KR20190127793A

KR20190127793A - 변이형 2-데옥시-실로-이노소스 합성효소

Info

Publication number: KR20190127793A
Application number: KR1020197029474A
Authority: KR
Inventors: 히로아키 타카쿠; 하루타케 야마자키; 미츠후미 와다; 다이스케 미야자와
Original assignee: 각코호진 니이가타기쥬츠카가쿠가쿠엔; 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2018-03-15
Publication date: 2019-11-13
Also published as: CN110462041A; KR102336516B1; US20210002687A1; JPWO2018180568A1; WO2018180568A1; EP3604526A1; EP3604526A4; US11499175B2; JP6989746B2; CN110462041B

Abstract

서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 유사 서열에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 14번째, 37번째, 290번째, 293번째 및 319번째의 아미노산 잔기 중 적어도 1개에 특정의 아미노산 변이를 가지는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드가 가지는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, 벡터, 및 형질전환체, 상기 폴리펩타이드의 제조 방법, 및 2-데옥시-실로-이노소스의 제조 방법.

Description

변이형 2-데옥시-실로-이노소스 합성효소

본 개시(開示)는, 예를 들면, 개변(改變) 2-데옥시-실로-이노소스(이하, "DOI"라고 한다.) 합성효소, 그 개변 DOI 합성효소를 코드하는 유전자, 그 유전자를 포함하는 발현 카세트, 그 발현 카세트를 포함하는 벡터, 그 벡터를 포함하는 형질전환체, 그 형질전환체를 사용한 개변 DOI 합성효소의 제조 방법, 및 DOI의 제조 방법에 관한 것이다.

플라스틱이나 세제 등 우리들의 일상 생활에 있어서 친밀한 제품의 상당수는, 화석 자원을 원료로 하여 제조되고 있다. 이들의 화성품(化成品) 원료가 되는 탄소 6원환(圓環) 화합물은, 석유화학공업에 의해, 원유(原油)로부터 생산되고 있다. 그러나, 석유로부터 화학제품 원료를 제조하는 종래부터의 석유화학 프로세스를 사용한 경우에는, 유한한 자원인 석유의 고갈과 그에 따르는 가격의 상승, 다량의 이산화탄소의 배출에 의한 지구 온난화 등, 지구적 규모의 문제가 발생될 염려가 있다.

탄소 6원환 골격을 가지는 키랄인 화합물인 DOI는, 의약, 농약, 산화 억제제나 향료 등의 각종 유용 화학품의 합성을 위한 매우 중요한 중간 원료이다. DOI는 카테콜이나 드로퀴논 등의 2가 페놀이나 하이드록시하이드로퀴논으로 합성 변환될 수 있다. 예를 들면, Kakinuma 등, Tetrahedron Letters, 2000, vol.41, p.1935는, DOI를 카테콜로 합성 변환하는 것을 개시하고 있다. 카테콜은 신경계 의약품 등의 원료, 식품 향료 원료, 헤어 케어 상품 등의 산화방지제 등에 사용되고, 하이드로퀴논은 지혈제, 진통제 등의 원료, 미백제 등의 화장품에 사용되며, 세계적으로 수요가 높은 물질이다. DOI는, 또한, 의사당(擬似糖)인 카르바글루코오스로도 변환이 가능하여, 용도가 광범위한 중간 원료이다. 예를 들면, 일본 특허공개공보 제2005-053899호는, DOI를 원료로 하여 카르바글루코오스를 합성하는 것을 개시하고 있다.

다수의 임상 의학적으로 중요한 화학요법제인 2-데옥시스트렙타민 함유 아미노글라이코시드계 항생 물질의 생합성 과정에 관여하는 효소의 하나로, 초발(初發)의 당질을 탄소환화(炭素環化)하는 효소가 발견되었다. 뷰티로신 생산균 바실러스·서큘런스(Bacillus·circulans)에 속하는 미생물로부터 정제된 이 효소는, 글루코오스-6-인산을 기질, 니코틴아마이드아데닌다이뉴클레오티드(NAD+)를 보효소(補酵素)로 하고, 다단계의 반응을 촉매하여, 최종적으로 DOI를 생합성했다. Kudo 등, J.Antibiot., 1999, vol.52, p.559 및 일본 특허공개공보 제2000-236881호는, 바실러스·서큘런스에 속하는 미생물로부터 그 DOI 합성효소 유전자(글루코오스-6-인산을 DOI로 변환하는 반응을 촉매하는 효소를 코드하는 btrC)를 클로닝하고, 대장균 내에서 그 유전자를 발현, 정제함으로써 재조합 DOI 합성효소를 대량으로 얻은 것을 기재하고 있다. 또한, 일본 특허공개공보 제2014-064513호는, 글루코오스에 헥소키나아제 또는 폴리인산 글루코키나아제와 DOI 합성효소를 작용시키는 2단계의 효소 반응이거나, 글루코오스-6-인산에 DOI 합성효소를 작용시키는 1단계의 효소 반응으로 DOI를 합성할 수 있는 것을 개시하고 있다. 또한 이 밖에도 Hirayama 등, J.Antibiot., 2005, vol.58, p.766은 스트렙토마이세스·프라디아에(Streptomyces·fradiae) 유래의 DOI 합성효소를 개시하고 있고, Subba 등, Mol.Cells, 2005, vol.20, p.90은 스트렙토마이세스·리보시디피커스(Streptomyces·ribosidificus)유래의 DOI 합성효소를 개시하고 있고, Kharel 등, Arch.Biochem.Biophys., 2004, vol.429, p.204는 스트렙토마이세스·카나마이세티커스(Streptomyces· kanamyceticus) 유래의 DOI 합성효소를 개시하고 있고, Unwin 등, J.Antibiot., 2004, vol.57, p.436은 마이크로모노스포라·에키노스포라(Micromonospora·echinospora) 유래의 DOI 합성효소를 개시하고 있고, Kharel 등, FEMS Microbiol.Lett., 2004, vol.230, p.185는 스트렙토마이세스·테네브라리우스(Streptomyces·tenebrarius) 유래의 DOI 합성효소를 개시하고 있고, Hirayama 등, J.Antibiot., 2006, vol.59, p.358은 스트렙토알로테이커스·힌더스타누스(Streptoalloteichus·hindustanus) 유래의 DOI 합성효소를 개시하고 있다.

그 밖에, 일본 특허공개공보 제2013-135697호는 특정의 아미노산 서열을 가지는 내열성 DOI 합성효소를 개시하고 있고, Tamegai 등, Biosci.Biotechnol.Biochem., 2010, vol.74, p.1215는 바실러스·서큘런스의 DOI 합성효소에 부수되는 BtrC2 단백질의 역할을 기재하고 있다. 국제 공개 제2006/109479호 및 Kogure 등, J.Biotechnol., 2007, vol.129, p.502는, DOI 합성효소의 유전자로 이루어지는 발현 카세트를 개시하고 있으며, 세포 내의 당대사(糖代謝)의 공학적 개변에 의한 생산량의 증강도 시도되고 있다. 국제 공개 제2010/053052호는, 스크로오스 비(非)PTS 유전자군 중에서 적어도 스크로오스 가수분해 효소(CscA)를 코드하는 유전자를 가짐과 동시에, 2-데옥시-실로-이노소스(DOI) 생산계가 부여 또는 강화되고, 바람직하게는 당 취입 능력 강화계를 더 가지는 DOI 생산 대장균을 개시하고 있다.

상기의 특허문헌 및 비특허문헌에 기재된 기술은, DOI 합성효소의 아미노산 서열을 개변함으로써, DOI 합성효소 활성을 증강하는 것을 시도한 것은 아니다. DOI 합성효소를 사용하여 DOI를 고효율로 생산할 수 있는 시스템을 구축하기 위해서는, 효소의 개변에 의한 효소 활성의 증강도 유효한 수단이다. DOI의 생산 효율을 향상시킬 수 있으면, DOI를 보다 염가로, 단시간에 다량으로 생산하는 것이 가능하게 된다. 효소의 활성을 높이는 방법으로서, 효소의 기질과 결합되는 활성 중심의 아미노산을 개변하여, 고활성의 효소를 선택하는 방법이 있다. 또한, 목적 효소를 코드하는 유전자에 시험관 내에서 신속히 인공적으로 변이를 유발시키고, 다수의 변이 유전자군 중에서, 목적 활성으로 개변된 효소를 코드하는 유전자를 선발하는 진화(進化) 공학적 방법도 있다. 후자의 방법은, 세제용 효소, 생분해성 플라스틱 생산용 효소 등의 개변에 적용되고 있지만, DOI 합성효소의 개변에 대한 응용은 알려지지 않았다.

본 발명자들은, DOI 합성효소의 활성에 주목하고, 향상된 DOI 합성 활성을 가지는 DOI 합성효소를 사용하여 글루코오스-6-인산을 효율적으로 DOI로 변환시킴으로써, 단시간에 대량의 DOI를 제조할 수 있는 가능성이 있다는 착상을 얻었다. 본 개시에 관련되는 일 실시형태는, 상기 상황을 감안하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 DOI 합성효소보다도 높은 DOI 합성 활성을 가지는 개변 DOI 합성효소, 그 개변 DOI 합성효소를 코드하는 유전자, 그 유전자를 포함하는 발현 카세트, 그 발현 카세트를 포함하는 벡터, 그 벡터를 포함하는 형질전환체, 그 형질전환체를 사용한 개변 DOI 합성효소의 제조 방법, 및 DOI의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 (銳意) 연구를 거듭한 결과, 진화 공학적 방법을 사용함으로써, DOI 합성효소를 보다 DOI 합성 활성이 높은 효소로 개변하는 것에 성공했다. 또한, 그 방법으로 얻어진 개변 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 형질전환체를 사용하여, 종래보다도 효율적으로 DOI를 제조하는데 성공했다.

본 개시에 의하면, 이하의 (1)~(9)가 제공된다.

(1) 하기 (A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열에 있어서, 하기 (a)~(e) 중 적어도 1개의 아미노산 변이를 가지는 폴리펩타이드.

　(A1) 서열번호 1의 아미노산 서열

　(A2) 글루코오스-6-인산으로부터 2-데옥시-실로-이노소스를 생성하는 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드의 아미노산 서열로서, 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열

　(a) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 14번째의 아스파라긴 잔기(殘基)에 얼라인먼트(alignment)상 대응되는 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환되는 아미노산 변이

　(b) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 37번째의 티로신 잔기에 얼라인먼트상 대응되는 아미노산 잔기가 페닐알라닌으로 치환되는 아미노산 변이

　(c) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 290번째의 알라닌 잔기에 얼라인먼트상 대응되는 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환되는 아미노산 변이

　(d) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 293번째의 트립토판 잔기에 얼라인먼트상 대응되는 아미노산 잔기가 아르기닌으로 치환되는 아미노산 변이

　(e) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 319번째의 히스티딘 잔기에 얼라인먼트상 대응되는 아미노산 잔기가 아르기닌으로 치환되는 아미노산 변이

(2) 상기 (A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열에 있어서, 상기 (d) 및 상기 (e)의 아미노산 변이 중 적어도 1개를 가지는, 상기 (1)에 기재된 폴리펩타이드.

(3) 상기 (A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열에 있어서, 상기 (d)의 아미노산 변이와, 상기 (a), (b), (c) 및 (e)로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 변이를 가지는, 상기 (1)에 기재된 폴리펩타이드.

(4) 상기 (1)~상기 (3) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩타이드가 가지는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 가지는, 폴리뉴클레오타이드.

(5) 상기 (4)에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드의 상류에 연결된 프로모터 서열, 및 상기 폴리뉴클레오타이드의 하류에 연결된 터미네이터 서열을 포함하는 발현 카세트.

(6) 상기 (5)에 기재된 발현 카세트를 함유하는 벡터.

(7) 상기 (6)에 기재된 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.

(8) 상기 (7)에 기재된 형질전환체를 배양하는 것을 포함하는, 글루코오스-6-인산으로부터 2-데옥시-실로-이노소스를 생성하는 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드의 제조 방법.

(9) 상기 (1)~상기 (3) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩타이드, 상기 (7)에 기재된 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물을 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산과 접촉시킴으로써, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 2-데옥시-실로-이노소스로 변환하는 것을 포함하는, 2-데옥시-실로-이노소스의 제조 방법.

본 개시에 의하면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 DOI 합성효소보다도 높은 DOI 합성 활성을 가지는 개변 DOI 합성효소, 그 개변 DOI 합성효소를 코드하는 유전자, 그 유전자를 포함하는 발현 카세트, 그 발현 카세트를 포함하는 벡터, 그 벡터를 포함하는 형질전환체, 그 형질전환체를 사용한 개변 DOI 합성효소의 제조 방법, 및 DOI의 제조 방법을 제공할 수 있다.

[도 1] DOI로부터 합성 변환 가능한 방향족 화합물을 나타내는 도면이다.
[도 2] 해당계(解糖系)의 포스포글루코오스이소메라아제 유전자(pgi), 펜토오스인산 경로의 글루코오스-6-인산데하이드로게나아제 유전자(zwf), 및 글라이코젠 생합성 경로로 향하는 포스포글루콤타아제 유전자(pgm)를 유전자 파괴하고, 글루코오스-6-인산을 우선적으로 DOI 합성효소(btrC 유전자로 코드되는 단백질)가 이용되도록 대사 공학적 개변을 한 ΔpgiΔzwfΔpgm주(株)를 나타내는 도면이다.
[도 3a] 에러프론(error prone) PCR을 사용한 변이형 DOI 합성효소 유전자 클론 라이브러리의 제작으로부터 DOI 고생산 DOI 합성효소 유전자 변이 클론의 단리(單離)(1, 2, 3차 선발)까지의 공정에 있어서의 변이형 DOI 합성효소 유전자 클론 라이브러리의 제작을 나타내는 도면이다.
[도 3b] 에러프론 PCR을 사용한 변이형 DOI 합성효소 유전자 클론 라이브러리의 제작으로부터 DOI 고생산 DOI 합성효소 유전자 변이 클론의 단리까지의 공정에 있어서의 1차 선발을 나타내는 도면이다.
[도 3c] 에러프론 PCR을 사용한 변이형 DOI 합성효소 유전자 클론 라이브러리의 제작으로부터 DOI 고생산 DOI 합성효소 유전자 변이 클론의 단리까지의 공정에 있어서의 2차 선발을 나타내는 도면이다.
[도 3d] 에러프론 PCR을 사용한 변이형 DOI 합성효소 유전자 클론 라이브러리의 제작으로부터 DOI 고생산 DOI 합성효소 유전자 변이 클론의 단리까지의 공정에 있어서의 3차 선발을 나타내는 도면이다.
[도 4] pGADP의 구조를 나타내는 도면이다.
[도 5] pGADP-mbtrC의 구조를 나타내는 도면이다.
[도 6] pGADP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(◆)와 pGADP-mbtrC 중 1개(후에 pGADP-btrC(W293R)라고 판명)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(■)의 배양(2×YT＋2% 글루코오스＋2% 만니톨, 50ml, 30℃)에 따른 배지 중의 DOI 생산량의 타임 코스(time course)를 나타내는 도면이다.
[도 7] (좌측) 야생형 DOI 합성효소(WT), (우측) 변이형 DOI 합성효소(W293R)의 DOI 합성효소 활성을 나타내는 도면이다.
[도 8] pGADP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(◆), pGADP-btrC(W293R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(■), pGADP-mbtrC(후에 pGADP-btrC(W293R/N14T)라고 판명)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(▲), pGADP-mbtrC(후에 pGADP-btrC(W293R/Y37F)라고 판명)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(×), pGADP-mbtrC(후에 pGADP-btrC(W293R/A290T)라고 판명)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(＋), pGADP-mbtrC(후에 pGADP-btrC(W293R/H319R)라고 판명)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(●)의 배양(2×YT＋2% 글루코오스＋2% 만니톨, 50ml, 30℃)에 따른 배지 중의 DOI 생산량의 타임 코스를 나타내는 도면이다.
[도 9] 좌측으로부터 야생형 DOI 합성효소(WT), 변이형 DOI 합성효소(W293R), 변이형 DOI 합성효소(W293R/N14T), 변이형 DOI 합성효소(W293R/Y37F), 변이형 DOI 합성효소(W293R/A290T), 변이형 DOI 합성효소(W293R/H319R)의 DOI 합성효소 활성을 나타내는 도면이다.
[도 10] pGAPP-btrC(W293R/H319R)의 구조를 나타내는 도면이다.
[도 11] pGAPP-btrC의 구조를 나타내는 도면이다.
[도 12a] pGAPP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(■)와 pGAPP-btrC(W293R/H319R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(▲)의 배양(2×YT＋5% 글루코오스＋5% 만니톨, 50ml, 30℃)에 따른 배지의 탁도(濁度)의 타임 코스를 나타내는 도면이다.
[도 12b] pGAPP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(■)와 pGAPP-btrC(W293R/H319R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(▲)의 배양(2×YT＋5% 글루코오스＋5% 만니톨, 50ml, 30℃)에 따른 배지 중의 글루코오스 농도의 타임 코스를 나타내는 도면이다.
[도 12c] pGAPP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(■)와 pGAPP-btrC(W293R/H319R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(▲)의 배양(2×YT＋5% 글루코오스＋5% 만니톨, 50ml, 30℃)에 따른 배지 중의 만니톨 농도의 타임 코스를 나타내는 도면이다.
[도 12d] pGAPP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(■)와 pGAPP-btrC(W293R/H319R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(▲)의 배양(2×YT＋5% 글루코오스＋5% 만니톨, 50ml, 30℃)에 따른 DOI 생산량의 타임 코스를 나타내는 도면이다.
[도 13] pGAPP-btrC(H319R)의 구조를 나타내는 도면이다.
[도 14a] pGAPP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(■)와 pGAPP-btrC(H319R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(▲)의 배양(2×YT＋3% 글루코오스＋4% 만니톨, 30ml, 30℃)에 따른 배지의 탁도의 타임 코스를 나타내는 도면이다.
[도 14b] pGAPP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(■)와 pGAPP-btrC(H319R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(▲)의 배양(2×YT＋3% 글루코오스＋4% 만니톨, 30ml, 30℃)에 따른 배지 중의 글루코오스 농도의 타임 코스를 나타내는 도면이다.
[도 14c] pGAPP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(■)와 pGAPP-btrC(H319R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(▲)의 배양(2×YT＋3% 글루코오스＋4% 만니톨, 30ml, 30℃)에 따른 배지 중의 만니톨 농도의 타임 코스를 나타내는 도면이다.
[도 14d] pGAPP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(■)와 pGAPP-btrC(H319R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(▲)의 배양(2×YT＋3% 글루코오스＋4% 만니톨, 30ml, 30℃)에 따른 DOI 생산량의 타임 코스를 나타내는 도면이다.
[도 15] pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf의 구조를 나타내는 도면이다.
[도 16] pGAPP-btrC(W293R/N14T)-cscA-glf의 구조를 나타내는 도면이다.
[도 17] pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf의 구조를 나타내는 도면이다.
[도 18a] pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf를 포함하는 대장균 MG1655ΔpgiΔzwf주에서의 DOI 생산량(▲), 글루코오스 농도(●), 프룩토오스 농도(◆), 자일로오스 농도(■)의 타임 코스를 나타내는 도면이다.
[도 18b] pGAPP-btrC(W293R/N14T)-cscA-glf를 포함하는 대장균 MG1655ΔpgiΔzwf주에서의 DOI 생산량(▲), 글루코오스 농도(●), 프룩토오스 농도(◆), 자일로오스 농도(■)의 타임 코스를 나타내는 도면이다.
[도 18c] pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf를 포함하는 대장균 MG1655ΔpgiΔzwf주에서의 DOI 생산량(▲), 글루코오스 농도(●), 프룩토오스 농도(◆), 자일로오스 농도(■)의 타임 코스를 나타내는 도면이다.

본 개시에 관련되는 개변 DOI 합성효소에 의하면, 높은 DOI 합성 활성에 의해 DOI 생산 속도를 향상시키는 것이 가능하고, 단시간에 효율적으로 글루코오스-6-인산을 DOI로 변환할 수 있다. 본 개시에 관련되는 개변 DOI 합성효소의 제조 방법에 의하면, 개변 DOI 합성효소 유전자를 숙주세포에서 발현시킴으로써, DOI 합성 활성이 높은 개변 합성효소를 제조할 수 있다. 또한, 본 개시에 관련되는 DOI의 제조 방법에 의하면, 그 개변 DOI 합성효소 유전자를 이용하여, 높은 효율로 글루코오스로부터 DOI를 제조할 수 있다.

전술한 바와 같이, DOI는 카테콜이나 하이드로퀴논 등의 2가 페놀이나 하이드록시하이드로퀴논으로 합성 변환될 수 있다(도 1 참조). 본 개시에 있어서의 일 실시형태에 의하면, 의약품, 공업품의 제조 원료로서 널리 보급되는 것이 기대되고 있는 DOI를, 간편하고 대량으로 효율적으로 제조하는 것이 가능하다. 이와 같이 하여 제조한 DOI로부터, 예를 들면, 의약품, 공업품의 제조 원료로서 널리 보급되는 것이 기대되고 있는 1,2,4-트라이하이드록시벤젠을, 제조하는 것도 가능하다.

＜개변 DOI 합성효소＞

본 개시에 관련되는 개변 DOI 합성효소는, 하기 (A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열에 있어서, 이하의 (a)~(e) 중 적어도 1개의 아미노산 변이를 가지는 폴리펩타이드이다.

(A1) 서열번호 1의 아미노산 서열

(a) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 14번째의 아스파라긴 잔기에 얼라인먼트상 대응되는 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환되는 아미노산 변이

이와 같은, 특정의 아미노산 잔기의 치환을 가지는 개변 DOI 합성효소는, 해당 아미노산 잔기 치환에 의해 향상된 DOI 합성 활성을 가진다. 본 개시에 관련되는 개변 DOI 합성효소는, (A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열에 대하여, 하기 (a)~(e) 중 적어도 1개의 아미노산 변이를 도입한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드라고 할 수도 있지만, 이 표현에 있어서 "(A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열에 대하여, 하기 (a)~(e) 중 적어도 1개의 아미노산 변이를 도입했다"라는 것은 최종적인 아미노산 서열을 특정하기 위해서만 사용되고 있는 것으로서, 출발점이 되는 아미노산 서열 및 실제의 서열 개변 조작의 과정을 한정하는 것은 아니다.

서열번호 1의 아미노산 서열은, 바실러스·서큘런스 유래의 DOI 합성효소의 아미노산 서열이며, btrC 유전자에 의해 코드되어 있다. 개변 DOI 합성효소는, 서열번호 1의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열을 가지고 있고, 본 개시에 있어서는 변이형 DOI 합성효소라고도 불린다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 이하의 표 1에 나타낸다.

글루코오스-6-인산으로부터 2-데옥시-실로-이노소스를 생성하는 효소 활성은, 50mM　Phosphate　buffer(pH7.7), 5mM　글루코오스-6-인산, 5mM　β-NAD^＋, 0.2mM　CoCl₂·6H₂O, 및 측정 대상의 DOI 합성효소 10μg로 이루어지는 용액을 46℃에서 5분간 반응시키고, 반응 후에 반응 용액을 페놀/클로로폼 처리를 하고, 제단백(除蛋白)을 실시하고, 원심(遠心) 후의 수층획분(水層畵分) 10μl를 샘플로 하고, HPLC로 DOI를 정량하여, 활성을 산출함으로써 측정할 수 있다. 또한, DOI 합성효소 1mg가 1분 당 합성되는 DOI의 양을 비활성으로 한다.

HPLC의 조건은,

칼럼　　：Phenomenex　Kinetex　XB-C18　100Å(Phenomenex사 제)

용리액　：H₂O/메탄올(80/20)

유량　　：0.7ml/min

칼럼 온도：40℃

검출　　：UV262nm

주입량　：2μl

로 한다.

또한, 아미노산 서열의 서열 동일성은, 예를 들면 BLAST(등록상표, National Library of Medicine) 프로그램을 사용하여 디폴트 파라미터(default parameter)로 평가할 수 있다.

또한, (A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 특정의 위치의 아미노산 잔기에 얼라인먼트상 대응되는 아미노산 잔기란, 예를 들면 BLAST(등록상표, National Library of Medicine) 프로그램(디폴트 파라미터)에 의해서 서열번호 1의 아미노산 서열과 (A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열을 얼라인먼트한 경우에, 서열번호 1 중의 특정 위치의 아미노산 잔기와 대응되는 것이 발견된, (A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기를 가리킨다.

상기 (A2)의 아미노산 서열이 가지는, 서열번호 1의 아미노산 서열과의 서열 동일성은, 85% 이상, 혹은 90% 이상, 혹은 95% 이상의 서열 동일성이어도 된다.

여기서, 상기 (A2)의 아미노산 서열은, 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서 DOI 합성효소 활성을 잃지 않는 범위에서의 서열의 개변을 가지는 아미노산 서열이어도 된다. 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열에 대하여 DOI 합성효소 활성을 잃지 않는 범위에서 서열의 개변을 더한 아미노산 서열이어도 된다. 이와 같은 개변으로서는, 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환 및 아미노산 서열 N말단 혹은 C말단 혹은 그 양쪽에 대한 추가의 아미노산 잔기의 부가를 들 수 있다. 아미노산 잔기의 삽입, 결실 및 치환 중 1개 이상이 있는 경우는, 삽입, 결실 및 치환의 각각은, 존재하는 경우는, 예를 들면 1~30 아미노산 잔기, 혹은 1~20 아미노산 잔기, 혹은 1~10 아미노산 잔기, 혹은 1~5 아미노산 잔기여도 되고, 아미노산 잔기의 삽입, 결실 및 치환의 총수는 예를 들면 1~50 아미노산 잔기, 혹은 1~30 아미노산 잔기, 혹은 1~10 아미노산 잔기, 혹은 1~5 아미노산 잔기여도 된다. 또한, 말단에 부가되는 아미노산 잔기의 수로서는, 존재하는 경우는 1말단 당 예를 들면 1~50 아미노산 잔기, 혹은 1~30 아미노산 잔기, 혹은 1~10 아미노산 잔기, 혹은 1~5 아미노산 잔기여도 된다. 이와 같은 추가의 아미노산 잔기는, 세포 밖으로의 분비 등을 위한 시그널 서열을 형성하고 있어도 된다. 시그널 서열의 예로서는, 대장균의 OmpA 시그널 서열 등을 들 수 있다.

상기 (a)~(e)의 아미노산 변이는, 모두, DOI 합성효소 활성을 상승시키는 아미노산 변이이다. 본 개시에 관련되는 개변 DOI 합성효소는, 상기 (a)~(e)의 아미노산 변이 중 적어도 1개만을 가지고 있어도 되고, 2개 이상을 가지고 있어도 된다. 예를 들면, 개변 DOI 합성효소는, 상기 (a)~(e)의 아미노산 변이 중 2개를 가지고 있어도 되고, 3개를 가지고 있어도 되고, 4개를 가지고 있어도 되며, 5개를 가지고 있어도 된다. 일 실시형태에 있어서는, 개변 DOI 합성효소는, (d) 및 (e)의 아미노산 변이 중 적어도 1개를 가지며, 이 경우 (a)~(c)의 아미노산 변이 중 적어도 1개를 더 가지고 있어도 된다. 다른 실시형태에 있어서는, 개변 DOI 합성효소는, (d)의 아미노산 변이를 가지며, (a), (b), (c) 및 (e)의 아미노산 변이 중 적어도 1개를 더 가진다. 또 다른 실시형태에 있어서는, 개변 DOI 합성효소는, (d)의 아미노산 변이를 가지며, (a), (b), 및 (e)의 아미노산 변이 중 적어도 1개를 더 가진다. 이 경우는 (c)의 아미노산 변이를 더 가져도 된다. 또 다른 실시형태에 있어서는, 개변 DOI 합성효소는, (d)의 아미노산 변이를 가지며, (a) 및 (e)의 아미노산 변이 중 적어도 1개를 더 가진다. 이 경우는 (b) 및 (c)의 아미노산 변이 중 적어도 1개를 더 가져도 된다. 또 다른 실시형태에 있어서는, 개변 DOI 합성효소는, (d)의 아미노산 변이 및 (e)의 아미노산 변이를 가진다. 이 경우는 (a)~(c)의 아미노산 변이 중 적어도 1개를 더 가져도 된다.

또한, 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 가지고, 글루코오스-6-인산으로부터 2-데옥시-실로-이노소스를 생성하는 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드는, 효소의 기능에 관계하는 구조에 관하여 서열번호 1의 아미노산과 고도로 유사한 구조를 가지기 때문에, 이와 같은 폴리펩타이드에 대하여도 상기의 (a)~(e)의 아미노산 변이는 각각 DOI 합성효소 활성을 상승시키는 효과를 나타낸다.

상기와 같이, (a)~(e)의 아미노산 변이 중 1개 이상을 가짐으로써, 향상된 DOI 합성효소 활성을 가지는 개변 DOI 합성효소를 얻을 수 있다. 개변 DOI 합성효소는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 DOI 합성효소(본 개시에 있어서는, 야생형 DOI 합성효소라고도 한다)보다도 높은 DOI 합성 활성을 가지는 것이 바람직하다. 개변 DOI 합성효소는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 DOI 합성효소에 대하여, 바람직하게는 1.1배 이상 높은 DOI 합성 활성을 가지고, 보다 바람직하게는 1.2배 이상 높은 DOI 합성 활성을 가지고, 보다 바람직하게는 1.3배 이상 높은 DOI 합성 활성을 가지고, 보다 바람직하게는 1.4배 이상 높은 DOI 합성 활성을 가지고, 보다 바람직하게는 1.5배 이상 높은 DOI 합성 활성을 가지고, 보다 바람직하게는 1.6배 이상 높은 DOI 합성 활성을 가지고, 보다 바람직하게는 1.7배 이상 높은 DOI 합성 활성을 가지며, 한층 바람직하게는 1.8배 이상 높은 DOI 합성 활성을 가진다.

상기 (a)~(e)의 아미노산 변이는, DOI 합성효소의 진화 공학적 개변에 의해 얻어진 것이다.

＜DOI 합성효소의 진화 공학적 개변＞

진화 공학적 개변이란, 목적의 단백질을 코드하는 유전자에 대하여, 시험관 내에서 인공적으로 돌연변이를 유발시켜, 원하는 성질로 개변된 단백질을 선발하고, 그 목적 단백질 분자를 개변하는 기술을 말한다.

목적 효소 유전자에의 랜덤한 변이의 도입은, 목적의 효소 유전자를 보유하는 미생물에 대하여, 알킬화 시약(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등) 처리, 핵산 염기의 산화적 탈아미노화 시약(아질산 등) 처리, 방사선(자외선, X선 등) 조사(照射), 또는 PCR을 이용한 랜덤한 변이 도입을 함으로써 실시할 수 있다.

PCR을 이용한 랜덤한 변이의 도입은, 목적 효소 유전자를 포함하는 DNA 단편을 주형(鑄型)으로 하여, 그 유전자의 증폭 과정에 있어서, DNA 폴리메라아제에 의한 DNA 복제의 정확성을 낮추는 조건 하에서 PCR 반응을 실시하고, 증폭된 DNA 서열 중에 에러를 축적시키는 에러프론 PCR을 실시하는 것으로 할 수 있다. 에러프론 PCR에 있어서는, 반응 용액 중에 망간 이온을 첨가하거나 4 종류의 디옥시리보핵산(dNTP)의 각 농도의 밸런스를 붕괴시키거나 함으로써, DNA 폴리메라아제의 정확성을 저하시켜, 변이를 도입할 수 있다.

예를 들면, 바실러스·서큘런스 유래의 DOI 합성효소 유전자(btrC)를 에러프론 PCR로 변이시키는 경우에는, 해당 유전자를 가지는 플라스미드(예를 들면, 국제 공개 제2006/109479호에 기재된 pLEX-btrC)나 DNA 단편을 주형으로 하고, 해당 유전자 증폭용의 프라이머를 이하여, DNA 폴리메라아제의 정확성을 저하시키는 조건 하에 있어서, PCR을 실시하면 된다. DNA 폴리메라아제의 정확성을 저하시키는 조건으로서는, 후술하는 실시예 1에 기재된 조건 등을 들 수 있다.

또한, 랜덤한 변이 도입에 의해 얻어진 개변 효소 유전자군은, 원하는 성질에 관하여 향상된 기능을 가질지를 지표로 하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, 개변 효소 유전자군이 발현되는 개변 효소군의 DOI 합성 활성을 측정하고, 변이 도입 전보다도 DOI 합성 활성이 향상된 개변 효소를 선발할 수 있다. 이와 같이 하여, 원하는 성질에 관하여 향상된 활성을 가지는 개변 효소를 얻을 수 있다. 얻어진 개변 효소를 코드하는 유전자에 대하여 랜덤한 변이 도입을 더 실시하고, 상기와 동일하게 스크리닝을 함으로써, 원하는 성질에 관하여 일층 향상된 활성을 가지는 개변 효소를 얻을 수 있다.

진화 공학적 개변에 의해, 효소 중에 있어서의 활성 중심의 위치를 알 수 없더라도, 향상된 성질을 가지는 개변 효소를 얻는 것이 가능해진다. 또한, 이와 같은 향상은, 진화 공학적 개변에 의하면, 기능과의 관계가 사전에는 알려지지 않은 아미노산 잔기 위치에 있어서의 아미노산 변이 혹은 그 조합에 의해, 누적적으로 달성할 수 있다. 이것으로부터, 본 개시에 관련되는 DOI 합성효소가 가지는 개변 및 그에 따른 DOI 합성 활성의 향상은, 당업자가 예상할 수 없는 것이다.

＜개변 DOI 합성효소를 코드하는 유전자＞

본 개시에 관련되는 개변 DOI 합성효소를 코드하는 유전자는, 상기 개변 DOI 합성효소를 코드하는 임의의 핵산이어도 된다. 특정의 아미노산 서열을 코드하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열은, 코돈의 축중(縮重)의 범위 내에서 변화시킬 수 있다. 이 경우, 재조합 미생물의 숙주가 되는 미생물에 있어 사용 빈도가 높은 코돈을 사용하는 것이, 유전자의 발현 효율의 점에서는 바람직하다. 본 개시에 의하면, 개변 DOI 합성효소가 가지는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.

또한, 유전자의 뉴클레오타이드 서열은, 코드해야 할 아미노산 서열로부터 코돈표를 바탕으로 설계할 수도 있다. 설계된 뉴클레오타이드 서열은, 기지(旣知)의 뉴클레오타이드 서열을 유전자 조작 기술을 이용하여 개변함으로써 얻어도 되고, 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성함으로써 얻어도 된다.

뉴클레오타이드 서열을 개변하는 방법으로서는, 예를 들면, 부위 특이적 변이법(Kramer, W. and Frita, H.J., Methods in Enzymology, vol.154, P.350(1987)), 리콘비난트 PCR법(PCR Technology, Stockton Press(1989)), 특정의 부분의 DNA를 화학 합성하는 방법, 유전자를 하이드록시아민 처리하는 방법, 유전자를 보유하는 균주를 자외선 조사 처리, 또는, 니트로소구아니딘이나 아질산 등의 화학 약제로 처리하는 방법, 시판의 돌연변이 도입 키트(kit)를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

목적의 유전자에 랜덤하게 변이를 가지는 유전자의 발현을 실시하기 위해, 여러 가지의 숙주·벡터계를 이용할 수 있다. 숙주·벡터계로서 세균, 효모 등의 계를 이용할 수 있지만, 랜덤하게 변이를 가지는 유전자를 효율적으로 발현, 제조할 수 있으면 특별히 제한되지 않는다. 얻어진 변이 도입된 PCR 단편을, 발현에 필요한 프로모터, 터미네이터를 가지며, 또한 숙주 내에서 발현할 수 있는 발현 벡터에 연결하여, 숙주에 도입한다.

＜개변 DOI 합성효소 유전자 발현 카세트＞

본 개시에 관련되는 유전자 발현 카세트는, 전술한 개변 DOI 합성효소를 코드하는 유전자를, 후술하는 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 유전자 발현 카세트는, 개변 DOI 합성효소를 코드하는 핵산 서열에 더하여, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, RBS(리보솜 결합 서열), 터미네이터 등 중 1개 이상을 포함하고 있어도 된다. 유전자 발현 카세트는, 개변 DOI 합성효소를 코드하는 핵산 서열에 더하여, 그 핵산 서열의 상류에 프로모터 및 그 핵산 서열의 하류에 터미네이터를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 대장균을 숙주세포로 하는 단백질의 대량 발현계에 있어서는, 개변 DOI 합성효소를 코드하는 DNA 서열의 상류측(5'말단측)에 프로모터, 인핸서, 및 RBS(리보솜 결합 부위) 등의 DNA 서열을 연결하고, 개변 DOI 합성효소를 코드하는 DNA 서열의 하류측(3'말단측)에, 예를 들면 터미네이터의 DNA 서열을 연결한 구성을 채용할 수 있다. 이들 각 요소는, 대장균 내에서 원하는 기능을 발휘하는 서열이면 특별히 한정되지 않는다. 프로모터에는 구성적으로 발현을 실시하는 프로모터 및 유도적으로 발현을 실시하는 프로모터가 있다. 본 개시에 관련되는 DOI 유전자 발현 카세트에 있어서는, 어느 타입의 프로모터를 사용해도 된다. 또한, 대장균을 숙주세포로 하는 경우에는, IPTG(이소프로필싸이오갈락토피라노사이드) 등의 유도 물질에 의해 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 사용해도 된다.

일례로서 대장균을 이용하는 경우, 상기 프로모터의 예로서는, 락토오스오페론의 프로모터, 트립토판오페론의 프로모터, 상기 2 종류의 융합 프로모터, λ파지(lambda phage)의 프로모터, 글리세르알데하이드-3-인산데하이드로게나아제 유전자 프로모터, 글루타메이트데카복실라아제 유전자 프로모터, gadA 프로모터, 알코올데하이드로게나아제(ADH1) 프로모터 등을 들 수 있다. 터미네이터는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 rrn 터미네이터, AspA 터미네이터 등을 이용 가능하다.

또한, 리보솜 결합 부위의 예로서는, 샤인달가노(SD) 서열의 AGGAG 등을 들 수 있다. 인핸서로서는, 공지의 인핸서가 사용 가능하다.

＜개변 DOI 합성효소 유전자 발현 벡터＞

본 개시에 관련되는 개변 DOI 합성효소 유전자 발현 벡터는, 전술한 개변 DOI 합성효소를 코드하는 유전자를 가지며, 후술하는 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 개변 DOI 합성효소 유전자 발현 벡터는 바람직하게는 상기 개변 DOI 합성효소 유전자 발현 카세트를 포함한다.

일례로서 대장균을 이용하는 경우, 효율적으로 유전자 발현을 실시하기 위해서 여러 가지의 발현 벡터가 구축되어 있다. 락토오스오페론의 프로모터, 트립토판오페론의 프로모터, 상기 2 종류의 융합 프로모터, λ파지의 프로모터, 글리세르알데하이드-3-인산데하이드로게나아제 유전자 프로모터, 글루타메이트데카복실라아제 유전자 프로모터, gadA 프로모터, 알코올데하이드로게나아제(ADH1) 프로모터 등의 하류에 변이 처리 유전자를 접속하고, 그 유전자의 하류에 터미네이터를 접속한 개변 DOI 합성효소 발현 벡터를 구축할 수 있다. 터미네이터에는 rrn 터미네이터, AspA 터미네이터 등이 이용될 수 있지만, 특별히 제한되는 것은 아니다.

벡터로서는, 숙주세포 내에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지 또는 플라스미드로부터 유전자 재조합용으로서 구축된 것이 적합하다. 파지로서는, 예를 들면 Escherichia　coli를 숙주세포로 하는 경우에는 Lambda　gt10, Lambda　gt11 등을 예시할 수 있다. 또한, 플라스미드로서는, 예를 들면 Eschenchia　coli를 숙주세포로 하는 경우에는, pBTrp2, pBTac1, pBTac2(Boehringer　Mannheim사 제), pKK233-2(Pharmacia사 제), pSE280(Invitrogen사 제), pGEMEX-1(Promega사 제), pQE-8, pQE-30(QIAGEN사 제), pBluescriptII　SK(＋), pBluescriptII　SK(-)(Stratagene사 제), pET-3(Novagen사 제), pUC18, pSTV28, pSTV29, pUC118(타카라주조사 제), pLEX(Invitrogen사 제), pQE80L(QIAGEN사 제), pBR322 등을 예시할 수 있다.

개변 DOI 합성효소 유전자 발현 벡터는, 개변 DOI 합성효소를 코드하는 DNA를 전사(轉寫)시키기 위한 프로모터를 가지고 있어도 된다. 프로모터의 예로서는, 상술한 프로모터를 들 수 있다. 또한, 개변 DOI 합성효소 유전자 발현 벡터는, 리보솜 결합 서열을 포함하고 있어도 된다. 리보솜 결합 서열의 예로서는, 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열을 들 수 있고, SD서열과 개시(開始) 코돈 사이를 적당한 거리(예를 들면 6~18 뉴클레오타이드)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

전사 및 번역을 효율적으로 실시하기 위해, 목적의 단백질의 N말단은 발현 벡터가 코드하는 다른 단백질의 N말단 부분에 융합되어 있어도 된다.

목적으로 하는 단백질의 발현에는 터미네이터는 반드시 필요하지 않지만, 구조 유전자 바로 아래에 터미네이터를 배치하는 것이 바람직하다.

클로닝 시, 상기와 같은 벡터를, 삽입되는 DNA의 잘라내기에 사용된 제한 효소로 절단하여 벡터 DNA 단편을 얻을 수 있지만, 반드시 삽입되는 DNA의 잘라내기에 사용된 제한 효소와 동일한 제한 효소를 사용할 필요는 없다. 삽입되는 DNA 단편과 벡터 DNA 단편을 결합시키는 방법은, 공지의 DNA 리가아제를 사용하는 방법이면 되고, 예를 들면 삽입되는 DNA 단편의 부착 말단과 벡터 DNA 단편의 부착 말단과의 어닐링 후, 적당한 DNA 리가아제의 사용에 의해 삽입되는 DNA 단편과 벡터 DNA 단편과의 재조합 DNA를 제작한다. 필요에 따라, 어닐링 후, 미생물 등의 숙주세포에 이입(移入)하여 생체내의 DNA 리가아제를 이용하여 재조합 DNA를 제작할 수도 있다.

본 개시에 관련되는 재조합 DNA를 숙주세포에 도입하기 위해서는, Sambrook, J., et.al., ”Molecular　Cloning：　A　Laboratory　Manual,　3rd　Edition”, Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press, (2001) 등에 기재되어 있는 분자생물학, 생물 공학 및 유전자 공학의 분야에 있어 공지의 일반적인 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면 컴피던트 셀(competent cell)을 사용하는 방법이나, 일렉트로포레이션(electroporation)을 사용하는 방법을 들 수 있다.

이와 같이 하여 제작된 발현 벡터를 복제, 유지할 수 있는 숙주 내에 도입함으로써 개변 DOI 합성효소 유전자를 발현하는 형질전환체를 얻을 수 있다. 이어서 얻어진 형질전환체가 발현하는 DOI 합성효소의 성질을 검증함으로써 그 효소의 개변을 검증한다.

＜형질전환체＞

본 개시에 관련되는 형질전환체는, 본 개시에 관련되는 개변 DOI 합성효소 유전자 발현 벡터를 포함하는 형질전환체이다.

형질전환체 제작에 사용되는 숙주세포로서는, 재조합 DNA가 안정하고 자율적으로 증식 가능하며, 또한 외래성 DNA의 형질을 발현할 수 있는 것이면 된다. 숙주세포는, 미생물의 세포인 것이 바람직하다. 상기 미생물의 세포는, 진핵생물(예를 들면 효모)의 세포여도, 원핵생물의 세포여도 된다. 숙주세포의 예로서 대장균(Escherichia　coli)의 세포를 들 수 있지만, 특히 대장균의 세포에 한정되는 것은 아니며, 에시에리히아속 세균의 세포, 고초균(Bacillus　subtilis) 등의 바실러스속 세균의 세포, 슈도모나스속 세균 등의 세균류의 세포, 사카로미세스속, 피키아속, 칸디다속 등의 효모류의 세포, 아스페르길루스속 등의 사상균류의 세포 등을 사용할 수 있다.

숙주세포는, DOI 합성효소의 기질이 되는 글루코오스-6-인산을 다량으로 축적하는 숙주세포인 것이 바람직하다. 이와 같은 숙주세포로서는, 예를 들면, 대장균에 있어서 글루코오스인산아이소메라아제를 코드하는 pgi 유전자를 파괴한 주(예를 들면, 국제 공개 제2006/109479호에 기재된 대장균 GI724Δpgi주), 대장균에 있어서 pgi 유전자 및 글루코오스-6-인산데하이드로게나아제를 코드하는 zwf 유전자를 파괴한 주(예를 들면, 국제 공개 제2010/053052호에 기재된 대장균 MG1655ΔpgiΔzwf주), 및 대장균에 있어서 pgi 유전자, zwf 유전자 및 포스포글루콤타아제를 코드하는 pgm 유전자를 파괴한 주(도 2 참조)(예를 들면, 국제 공개 제2006/109479호에 기재된 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주)가 있다.

숙주세포는 글루코오스로부터 글루코오스-6-인산을 생성하는 효소를 코드하는 유전자, 예를 들면 glk를 가지는 세포인 것이 바람직하다.

또한, 숙주세포에는, 세포 외의 글루코오스를 그대로 세포 내에 취입하는 능력을 더 부여해도 되고, 이 때문에 예를 들면 글루코오스 수송 촉진 단백질 유전자를 더 도입해도 된다. 글루코오스 수송 촉진 단백질 유전자로서는, 예를 들면, 자이모모나스·모빌리스(Zymomonas·mobilis) 유래의 glf 등이 있다. 또한, 숙주세포에는, 프룩토오스 및 스크로오스가 향상된 이용능(利用能)을 더 부여해도 되고, 이 때문에 예를 들면 스크로오스 가수분해 효소 유전자를 더 도입해도 된다. 스크로오스 가수분해 효소 유전자로서는, 예를 들면, 대장균 O-157 유래의 cscA 등이 있다. 이와 같은 유전자를 가지는 벡터의 예로서, 국제 공개 제2010/053052호에 기재되어 있는 플라스미드 벡터 pGAP-btrC-cscA-glf 등이 있다.

숙주세포에 재조합 DNA를 이입하는 방법으로서는, 예를 들면 숙주세포가 대장균인 경우에는, 칼슘 처리에 의한 컴피던트 셀법이나 일렉트로포레이션법 등을 사용할 수 있다. 컴피던트 셀로서는, 대장균 DH5α의 컴피던트 셀 등을 이용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 형질전환체는, 배양됨으로써, 개변 DOI 합성효소를 안정하게 생산할 수 있다. 상기 형질전환체의 배양의 조건은, 원래의 숙주 미생물의 배양 조건과 동일하고, 공지의 조건을 사용할 수 있다.

그 형질전환체의 배양에는, 여러 가지의 탄소원, 질소원, 무기 염류 및 유기 영양원을 임의로 사용할 수 있다. 탄소원으로서는, 예를 들면 글루코오스, 자당(蔗糖), 당밀(糖蜜), 유지(油脂) 등을 이용할 수 있다. 질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염 이외, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스 등을 들 수 있다. 무기 염류로서는, 예를 들면 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 그 밖의 유기 영양원으로서는, 예를 들면 글라이신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 프롤린 등의 아미노산, 비타민 B1, 비타민 B12, 비타민 C 등의 비타민 등을 들 수 있다.

탄소원, 질소원, 무기물 및 그 밖의 영양소를 적당량 함유하는 배지라면, 합성 배지 또는 천연 배지 중 어느 것이라도 사용할 수 있다. 배지의 예로서, 예를 들면, LB액체배지, RM액체배지, 2×YT액체배지, L한천배지, RMM액체배지 등을 들 수 있다. 혹은 LB한천플레이트 등이어도 된다. 또한, 선택 마커를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체의 배양에 있어서는, 예를 들면, 상기 선택 마커가 약제 내성(耐性)인 경우에는, 그것에 대응하는 약제를 포함하는 배지를 사용하고, 상기 선택 마커가 영양 요구성인 경우에는, 그것에 대응하는 영양소를 포함하지 않는 배지를 사용한다.

배양 조건은, 배지의 종류, 배양 방법에 따라 적절히 선택하면 되고, 형질전환체가 생육되는 조건이면 특별히 제한은 없다.

배양 온도는, 그 형질전환체가 생육 가능한 온도이면 된다. 배양 시의 pH는, 그 형질전환체가 생육 가능한 pH이면 된다. 배양 시간은 DOI 합성효소를 효율적으로 생산할 수 있는 시간이면 특별히 제한은 없다.

배양 온도는 예를 들면 20℃~45℃의 범위 내의 온도여도 되고, 25℃~35℃의 범위 내의 온도여도 되고, 24℃~37℃의 범위 내의 온도여도 된다. 배지의 pH는, 예를 들면 4~8의 범위에서 선택하면 되고, 5~8의 범위여도 되고, 6.5~8의 범위여도 된다. 배양은, 미생물의 종류에 따라, 호기적(好氣的)으로 실시해도 되고, 혐기적(嫌氣的)으로 실시해도 된다.

배양 기간은 예를 들면 1시간~7일간이어도 되고, 6시간~60시간이어도 되고, 12시간~30시간이어도 된다. 배양 기간은, 개변 DOI 합성효소의 산생량(産生量)이 최대가 되도록 설정해도 된다. 예를 들면, 호기 조건 하에서 pH는 6 이상 8 이하인 pH, 온도는 25℃ 이상 40℃ 이하의 범위 내인 온도로, pH와 온도를 적절히 제어하면서 배양한 경우, 배양에 필요한 시간은 48시간 이내로 해도 된다. 배양 시간은 0.5시간~30시간의 범위내여도 된다.

배양은 상기 배양 성분을 함유하는 액체배지 중에서, 진탕배양, 통기교반배양, 연속배양 또는 유가(流加)배양 등의 통상의 배양 방법을 사용하여 실시할 수 있다.

얻어진 형질전환체를, DOI가 생산 가능한 조건 하에서 배양하고, 배양액 중의 DOI의 생산량 상황을 조사한다. 예를 들면, DOI의 생산량 상황은, 가스 크로마토그래피 질량 분석계나 고속 액체 크로마토그래프 분석계로 조사할 수 있다. 이와 같은 생산량 분석은, Kogure 등, J.Biotechnol., 2007, vol.129, p.502를 참조하여 실시할 수 있다.

상기에 있어서, DOI의 생산량 상황에 변화가 확인된 형질전환체에 관해서는, 그 형질전환체가 가지는 발현 벡터를 추출하여, 그 효소를 코드하는 유전자의 염기 서열을 결정한다. 이어서, 그 효소의 추정 아미노산 서열을 야생형 효소의 아미노산 서열과 비교하여, 어느 아미노산이 그 효소의 성질의 개변에 기여하고 있는지를 특정할 수 있다.

성질이 개변된 효소의 추정 아미노산 서열 상에 복수의 아미노산 치환이 발견된 경우에는, 각각의 아미노산의 치환이 효소의 성질의 개변에 어느 정도 기여하고 있는지를, 부위 특이적 변이 도입법으로 임의의 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여, 조사할 수 있다.

상기에서 얻어진 변이형 효소의 효소 학문적 성질은, 각 변이형 효소를 분리·정제 후, 비활성, 기질 특이성, 지적(至適) 온도, 지적 pH 등을 조사하고, 야생형 효소와 비교함으로써, 효소의 성질의 변화를 검증할 수 있다.

형질전환체가 산생된 개변 DOI 합성효소는, 배양물 중의 형질전환체를 포함하는 배양액을 그대로 채취하여 이용할 수도 있다. 또한, 얻어진 배양물로부터 여과 또는 원심분리 등의 수단에 의해 형질전환체를 채취하여 이용할 수도 있다. 채취한 형질전환체를 기계적 방법 또는 리소자임 등의 효소적 방법으로 파괴하고, 또한 필요에 따라 Ethylenediaminetetraacetic　acid(EDTA) 등의 킬레이트제 및 또는 계면활성제를 첨가하고 폴리펩타이드를 가용화하여, 용액으로서 분리 채취할 수 있다.

＜개변 DOI 합성효소의 제조 방법＞

본 개시에 관련되는 DOI 합성 활성을 가지는 폴리펩타이드(개변 DOI 합성효소)의 제조 방법은, 본 개시에 관련되는 형질전환체를 배양하는 것을 포함한다. 형질전환체의 배양에 사용되는 배지 및 배양 조건, 배양 방법 등에 관해서는, 본 개시에 관련되는 형질전환체의 설명에서 서술한 바와 같다. 배양 조건은, 숙주세포가 생육하여 DOI 합성 활성을 가지는 단백질을 산생할 수 있는 조건이면 특별히 제한은 없다.

본 개시에 관련되는 형질전환체를 배양함으로써, 본 개시에 관련되는 벡터 상의 개변 DOI 합성효소를 코드하는 유전자가 발현되어, 개변 DOI 합성효소가 생성된다. 예를 들면, 적절한 배지 중, 호기 조건 하, pH6~8의 범위 내의 pH, 온도 25℃~40℃의 범위 내의 온도에 있어서, 48시간 이내의 배양에 의해 개변 DOI 합성효소를 얻을 수 있다.

생성된 개변 DOI 합성효소는, 형질전환체의 세포(예를 들면 대장균의 균체) 내 및 배지 중 적어도 1개에 포함된 상태로 있다. 이 형질전환체의 세포 및 배지를 정제하지 않고 그대로 DOI 합성 반응에 사용해도 되고, 혹은 배지로부터 개변 DOI 합성효소를 정제해도 된다. 이 때에는, 세포를 파쇄 혹은 용해함으로써, 세포 내의 개변 DOI 합성효소도 회수할 수 있다. 혹은, 원심분리 등에 의해서 배지로부터 세포를 분리하고, 이 분리된 세포를 DOI 합성 반응에 사용해도 되고, 혹은 이 세포를 건조, 동결 또는 동결건조시켜 보존해도 된다. 혹은 분리한 세포를 파쇄 또는 용해하고, 방출된 DOI 합성효소를 그대로 DOI 합성 반응에 사용해도 되고, 혹은 방출된 DOI 합성효소를 정제해도 된다. 효소의 정제에는, 원심분리, 염석, 탈염, 크로마토그래피, 전기영동, 한외여과 등의, 일반적인 정제법을, 적절히 조절한 조건 하에서 사용할 수 있다. 예를 들면, Lysis　buffer을 사용한 세포의 용해, Ni-NTA 아가로오스에의 DOI 합성효소의 고정, 및 용출 buffer에 의한 용출에 의해 DOI 합성효소를 정제할 수도 있다.

＜DOI의 제조 방법＞

본 개시에 관련되는 DOI 제조 방법은, 본 개시에 관련되는 개변 DOI 합성효소, 본 개시에 관련되는 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물을 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산과 접촉시킴으로써, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 DOI로 변환하는 것을 포함하는, DOI의 제조 방법이다.　

형질전환체의 배양물이란, 형질전환체를 배양하여 얻어지는, 세포와 주위의 배지 등으로 이루어지는 산물을 가리킨다. 배양물은 사용하지 않아도 되고, 예를 들면, 미리 조제된 건조 혹은 동결시킨 형질전환체의 세포를, 직접 반응계에 첨가해도 된다.

형질전환체의 배양물을 얻기 위한 배지, 배양 조건, 배양 방법 등은, 상기의 형질전환체의 배양에 사용할 수 있는 배지, 배양 조건, 배양 방법 등과 동일하다. 배양 조건은, 숙주세포가 생육하여 DOI 합성 활성을 가지는 단백질을 산생할 수 있는 조건이면 특별히 제한은 없다.

또한, 상기 형질전환체의 처리물이란, 형질전환체가 산생되는 개변 DOI 합성효소의 활성을 잃지 않는 범위에서, 형질전환체에 대하여 임의의 처리를 실시한 산물을 가리킨다. 이와 같은 처리로서는, 예를 들면, 가열 처리, 냉각 처리, 기계적 파괴, 초음파 처리, 동결융해 처리, 건조 처리, 가압 또는 감압 처리, 침투압 처리, 자기(自己) 소화, 계면활성제 처리 및 효소 처리(예를 들면 세포용해 처리)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 처리 등을 들 수 있다. 비록, 이와 같은 처리에 의해 형질전환체 자체가 사멸되었다고 해도, 해당 형질전환체가 산생된 효소의 활성이 잔존하고 있으면, 반응에 사용하는 것이 가능하다.

상기 배양물의 처리물이란, 형질전환체가 산생되는 개변 DOI 합성효소의 활성을 잃지 않는 범위에서, 형질전환체의 배양물에 대하여 임의의 처리를 실시한 산물을 가리킨다. 이와 같은 처리로서는, 가열 처리, 냉각 처리, 세포의 기계적 파괴, 초음파 처리, 동결융해 처리, 건조 처리, 가압 또는 감압 처리, 침투압 처리, 세포의 자기 소화, 계면활성제 처리, 효소 처리(예를 들면 세포파괴 처리), 세포분리 처리, 정제 처리 및 추출 처리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 처리를 들 수 있다. 예를 들면, 형질전환체의 세포를 배지 등으로부터 분리하고, 분리된 세포를 반응계에 첨가해도 된다. 이와 같은 분리에는, 여과 또는 원심분리 등의 수단이 사용 가능하다. 혹은, 개변 DOI 합성효소를 협잡물(挾雜物)로부터 분리하기 위한 정제 처리를 실시하고, 그 정제 처리에 의해 얻어진 효소를 포함하는 용액을 반응계에 첨가해도 된다. 혹은, 배양물을, 메탄올이나 아세토나이트릴 등의 유기용매 또는 유기용매와 물과의 혼합 용매를 사용하여 추출한 추출물을 반응계에 첨가해도 된다. 이와 같은 정제물 또는 추출물은, 형질전환체의 세포를 포함하지 않는 것이어도 된다. 해당 형질전환체의 세포가 존재 하지 않아도, 효소의 활성이 잔존하고 있으면, 반응에 사용하는 것이 가능하다.

상기와 같은 세포의 파쇄 혹은 용해 처리는, 리소자임 처리, 동결융해, 초음파 파쇄 등의 공지의 방법에 따라 형질전환체의 세포막을 파괴함으로써, 실시할 수 있다.

본 개시에 관련되는 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물과, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산과의 접촉은, 이하와 같은 조건에서 실시하는 것이 바람직하다.

접촉은 기질로서의 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 포함하는 용액 중에서 실시하는 것이 바람직하다. 물론, 용액은 글루코오스와 글루코오스-6-인산의 양쪽를 포함하고 있어도 된다. 반응은, 반응의 효율 등에서, NAD, NADP 등의 보효소의 존재 하에서 실시하는 것이 바람직하다.

반응 조건은, 상기 반응이 진행되는 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 용액의 pH는, 개변 DOI 합성효소의 효소 활성이 유지되는 한은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 반응 시의 pH는, 4.0~9.0의 범위 내의 pH인 것이 바람직하고, 바람직하게는 5.0~8.0의 범위 내의 pH이며, 6.0~8.0의 범위 내의 pH인 것이 보다 바람직하다. 용액의 온도도, 개변 DOI 합성효소의 효소 활성이 유지되는 한은 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 10℃~50℃의 범위 내의 온도, 보다 바람직하게는 20℃~45℃의 범위 내의 온도, 더욱보다 바람직하게는 30℃~42℃의 범위 내의 온도이다.

용액의 매체로서는, 물 혹은 수성 매체, 유기용매 또는 물 혹은 수성 매체와 유기용매의 혼합액이 사용된다. 수성 매체로서는, 예를 들면 인산 완충액, HEPES(N-2-하이드록시에틸피페라진-N-에테인설폰산) 완충액, 트리스[트리스(하이드록시메틸)아미노메테인]염산 완충액 등의 완충액이 사용된다. 유기용매로서는 반응을 저해하지 않는 것이면 어느 것이어도 되고, 예를 들면 아세톤, 아세트산에틸, 다이메틸설폭사이드, 자일렌, 메탄올, 에탄올, 뷰탄올 등이 사용된다. 혹은 용액은 액체배지여도 된다.

본 개시에 관련되는 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물과, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산과의 접촉은, 진탕 혹은 교반 하에서 실시하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 이와 같은 접촉은 용액 중에서 실시할 수 있다. 예를 들면, 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물을 포함하는 용액에, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 기질 용액의 형태로 혹은 고체의 형태로 첨가해도 된다.

반응 개시 시 혹은 반응 도중에 있어서, 반응액의 pH를 적절한 범위로 유지하기 위해, 산이나 알칼리를 첨가해도 된다. 반응 용액에 첨가 가능한 알칼리의 예로서는, 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리 금속 수산화물 이외, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 인산2칼륨, 인산2나트륨, 피로인산칼륨, 암모니아 등 물에 용해하고, 액성을 염기성으로 하는 것을 들 수 있다. 반응 용액에 첨가 가능한 산의 예로서는, 염산, 황산, 질산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다.

상기 접촉은, 예를 들면, 공기 분위기 하에서 실시해도 되고, 탈산소 분위기 하에서 실시해도 된다. 탈산소 분위기는, 불활성 가스에 의한 치환, 감압, 비등(沸騰)이나 이들을 조합함으로써 달성할 수 있다. 적어도, 불활성 가스에 의한 치환, 즉, 불활성 가스 분위기를 사용하는 것이 적합하다. 상기 불활성 가스로서는, 예를 들면, 질소 가스, 헬륨 가스, 아르곤 가스, 탄산 가스 등을 들 수 있고, 바람직하게는 질소 가스이다.

바람직한 실시형태에서는, 사용되는, 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물은, 상기 개변 DOI 합성효소를 포함하고 있다. 이 때문에, 상기 접촉에 의해, 반응 용액 중에 모두 존재 하고 있는 상기 개변 DOI 합성효소가 작용하여, DOI를 높은 생산 효율로 생산한다. 또한, 상기 형질전환체의 처리물 혹은 상기 배양물의 처리물이 살아있는 상태의 상기 형질전환체를 포함하고 있는 것은 필수는 아니지만, 반응에 관여하는 물질을 대사에 의해 계속적으로 공급할 수 있다고 하는 관점에서는, 살아있는 상태의 상기 형질전환체를 포함하는 것이 바람직하다.

형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물의 첨가 시기는, 반응 개시 시에 일괄로 첨가해도 상관없고, 반응 중에 분할하여 또는 연속하여 첨가해도 상관없다. 동일하게, 원료가 되는 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산도, 반응 개시 시에 일괄로 첨가해도 상관없고, 반응 중에 분할하여 또는 연속하여 첨가해도 상관없다.

글루코오스 또는 글루코오스-6-인산의 반응 용액 중에 있어서의 농도는, 예를 들면 0.1질량%~20질량%이고, 혹은 0.5질량%~15질량%이며, 혹은 2질량%~10질량%여도 된다.

상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물과, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 접촉시키는 방법으로서는, 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물을 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 포함하는 용액에 첨가하고, 교반하면서 반응을 진행시키는 방법, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물을 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 포함하는 용액에 첨가하고, 진탕하면서 반응을 진행시키는 방법, 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물과 피리독신 또는 그 염을 용액 중에서 충분히 혼화 후, 정치(靜置)하여 반응을 진행시키는 방법 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 반응 효율의 관점에서, 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물을 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 포함하는 용액에 첨가하고, 교반하면서 반응을 진행시키는 방법을 들 수 있다.

반응에 사용 가능한 반응용기로서는 특별히 제한은 없다. 바람직하게는, 첨가한 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물과 피리독신 또는 그 염을 포함하는 용액이 충분히 혼화되도록 교반할 수 있는 것과 동시에, 개변 DOI 합성효소의 최적 온도 범위 내에 유지할 수 있도록 온도 조절 기능을 가지는 반응용기인 것이 바람직하다.

상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물과, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산과의 접촉 시간(반응 시간)은, 개변 DOI 합성효소의 효소 활성이 유지되는 한은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 30분간~100시간이며, 혹은 2시간~50시간이어도 된다. 또한, 반응은 배치(batch)식으로 실시해도 되고, 반응 도중에, 기질 및 상기 미생물, 상기 배양물 혹은 상기 처리물 중 한쪽 또는 양쪽를 축차(逐次) 첨가하는 세미 배치(semi-batch)식으로 실시해도 되고, 연속식으로 실시해도 된다. 세미 배치식이나 연속식의 경우는, 새로운 원료 및 상기 형질전환체, 상기 배양물 혹은 상기 처리물 중 한쪽 또는 양쪽이 공급되는 등의 조작이 실시되기 때문에, 반응 시간의 상한은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 연속적으로 첨가해도 된다.

일 실시형태에 있어서는, DOI의 제조 방법은, 본 개시에 관련되는 형질전환체를 배지 중에서 배양하는 것을 포함한다. 배지는 바람직하게는 액체배지이고, 또한, 바람직하게는 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 포함한다. cscA의 도입 등에 의해 프룩토오스 이용능이 향상되어 있는 형질전환체의 경우에는, 배지는 프룩토오스를 더 포함하고 있어도 된다. 사용할 수 있는 배지 및 배양 조건, 배양 방법 등에 관해서는, 상술한, 형질전환체의 배양에 사용할 수 있는 배지, 배양 조건, 배양 방법 등을 적용할 수 있다. 예를 들면, 2×YT액체배지 등을 사용할 수 있다. 이와 같은 배지에, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 첨가하고, 원하는 농도의 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 배지 중에 포함하도록 해도 된다. 배양 온도는 예를 들면 25℃~35℃의 범위 내의 온도여도 되고, 배양 시간은 예를 들면 5시간~30시간이어도 된다. 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산의 배지 중에 있어서의 농도는, 예를 들면 0.1질량%~20질량%이고, 혹은 0.5질량%~15질량%이며, 혹은 1.5질량%~10질량%여도 된다. 이와 같은 배양에 의해서, 형질전환체의 존재에 의하여 DOI가 산생된다.

DOI 생산을 위한 배양(이하 본배양(本培養)이라고도 부른다) 전에, 형질전환체에 대하여 전배양(前培養)을 실시해도 된다. 전배양에 사용되는 배지는, DOI 생산을 위한 배양에 사용되는 배지와는 상이한 배지여도 된다. 배지의 차이는, 기본 배지의 차이여도 되고, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산의 농도에 있어서의 차이여도 된다. 전배양에 사용되는 배지, 배양 조건, 배양 방법 등에 관해서는, 상술한, 형질전환체의 배양에 사용할 수 있는 배지, 배양 조건, 배양 방법 등을 적용할 수 있다. 전배양에 사용되는 배지는, 글루코오스도 글루코오스-6-인산도 포함하지 않는 배지여도 된다. 전배양에 사용되는 배지의 예로서는, RM액체배지나 RMM액체배지를 들 수 있지만, 2×YT액체배지여도 된다. 전배양은 형질전환체 상태가 안정될 때까지 실시하면 되지만, 전배양 시간은 예를 들면 3시간~48시간이며, 혹은 8시간~30시간이어도 된다. 전배양 후의 형질전환체는, 그대로 배지마다 본배양을 위한 배지에 첨가해도 되고, 원심 처리 등으로 전배양에 사용된 배지로부터 분리하고 나서 본배양을 위한 배지에 첨가해도 된다. 통상은, 본배양의 배양액량은, 전배양의 배양액량보다 큰 배양 용량, 예를 들면 체적으로 10배 이상, 혹은 20배 이상으로 할 수 있다.

본배양은, 배치식으로 실시해도 되고, 반응 도중에, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 축차 첨가하는 세미 배치식으로 실시해도 되고, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 연속적으로 첨가하는 연속식으로 실시해도 된다. 세미 배치식이나 연속식의 경우는, 새로운 원료가 공급되는 등의 조작이 실시되기 때문에, 반응 시간의 상한은 특별히 한정되지 않는다.

상기의 방법에 있어서는, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 원료로서 본 개시에 관련되는 형질전환체 혹은 상기 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물을 사용함으로써, DOI를 높은 생산 효율로 제조할 수 있다. 상기의 방법에 의해 얻어진 DOI는, 예를 들면 카테콜로 변환되어 신경계 의약품 등의 원료, 식품 향료 원료, 헤어 케어 상품 등의 산화방지제 등에 사용할 수 있고, 하이드로퀴논으로 변환되어 지혈제, 진통제 등의 원료, 미백제 등의 화장품 등에 이용 가능하다. 상기의 방법으로 얻어진 DOI를 탈수함으로써 1,2,4-트라이하이드록시벤젠(THB)을 얻을 수 있다. 또한 상기의 방법으로 얻어진 THB의 수산기를 글리시딜에터화하여 1,2,4-트라이글리시딜옥시벤젠(TGB)을 얻을 수 있다. TGB는 내열성이 뛰어나고, 또한 상온에서 저점도의 액상이며, 전자 부품의 봉지재(封止材), 회로기재(基材), 접착제, 코팅재, 도료, 복합재료의 매트릭스 수지 등 광범위한 범위에 걸쳐 이용할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 "공정"이라는 용어는, 독립한 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없는 경우여도 그 공정의 소기의 목적이 달성되면, 본용어에 포함된다. 또한 본 명세서에 있어서 "~"를 사용해서 나타낸 수치 범위는, "~"의 전후에 기재되는 수치를 각각 최소값 및 최대값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.

본 명세서에 있어서, 조성물 중의 각 성분의 양에 관하여 언급하는 경우, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재하는 경우에는, 특별히 단정짓지 않는 한, 조성물 중에 존재하는 해당 복수의 물질의 합계량을 의미한다.

실시예

이하, 실시예에 의해 실시형태를 구체적으로 설명하지만, 본 개시는, 이와 같은 실시예에 의해 그 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다. 또한, 실시예에 있어서, 특별히 단정짓지 않는 한, 물질의 함유량 또는 첨가량을 나타내는 "%"는 "질량%"를 의미한다.

(실시예 1)

＜에러프론 PCR에 의한 변이형 DOI 합성효소 유전자 클론 라이브러리의 구축＞

에러프론 PCR을 사용한 변이형 DOI 합성효소 유전자 클론 라이브러리의 제작으로부터 DOI 고생산 DOI 합성효소 유전자 변이 클론의 단리(1, 2, 3차 선발)까지의 공정을 도 3a~도 3d에 나타냈다.

서열번호 1로 나타내는 바실러스·서큘런스 유래의 DOI 합성효소의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(btrC)에, 에러프론 PCR로 랜덤하게 변이를 도입했다. btrC 유전자 전체 길이를 포함하는 플라스미드 pLEX-btrC(국제 공개 제2006/109479호에 기재되어 있는, 바실러스·서큘런스 유래의 DOI 합성효소의 42 kDa 서브유닛을 코드하는 btrC 유전자를 벡터 pLEX(Invitrogen)의 멀티 클로닝 사이트의 NdeI-XbaI 부위에 삽입한 것)를 주형으로 하고, btrC 유전자의 개시(開始) 코돈 상류에 SalI 제한 효소 사이트를 부가한 뉴클레오타이드 서열에 상당하는 서열번호 2로 나타내는 프라이머 1(5'-acgcgtcgacatgacgactaaacaaatttg-3')과 btrC 유전자의 종지(終止) 코돈 상류에 PstI 제한 효소 사이트를 부가한 뉴클레오타이드 서열에 상당하는 서열번호 3로 나타내는 프라이머 2(5'-aaaactgcagttacagcccttcccgga-3')를 사용하고, DNA 폴리메라아제의 정확성을 저하시키는 조건(표 2)에서 PCR을 실시함으로써, 변이 개소(箇所)를 한정하는 경우 없이 btrC 유전자 전(全)영역에의 랜덤한 변이의 도입을 실시했다.

PCR은, 94℃에서 2분 30초 유지 후, 94℃에서 20초의 열변성, 50℃에서 25초의 어닐링, 72℃에서 1분 10초의 DNA 신장(伸長)의 반응을 1사이클로 하여, 30사이클 실시하고, 또한 72℃에서 3분 유지하고, 얻어진 PCR 증폭 산물을 4℃에서 유지했다.

이와 같이 PCR 증폭한 DNA 단편을 페놀/클로로폼으로 처리하고, 원심분리하고, 상청(上淸)을 에탄올 침전시켜, DNA 단편을 회수했다. 회수한 DNA 단편을 제한 효소 SalI와 PstI로 소화하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제·단리하여, 변이형 DOI 합성효소 유전자의 DNA 단편을 취득했다.

이어서, 변이형 DOI 합성효소 유전자의 DNA 단편을 숙주세포(대장균)에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 구축했다. pLEX 벡터(Invitrogen)를 주형으로 하고, 서열번호 4로 나타내는 프라이머 3(5'-atggtaccgagctcggatcc-3')과 5'측에 XbaI 제한 효소 사이트를 부가한 뉴클레오타이드 서열에 상당하는 서열번호 5로 나타내는 프라이머 4(5'-ctagtctagactaggagataatttatcaccgcag-3')를 사용하여, PCR 증폭을 실시했다. PCR 증폭에는, KOD 폴리메라아제(TOYOBO)를 사용했다. PCR의 반응 조건은, 94℃에서 2분 유지 후, 94℃에서 30초의 열변성, 52℃에서 30초의 어닐링, 68℃에서 1분의 DNA 신장의 반응을 1사이클로 하여, 30사이클 실시하고, 또한 68℃에서 2분 유지하고, 얻어진 PCR 증폭 산물을 4℃에서 유지했다. 이와 같이 PCR 증폭한 DNA 단편을 페놀/클로로폼으로 처리하고, 원심분리하고, 상청을 에탄올 침전시켜, DNA 단편을 회수했다. 회수한 DNA 단편을 제한 효소 SalI와 XbaI로 소화하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해서 정제·단리하여, 발현 벡터의 DNA 단편을 취득했다.

이어서, 변이형 DOI 합성효소 유전자의 DNA 단편을 숙주세포(대장균)에서 발현시키기 위한 프로모터로서, gadA 프로모터를 취득했다. gadA 프로모터는, 구체적으로는 이하와 같이 하여 취득했다. 대장균의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 5'측에 XbaI 제한 효소 사이트를 부가한 뉴클레오타이드 서열에 상당하는 서열번호 6로 나타내는 프라이머 5(5'-ctagtctagagtcgtttttctgct-3')와 5'측에 SalI 제한 효소 사이트를 부가한 뉴클레오타이드 서열에 상당하는 서열번호 7로 나타내는 프라이머 6(5'-acgcgtcgacttcgaactccttaaatttatttgaaggc-3')을 사용하여, PCR 증폭을 실시했다. PCR 증폭에는, KOD 폴리메라아제(TOYOBO)를 사용했다. PCR의 반응 조건은, 94℃에서 2분 유지 후, 94℃에서 30초의 열변성, 50℃에서 30초의 어닐링, 68℃에서 1분의 DNA 신장의 반응을 1사이클로 하여, 30사이클 실시하고, 또한 68℃에서 2분 유지하고, 얻어진 PCR 증폭 산물을 4℃에서 유지했다. 이와 같이 PCR 증폭한 DNA 단편을 페놀/클로로폼으로 처리하고, 원심분리하고, 상청을 에탄올 침전시켜, DNA 단편을 회수했다. 회수한 DNA 단편을 제한 효소 SalI와 XbaI로 소화하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해서 정제·단리하여, gadA 프로모터의 DNA 단편을 취득했다.

이어서, 상기에서 증폭시킨 발현 벡터의 DNA 단편과 gadA 프로모터의 DNA 단편을, 2×Ligation　mix를 사용하고, 16℃, 30분에서 반응시키고, 연결함으로써 gadA 프로모터의 DNA 단편을 발현 벡터의 DNA 단편에 삽입하여, 발현 벡터 pGADP(도 4)를 취득했다.

상기 조작에 의해서 얻어진 발현 벡터 pGADP를 제한 효소 SalI와 PstI로 소화하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해서 정제·단리하여, 변이형 DOI 합성효소 유전자의 DNA 단편을 연결 삽입함으로써, 변이형 DOI 합성효소 유전자(mbtrC)의 분자 집단을 얻었다.

상기 조작에 의해서 취득한 분자 집단을 대장균 DH5α의 컴피던트 셀 세포로 형질전환하여, 변이형 DOI 합성효소 유전자 클론 라이브러리를 구축했다.

(실시예 2)

＜DOI 고생산 DOI 합성효소 유전자 변이 클론의 단리＞

상기 조작에 의해 취득된 변이형 DOI 합성효소 유전자 클론 라이브러리로부터 변이형 DOI 합성효소 유전자 라이브러리(pGADP-mbtrC, 도 5)를 추출하고, DOI 합성효소의 기질인 글루코오스-6-인산이 고축적되는 대장균 GI724Δpgi주(국제 공개 제2006/109479호 및 Kakinuma 등, Tetrahedron Letters, 2000, vol.41, p.1935에 기재되어 있는, 대장균 GI724주에 있어서의 pgi 유전자를 파괴한 주)의 컴피던트 셀로 형질전환했다. 형질전환 세포를 L한천배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% NaCl, 2% 한천, 100μg/ml 암피실린)에서 배양하고, 생육된 클론을 DOI 합성효소 유전자 변이 클론의 단리의 선발 대상으로 했다.

1차 선발에서는, 우선, 얻어진 선발 대상 클론을 RM액체배지(2% 카사미노산, 1% 글라이세롤, 0.6% Na₂HPO₄, 0.3% KH₂PO₄, 0.05% NaCl, 0.1% NH₄Cl, 1mM　MgCl₂, 100μg/ml 암피실린)가 1ml씩 들어간 딥 웰 플레이트(deep well plate) 96Well 둥근바닥(丸底)에 식균하고, 30℃에서 24시간 진탕하여, 전배양을 실시했다. 다음으로, 전배양액을 1차 선발용 2×YT액체배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 엑기스, 0.5% NaCl, 1% 글루코오스, 100μg/ml 암피실린)가 1ml씩 들어간 딥 웰 플레이트 96Well 둥근바닥에 10μl씩 식균하고, 30℃에서 15시간 진탕하여, 본배양을 실시했다. 본배양 후의 배양액을 원심분리하고 균체를 제외한 상청 10μl, 멸균 증류수 90μl, 메탄올 100μl, 옥심화 시약 NBHA(20mg/ml)를 혼합하고, 60℃에서 1시간 옥심화 반응을 실시했다. 옥심화 반응 후, 감압 농축 원심기로 건고(乾固)하고, 메탄올 200μl로 재용해 후, 표 3의 조건에서 HPLC 분석을 실시하여, DOI 농도를 결정하고, 야생형 DOI 합성효소 유전자를 가지는 클론보다도 DOI 생산량이 많았던 후보 클론을 선발했다.

1차 선발에 있어서 얻어진 후보 클론을 대상으로 하여, 2차 선발을 실시했다. 2차 선발에서는, 1차 선발에 있어서 얻어진 후보 클론을 RM액체배지가 3ml씩 들어간 시험관에 식균하고, 30℃에서 24시간 진탕하여, 전배양을 실시했다. 다음으로, 전배양액을 2차 선발용 2×YT액체배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 엑기스, 0.5% NaCl, 2% 글루코오스, 100μg/ml 암피실린)가 50ml씩 들어간 500ml 삼각 플라스크에 탁도 OD600=0.1이 되도록 식균하고, 30℃에서 36시간 진탕하여, 본배양을 실시했다. 본배양 개시 0, 12, 24, 36시간 후의 배양액을 원심분리하여 균체를 제외한 상청 10μl에 대하여, 1차 선발에 있어서의 DOI 농도 측정 조작과 동일한 조작을 실시함으로써, DOI 농도를 HPLC로 결정하고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소 유전자를 가지는 클론보다도 DOI 생산량이 많았던 후보 클론을 선발했다.

2차 선발에 있어서 얻어진 후보 클론을 대상으로 하여, 3차 선발을 실시했다. 2차 선발에서 얻어진 클론으로부터, 플라스미드 벡터를 정제 단리하고, DOI 합성효소의 기질인 글루코오스-6-인산이 고축적되는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(국제 공개 제2006/109479호 및 Kakinuma 등, Tetrahedron Letters, 2000, vol.41, p.1935에 기재되어 있는, 대장균 GI724주에 있어서의 pgi 유전자, zwf 유전자 및 pgm 유전자를 파괴한 주)의 컴피던트 셀 세포로 형질전환했다. 형질전환 세포를 L한천배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% NaCl, 2% 한천, 100μg/ml 암피실린)에서 배양하고, 생육된 클론을 3차 선발에 사용했다. 3차 선발에서는, 우선, 얻어진 선발 대상 클론을 RMM액체배지(2% 카사미노산, 0.5% 만니톨, 0.6% Na₂HPO₄, 0.3% KH₂PO₄, 0.05% NaCl, 0.1% NH₄Cl, 1mM　MgCl₂, 100μg/ml 암피실린)가 3ml씩 들어간 시험관에 식균하고, 30℃에서 24시간 진탕하여, 전배양을 실시했다. 다음으로, 전배양액을 3차 선발용 2×YT액체배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 엑기스, 0.5% NaCl, 2% 글루코오스, 2% 만니톨, 100μg/ml 암피실린)가 50ml씩 들어간 500ml 삼각 배플(baffle) 플라스크에 탁도 OD600=0.1이 되도록 식균하고, 30℃에서 36시간 진탕하여, 본배양을 실시했다. 본배양 개시 0, 12, 24, 36시간 후의 배양액을 원심분리하여 균체를 제외한 상청 10μl에 대하여, 1차 선발에 있어서의 DOI 농도 측정 조작과 동일한 조작을 실시함으로써, DOI 농도를 HPLC로 결정하고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소 유전자를 가지는 클론보다도 DOI 생산량이 많았던 후보 클론을 선발했다(도 6). 도 6 중, ◆로 표시되는 데이터 계열은 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소 유전자를 가지는 클론에 의한 DOI 생산량, ■로 표시되는 데이터 계열은 야생형 DOI 합성효소 유전자를 가지는 클론보다도 DOI 생산량이 많았던 후보 클론에 의한 DOI 생산량이다.

(실시예 3)

＜변이형 DOI 합성효소 유전자의 염기 서열의 해석＞

DOI 합성효소 유전자의 변이점을 결정하기 위해서, 상기 3차 선발에 있어서 얻어진 클론의 DOI 합성효소 유전자의 염기 서열 해석을 실시했다. 해석용 프라이머는, 서열번호 8로 나타내는 프라이머 7(5'-ggagccaaccgaagaacc-3'), 서열번호 9로 나타내는 프라이머 8(5'-ctagtctagagtcgtttttctgct-3'), 서열번호 10으로 나타내는 프라이머 9(5'-acctgatgcccgaacatg-3'), 서열번호 11로 나타내는 프라이머 10(5'-agatcgaatccgggtccg-3')의 합계 4종의 프라이머를 사용하고, 벡크만쿨터사 제의 DTCS　Quick　Start　Kit를 이용하고, PCR 반응을 실시하여, 그 반응 샘플을 벡크만쿨터사 제의 CEQ8000 제네틱어널라이저에 의해 해석했다. 해석의 결과, DOI 합성효소 유전자(btrC)의 개시 코돈으로부터 877번째의 T가 A로 염기 치환되어 있었다. 즉, N말단으로부터 293번째의 트립토판이 아르기닌으로 아미노산 치환되고 있었다. 이와 같이 하고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소와 비교하여, DOI 생산성을 향상시키는 변이형 DOI 합성효소를 코드하는 유전자(btrC(W293R))를 취득했다.

(실시예 4)

＜야생형 및 변이형 DOI 합성효소의 생산 및 정제＞

서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소를 포함하는 플라스미드 벡터 pLEX-btrC(국제 공개 제2006/109479호에 기재되어 있다)를 템플릿으로 하고, btrC 유전자의 개시 코돈 상류에 BamHI 제한 효소 사이트를 부가한 뉴클레오타이드 서열에 상당하는 서열번호 12로 나타내는 프라이머 11(5'-cgcggatccatgacgactaaacaaattt-3'), btrC 유전자의 종지 코돈 상류에 HindIII 제한 효소 사이트를 부가한 뉴클레오타이드 서열에 상당하는 서열번호 13로 나타내는 프라이머 12(5'-cccaagcttttacagcccttccccgatc-3')를 사용하여 btrC 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 PCR법에 의해 증폭하고, 대장균 재조합 단백질 고발현 벡터 pQE80L(QIAGEN)에 연결하고, 대장균 DH5α로 형질전환하여, 플라스미드 pQE80L-btrC를 얻었다. pQE80L 벡터에 연결함으로써 히스티딘 태그 서열과 DOI 합성효소가 융합한 재조합 DOI 합성효소를 생산할 수 있다. 재조합 단백질로서 DOI 합성효소를 고발현시킨 대장균을 원심에 의해 회수후, Lysis　　buffer(500mM　Phosphate　buffer(pH7.7), 300mM　NaCl, 0.2mM　CoCl₂·6H₂O)에 현탁시켰다. 현탁액을 초음파 파쇄기에 걸쳐, 대장균을 파쇄 후, 원심(遠心)을 함으로써 재조합 DOI 합성효소를 상청으로 회수했다. 상청액과 히스티딘 태그 서열과 특이적으로 결합되는 Ni-NTA 아가로오스를 혼합하고, Ni-NTA 아가로오스에 DOI 합성효소를 결합시킨 후, Wash　buffer(500mM　Phosphate　buffer(pH7.7), 30mM　Imidazole, 0.2mM　CoCl₂·6H₂O)를 더하고, 세정하고, 원심하여 상청을 버렸다. 재조합 DOI 합성효소가 결합한 Ni-NTA 아가로오스에 용출buffer(50mM　Phosphate　buffer(pH7.7), 200mM　Imidazole, 0.2mM　CoCl₂·6H₂0)를 첨가하고, 재조합 DOI 합성효소를 용출시켜, 고순도의 재조합 DOI 합성효소를 정제할 수 있었다.

동일하게, 변이형 DOI 합성효소(btrC(W293R))에 관해서도, 상기에서 취득한 변이형 DOI 합성효소(btrC(W293R))를 포함하는 플라스미드 벡터를 템플릿으로 하고, btrC 유전자의 개시 코돈 상류에 BamHI 제한 효소 사이트를 부가한 뉴클레오타이드 서열에 상당하는 서열번호 12로 나타내는 프라이머 11(5'-cgcggatccatgacgactaaacaaattt-3'), btrC 유전자의 종지 코돈 상류에 HindIII 제한 효소 사이트를 부가한 뉴클레오타이드 서열에 상당하는 서열번호 13로 나타내는 프라이머 12(5'-cccaagcttttacagcccttccccgatc-3')를 사용하여 btrC(W293R) 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 PCR법에 의해 증폭하고, 대장균 재조합 단백질 고발현 벡터 pQE80L(QIAGEN)에 연결하고, 대장균 DH5α로 형질전환하여, 플라스미드 pQE80L-btrC(W293R)를 얻었다. 동일한 방법으로 재조합 변이형 DOI 합성효소의 생산, 정제를 실시했다.

(실시예 5)

＜야생형 및 변이형 DOI 합성효소의 활성 측정＞

실시예 4에서 정제한 야생형 및 변이형 DOI 합성효소의 효소 활성을 글루코오스-6-인산, NAD^＋를 사용하여 측정했다. 아세이(assay)의 반응 용액의 조성은, 50mM　Phosphate　buffer(pH7.7), 5mM　글루코오스-6-인산, 5mM　β-NAD^＋, 0.2mM CoCl₂·6H₂O, 야생형 또는 변이형 DOI 합성효소　10μg로 하고, 46℃, 5분간 반응시켰다. 반응 후, 반응 용액을 페놀/클로로폼 처리를 하고, 제단백(除蛋白)을 실시하고, 원심 후의 수층획분 10μl를 샘플로 하고, 실시예 2에 있어서의 1차 선발에 있어서의 DOI 농도 측정에 사용된 HPLC를 사용한 방법으로 DOI를 정량하여, 활성을 산출했다. 또한, DOI 합성효소 1mg이 1분 당 합성되는 DOI의 양을 비활성으로 했다. 변이형 DOI 합성효소(W293R)의 DOI 합성효소 활성은, 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소의 활성보다도, 1.5배 고활성이었다(도 7).

(실시예 6)　

DOI 생산성을 더 향상시키는 변이형 DOI 합성효소 유전자를 취득하기 위해서, 변이형 DOI 합성효소 유전자(W293R)를 포함하는 플라스미드를 템플릿으로 하고, 실시예 1에 나타낸 에러프론 PCR법으로, 새로운 변이형 DOI 합성효소 유전자 클론 라이브러리를 구축했다. 이어서, 실시예 2의 DOI 합성효소 유전자 변이 클론의 단리에 나타낸 1, 2, 3차 선발을 실시하고, 변이형 DOI 합성효소 유전자(W293R)를 포함하는 클론보다도 DOI 생산성이 더 향상된 클론을 취득했다(도 8). 도 8 중, ◆로 표시되는 데이터 계열은 pGADP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주에 의한 DOI 생산량을 나타내고, ■로 표시되는 데이터 계열은 pGADP-btrC(W293R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주에 의한 DOI 생산량을 나타내고, ▲로 표시되는 데이터 계열, ×로 표시되는 데이터 계열, ＋로 표시되는 데이터 계열, 및 ●로 표시되는 데이터 계열은, 각각 상이한 변이형 DOI 합성효소 유전자를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주에 의한 DOI 생산량을 나타낸다.

다음으로 실시예 3의 변이형 DOI 합성효소 유전자의 염기 서열의 해석과 동일하게 염기 서열 해석을 한 결과, 표 4에 나타내는 바와 같이, 이하의 4종의 변이형 DOI 합성효소 유전자가 얻어졌다.

DOI 합성효소 유전자(btrC)의 개시 코돈으로부터 877번째의 T가 A로 염기 치환됨으로써, 서열번호 1에 있어서의 N말단으로부터 293번째의 트립토판이 아르기닌으로 아미노산 치환되고, 또한 DOI 합성효소 유전자(btrC)의 개시 코돈으로부터 41번째의 A가 C로 염기 치환됨으로써, 서열번호 1에 있어서의 N말단으로부터 14번째의 아스파라긴이 트레오닌으로 아미노산 치환된 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/N14T)).

DOI 합성효소 유전자(btrC)의 개시 코돈으로부터 877번째의 T가 A로 염기 치환됨으로써, 서열번호 1에 있어서의 N말단으로부터 293번째의 트립토판이 아르기닌으로 아미노산 치환되고, 또한 DOI 합성효소 유전자(btrC)의 개시 코돈으로부터 110번째의 A가 T로 염기 치환됨으로써, 서열번호 1에 있어서의 N말단으로부터 37번째의 티로신이 페닐알라닌으로 아미노산 치환된 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/Y37F)).

DOI 합성효소 유전자(btrC)의 개시 코돈으로부터 877번째의 T가 A로 염기 치환됨으로써, 서열번호 1에 있어서의 N말단으로부터 293번째의 트립토판이 아르기닌으로 아미노산 치환되고, 또한 DOI 합성효소 유전자(btrC)의 개시 코돈으로부터 868번째의 G가 A로 염기 치환됨으로써, 서열번호 1에 있어서의 N말단으로부터 290번째의 알라닌이 트레오닌으로 아미노산 치환된 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/A290T)).

DOI 합성효소 유전자(btrC)의 개시 코돈으로부터 877번째의 T가 A로 염기 치환됨으로써, 서열번호 1에 있어서의 N말단으로부터 293번째의 트립토판이 아르기닌으로 아미노산 치환되고, 또한 DOI 합성효소 유전자(btrC)의 개시 코돈으로부터 956번째의 A가 G로 염기 치환됨으로써, 서열번호 1에 있어서의 N말단으로부터 319번째의 히스티딘이 아르기닌으로 아미노산 치환된 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/H319R)).

야생형 DOI 합성효소 유전자를 포함하는 클론, W293R 변이를 가지는 변이형 DOI 합성효소 유전자를 포함하는 클론, 및 표 4에 나타낸 각 클론에 의한 DOI 생산(도 8에 나타낸 것)에 관하여, 이하의 표 5에 수치를 나타낸다.

다음으로 실시예 4와 동일하게 상기 4종의 (btrC(W293R/N14T)), (btrC(W293R/Y37F)), (btrC(W293R/A290T)), (btrC(W293R/H319R))의 변이형 DOI 합성효소를 생산, 정제했다. 그 후, 실시예 5와 동일하게 야생형 DOI 합성효소와 각 변이형 DOI 합성효소의 아세이를 실시하고, 활성을 비교한 결과,

변이형 DOI 합성효소(W293R/N14T)의 DOI 합성효소 활성은, 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소의 활성보다도, 1.92배 고활성(도 9),

변이형 DOI 합성효소(W293R/Y37F)의 DOI 합성효소 활성은, 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소의 활성보다도, 1.57배 고활성(도 9),

변이형 DOI 합성효소(W293R/A290T)의 DOI 합성효소 활성은, 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소의 활성보다도, 1.45배 고활성(도 9),

변이형 DOI 합성효소(W293R/H319R)의 DOI 합성효소 활성은, 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소의 활성보다도, 1.83배 고활성(도 9),

이고, 이상 4종의 변이형 DOI 합성효소 유전자는 모두 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소보다도 고활성이었다.

(실시예 7)

＜변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/H319R))를 도입한 형질전환체에 의한 DOI 발효 생산성＞

변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/H319R))의 DNA 단편을 숙주세포(대장균)에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 구축했다. 구체적으로는, pLEX 벡터(Invitrogen)를 주형으로 하고, 서열번호 4로 나타내는 프라이머 3(5'-atggtaccgagctcggatcc-3')과 5'측에 BamHI 제한 효소 사이트를 가지는 서열번호 14로 나타내는 프라이머 13(5'-cgcggatccgagataatttatcaccgcag-3')을 사용하여, PCR 증폭을 실시했다. PCR 증폭에는, KOD 폴리메라아제(TOYOBO)를 사용했다. PCR의 반응 조건은, 94℃에서 2분 유지 후, 94℃에서 30초의 열변성, 50℃에서 30초의 어닐링, 68℃에서 1분의 DNA 신장의 반응을 1사이클로 하여, 30사이클 실시하고, 또한 68℃에서 2분 유지하고, 얻어진 PCR 증폭 산물을 4℃에서 유지했다. 이와 같이 PCR 증폭한 DNA 단편을 페놀/클로로폼으로 처리하고, 원심분리하고, 상청을 에탄올 침전시켜, DNA 단편을 회수했다. 회수한 DNA 단편을 제한 효소 BamHI와 PstI로 소화하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해서 정제·단리하여, 발현 벡터의 DNA 단편을 취득했다.

이어서, 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/H319R))의 DNA 단편을 숙주세포(대장균)에서 발현시키기 위한 프로모터로서, gapA 프로모터를 취득했다. gapA 프로모터는, 구체적으로는 이하와 같이 하여 취득했다. 대장균의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 5'측에 BamHI 제한 효소 사이트를 가지는 서열번호 15로 나타내는 프라이머 14(5'-cgcggatccgcgggaagagtgaggcgagtc-3')와 5'측에 인산기를 부가한 서열번호 16로 나타내는 프라이머 15(5'-atattccaccacctatttg-3')를 사용하고, PCR 증폭을 실시했다. PCR 증폭에는, KOD 폴리메라아제(TOYOBO)를 사용했다. PCR의 반응 조건은, 94℃에서 2분 유지 후, 94℃에서 30초의 열변성, 50℃에서 30초의 어닐링, 68℃에서 1분의 DNA 신장의 반응을 1사이클로 하여, 30사이클 실시하고, 또한 68℃에서 2분 유지하고, 얻어진 PCR 증폭 산물을 4℃에서 유지했다. 이와 같이 PCR 증폭한 DNA 단편을 페놀/클로로폼으로 처리하고, 원심분리하고, 상청을 에탄올 침전시켜, gapA 프로모터의 DNA 단편을 회수했다.

이어서, 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/H319R))를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하고, 5'측에 인산기를 부가한 서열번호 17로 나타내는 프라이머 16(5'-atgacgactaaacaaatttgttttgcgg-3')과 5'측에 PstI 제한 효소 사이트를 가지는 서열번호 18로 나타내는 프라이머 17(5'-aaaactgcagttacagcccttcccggatc-3')을 사용하여, PCR 증폭을 실시했다. PCR 증폭에는, KOD 폴리메라아제(TOYOBO)를 사용했다. PCR의 반응 조건은, 94℃에서 2분 유지 후, 94℃에서 30초의 열변성, 50℃에서 30초의 어닐링, 68℃에서 1분의 DNA 신장의 반응을 1사이클로 하여, 30사이클 실시하고, 또한 68℃에서 2분 유지하고, 얻어진 PCR 증폭 산물을 4℃에서 유지했다. 이와 같이 PCR 증폭한 DNA 단편을 페놀/클로로폼으로 처리하고, 원심분리하고, 상청을 에탄올 침전시켜, 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/H319R))의 DNA 단편을 회수했다.

다음으로, 상기에서 증폭시킨 gapA 프로모터의 DNA 단편과, 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/H319R))의 DNA 단편을, 2×Ligation　mix를 사용하여, 16℃, 30분에 반응시켰다. 이와 같이 하여 얻은 Ligation 산물을 주형으로 하고, 서열번호 15로 나타내는 프라이머 14와 서열번호 18로 나타내는 프라이머 17을 사용하여, PCR 증폭을 실시했다. PCR 증폭에는, KOD 폴리메라아제(TOYOBO)를 사용했다. PCR의 반응 조건은, 94℃에서 2분 유지 후, 94℃에서 30초의 열변성, 50℃에서 30초의 어닐링, 68℃에서 1분의 DNA 신장의 반응을 1사이클로 하여, 30사이클 실시하고, 또한 68℃에서 2분 유지하고, 얻어진 PCR 증폭 산물을 4℃에서 유지했다. 이와 같이 PCR 증폭한 DNA 단편을 페놀/클로로폼으로 처리하고, 원심분리하고, 상청을 에탄올 침전시켜, DNA 단편을 회수했다. 회수한 DNA 단편을 제한 효소 BamHI와 PstI로 소화하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해서 정제·단리하여, 발현 벡터의 DNA 단편을 취득했다. 이 DNA 단편을, 상기한 발현 벡터의 DNA 단편에 연결 삽입하여, 플라스미드 pGAPP-btrC(W293R/H319R)를 얻었다(도 10). 또한, 동일한 방법으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소 유전자가 삽입된 pGAPP-btrC도 얻었다(도 11).

플라스미드 pGAPP-btrC(W293R/H319R) 및 pGAPP-btrC를 정제 단리하고, DOI 합성효소의 기질인 글루코오스-6-인산이 고축적되는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(국제 공개 제2006/109479호 및 Kakinuma 등, Tetrahedron Letters, 2000, vol.41, p.1935에 기재되어 있다)의 컴피던트 셀로 형질전환했다. 형질전환 세포를 2×YT액체배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 엑기스, 100μg/ml 암피실린)가 3ml 들어간 시험관에 식균하고, 30℃에서 24시간 진탕하여, 전배양을 실시했다. 다음으로, 전배양액을 평가 배양용 2×YT액체배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 엑기스, 0.5% NaCl, 5% 글루코오스, 5% 만니톨, 100μg/ml 암피실린)가 50ml씩 들어간 500ml 삼각 배플 플라스크에 탁도 OD600=0.1이 되도록 식균하고, 30℃에서 60시간 진탕하여, 본배양을 실시했다. 본배양 개시 0, 12, 24, 36, 48, 60시간 후의 배양액을 원심분리하여 균체를 제외한 상청 10μl에 대하여, 실시예 2에 있어서의 1차 선발에 있어서의 DOI 농도 측정 조작과 동일한 조작을 실시함으로써, DOI 농도를 HPLC로 결정했다. 또한, 균체의 탁도, 배지 중의 글루코오스 농도, 만니톨 농도도 아울러 측정했다. 균체 탁도는 분광 광도계를 사용하여 600nm에서 흡광도를 측정하고, 글루코오스 농도는 와코준약쿠고우교우(주) 제의 글루코오스 CII-테스트 와코에 따라, 만니톨 농도는, Magazyme사 제의 Mannitol　Assay　Kit에 따라 측정했다.

도 12a에 배지의 탁도의 타임 코스, 도 12b에 배지 중의 글루코오스 농도의 타임 코스, 도 12c에 배지 중의 만니톨 농도의 타임 코스 및 도 12d에 DOI 생산량의 타임 코스를 나타낸다. pGAPP-btrC(W293R/H319R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(도 12a~도 12d중에 있어서의 ▲로 나타내는 데이터 계열)는, pGAPP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(도 12a~도 12d중에 있어서의 ■로 나타내는 데이터 계열)의 약 2배의 DOI 생산 속도를 나타냈다.

(실시예 8)

＜변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(H319R))를 도입한 형질전환체에 의한 DOI 발효 생산성＞

변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(H319R))의 DNA 단편을 숙주세포(대장균)에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 구축했다. 서열번호 1의 아미노산 서열의 야생형 DOI 합성효소 유전자가 삽입된 pGAPP-btrC(도 11)를 주형으로 하고, 서열번호 19로 나타내는 프라이머 18(5'-ttccattatttaatccgcgataacaagagg-3')과 서열번호 20으로 나타내는 프라이머 19(5'-cctcttgttatcgcggattaaataatggaa-3')를 사용하여, PCR 증폭을 실시했다. PCR 증폭에는, KOD 폴리메라아제(TOYOBO)를 사용했다. PCR의 반응 조건은, 94℃에서 2분 유지 후, 98℃에서 15초의 열변성, 55℃에서 30초의 어닐링, 68℃에서 6 분의 DNA 신장의 반응을 1사이클로 하여, 20 사이클 실시하고, 또한 68℃에서 3분 유지하고, 얻어진 PCR 증폭 산물을 4℃에서 유지했다. 이와 같이 PCR 증폭한 DNA 단편을 제한 효소 DpnI로 소화하고, 대장균 DH5α로 형질전환하여, 플라스미드 pGAPP-btrC(H319R)를 얻었다(도 13).

플라스미드 pGAPP-btrC(H319R) 및 pGAPP-btrC를 정제 단리하고, DOI 합성효소의 기질인 글루코오스-6-인산이 고축적되는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(국제 공개 제2006/109479호 및 Kakinuma 등, Tetrahedron Letters, 2000, vol.41, p.1935에 기재되어 있다)의 컴피던트 셀로 형질전환했다. 형질전환 세포를 2×YT액체배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 엑기스, 100μg/ml 암피실린)이 3ml 들어간 시험관에 식균하고, 30℃에서 24시간 진탕하여, 전배양을 실시했다. 다음으로, 전배양액을 평가 배양용 2×YT액체배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 엑기스, 0.5% NaCl, 3% 글루코오스, 4% 만니톨, 100μg/ml 암피실린)가 30ml씩 들어간 200ml 삼각 배플 플라스크에 탁도 OD600=0.1이 되도록 식균하고, 30℃에서 48시간 진탕하여, 본배양을 실시했다. 본배양 개시 0, 12, 24, 36, 48시간 후의 배양액을 원심분리하여 균체를 제외한 상청 10μl에 대하여, 실시예 2에 있어서의 1차 선발에 있어서의 DOI 농도 측정 조작과 동일한 조작을 실시함으로써, DOI 농도를 HPLC로 결정했다. 또한, 균체의 탁도, 배지 중의 글루코오스 농도, 만니톨 농도도 아울러 측정했다. 균체 탁도는 분광 광도계를 사용하여 600nm에서 흡광도를 측정하고, 글루코오스 농도는 와코준약쿠고우교우(주) 제의 글루코오스 CII-테스트 와코에 따라, 만니톨 농도는, Magazyme사 제의 Mannitol　Assay　Kit에 따라 측정했다.

도 14a에 배지의 탁도의 타임 코스, 도 14b에 배지 중의 글루코오스 농도의 타임 코스, 도 14c에 배지 중의 만니톨 농도의 타임 코스 및 도 14d에 DOI 생산량의 타임 코스를 나타낸다. pGAPP-btrC(H319R)를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(도 14a~도 14d 중에 있어서의 ▲로 나타내는 데이터 계열)는, pGAPP-btrC를 포함하는 대장균 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(도 14a~도 14d 중에 있어서의 ■로 나타내는 데이터 계열)의 약 1.2배의 DOI 생산 속도를 나타냈다.

(실시예 9)

＜변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/N14T), (W293R/H319R))를 도입한 형질전환체에 의한 자 퍼멘터(Jar fermentor)에서의 DOI 발효 생산성 평가＞　

자 퍼멘터의 배양에서는 실시예 8과는 상이한 숙주와 발현 벡터를 사용했다.숙주에는 DOI 합성효소 기질인 글루코오스-6-인산이 고축적되는 대장균 MG1655ΔpgiΔzwf주(국제 공개 제2010/053052호에 기재되어 있는, 대장균 MG1655주에 있어서의 pgi 유전자 및 zwf 유전자를 파괴한 주)를 사용했다. 한편, 발현 벡터에 관하여는 이하와 같이 작성했다.

DOI 합성효소 유전자(btrC)를 포함하는 플라스미드 벡터 pGAP-btrC-cscA-glf(국제 공개 제2010/053052호에 기재되어 있는, GADPH 프로모터, 바실러스·서큘런스의 DOI 합성효소 유전자인 btrC, 대장균 O-157주 유래의 스크로오스 가수분해 효소 유전자인 cscA 및 자이모모나스·모빌리스 유래의 글루코오스 수송 촉진 단백질 유전자인 glf의 발현 유닛을 pBR322(Genbank　accession　No.J01749)에 도입한 것)를 주형으로 하고 서열번호 21로 나타내는 프라이머 20(5'-cattacaggcttttaaataaaatcggg-3'), 서열번호 22로 나타내는 프라이머 21(5'-taaaagcctgtaatgggcggacacgtc-3')을 사용하여, PCR 증폭을 실시했다. PCR 증폭에는 PrimeSTAR　Max　DNA　Polymerase(TAKARA)를 사용했다. PCR의 반응 조건은 98℃에서 10초간의 열변성, 55℃에서 15초간의 어닐링, 72℃에서 40초간의 DNA 신장 반응을 1사이클로 하여 30사이클 실시했다. 이와 같이 증폭한 PCR 산물을 대장균 DH5α로 형질전환하고, 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R))를 포함하는 플라스미드 벡터 pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf를 얻었다.(도 15)

변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R))를 포함하는 플라스미드 벡터 pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf를 주형으로 하고 서열번호 23로 나타내는 프라이머 22(5'-tgttttacctttgcattcggcgaacat-3'), 서열번호 24로 나타내는 프라이머 23(5'-tgcaaaggtaaaacaccggtccgcaaa-3')을 사용하여, PCR 증폭을 실시했다. PCR 증폭에는 PrimeSTAR　Max　DNA　Polymerase(TAKARA)를 사용했다. PCR의 반응 조건은 98℃에서 10초간의 열변성, 58℃에서 15초간의 어닐링, 72℃에서 40초간의 DNA 신장 반응을 1사이클로 하여, 30사이클 실시했다. 이와 같이 증폭한 PCR 산물을 대장균 DH5α로 형질전환하고, 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/N14T))를 포함하는 플라스미드 벡터 pGAPP-btrC(W293R/N14T)-cscA-glf를 얻었다.(도 16)

또한, 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R))를 포함하는 플라스미드 벡터 pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf를 주형으로 하고 서열번호 25로 나타내는 프라이머 24(5'-ttaatccgcgataacaagaggggctac-3'), 서열번호 26로 나타내는 프라이머 25(5'-ttatcgcggattaaataatggaagat-3')를 사용하여, PCR 증폭을 실시했다. PCR 증폭에는 PrimeSTAR　Max　DNA　Polymerase(TAKARA)를 사용했다. PCR의 반응 조건은 98℃에서 10초간의 열변성, 54.4℃에서 15초간의 어닐링, 72℃에서 40초간의 DNA 신장 반응을 1사이클로 하여, 30사이클 실시했다. 이와 같이 증폭한 PCR 산물을 대장균 DH5α로 형질전환하고, 변이형 DOI 합성효소 유전자(btrC(W293R/H319R)를 포함하는 플라스미드 벡터 pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf를 얻었다.(도 17)

플라스미드 pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf 및 플라스미드 pGAPP-btrC(W293R/N14T)-cscA-glf, pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf를 Monarch(등록상표)　Plasmid　Miniprep　kit(New　England　Biolabs)를 사용하여 정제 단리하고, DOI 합성효소의 기질인 글루코오스-6-인산이 고축적되는 대장균 MG1655ΔpgiΔzwf주(국제 공개 제2010/053052호에 기재되어 있다)의 컴피던트 셀로 형질전환하고, 암피실린 100μg/ml를 포함하는 LB한천플레이트로 37℃에서 하룻밤 배양함으로써 3 종류의 플라스미드 pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf, pGAPP-btrC(W293R/N14T)-cscA-glf, pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf를 각각 포함하는, 3 종류의 MG1655ΔpgiΔzwf주를 얻었다.

3 종류의 플라스미드 pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf, pGAPP-btrC(W293R/N14T)-cscA-glf, pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf를 각각 포함하는 MG1655ΔpgiΔzwf주에 관하여, 자 퍼멘터를 사용한 DOI 생산성 평가를 실시했다.

전배양으로서 LB배지(1% 하이폴리펩톤N, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% NaCl, 0.01% FeSO₄·7H₂O)가 100g씩 들어간 500ml 삼각 배플 플라스크에 암피실린 100mg/ml를 0.1ml 첨가하고, 3 종류의 플라스미드 pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf, pGAPP-btrC(W293R/N14T)-cscA-glf, pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf를 각각 포함하는 3 종류의 MG1655ΔpgiΔzwf주를, 0.1ml 별개의 상기 삼각 배플 플라스크에 식균하고, 하룻밤 120rpm, 28℃에서 교반배양을 실시했다.

배지 성분 1(0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄, 0.01% FeSO₄·7H₂O, 0.03% 아데카놀) 350g이 들어간 1L 배양조(ABLE사 제조 배양조　BML-01KP3)를 멸균하고, 배지 성분 2(10% (NH₄)₂SO₄, 4.6% NH₄Cl, 4.6% MgSO₄·7H₂O)를 15g, 50% 콘 스팁 리커(corn steep liquor)를 5g, 50% 피틴산을 700μl 첨가하고, 전배양액을 10g 식균하여 배양을 개시했다. 배양 개시와 함께 시약 당액(糖液)(21% Glc, 21% Fru, 1% Xyl)을 0.13g/min의 속도로 30시간 유가(流加)했다. 시약 당액은 글루코오스 용액, 프룩토오스 용액, 자일로오스 용액을 각각 별개로 고압 증기 멸균하고 혼합하여 제작했다.

배양은 대기압 하, 통기량 0.5L/min, 교반속도 800rpm, 배양 온도 30℃, pH 6.0(12.5% 암모니아 용액으로 조정)에서 32시간 실시했다. 배양 개시 0, 8, 24, 27, 32시간 후의 배양액을 원심분리하고, 균체를 없앤 상청을 멸균 증류수로 100배 희석하고, 필터(마이렉스-GV, 0.22μm, PVDF, 4mm)를 사용하여 여과하고, 표 7의 조건에 따라 DOI, 글루코오스, 프룩토오스, 자일로오스 농도의 측정을 HPLC를 사용해서 실시했다.

도 18a에 pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf를 포함하는 MG1655ΔpgiΔzwf주에서의 DOI 생산량(▲), 글루코오스 농도(●), 프룩토오스 농도(◆), 자일로오스 농도(■)의 타임 코스를 나타내고, 도 18b에 pGAPP-btrC(W293R/N14T)-cscA-glf를 포함하는 MG1655ΔpgiΔzwf주에서의 DOI 생산량(▲), 글루코오스 농도(●), 프룩토오스 농도(◆), 자일로오스 농도(■)의 타임 코스를 나타내고, 도 18c에 pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf를 포함하는 MG1655ΔpgiΔzwf주에서의 DOI 생산량(▲), 글루코오스 농도(●), 프룩토오스 농도(◆), 자일로오스 농도(■)의 타임 코스를 나타냈다.

표 6에 3 종류의 플라스미드 pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf, pGAPP-btrC(W293R/N14T)-cscA-glf, pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf를 각각 포함하는 MG1655ΔpgiΔzwf주의 32시간째의 DOI 농도를 나타냈다. 즉, pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf를 포함하는 대장균 MG1655ΔpgiΔzwf주, pGAPP-btrC(W293R/N14T)-cscA-glf를 포함하는 대장균 MG1655ΔpgiΔzwf주, pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf를 포함하는 대장균 MG1655ΔpgiΔzwf주 각각의 32시간 배양을 실시한 후의 DOI 농도를 나타낸 도면이다.

32시간째의 DOI 농도는 pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf를 포함하는 MG1655ΔpgiΔzwf주로 56.6g/L, pGAPP-btrC(W293R/N14T)-cscA-glf를 포함하는 MG1655ΔpgiΔzwf주로 30.6g/L, pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf를 포함하는 MG1655ΔpgiΔzwf주로 70.5g/L가 되었다.

따라서 pGAPP-btrC(W293R/H319R)-cscA-glf를 포함하는 MG1655ΔpgiΔzwf주에서 pGAPP-btrC(W293R)-cscA-glf를 포함하는 MG1655ΔpgiΔzwf주의 약 1.2배의 DOI 생산성을 나타냈다.

2017년 3월 27일에 출원된 일본 특허출원 제2017-061572호의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 또한, 본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격이 참조에 의해 원용되는 것이 구체적이고 개개로 기록된 경우와 동일한 정도로, 본 명세서 중에 참조에 의해 원용된다.

SEQUENCE LISTING <110> Mitsui Chemicals Inc. The Niigata Institute of Science and Technology <120> Mutant 2-Deoxy-Scyllo-Inosose Synthase <130> 2018P00054 <150> JP2017-061572 <151> 2017-03-27 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 368 <212> PRT <213> Bacillus circulans SANK72073 <400> 1 Met Thr Thr Lys Gln Ile Cys Phe Ala Asp Arg Cys Phe Asn Phe Ala 1 5 10 15 Phe Gly Glu His Val Leu Glu Ser Val Glu Ser Tyr Ile Pro Arg Asp 20 25 30 Glu Phe Asp Gln Tyr Ile Met Ile Ser Asp Ser Gly Val Pro Asp Ser 35 40 45 Ile Val His Tyr Ala Ala Glu Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Pro Val His 50 55 60 Ile Leu Arg Phe Gln Gly Gly Glu Glu Tyr Lys Thr Leu Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Asn Leu Gln Glu Arg Ala Ile Ala Leu Gly Ala Asn Arg Arg Thr 85 90 95 Ala Ile Val Ala Val Gly Gly Gly Leu Thr Gly Asn Val Ala Gly Val 100 105 110 Ala Ala Gly Met Met Phe Arg Gly Ile Ala Leu Ile His Val Pro Thr 115 120 125 Thr Phe Leu Ala Ala Ser Asp Ser Val Leu Ser Ile Lys Gln Ala Val 130 135 140 Asn Leu Thr Ser Gly Lys Asn Leu Val Gly Phe Tyr Tyr Pro Pro Arg 145 150 155 160 Phe Val Phe Ala Asp Thr Arg Ile Leu Ser Glu Ser Pro Pro Arg Gln 165 170 175 Val Lys Ala Gly Met Cys Glu Leu Val Lys Asn Met Leu Ile Leu Glu 180 185 190 Asn Asp Asn Lys Glu Phe Thr Glu Asp Asp Leu Asn Ser Ala Asn Val 195 200 205 Tyr Ser Pro Lys Gln Leu Glu Thr Phe Ile Asn Phe Cys Ile Ser Ala 210 215 220 Lys Met Ser Val Leu Ser Glu Asp Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Gly Leu 225 230 235 240 Ile Phe Glu Tyr Gly His Thr Ile Gly His Ala Ile Glu Leu Ala Glu 245 250 255 Gln Gly Gly Ile Thr His Gly Glu Ala Ile Ala Val Gly Met Ile Tyr 260 265 270 Ala Ala Lys Ile Ala Asn Arg Met Asn Leu Met Pro Glu His Asp Val 275 280 285 Ser Ala His Tyr Trp Leu Leu Asn Lys Ile Gly Ala Leu Gln Asp Ile 290 295 300 Pro Leu Lys Ser Asp Pro Asp Ser Ile Phe His Tyr Leu Ile His Asp 305 310 315 320 Asn Lys Arg Gly Tyr Ile Lys Leu Asp Glu Asp Asn Leu Gly Met Ile 325 330 335 Leu Leu Ser Gly Val Gly Lys Pro Ala Met Tyr Asn Gln Thr Leu Leu 340 345 350 Thr Pro Val Arg Lys Thr Leu Ile Lys Glu Val Ile Arg Glu Gly Leu 355 360 365 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 2 acgcgtcgac atgacgacta aacaaatttg 30 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 aaaactgcag ttacagccct tcccgga 27 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 atggtaccga gctcggatcc 20 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 ctagtctaga ctaggagata atttatcacc gcag 34 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 6 ctagtctaga gtcgtttttc tgct 24 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 7 acgcgtcgac ttcgaactcc ttaaatttat ttgaaggc 38 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 8 ggagccaacc gaagaacc 18 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 9 ctagtctaga gtcgtttttc tgct 24 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 10 acctgatgcc cgaacatg 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 11 agatcgaatc cgggtccg 18 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 12 cgcggatcca tgacgactaa acaaattt 28 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 13 cccaagcttt tacagccctt ccccgatc 28 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 14 cgcggatccg agataattta tcaccgcag 29 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 15 cgcggatccg cgggaagagt gaggcgagtc 30 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 16 atattccacc acctatttg 19 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 17 atgacgacta aacaaatttg ttttgcgg 28 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 18 aaaactgcag ttacagccct tcccggatc 29 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 19 ttccattatt taatccgcga taacaagagg 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 20 cctcttgtta tcgcggatta aataatggaa 30 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 21 cattacaggc ttttaaataa aatcggg 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 22 taaaagcctg taatgggcgg acacgtc 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 23 tgttttacct ttgcattcgg cgaacat 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 24 tgcaaaggta aaacaccggt ccgcaaa 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 25 ttaatccgcg ataacaagag gggctac 27 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 26 ttatcgcgga ttaaataatg gaagat 26

Claims

하기 (A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열에 있어서, 하기 (a)~(e) 중 적어도 1개의 아미노산 변이를 가지는 폴리펩타이드.
(A1) 서열번호 1의 아미노산 서열
(A2) 글루코오스-6-인산으로부터 2-데옥시-실로-이노소스를 생성하는 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드의 아미노산 서열로서, 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 14번째의 아스파라긴 잔기에 얼라인먼트상 대응되는 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환되는 아미노산 변이
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 37번째의 티로신 잔기에 얼라인먼트상 대응되는 아미노산 잔기가 페닐알라닌으로 치환되는 아미노산 변이
(c) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 290번째의 알라닌 잔기에 얼라인먼트상 대응되는 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환되는 아미노산 변이
(d) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 293번째의 트립토판 잔기에 얼라인먼트상 대응되는 아미노산 잔기가 아르기닌으로 치환되는 아미노산 변이
(e) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 N말단으로부터 319번째의 히스티딘 잔기에 얼라인먼트상 대응되는 아미노산 잔기가 아르기닌으로 치환되는 아미노산 변이
청구항 1에 있어서,
상기 (A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열에 있어서, 상기 (d) 및 상기 (e)의 아미노산 변이 중 적어도 1개를 가지는, 폴리펩타이드.
청구항 1에 있어서,
상기 (A1) 또는 (A2)의 아미노산 서열에 있어서,
상기 (d)의 아미노산 변이와, 상기 (a), (b), (c) 및 (e)로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 변이를 가지는, 폴리펩타이드.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드가 가지는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 가지는, 폴리뉴클레오타이드.
청구항 4에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드의 상류에 연결된 프로모터 서열, 및 상기 폴리뉴클레오타이드의 하류에 연결된 터미네이터 서열을 포함하는 발현 카세트.
청구항 5에 기재된 발현 카세트를 함유하는 벡터.
청구항 6에 기재된 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
청구항 7에 기재된 형질전환체를 배양하는 것을 포함하는, 글루코오스-6-인산으로부터 2-데옥시-실로-이노소스를 생성하는 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드의 제조 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드, 청구항 7에 기재된 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 형질전환체 혹은 상기 배양물의 처리물을 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산과 접촉시킴으로써, 글루코오스 또는 글루코오스-6-인산을 2-데옥시-실로-이노소스로 변환하는 것을 포함하는, 2-데옥시-실로-이노소스의 제조 방법.