为7.6mM，转化率为15％。虽然400mM乙二醇、40mg/mL EgDH条件下生成L-赤藓酮糖的量略高于上述条件，但因为底物浓度与酶浓度大幅提高，增加了生产成本，所以不作为优选用量。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种L-赤藓酮糖和赤藓糖醇生产方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 663

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 1

Met Ser Ser Arg Lys Glu Leu Ala Asn Ala Ile Arg Ala Leu Ser Met

1 5 10 15

Asp Ala Val Gln Lys Ala Lys Ser Gly His Pro Gly Ala Pro Met Gly

20 25 30

Met Ala Asp Ile Ala Glu Val Leu Trp Arg Asp Phe Leu Lys His Asn

35 40 45

Pro Gln Asn Pro Ser Trp Ala Asp Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser Asn

50 55 60

Gly His Gly Ser Met Leu Ile Tyr Ser Leu Leu His Leu Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Leu Pro Met Glu Glu Leu Lys Asn Phe Arg Gln Leu His Ser Lys

85 90 95

Thr Pro Gly His Pro Glu Val Gly Tyr Thr Ala Gly Val Glu Thr Thr

100 105 110

Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile Ala Asn Ala Val Gly Met Ala Ile

115 120 125

Ala Glu Lys Thr Leu Ala Ala Gln Phe Asn Arg Pro Gly His Asp Ile

130 135 140

Val Asp His Tyr Thr Tyr Ala Phe Met Gly Asp Gly Cys Met Met Glu

145 150 155 160

Gly Ile Ser His Glu Val Cys Ser Leu Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly

165 170 175

Lys Leu Ile Ala Phe Tyr Asp Asp Asn Gly Ile Ser Ile Asp Gly His

180 185 190

Val Glu Gly Trp Phe Thr Asp Asp Thr Ala Met Arg Phe Glu Ala Tyr

195 200 205

Gly Trp His Val Ile Arg Asp Ile Asp Gly His Asp Ala Ala Ser Ile

210 215 220

Lys Arg Ala Val Glu Glu Ala Arg Ala Val Thr Asp Lys Pro Ser Leu

225 230 235 240

Leu Met Cys Lys Thr Ile Ile Gly Phe Gly Ser Pro Asn Lys Ala Gly

245 250 255

Thr His Asp Ser His Gly Ala Pro Leu Gly Asp Ala Glu Ile Ala Leu

260 265 270

Thr Arg Glu Gln Leu Gly Trp Lys Tyr Ala Pro Phe Glu Ile Pro Ser

275 280 285

Glu Ile Tyr Ala Gln Trp Asp Ala Lys Glu Ala Gly Gln Ala Lys Glu

290 295 300

Ser Ala Trp Asn Glu Lys Phe Ala Ala Tyr Ala Lys Ala Tyr Pro Gln

305 310 315 320

Glu Ala Ala Glu Phe Thr Arg Arg Met Lys Gly Glu Met Pro Ser Asp

325 330 335

Phe Asp Ala Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Lys Leu Gln Ala Asn Pro

340 345 350

Ala Lys Ile Ala Ser Arg Lys Ala Ser Gln Asn Ala Ile Glu Ala Phe

355 360 365

Gly Pro Leu Leu Pro Glu Phe Leu Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Pro

370 375 380

Ser Asn Leu Thr Leu Trp Ser Gly Ser Lys Ala Ile Asn Glu Asp Ala

385 390 395 400

Ala Gly Asn Tyr Ile His Tyr Gly Val Arg Glu Phe Gly Met Thr Ala

405 410 415

Ile Ala Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Phe Leu Pro Tyr Thr Ser

420 425 430

Thr Phe Leu Met Phe Val Glu Tyr Ala Arg Asn Ala Val Arg Met Ala

435 440 445

Ala Leu Met Lys Gln Arg Gln Val Met Val Tyr Thr His Asp Ser Ile

450 455 460

Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Gln Val Ala

465 470 475 480

Ser Leu Arg Val Thr Pro Asn Met Ser Thr Trp Arg Pro Cys Asp Gln

485 490 495

Val Glu Ser Ala Val Ala Trp Lys Tyr Gly Val Glu Arg Gln Asp Gly

500 505 510

Pro Thr Ala Leu Ile Leu Ser Arg Gln Asn Leu Ala Gln Gln Glu Arg

515 520 525

Thr Glu Glu Gln Leu Ala Asn Ile Ala Arg Gly Gly Tyr Val Leu Lys

530 535 540

Asp Cys Ala Gly Gln Pro Glu Leu Ile Phe Ile Ala Thr Gly Ser Glu

545 550 555 560

Val Glu Leu Ala Val Ala Ala Tyr Glu Lys Leu Thr Ala Glu Gly Val

565 570 575

Lys Ala Arg Val Val Ser Met Pro Ser Thr Asp Ala Phe Asp Lys Gln

580 585 590

Asp Ala Ala Tyr Arg Glu Ser Val Leu Pro Lys Ala Val Thr Ala Arg

595 600 605

Val Ala Val Glu Ala Gly Ile Ala Asp Tyr Trp Tyr Lys Tyr Val Gly

610 615 620

Leu Asn Gly Ala Ile Val Gly Met Thr Thr Phe Gly Glu Ser Ala Pro

625 630 635 640

Ala Glu Leu Leu Phe Glu Glu Phe Gly Phe Thr Val Asp Asn Val Val

645 650 655

Ala Lys Ala Lys Glu Leu Leu

660

<210> 2

<211> 262

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 2

Met Ser Lys Lys Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly

1 5 10 15

Gly Asn Ile Gly Leu Ala Thr Ala Leu Arg Leu Ala Glu Glu Gly Thr

20 25 30

Ala Ile Ala Leu Leu Asp Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ala Glu

35 40 45

Ala Ser Val Arg Glu Lys Gly Val Glu Ala Arg Ser Tyr Val Cys Asp

50 55 60

Val Thr Ser Glu Glu Ala Val Ile Gly Thr Val Asp Ser Val Val Arg

65 70 75 80

Asp Phe Gly Lys Ile Asp Phe Leu Phe Asn Asn Ala Gly Tyr Gln Gly

85 90 95

Ala Phe Ala Pro Val Gln Asp Tyr Pro Ser Asp Asp Phe Ala Arg Val

100 105 110

Leu Thr Ile Asn Val Thr Gly Ala Phe His Val Leu Lys Ala Val Ser

115 120 125

Arg Gln Met Ile Thr Gln Asn Tyr Gly Arg Ile Val Asn Thr Ala Ser

130 135 140

Met Ala Gly Val Lys Gly Pro Pro Asn Met Ala Ala Tyr Gly Thr Ser

145 150 155 160

Lys Gly Ala Ile Ile Ala Leu Thr Glu Thr Ala Ala Leu Asp Leu Ala

165 170 175

Pro Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ala Ile Ser Pro Gly Tyr Met Gly Pro

180 185 190

Gly Phe Met Trp Glu Arg Gln Val Glu Leu Gln Ala Lys Val Gly Ser

195 200 205

Gln Tyr Phe Ser Thr Asp Pro Lys Val Val Ala Gln Gln Met Ile Gly

210 215 220

Ser Val Pro Met Arg Arg Tyr Gly Asp Ile Asn Glu Ile Pro Gly Val

225 230 235 240

Val Ala Phe Leu Leu Gly Asp Asp Ser Ser Phe Met Thr Gly Val Asn

245 250 255

Leu Pro Ile Ala Gly Gly

260

<210> 3

<211> 343

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 3

Met Ala Asp Thr Met Leu Ala Ala Val Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro

1 5 10 15

Leu Ser Ile Glu Arg Leu Pro Ile Pro Asp Ile Lys Pro His Gln Ile

20 25 30

Leu Val Lys Val Asp Thr Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala

35 40 45

Ala Arg Gly Asp Trp Pro Ser Lys Pro Asn Pro Pro Phe Ile Pro Gly

50 55 60

His Glu Gly Val Gly His Ile Val Ala Val Gly Ser Gln Val Gly Asp

65 70 75 80

Phe Val Lys Thr Gly Asp Val Val Gly Val Pro Trp Leu Tyr Ser Ala

85 90 95

Cys Gly His Cys Glu His Cys Leu Gly Gly Trp Glu Thr Leu Cys Glu

100 105 110

Lys Gln Asp Asp Thr Gly Tyr Thr Val Asn Gly Cys Phe Ala Glu Tyr

115 120 125

Val Val Ala Asp Pro Asn Tyr Val Ala His Leu Pro Ser Thr Ile Asp

130 135 140

Pro Leu Gln Ala Ser Pro Val Leu Cys Ala Gly Leu Thr Val Tyr Lys

145 150 155 160

Gly Leu Lys Met Thr Glu Ala Arg Pro Gly Gln Trp Val Ala Val Ser

165 170 175

Gly Val Gly Gly Leu Gly Gln Met Ala Val Gln Tyr Ala Val Ala Met

180 185 190

Gly Met Asn Val Val Ala Val Asp Ile Asp Asp Glu Lys Leu Ala Thr

195 200 205

Ala Lys Lys Leu Gly Ala Ser Leu Thr Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp

210 215 220

Pro Ala Arg Phe Ile Gln Gln Gln Ile Gly Gly Ala His Gly Ala Leu

225 230 235 240

Val Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Phe Ser Gln Ala Met Gly Tyr Ala

245 250 255

Arg Arg Gly Gly Thr Ile Val Leu Asn Gly Leu Pro Pro Gly Asp Phe

260 265 270

Pro Val Ser Ile Phe Asp Met Val Met Asn Gly Thr Thr Ile Arg Gly

275 280 285

Ser Ile Val Gly Thr Arg Leu Asp Met Ile Glu Ala Met Asp Phe Phe

290 295 300

Ala Arg Gly Lys Val Lys Ser Val Val Thr Pro Gly Lys Leu Glu Asn

305 310 315 320

Ile Asn Thr Ile Phe Asp Asp Leu Gln Asn Gly Arg Leu Glu Gly Arg

325 330 335

Thr Val Leu Asp Phe Arg Ser

340

<210> 4

<211> 450

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 4

Met Lys Val Thr Val Val Gly Cys Thr His Ala Gly Thr Phe Ala Ile

1 5 10 15

Lys Gln Ile Leu Ala Glu His Pro Asp Ala Glu Val Thr Val Tyr Glu

20 25 30

Arg Asn Asp Val Ile Ser Phe Leu Ser Cys Gly Ile Ala Leu Tyr Leu

35 40 45

Gly Gly Lys Val Ala Asp Pro Gln Gly Leu Phe Tyr Ser Ser Pro Glu

50 55 60

Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Asn Val Gln Met Asn His Asn Val Leu

65 70 75 80

Ala Ile Asp Pro Asp Gln Lys Thr Val Thr Val Glu Asp Leu Thr Asn

85 90 95

His Ala Gln Thr Thr Glu Ser Tyr Asp Lys Leu Val Met Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Trp Pro Ile Val Pro Lys Ile Pro Gly Ile Asp Ser Asp Arg Val

115 120 125

Lys Leu Cys Lys Asn Trp Ala His Ala Gln Ala Leu Ile Glu Asp Ala

130 135 140

Lys Glu Ala Lys Arg Ile Thr Val Ile Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ala

145 150 155 160

Glu Leu Ala Glu Ala Tyr Ser Thr Thr Gly His Asp Val Thr Leu Ile

165 170 175

Asp Ala Met Ala Arg Val Met Pro Lys Tyr Phe Asp Ala Asp Phe Thr

180 185 190

Asp Val Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Asp His Gly Val Gln Leu Ala Leu

195 200 205

Gly Glu Thr Val Glu Ser Phe Thr Asp Ser Ala Thr Gly Leu Thr Ile

210 215 220

Lys Thr Asp Lys Asn Ser Tyr Glu Thr Asp Leu Ala Ile Leu Cys Ile

225 230 235 240

Gly Phe Arg Pro Asn Thr Asp Leu Leu Lys Gly Lys Val Asp Met Ala

245 250 255

Pro Asn Gly Ala Ile Ile Thr Asp Asp Tyr Met Arg Ser Ser Asn Pro

260 265 270

Asp Ile Phe Ala Ala Gly Asp Ser Ala Ala Val His Tyr Asn Pro Thr

275 280 285

His Gln Asn Ala Tyr Ile Pro Leu Ala Thr Asn Ala Val Arg Gln Gly

290 295 300

Ile Leu Val Gly Lys Asn Leu Val Lys Pro Thr Val Lys Tyr Met Gly

305 310 315 320

Thr Gln Ser Ser Ser Gly Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Thr Ile Val Ser

325 330 335

Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ala Lys Gln Gln Gly Leu Asn Ala Glu

340 345 350

Gln Val Ile Val Glu Asp Asn Tyr Arg Pro Glu Phe Met Pro Ser Thr

355 360 365

Glu Pro Val Leu Met Ser Leu Val Phe Asp Pro Asp Thr His Arg Ile

370 375 380

Leu Gly Gly Ala Leu Met Ser Lys Tyr Asp Val Ser Gln Ser Ala Asn

385 390 395 400

Thr Leu Ser Val Cys Ile Gln Asn Glu Asn Thr Ile Asp Asp Leu Ala

405 410 415

Met Val Asp Met Leu Phe Gln Pro Asn Phe Asp Arg Pro Phe Asn Tyr

420 425 430

Leu Asn Ile Leu Ala Gln Ala Ala Gln Ala Lys Val Ala Gln Ser Val

435 440 445

Asn Ala

450

<210> 5

<211> 362

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 5

Met Lys Val Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Gln Asp

1 5 10 15

Glu Glu Arg Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Ala Leu Gly Ile Arg Asp

20 25 30

Trp Leu Glu Lys Gln Gly His Glu Leu Val Val Thr Ser Asp Lys Glu

35 40 45

Gly Glu Asn Ser Val Leu Glu Lys Asn Ile Pro Asp Ala Asp Val Ile

50 55 60

Ile Ser Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Ile Asp

65 70 75 80

Lys Ala Lys Lys Leu Lys Leu Leu Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp

85 90 95

His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Ser Gly Arg Asp Ile Ser Val

100 105 110

Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val

115 120 125

Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln

130 135 140

Ile Ile Ser Gly Gly Trp Asn Val Ala Glu Ile Ala Lys Asp Ser Phe

145 150 155 160

Asp Ile Glu Gly Lys Val Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly

165 170 175

Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Val Ala Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu

180 185 190

Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ser Leu Ser Arg Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly

195 200 205

Ala Arg Arg Val His Asp Ile Lys Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile

210 215 220

Val Thr Ile Asn Cys Pro Leu His Ala Gly Ser Lys Gly Leu Val Asn

225 230 235 240

Ala Glu Leu Leu Lys His Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr

245 250 255

Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Val Lys

260 265 270

Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Tyr Pro Gln Pro

275 280 285

Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Ser Met Ala Asn Lys Tyr Gly Ala

290 295 300

Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Ser Val Ile Asp Ala Gln

305 310 315 320

Val Arg Tyr Ala Gln Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr

325 330 335

Gln Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Lys

340 345 350

Tyr Lys Thr Lys Ser Tyr Gly Ala Asp Lys

355 360

<210> 6

<211> 1992

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

atgtcctcac gtaaagagct tgccaatgct attcgtgcgc tgagcatgga cgcagtacag 60

aaagccaaat ccggtcaccc gggtgcccct atgggtatgg ctgacattgc cgaagtcctg 120

tggcgtgatt tcctgaaaca caacccgcag aatccgtcct gggctgaccg tgaccgcttc 180

gtgctgtcca acggccacgg ctccatgctg atctacagcc tgctgcacct caccggttac 240

gatctgccga tggaagaact gaaaaacttc cgtcagctgc actctaaaac tccgggtcac 300

ccggaagtgg gttacaccgc tggtgtggaa accaccaccg gtccgctggg tcagggtatt 360

gccaacgcag tcggtatggc gattgcagaa aaaacgctgg cggcgcagtt taaccgtccg 420

ggccacgaca ttgtcgacca ctacacctac gccttcatgg gcgacggctg catgatggaa 480

ggcatctccc acgaagtttg ctctctggcg ggtacgctga agctgggtaa actgattgca 540

ttctacgatg acaacggtat ttctatcgat ggtcacgttg aaggctggtt caccgacgac 600

accgcaatgc gtttcgaagc ttacggctgg cacgttattc gcgacatcga cggtcatgac 660

gcggcatcta tcaaacgcgc agtagaagaa gcgcgcgcag tgactgacaa accttccctg 720

ctgatgtgca aaaccatcat cggtttcggt tccccgaaca aagccggtac ccacgactcc 780

cacggtgcgc cgctgggcga cgctgaaatt gccctgaccc gcgaacaact gggctggaaa 840

tatgcgccgt tcgaaatccc gtctgaaatc tatgctcagt gggatgcgaa agaagcaggc 900

caggcgaaag aatccgcatg gaacgagaaa ttcgctgctt acgcgaaagc ttatccgcag 960

gaagccgctg aatttacccg ccgtatgaaa ggcgaaatgc cgtctgactt cgacgctaaa 1020

gcgaaagagt tcatcgctaa actgcaggct aatccggcga aaatcgccag ccgtaaagcg 1080

tctcagaatg ctatcgaagc gttcggtccg ctgttgccgg aattcctcgg cggttctgct 1140

gacctggcgc cgtctaacct gaccctgtgg tctggttcta aagcaatcaa cgaagatgct 1200

gcgggtaact acatccacta cggtgttcgc gagttcggta tgaccgcgat tgctaacggt 1260

atctccctgc acggtggctt cctgccgtac acctccacct tcctgatgtt cgtggaatac 1320

gcacgtaacg ccgtacgtat ggctgcgctg atgaaacagc gtcaggtgat ggtttacacc 1380

cacgactcca tcggtctggg cgaagacggc ccgactcacc agccggttga gcaggtcgct 1440

tctctgcgcg taaccccgaa catgtctaca tggcgtccgt gtgaccaggt tgaatccgcg 1500

gtcgcgtgga aatacggtgt tgagcgtcag gacggcccga ccgcactgat cctctcccgt 1560

cagaacctgg cgcagcagga acgaactgaa gagcaactgg caaacatcgc gcgcggtggt 1620

tatgtgctga aagactgcgc cggtcagccg gaactgattt tcatcgctac cggttcagaa 1680

gttgaactgg ctgttgctgc ctacgaaaaa ctgactgccg aaggcgtgaa agcgcgcgtg 1740

gtgtccatgc cgtctaccga cgcatttgac aagcaggatg ctgcttaccg tgaatccgta 1800

ctgccgaaag cggttactgc acgcgttgct gtagaagcgg gtattgctga ctactggtac 1860

aagtatgttg gcctgaacgg tgctatcgtc ggtatgacca ccttcggtga atctgctccg 1920

gcagagctgc tgtttgaaga gttcggcttc actgttgata acgttgttgc gaaagcaaaa 1980

gaactgctgt aa 1992

<210> 7

<211> 789

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

atgagcaaaa aattcaacgg caaagtctgc ctggtaaccg gcgctggcgg taatattggt 60

ctggcaaccg cactgcgtct ggcagaagaa ggtaccgcaa ttgctctgct ggatatgaac 120

cgtgaagcac tggaaaaagc ggaagcgagc gtgcgcgaaa aaggcgttga agcacgtagt 180

tacgtttgcg acgttaccag cgaagaagca gtcattggca ccgttgatag cgttgttcgt 240

gacttcggca aaatcgactt cctgttcaac aatgcgggtt atcaaggcgc atttgcaccg 300

gttcaggatt atccgtctga cgatttcgcg cgtgttctga ccattaacgt taccggcgca 360

tttcacgttc tgaaagcggt tagccgtcag atgatcaccc agaactacgg ccgtattgtc 420

aacaccgcaa gtatggcagg cgttaaaggt ccgccgaata tggcagcata cggtaccagc 480

aaaggcgcga ttattgcact gaccgaaacc gcagcactgg atctggcgcc gtataatatt 540

cgcgttaacg cgatttctcc gggttatatg ggtccgggtt tcatgtggga acgtcaggtt 600

gaactgcagg caaaagttgg tagccagtac tttagcaccg atccgaaagt tgttgcccag 660

caaatgatcg gttctgttcc gatgcgtcgt tacggcgata ttaacgaaat cccgggcgtt 720

gttgcatttc tgctgggcga cgattctagc tttatgaccg gcgttaacct gccgattgca 780

ggcggttaa 789

<210> 8

<211> 1032

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

atggccgata ccatgctggc cgccgttgtt cgcgagtttg gcaagccgct gagtattgaa 60

cgcctgccga ttccggatat caagccgcat cagattctgg tgaaagtgga tacctgcggc 120

gtgtgtcata ccgacttaca tgccgcccgc ggtgattggc cgagtaaacc gaatccgccg 180

ttcattcctg gtcatgaagg cgtgggccat attgtggccg ttggtagcca ggtgggcgat 240

tttgtgaaga ccggcgatgt ggtgggtgtg ccgtggctgt atagtgcctg cggccactgc 300

gaacattgcc tgggcggttg ggaaaccctg tgtgaaaagc aggacgacac cggctatacc 360

gttaacggtt gcttcgccga gtatgtggtg gcagatccga actatgtggc ccatttaccg 420

agcaccattg acccgttaca ggccagcccg gttctgtgcg ccggcttaac cgtgtacaaa 480

ggtctgaaaa tgaccgaagc ccgtccgggt cagtgggttg ccgttagcgg tgttggtggt 540

ttaggccaga tggccgttca gtacgccgtg gccatgggta tgaatgttgt ggccgtggat 600

atcgacgacg aaaagctggc caccgctaaa aaactgggcg ccagcctgac cgtgaatgcc 660

aaagataccg atccggcccg ctttatccag cagcagattg gcggtgcaca tggtgcactg 720

gtgaccgcag ttggccgtac agcatttagc caggcaatgg gctatgcacg ccgcggtggt 780

accattgtgc tgaatggtct gccgccgggc gattttccgg tgagcatctt cgacatggtg 840

atgaacggca caaccattcg cggtagcatt gtgggcaccc gtctggatat gatcgaggcc 900

atggactttt tcgcccgcgg caaggttaaa agcgtggtga ccccgggcaa actggaaaac 960

atcaatacca tttttgacga tttacaaaac ggccgtctgg aaggccgtac cgtgctggat 1020

tttcgcagct aa 1032

<210> 9

<211> 1353

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

atgaaagtga ccgtggttgg ttgcacccac gccggcacct tcgcaatcaa acagatcctg 60

gcagaacatc ctgatgccga ggttaccgtg tacgagcgca atgacgttat cagtttcctg 120

agctgcggta tcgcactgta tctgggtggc aaggttgccg atccgcaggg tctgttttat 180

agtagcccgg aggagttaca aaaactgggc gccaacgttc agatgaacca taacgtgctg 240

gcaattgacc cggatcaaaa aaccgtgacc gtggaagatc tgacaaacca tgcccagaca 300

accgagagtt acgacaagct ggtgatgacc agcggtagct ggccgatcgt gccgaaaatc 360

ccgggtatcg atagcgatcg cgtgaaactg tgcaaaaact gggcccatgc acaggccctg 420

atcgaagatg ccaaagaggc caagcgtatt accgtgattg gtgccggtta catcggcgcc 480

gagctggcag aagcatatag caccaccggc catgatgtta ccctgattga cgcaatggcc 540

cgtgtgatgc cgaagtactt cgacgccgac tttaccgacg tgatcgaaca ggactatcgt 600

gatcacggcg tgcagctggc actgggtgaa accgtggaga gctttacaga tagcgccacc 660

ggcctgacca ttaagaccga caaaaatagt tatgaaaccg atttagccat tctgtgtatc 720

ggcttccgcc cgaataccga cctgttaaag ggcaaagtgg acatggcccc gaacggtgcc 780

attatcacag acgactacat gcgcagcagc aacccggata ttttcgccgc aggtgatagc 840

gcagccgtgc actacaaccc tacacaccaa aatgcctaca ttccgctggc aaccaacgcc 900

gttcgtcagg gcatcctggt gggcaaaaat ctggtgaagc cgacagtgaa gtacatgggt 960

acacagagca gcagcggcct ggcactgtac gatcgtacca tcgtgagcac cggtctgacc 1020

ctggccgcag ccaagcagca gggtctgaac gccgaacagg tgatcgtgga agataactac 1080

cgcccggaat ttatgccgag taccgaacct gtgctgatga gcctggtttt cgatccggac 1140

acccatcgca tcctgggtgg tgccctgatg agcaagtacg atgttagcca gagcgccaac 1200

accctgagcg tgtgtattca gaatgagaac accattgatg atctggccat ggtggacatg 1260

ctgtttcagc cgaacttcga ccgcccgttt aactatctga acatcctggc ccaggccgcc 1320

caagcaaagg ttgcccagag tgttaatgcc taa 1353

<210> 10

<211> 1089

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

atgaaagttg ttctggttct gtacgacgct ggtaaacacg ctcaggacga agaacgtctg 60

tacggttgca ccgaaaacgc tctgggtatc cgtgactggc tggaaaaaca gggtcacgaa 120

ctggttgtta cctctgacaa agaaggtgaa aactctgttc tggaaaaaaa catcccggac 180

gctgacgtta tcatctctac cccgttccac ccggcttaca tcaccaaaga acgtatcgac 240

aaagctaaaa aactgaaact gctggttgtt gctggtgttg gttctgacca catcgacctg 300

gactacatca accagtctgg tcgtgacatc tctgttctgg aagttaccgg ttctaacgtt 360

gtttctgttg ctgaacacgt tgttatgacc atgctggttc tggttcgtaa cttcgttccg 420

gctcacgaac agatcatctc tggtggttgg aacgttgctg aaatcgctaa agactctttc 480

gacatcgaag gtaaagttat cgctaccatc ggtgctggtc gtatcggtta ccgtgttctg 540

gaacgtctgg ttgctttcaa cccgaaagaa ctgctgtact acgactacca gtctctgtct 600

cgtgaagctg aagaaaaagt tggtgctcgt cgtgttcacg acatcaaaga actggttgct 660

caggctgaca tcgttaccat caactgcccg ctgcacgctg gttctaaagg tctggttaac 720

gctgaactgc tgaaacactt caaaaaaggt gcttggctgg ttaacaccgc tcgtggtgct 780

atctgcgttg ctgaagacgt tgctgctgct gttaaatctg gtcagctgcg tggttacggt 840

ggtgacgttt ggtacccgca gccggctccg aaagaccacc cgtggcgttc tatggctaac 900

aaatacggtg ctggtaacgc tatgaccccg cactactctg gttctgttat cgacgctcag 960

gttcgttacg ctcagggtac caaaaacatc ctggaatctt tcttcaccca gaaattcgac 1020

taccgtccgc aggacatcat cctgctgaac ggtaaataca aaaccaaatc ttacggtgct 1080

gacaaataa 1089

Claims (15)

1.如下1)-3)任一一种应用：

1)tktA酶或其相关生物材料在生产L-赤藓酮糖中的应用，且所述应用的底物不含有羟基丙酮酸；

2)GoXDH酶或其相关生物材料在生产赤藓糖醇中的应用；

3)tktA酶或其相关生物材料和GoXDH酶或其相关生物材料在生产赤藓糖醇中的应用，且所述应用的底物不含有羟基丙酮酸；

1)所述应用的底物为羟基乙醛或乙二醇；

2)所述应用的底物为L-赤藓酮糖；

3)所述应用的底物为羟基乙醛；

各自酶的所述相关生物材料为能够表达所述各自酶的编码核酸分子的重组菌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述重组菌为将表达各自酶编码核酸导入宿主细胞中得到的重组菌；

所述表达各自酶编码核酸是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述重组载体为携带有各自酶编码核酸的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述宿主细胞为细菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌。

6.一种生产L-赤藓酮糖的方法，为如下1)或2)：

1)所示的方法包括如下步骤：以羟基乙醛为底物，用tktA酶或表达tktA酶编码核酸的重组菌进行催化反应，得到L-赤藓酮糖；

2)所示的方法包括如下步骤：以乙二醇为底物，先用EgDH酶或表达EgDH酶编码核酸的重组菌进行第一次催化反应，得到第一次催化产物；再以所述第一次催化产物中为底物，用tktA酶或表达tktA酶编码核酸的重组菌进行第二次催化反应，得到L-赤藓酮糖；

1)所示的方法包括如下步骤：所述用tktA酶进行催化反应还在辅助因子1存在的条件下进行；所述辅助因子1为硫酸镁和TPP；

或，所述用表达tktA酶编码核酸的重组菌进行催化反应还在辅助因子1存在的条件下进行；所述辅助因子1为硫酸镁；

2)所示的方法包括如下步骤：所述第一次催化反应还在辅助因子2存在的条件下进行；

所述辅助因子2包括NAD+和NOX2酶；

所述第二次催化反应还在所述辅助因子1存在的条件下进行；

1)所示的方法中，

所述羟基乙醛、tktA酶、TPP和硫酸镁的配比为200-2000mM：0.1-5mg/mL：0.01-5mM:0.1-10mM；

或，所述羟基乙醛、表达tktA酶编码核酸的重组菌和硫酸镁的配比为10-1000mM：0.2-20mg/ml：5mM；所述催化反应的pH值为6.5-8；

2)所示的方法中，

所述乙二醇、EgDH、tktA酶、NAD+、TPP、硫酸镁和NOX2的配比为100-400mM：20-40mg/mL：1mg/mL：2mM:1mM:5mM：10mg/mL；

所述第一次催化反应的pH值为8.5；

所述第二次催化反应的pH值为7。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述羟基乙醛、tktA酶、TPP和硫酸镁的配比为1600mM：1mg/mL：1mM：5mM。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述羟基乙醛、表达tktA酶编码核酸的重组菌和硫酸镁的配比为200mM：8mg/ml：5mM。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

1)所示的方法中，所述催化反应的pH值为7。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述乙二醇、EgDH、tktA酶、NAD+、TPP、硫酸镁和NOX2的配比为100mM：20mg/mL：1mg/mL：2mM:1mM:5mM：10mg/mL。

11.一种生产赤藓糖醇的方法，为如下3)或4)：

3)所示的方法包括如下步骤：以羟基乙醛为底物，用GoXDH酶和tktA酶或表达GoXDH酶编码核酸和tktA酶编码核酸的重组菌进行催化反应，得到赤藓糖醇；所述催化反应还在辅助因子1和辅助因子3存在的条件下进行；

所述辅助因子1为硫酸镁和TPP；

所述辅助因子3为NADH；

或所述辅助因子3为NADH、FDH酶和甲酸；

4)所示的方法包括如下步骤：以L-赤藓酮糖为原料为底物，用GoXDH酶或表达GoXDH酶编码核酸的重组菌进行催化反应，得到赤藓糖醇；所述催化反应还在所述辅助因子3存在的条件下进行；

3)所示的方法中，

所述羟基乙醛、GoXDH酶、tktA酶、TPP、硫酸镁和NADH的配比为10-800mM：0.6mg/mL：0.2mg/mL：1mM：5mM：1mM；

或所述羟基乙醛、GoXDH酶、tktA酶、TPP、硫酸镁、FDH酶、甲酸和NADH的配比为10-800mM：0.6mg/mL：0.2mg/mL：1mM：5mM：0.4mg/mL：5-400mM：1mM；

所述催化反应的pH值为7.0；

4)所示的方法中，

所述L-赤藓酮糖、GoXDH酶、NADH的配比为10-1000mM：1mg/mL：1mM；

或，所述L-赤藓酮糖、GoXDH酶、NADH、甲酸和FDH酶的配比为10-1000mM：1mg/mL：1mM：10-1000mM：0.4mg/mL；

所述催化反应的pH值为8-8.5。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：

3)所示的方法中，所述羟基乙醛、GoXDH酶、tktA酶、TPP、硫酸镁和NADH的配比为200mM：0.6mg/mL：0.2mg/mL：1mM：5mM：1mM；

或，所述羟基乙醛、GoXDH酶、tktA酶、TPP、硫酸镁、FDH酶、甲酸和NADH的配比为200mM：0.6mg/mL：0.2mg/mL：1mM：5mM：0.4mg/mL：100mM：1mM。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：

4)所示的方法中，

所述L-赤藓酮糖、GoXDH酶、NADH的配比为200mM：1mg/mL：1mM；

或，所述L-赤藓酮糖、GoXDH酶、NADH、甲酸和FDH酶的配比为200mM：1mg/mL：1mM：200mM：0.4mg/mL。

14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：4)所示的方法中，所述催化反应的pH值具体为8.5。

15.一种生产L-赤藓酮糖的试剂盒，包括羟基乙醛和tktA酶或其相关生物材料；

或，一种生产赤藓糖醇的试剂盒，包括L-赤藓酮糖和GoXDH酶或其相关生物材料；

或，一种生产赤藓糖醇的试剂盒，包括羟基乙醛、tktA酶或其相关生物材料和GoXDH酶或其相关生物材料；

或，一种生产赤藓糖醇的试剂盒，包括乙二醇和tktA酶或其相关生物材料；

各自酶的所述相关生物材料为能够表达各自酶编码核酸分子的重组菌。

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