JPWO2011052482A1 - イソプロピルアルコール生産細菌及びイソプロピルアルコール生産方法 - Google Patents
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Abstract
グルコース−6−リン酸イソメラーゼ活性が不活化されると共にイソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌と、このイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
Description
本発明は、イソプロピルアルコール生産細菌及びこれを用いたイソプロピルアルコール生産方法に関する。
プロピレンは、ポリプロピレンなどの合成樹脂や石油化学製品の重要な基礎原料であり、自動車用バンパーや食品容器、フィルム、医療機器などに幅広く使われている。
植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。京都議定書によって2008年から2012年の間に先進国全体で二酸化炭素排出量を1990年比で5%削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。
植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。京都議定書によって2008年から2012年の間に先進国全体で二酸化炭素排出量を1990年比で5%削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。
植物由来原料を資化してイソプロピルアルコールを生産する細菌は既に知られている。例えば国際公開2009/008377号パンフレットには、グルコースを原料としてイソプロピルアルコールを高生産するように改変された細菌が開示されており、イソプロピルアルコールの工業生産用生体触媒として優れていると記載されている。しかしながら、該大腸菌によって得られる生成物にはイソプロピルアルコールの他にアセトンが含まれているため、プロピレンの原料として用いるためには生成物からアセトンを分離して除去するか、生成物中のアセトンをイソプロピルアルコールへ変換する必要があった。
副生したアセトンをイソプロピルアルコールに変換するプロセスとしては、ラネーニッケル触媒等を用いてアセトンと水素を反応させてイソプロピルアルコールを得る方法が提案されている(例えば、特開平2−174737号公報参照)。しかし、アセトン含量が多いと水添のための水素の使用量が増えることとなり、コスト上問題であった。
このため、イソプロピルアルコール生産大腸菌によって得られる生成物中のアセトン含量を下げ、イソプロピルアルコールの純度を向上させることが強く望まれていた。
一方、微生物による物質生産の収率を上げる方法としては、微生物がグルコースを分解する代謝経路(解糖系)を構成する主要な酵素を不活化する方法が知られている。例えば、特表2007−510411号公報には、キノンオキシドレダクターゼと可溶性トランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に加えて、解糖系の主要酵素であるグルコース−6−リン酸イソメラーゼ(ホスホグルコースイソメラーゼ)をコードする遺伝子を欠失させて、エチル−3−ヒドロキシブチラートを生産する細菌が開示されている。
また、特表2003−520583号公報には、グルコース−6−リン酸イソメラーゼの活性を減少させた酵母と、この酵素遺伝子を完全に欠失させた酵母とを比較して、酵母でポリオールを生産させる際に、グルコース−6−リン酸イソメラーゼの活性を維持することが生産性の向上に必要であり、酵素活性を欠失させると生産性向上の効果がなくなると記載されている。
更に、2−デオキシ−シロ−イノソース(DOI)生成酵素を導入したDOI生産大腸菌のグルコース−6−リン酸イソメラーゼ遺伝子を破壊すると、DOIの収率が向上することが報告されている(例えば、Journal of Biotechnology.,129,pp.502−509,(2007)参照)。
また、特表2003−520583号公報には、グルコース−6−リン酸イソメラーゼの活性を減少させた酵母と、この酵素遺伝子を完全に欠失させた酵母とを比較して、酵母でポリオールを生産させる際に、グルコース−6−リン酸イソメラーゼの活性を維持することが生産性の向上に必要であり、酵素活性を欠失させると生産性向上の効果がなくなると記載されている。
更に、2−デオキシ−シロ−イノソース(DOI)生成酵素を導入したDOI生産大腸菌のグルコース−6−リン酸イソメラーゼ遺伝子を破壊すると、DOIの収率が向上することが報告されている(例えば、Journal of Biotechnology.,129,pp.502−509,(2007)参照)。
上記のように、イソプロピルアルコール生産大腸菌によって得られる生成物中のアセトン含量を下げ、イソプロピルアルコールの純度を向上させることは、解決すべき大きな課題であった。
本発明は、イソプロピルアルコールを高い純度で生産するために有用なイソプロピルアルコール生産大腸菌及びイソプロピルアルコール生産方法を提供することを目的とする。
本発明は、イソプロピルアルコールを高い純度で生産するために有用なイソプロピルアルコール生産大腸菌及びイソプロピルアルコール生産方法を提供することを目的とする。
本発明は上記状況を鑑みてなされたものであり、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌及びイソプロピルアルコール生産方法は、以下のとおりである。
〔1〕 グルコース−6−リン酸イソメラーゼ活性が不活化されると共にイソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔2〕 さらに、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ活性が強化されている〔1〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔3〕 前記イソプロピルアルコール生産大腸菌が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与された大腸菌である〔1〕又は〔2〕のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔4〕 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも1種由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔3〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔5〕 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が、クロストリジウム属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔3〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔6〕 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔3〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔7〕 さらに、スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有する〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔8〕 〔1〕〜〔7〕に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
〔2〕 さらに、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ活性が強化されている〔1〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔3〕 前記イソプロピルアルコール生産大腸菌が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与された大腸菌である〔1〕又は〔2〕のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔4〕 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも1種由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔3〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔5〕 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が、クロストリジウム属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔3〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔6〕 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔3〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔7〕 さらに、スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有する〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔8〕 〔1〕〜〔7〕に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ活性が不活化されると共にイソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌である。
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌では、大腸菌が本来有するグルコース−6−リン酸イソメラーゼの活性が不活化されているので、副生物であるアセトンの生成が低減されて、イソプロピルアルコールを高い純度で生産することができる。
即ち本発明は、グルコースを分解してイソプロピルアルコールに変換する代謝経路のうち、グルコース分解(解糖系)の主要酵素の一つであるグルコース−6−リン酸イソメラーゼ活性を不活化することによって、該大腸菌による生成物のイソプロピルアルコールの純度が向上することを見出したものである。グルコース−6−リン酸イソメラーゼは解糖系の主要酵素であり、該酵素をコードする遺伝子を不活性化することがイソプロピルアルコールの生産性に関与することを明らかにした知見は、現在までに一切見られない。更に、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ活性の不活化が、イソプロピルアルコールの生産において副生物であるアセトンの蓄積量を低減させる効果を明らかにした知見も一切ない。よって、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ活性の不活化により生産物中のイソプロピルアルコール純度が向上することは、全く予想外であった。
なお、本発明における「不活化」とは、既存のあらゆる測定系によっても測定された当該酵素の活性が検出限界以下である状態を指す。
本発明における「遺伝子組み換えにより」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のDNAの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
本発明における「遺伝子組み換えにより」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のDNAの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
本発明における「活性」又は「能力」の「付与」又は「強化」とは、酵素をコードする遺伝子を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することの他に、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化すること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子の発現を強化させたものを含む。
なお、本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
以下に、本発明について説明する。
なお、本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
以下に、本発明について説明する。
本発明におけるグルコース−6−リン酸イソメラーゼとは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号5.3.1.9に分類され、D−グルコース−6−リン酸からD−フルクトース−6−リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
本発明において酵素の活性が不活化された大腸菌とは、上記の活性を付与した細菌と同様に、菌体外から菌体内への何らかの方法によって、生来の活性が損なわれた細菌を指す。これらの細菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を破壊すること(遺伝子破壊)により作出することができる。
本発明における遺伝子破壊とは、ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変異を入れる、別のDNAを挿入する、あるいは、遺伝子のある部分を欠失させることを示している。遺伝子破壊の結果、例えばその遺伝子がmRNAへ転写できなくなり、構造遺伝子が翻訳されない、あるいは、転写されたmRNAが不完全なため、翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じ、本来の機能の発揮が不可能になる。
遺伝子破壊株の作製は、当該酵素又は蛋白質が発現しない破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能である。遺伝子破壊の方法は種々の方法(自然育種、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射、ランダム突然変異、トランスポゾン、部位特異的遺伝子破壊)が報告されているが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同組換えによる遺伝子破壊が好ましい。相同組換えによる手法はJ.Bacteriol.,161,1219-1221(1985)やJ.Bacteriol.,177,1511-1519(1995)やProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,97,6640-6645(2000)に記載されており、これらの方法及びその応用によって同業技術者であれば容易に実施可能である。
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコール生産系を備えた大腸菌であり、遺伝子組み換えにより導入又は改変されたイソプロピルアルコール生産能力を保有する大腸菌をいう。このようなイソプロピルアルコール生産系は、対象となる大腸菌にイソプロピルアルコールを生産させるものであればいずれのものであってもよい。
好ましくは、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性の付与を挙げることができる。本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の4種類の酵素活性が付与されていることが更に好ましい。
好ましくは、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性の付与を挙げることができる。本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の4種類の酵素活性が付与されていることが更に好ましい。
本発明におけるアセト酢酸デカルボキシラーゼとは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号4.1.1.4に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ(Bacillus polymyxa)等のバチルス属細菌由来のものが挙げられる。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ(Bacillus polymyxa)等のバチルス属細菌由来のものが挙げられる。
本発明の宿主細菌に導入されるアセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はバチルス属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、バチルス・ポリミクサ由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
本発明におけるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号1.1.1.80に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。
本発明の宿主細菌に導入されるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
本発明におけるCoAトランスフェラーゼとは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号2.8.3.8に分類され、アセトアセチルCoAからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス(Roseburia intestinalis)等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ(Faecalibacterium prausnitzii)等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス(Coprococcus)属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli:大腸菌)等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス(Roseburia intestinalis)等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ(Faecalibacterium prausnitzii)等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス(Coprococcus)属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli:大腸菌)等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
本発明の宿主細菌に導入されるCoAトランスフェラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるCoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ等のファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
本発明におけるチオラーゼとは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号2.3.1.9に分類され、アセチルCoAからアセトアセチルCoAを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種(Halobacterium sp.)細菌、ズーグロア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)等のズーグロア属細菌、、リゾビウム種(Rhizobium sp.)細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium japonicum)等のブラディリゾビウム属細菌、、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス(Streptomyces collinus)等のストレプトマイセス属細菌、、エンテロコッカス・ファカリス(Enterococcus faecalis)等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種(Halobacterium sp.)細菌、ズーグロア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)等のズーグロア属細菌、、リゾビウム種(Rhizobium sp.)細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium japonicum)等のブラディリゾビウム属細菌、、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス(Streptomyces collinus)等のストレプトマイセス属細菌、、エンテロコッカス・ファカリス(Enterococcus faecalis)等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。
本発明の宿主細菌に導入されるチオラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種の細菌、ズーグロア・ラミゲラ等のズーグロア属細菌、リゾビウム種の細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス等のエンテロコッカス属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
このうち、上記4種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも1種由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、なかでも、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム属細菌由来であり、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア属細菌由来である場合と、これら4種類の酵素がいずれもクロストリジム属細菌由来である場合が更に好ましい。
なかでも本発明にかかる4種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジュリンキ又はエシェリヒア・コリのいずれか由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、アセト酢酸デカルボキシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素であり、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼが、それぞれクロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の酵素であり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼが、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素であることがより好ましく、上記4種類の酵素は、酵素活性の観点から、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来であり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来であり、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来であることが特に好ましい。
本発明においてイソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性が増強され、イソプロピルアルコールを生産する大腸菌の例として、WO2009/008377号に記載のpIPA/B株又はpIaaa/B株を例示できる。
本発明における遺伝子のプロモーターとは、上記いずれかの遺伝子の発現を制御可能なものであればよいが、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターであり、具体的にはグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターを例示することができる。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するRNAポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のGAPDHプロモーターはGenBank accession number X02662の塩基配列情報において、塩基番号397−440に記されている。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するRNAポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のGAPDHプロモーターはGenBank accession number X02662の塩基配列情報において、塩基番号397−440に記されている。
大腸菌由来のCoAトランスフェラーゼ遺伝子(atoD及びatoA)とチオラーゼ遺伝子(atoB)は、atoD、atoA、atoBの順番で大腸菌ゲノム上でオペロンを形成しているため(Journal of Baceteriology Vol.169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkinsら)、atoDのプロモーターを改変することによって、CoAトランスフェラーゼ遺伝子とチオラーゼ遺伝子の発現を同時に制御することが可能である。
このことから、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が宿主大腸菌のゲノム遺伝子より得られたものである場合、充分なイソプロピルアルコール生産能力を獲得する観点から、両酵素遺伝子の発現を担うプロモーターを他のプロモーターと置換する等によって両酵素遺伝子の発現を強化することが好ましい。CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性を強化するために用いられるプロモーターとしては、前述のエシェリヒア・コリ由来GAPDHプロモーター等を挙げることができる。
このことから、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が宿主大腸菌のゲノム遺伝子より得られたものである場合、充分なイソプロピルアルコール生産能力を獲得する観点から、両酵素遺伝子の発現を担うプロモーターを他のプロモーターと置換する等によって両酵素遺伝子の発現を強化することが好ましい。CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性を強化するために用いられるプロモーターとしては、前述のエシェリヒア・コリ由来GAPDHプロモーター等を挙げることができる。
また、本発明におけるグルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)とは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号1.1.1.49に分類され、D−グルコース−6−リン酸からD−グルコノ−1,5−ラクトン−6−リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、Deinococcus radiophilus等のDeinococcus属菌、Aspergillus niger、Aspergillus aculeatus等のAspergillus属菌 、Acetobacter hansenii等のAcetobacter属菌、Thermotoga maritima等のThermotoga属菌、Cryptococcus neoformans等のCryptococcus属菌、Dictyostelium discoideum等のDictyostelium属菌、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa等のPseudomonas属、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属、Bacillus megaterium等のBacillus属菌、Escherichia coli等のEscherichia属菌由来のものが挙げられる。
そのようなものとしては、例えば、Deinococcus radiophilus等のDeinococcus属菌、Aspergillus niger、Aspergillus aculeatus等のAspergillus属菌 、Acetobacter hansenii等のAcetobacter属菌、Thermotoga maritima等のThermotoga属菌、Cryptococcus neoformans等のCryptococcus属菌、Dictyostelium discoideum等のDictyostelium属菌、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa等のPseudomonas属、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属、Bacillus megaterium等のBacillus属菌、Escherichia coli等のEscherichia属菌由来のものが挙げられる。
本発明において用いられるグルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)の遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、Deinococcus radiophilus等のDeinococcus属菌、Aspergillus niger、Aspergillus aculeatus等のAspergillus属菌 、Acetobacter hansenii等のAcetobacter属菌、Thermotoga maritima等のThermotoga属菌、Cryptococcus neoformans等のCryptococcus属菌、Dictyostelium discoideum等のDictyostelium属菌、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa等のPseudomonas属、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属、Bacillus megaterium等のBacillus属菌、Escherichia coli等のEscherichia属菌由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。より好適なものとしては、Deinococcus属菌、Aspergillus属菌 、Acetobacter属菌、Thermotoga属菌、Pseudomonas属、Bacillus属菌、Escherichia属などの原核生物に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、Escherichia coli由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
本発明おけるこれらの酵素の活性は、菌体外から菌体内へ導入されたもの又は、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものとすることができる。
本発明におけるスクロース非PTSとは、微生物がスクロースを資化するメカニズムの一つを指す。従来の知見によれば微生物がスクロースを資化するメカニズムは、スクロースPTS(Phosphoenolpyruvate: Carbohydrate Phosphotransferase System)とスクロース非PTSの2つに大別される(特開2001−346578号公報を参照)。スクロース非PTSはcscB(スクロースの取り込みを行う)、cscA(微生物内部でスクロースの分解を行う)、cscK(フルクトースのリン酸化を行う),cscR(cscB,A,Kの発現を制御する)の4つの因子から構成されていることが知られている。また、スクロースPTSはscrA(スクロースの取り込みを行う)、scrY(スクロースのリン酸化を行う)、scrB(微生物内部でスクロースの分解を行う)、scrR(scrA,Y,Bの発現を制御する)、scrK(フルクトースのリン酸化を行う)の5つの因子から構成されていることが知られている。
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、スクロース非PTS遺伝子群のうち、スクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有することが好ましい。これにより、スクロースを資化できない大腸菌にスクロースを資化する能力が付与される。この結果、サトウキビや甜菜などを原料に使用することができ、安価で大量供給可能なスクロースからイソプロピルアルコールを得ることができる。
特に、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、スクロースの分解産物であるグルコースとフルクトースをほぼ同時に資化して、イソプロピルアルコールを生産することができるのでより効率的である。なお、スクロース資化能を本来は備えていない大腸菌としては、K12株、B株、C株及びその由来株等を挙げることができる。
特に、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、スクロースの分解産物であるグルコースとフルクトースをほぼ同時に資化して、イソプロピルアルコールを生産することができるのでより効率的である。なお、スクロース資化能を本来は備えていない大腸菌としては、K12株、B株、C株及びその由来株等を挙げることができる。
本発明におけるスクロース非PTS遺伝子群とは、微生物のスクロース資化経路のうち非PTS系に関与する遺伝子群のことをいう。詳しくは、リプレッサー蛋白質(cscR)、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)、スクロース透過酵素(cscB)で構成される遺伝子群である。なかでも、スクロースを効率的に利用するために、cscAをコードする遺伝子のみを有し、その他の遺伝子を含まないことが好ましい。
本発明におけるスクロース加水分解酵素(インベルターゼ、CscA)とは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号3.2.1.26に分類され、スクロースからD−グルコースとD−フルクトースを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
この酵素は、K12株及びB株等の大腸菌には本来保有されていない酵素であり、スクロース透過酵素、スクロース加水分解酵素、フルクトキナーゼ及びスクロース特異的リプレッサーを含む非PTS代謝経路の酵素の1つである(Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol.45, pp418-422参照)。本発明においてこのCscAを付与することにより、特にCscAのみを付与することにより、菌体外におけるスクロースをおそらく細胞膜の近くでグルコース及びフルクトースに分解して細胞外へ放出し、グルコースPTS及びフルクトースPTSを介して細胞質内にリン酸化して取り込む。この結果、フルクトースを細菌におけるフルクトース代謝系へ供給して、解糖系を利用した資化が可能となる。
この酵素は、K12株及びB株等の大腸菌には本来保有されていない酵素であり、スクロース透過酵素、スクロース加水分解酵素、フルクトキナーゼ及びスクロース特異的リプレッサーを含む非PTS代謝経路の酵素の1つである(Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol.45, pp418-422参照)。本発明においてこのCscAを付与することにより、特にCscAのみを付与することにより、菌体外におけるスクロースをおそらく細胞膜の近くでグルコース及びフルクトースに分解して細胞外へ放出し、グルコースPTS及びフルクトースPTSを介して細胞質内にリン酸化して取り込む。この結果、フルクトースを細菌におけるフルクトース代謝系へ供給して、解糖系を利用した資化が可能となる。
本発明の宿主細菌に導入されるスクロース加水分解酵素(インベルターゼ、CscA)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるスクロース加水分解酵素(インベルターゼ、CscA)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。またcscAには、cscAを菌体のペリプラズムへ移行させるためのシグナル配列が付加されていることが好ましい。
本発明の宿主細菌に導入されるリプレッサー蛋白質(CscR)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるリプレッサータンパク質(CscR)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
本発明の宿主細菌に導入されるフルクトキナーゼ(CscK)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトキナーゼ(CscK)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
本発明の宿主細菌に導入される、スクロース透過酵素(CscB)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られる、スクロース透過酵素(CscB)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
本発明においてスクロース資化とは、スクロースを、そのまま、低分子化または高分子化して、好ましくは低分子化して、生体内に取り入れる能力、あるいは代謝的に別物質に変換する能力をいう。また、本発明において、資化とはスクロースをより低分子化する分解を含む。詳しくは、スクロースをD−グルコースとD−フルクトースに分解することを含む。
酵素活性の導入は、例えばそれら4種類の酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することにより行うことができる。このとき、導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれであってもよい。菌体外から菌体内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムDNAの調製、DNAの切断及び連結、形質転換、PCR(Polymerase Chain Reaction)、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook, J., et al., ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)などに記載されている。
本発明において酵素の活性を付与した大腸菌とは、菌体外から菌体内へ何らかの方法によって該酵素活性が与えられた大腸菌を指す。これらの大腸菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を、前述したものと同様の遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内に導入する等の方法を用いて作出することができる。
本発明において酵素の活性を強化した大腸菌とは、何らかの方法によって該酵素活性が強化された大腸菌を指す。これらの大腸菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を、前述したものと同様の遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内にプラスミドを用いて導入する又は、宿主大腸菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させる、等の方法を用いて作出することができる。
本発明において大腸菌とは、本来、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有し得る大腸菌を意味する。
ここで上記の各遺伝子の導入対象となる大腸菌としては、イソプロピルアルコール生産能を有しないものであってもよく、上記の各遺伝子の導入及び変更が可能であればいずれの大腸菌であってもよい。
より好ましくは、イソプロピルアルコール生産能が予め付与された大腸菌であることができ、これにより、より効率よくイソプロピルアルコールを生産させることができる。
より好ましくは、イソプロピルアルコール生産能が予め付与された大腸菌であることができ、これにより、より効率よくイソプロピルアルコールを生産させることができる。
このようなイソプロピルアルコール生産大腸菌としては、例えば国際公開2009/008377号パンフレットに記載されているアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成大腸菌などを挙げることができる。
本発明のイソプロピルアルコール生産方法は、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産させることを含むものであり、即ち、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、培養する工程と、接触により得られたイソプロピルアルコールを回収する回収工程とを含むものである。
上記イソプロピルアルコール生産方法に用いられる植物由来原料は、植物から得られる炭素源であり、植物由来原料であれば特に制限されない。本発明においては、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。
このような植物由来原料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、またはこれら成分を多く含む草木質分解産物、セルロース加水分解物など又はこれらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。
本発明における植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、又はこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。
培養工程におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料との接触は、一般に、植物由来原料を含む培地でイソプロピルアルコール生産大腸菌を培養することにより行われる。
植物由来原料とイソプロピルアルコール生産大腸菌との接触密度は、イソプロピルアルコール生産大腸菌の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来原料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して20質量%以下とすることができ、大腸菌の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を15質量%以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。
また培地中のイソプロピルアルコール生産大腸菌の含有量としては、大腸菌の種類及び活性によって異なるが一般に、培養開始時に投入する前培養の菌液の量を培養液に対して0.1質量%〜30質量%、培養条件制御の観点から好ましくは1質量%〜10質量%とすることができる。
イソプロピルアルコール生産大腸菌の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及びイソプロピルアルコールを生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた通常用いられる培地であれば特に制限はない。
本発明の培養に際して、培養条件は特別の制限はなく、例えば好気条件下でpH4〜9、好ましくはpH6〜8、温度20℃〜50℃、好ましくは25℃〜42℃の範囲内でpHと温度を適切に制御しながら培養することができる。
前記混合物中への気体の通気量は、特に制限はないが、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に0.02vvm〜2.0vvm(vvm;通気容量〔mL〕/液容量〔mL〕/時間〔分〕)であり、大腸菌への物理的ダメージを抑制する観点から0.1vvm〜1.5vvmで行うことが好ましい。
培養工程は、培養開始から混合物中の植物由来原料が消費されるまで、又はイソプロピルアルコール生産大腸菌の活性がなくなるまで継続させることができる。培養工程の期間は、混合物中のイソプロピルアルコール生産大腸菌の数及び活性並びに、植物由来原料の量により異なるが、一般に、1時間以上、好ましくは4時間以上であればよい。一方、植物由来原料又はイソプロピルアルコール生産大腸菌の再投入を行うことによって、培養期間は無制限に連続することができるが、処理効率の観点から、一般に5日間以下、好ましくは55時間以下とすることができる。その他の条件は、通常の培養に用いられる条件をそのまま適用すればよい。
培養液中に蓄積したイソプロピルアルコールを回収する方法としては、特に制限はないが、例えば培養液から菌体を遠心分離などで除去した後、蒸留や膜分離等通常の分離方法でイソプロピルアルコールを分離する方法が採用できる。
なお、本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、イソプロピルアルコール生産のための培養工程の前に、使用するイソプロピルアルコール生産大腸菌を適切な菌数又は適度な活性状態とするための前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程は、イソプロピルアルコール生産細菌の種類に応じた通常用いられる培養条件による培養であればよい。
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、好ましくは、前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、該イソプロピルアルコール生産大腸菌を培養する培養工程と、前記培養により生成したイソプロピルアルコールを混合物から分離し回収する回収工程とを含む。
この方法によれば、混合物に気体を供給しながら生産大腸菌を培養する(通気培養)。この通気培養により、生産されたイソプロピルアルコールは混合物中に放出されると共に、混合物から蒸散し、この結果、生成したイソプロピルアルコールを混合物から容易に分離することができる。また、生成したイソプロピルアルコールが混合物から連続的に分離するため、混合物中のイソプロピルアルコールの濃度の上昇を抑制することができる。これにより、イソプロピルアルコール生産大腸菌のイソプロピルアルコールに対する耐性を特に考慮する必要がない。
なお、本方法における混合物とは、大腸菌の培養に一般的に用いられる基本培地を主体とすればよい。培養条件については、前述した事項がそのまま適用される。
なお、本方法における混合物とは、大腸菌の培養に一般的に用いられる基本培地を主体とすればよい。培養条件については、前述した事項がそのまま適用される。
回収工程では、培養工程で生成され、混合物から分離したイソプロピルアルコールを回収する。この回収方法としては、通常培養により混合物から蒸散したガス状又は飛沫状のイソプロピルアルコールを収集することができるものであればよい。このような方法としては、一般に用いられる密閉容器等の収集部材へ収容すること等を挙げることができるが、なかでも、イソプロピルアルコールのみを純度高く回収できる観点から、イソプロピルアルコールを捕捉するための捕捉液と、混合物から分離したイソプロピルアルコールとを接触することを含むものであることが好ましい。
本方法では、イソプロピルアルコールは、捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収することができる。そのような回収方法としては、例えば国際公開2009/008377号パンフレットに記載された方法などが挙げられる。回収されたイソプロピルアルコールは、HPLC等の通常の検出手段を用いて確認することができる。回収されたイソプロピルアルコールは、必要に応じて更に精製することができる。このような精製方法としては、蒸留等をあげることができる。
回収されたイソプロピルアルコールが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコールの生産方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコールの脱水は、常法により行なうことができる。
回収されたイソプロピルアルコールが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコールの生産方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコールの脱水は、常法により行なうことができる。
捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収可能なイソプロピルアルコールの生産方法に適用可能な装置としては、例えば、国際公開2009/008377号パンフレットの図1に示される生産装置を挙げることができる。
この生産装置では、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。
また、培養槽には、連結管を介して、捕捉液としてのトラップ液が収容されたトラップ槽が連結されている。このとき、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じる。
これにより、培養槽で通気培養により生成したイソプロピルアルコールは、エアレーションによって蒸散して培地から容易に分離される共に、トラップ槽においてトラップ液に捕捉される。この結果、イソプロピルアルコールを、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。
この生産装置では、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。
また、培養槽には、連結管を介して、捕捉液としてのトラップ液が収容されたトラップ槽が連結されている。このとき、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じる。
これにより、培養槽で通気培養により生成したイソプロピルアルコールは、エアレーションによって蒸散して培地から容易に分離される共に、トラップ槽においてトラップ液に捕捉される。この結果、イソプロピルアルコールを、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法では、イソプロピルアルコールを高い純度で生成することができ、同様の方法で通常得られる副生物、例えばアセトンの含有率は、本発明を適用しない場合と比較して低い。生産方法の条件や用いられるイソプロピルアルコール生産大腸菌の状態によって異なるが、培養工程終了時において大腸菌の代謝経路を用いて菌体内から菌体外へ放出された全生成物(気体及び水を除く)におけるイソプロピルアルコールの割合は、65質量%〜100質量%、好ましくは80質量%〜100質量%とすることができる。又は、培養工程終了時における副生アセトンとイソプロピルアルコールの生成量の比は、イソプロピルアルコールの生成量(g/L)を1としたときの副生アセトンの生成量(g/L)を0〜0.4、好ましくは0〜0.2とすることができる。
このように本発明のイソプロピルアルコール生産方法により得られた生成物は、アセトンなどの副生物のイソプロピルアルコールに対する割合が低いため、例えば、固体酸物質および水添触媒の存在下で、植物由来原料からイソプロピルアルコール生産細菌により生産されたアセトンを含むイソプロピルアルコールからプロピレンを製造した場合、アセトンの水添に使用する水素量を少なくすることができる。
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、記載中の「%」は特に断らない限り、質量基準である。
[実施例1]
<エシェリヒア・コリB株Δpgi株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ(以下pgiと呼ぶことがある)をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている(GenBank accession number X15196)。pgiをコードする遺伝子(1,650bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、caggaattcgctatatctggctctgcacg(配列番号1)、cagtctagagcaatactcttctgattttgag(配列番号2)、cagtctagatcatcgtcgatatgtaggcc(配列番号3)及びgacctgcagatcatccgtcagctgtacgc(配列番号4)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号1のプライマーは5’末端側にEcoRI認識部位を、配列番号2および3のプライマーは5’末端側にXbaI認識部位を、配列番号4のプライマーは5’末端側にPstI認識部位をそれぞれ有している。
[実施例1]
<エシェリヒア・コリB株Δpgi株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ(以下pgiと呼ぶことがある)をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている(GenBank accession number X15196)。pgiをコードする遺伝子(1,650bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、caggaattcgctatatctggctctgcacg(配列番号1)、cagtctagagcaatactcttctgattttgag(配列番号2)、cagtctagatcatcgtcgatatgtaggcc(配列番号3)及びgacctgcagatcatccgtcagctgtacgc(配列番号4)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号1のプライマーは5’末端側にEcoRI認識部位を、配列番号2および3のプライマーは5’末端側にXbaI認識部位を、配列番号4のプライマーは5’末端側にPstI認識部位をそれぞれ有している。
エシェリヒア・コリMG1655株(ATCC700926)のゲノムDNAを調製し、得られたゲノムDNAを鋳型とし、配列番号1と配列番号2のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下pgi−L断片と呼ぶことがある)。また、配列番号3と配列番号4のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下pgi−R断片と呼ぶことがある)。これらのDNA断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、pgi−L断片をEcoRI及びXbaIで、pgi−R断片をXbaI及びPstIでそれぞれ消化した。この消化断片2種と、温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)のEcoRI及びPstI消化物とを混合し、T4DNAリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績社製)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、pgiをコードする遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の2つの断片がpTH18cs1に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをXbaIで消化した後、T4DNAポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本DNA断片と、pUC4Kプラスミド(GenBank accession number X06404)(Pharmacia)をEcoRIで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにT4DNAポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったDNA断片とをT4DNAリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlとカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、pgiをコードする遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の間にカナマイシン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認した。
こうして得られたプラスミドをエシェリヒア・コリB株(ATCC11303)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlとカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むLB寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRにより、pgi遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約3.3kbp断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をB株pgi遺伝子欠失株(以下△pgi株と略することがある)と命名した。
なおエシェリヒア・コリMG1655株およびエシェリヒア・コリB株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
[実施例2]
<エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来CoAトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリのチオラーゼおよびエシェリヒア・コリのCoAトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼをコードする遺伝子はGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2324131〜2325315に記載されている。またCoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子は上記エシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469〜2322781に記載されている。これらと共に、後述するクロストリジウム属細菌由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させることでイソプロピルアルコールの生産が可能である。上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
<エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来CoAトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリのチオラーゼおよびエシェリヒア・コリのCoAトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼをコードする遺伝子はGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2324131〜2325315に記載されている。またCoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子は上記エシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469〜2322781に記載されている。これらと共に、後述するクロストリジウム属細菌由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させることでイソプロピルアルコールの生産が可能である。上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgagctacatatgcaatgattgacacgattccg(配列番号5)、及びcgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg(配列番号6)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素NdeI、SphIで消化することで約110bpのGAPDHプロモーターにあたるDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpBR322(GenBank accession number J01749)を制限酵素NdeI及びSphIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpBRgapPを回収した。
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium beijerinckii NRRL B−593のゲノムDNAをテンプレートに用いて、aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(配列番号7)、及びgcggatccggtaccttataatataactactgctttaattaagtc(配列番号8)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素SphI、BamHIで消化することで約1.1kbpのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpBRgapPを制限酵素SphI及びBamHIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP-IPAdhを回収した。
エシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてatggatccgctggtggaacatatgaaaaattgtgtcatcgtcag(配列番号9)、及びgcagaagcttgtctagattaattcaaccgttcaatcaccatc(配列番号10)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI、HindIIIで消化することで約1.2kbpのチオラーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdhを制限酵素BamHI及びHindIIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP-IPAdh-atoBを回収した。
エシェリヒア・コリ由来のCoAトランスフェラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてgctctagagctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(配列番号11)、及びtagcaagcttctactcgagttatttgctctcctgtgaaacg(配列番号12)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素XbaI、HindIIIで消化することで約600bpのCoAトランスフェラーゼαサブユニットフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdh-atoBを制限酵素XbaI及びHindIIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP-IPAdh-atoB−atoDを回収した。
さらにエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてaagtctcgagctggtggaacatatggatgcgaaacaacgtattg(配列番号13)、及びggccaagcttcataaatcaccccgttgc(配列番号14)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素XhoI、HindIIIで消化することで約600bpのCoAトランスフェラーゼβサブユニットフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdh-atoB−atoDを制限酵素XhoI及びHindIIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP−IPAdh−atoB−atoD−atoAを回収した。
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium acetobutylicum ATCC824のゲノムDNAをテンプレートに用いて、caggtaccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(配列番号15)、及びgcggatccttacttaagataatcatatataacttcagc(配列番号16)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素KpnI、BamHIで消化することで約700bpのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdh-atoB−atoD−atoAを制限酵素KpnI及びBamHIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP-Iaaaを回収した。
このプラスミドpGAP-Iaaaを実施例1で作製した△pgi株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B△pgi株を得た。
同様に、pGAP-Iaaaをエシェリシア・コリB株(ATCC11303)コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株を得た。
なおエシェリヒア・コリMG1655株、Clostridium acetobutylicum ATCC824、エシェリシア・コリB株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
同様に、pGAP-Iaaaをエシェリシア・コリB株(ATCC11303)コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株を得た。
なおエシェリヒア・コリMG1655株、Clostridium acetobutylicum ATCC824、エシェリシア・コリB株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
<B::atoDAB株の作製>
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリMG1655株のCoAトランスフェラーゼ αサブユニットをコードする遺伝子(以下、atoDと略することがある)の塩基配列も報告されている。すなわちatoDはGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469〜2322131に記載されている。
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgctcaattgcaatgattgacacgattccg(配列番号44)、及びacagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(配列番号45)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素MfeI及びEcoRIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpUC19(GenBank accession number X02514)を制限酵素EcoRIで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー10個をそれぞれアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素EcoRI及びKpnIで消化した際、GAPDHプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、DNA配列を確認しGAPDHプロモーターが正しく挿入されたものをpUCgapPとした。得られたpUCgapPを制限酵素EcoRI及びKpnIで消化した。
さらにatoDを取得するために、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(配列番号46)、及びgcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg(配列番号47)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRI及びKpnIで消化することで約690bpのatoDフラグメントを得た。このDNAフラグメントを先に制限酵素EcoRI及びKpnIで消化したpUCgapPと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、atoDが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAPatoDと命名した。
なおエシェリヒア・コリMG1655株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリMG1655株のCoAトランスフェラーゼ αサブユニットをコードする遺伝子(以下、atoDと略することがある)の塩基配列も報告されている。すなわちatoDはGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469〜2322131に記載されている。
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgctcaattgcaatgattgacacgattccg(配列番号44)、及びacagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(配列番号45)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素MfeI及びEcoRIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpUC19(GenBank accession number X02514)を制限酵素EcoRIで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー10個をそれぞれアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素EcoRI及びKpnIで消化した際、GAPDHプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、DNA配列を確認しGAPDHプロモーターが正しく挿入されたものをpUCgapPとした。得られたpUCgapPを制限酵素EcoRI及びKpnIで消化した。
さらにatoDを取得するために、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(配列番号46)、及びgcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg(配列番号47)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRI及びKpnIで消化することで約690bpのatoDフラグメントを得た。このDNAフラグメントを先に制限酵素EcoRI及びKpnIで消化したpUCgapPと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、atoDが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAPatoDと命名した。
なおエシェリヒア・コリMG1655株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
上述した通り、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAにおけるatoDの塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリMG1655株のatoDの5’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、gctctagatgctgaaatccactagtcttgtc(配列番号48)とtactgcagcgttccagcaccttatcaacc(配列番号49)を用いて、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより約1.1kbpのDNA断片を増幅した。
また、エシェリヒア・コリMG1655株のGAPDHプロモーターの配列情報に基づいて作製されたggtctagagcaatgattgacacgattccg(配列番号50)とエシェリヒア・コリMG1655株のatoDの配列情報に基づいて作製された配列番号4のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターpGAPatoDを鋳型としてPCRを行い、GAPDHプロモーターとatoDからなる約790bpのDNAフラグメントを得た。
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素PstIとXbaI、XbaIとKpnIで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をPstIとKpnIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、DH5α株に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリB株(ATCC11303)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないLB液体培地で30℃で2時間培養し、抗生物質を含まないLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないLB寒天プレートとクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体DNAからPCRによりGAPDHプロモーターとatoDを含む約790bp断片を増幅させ、atoDプロモーター領域がGAPDHプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリ、B::atoDABと命名した。
なお、エシェリシア・コリB株(ATCC11303)は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
また、エシェリヒア・コリMG1655株のGAPDHプロモーターの配列情報に基づいて作製されたggtctagagcaatgattgacacgattccg(配列番号50)とエシェリヒア・コリMG1655株のatoDの配列情報に基づいて作製された配列番号4のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターpGAPatoDを鋳型としてPCRを行い、GAPDHプロモーターとatoDからなる約790bpのDNAフラグメントを得た。
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素PstIとXbaI、XbaIとKpnIで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をPstIとKpnIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、DH5α株に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリB株(ATCC11303)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないLB液体培地で30℃で2時間培養し、抗生物質を含まないLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないLB寒天プレートとクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体DNAからPCRによりGAPDHプロモーターとatoDを含む約790bp断片を増幅させ、atoDプロモーター領域がGAPDHプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリ、B::atoDABと命名した。
なお、エシェリシア・コリB株(ATCC11303)は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
<プラスミドpIazの作製>
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼはGenBank accession number M55392に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはGenBank accession number AF157307に記載されている。
上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgagctacatatgcaatgattgacacgattccg(配列番号5)、及びcgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg(配列番号6)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素NdeI、SphIで消化することで約110bpのGAPDHプロモーターにあたるDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpBR322(GenBank accession number J01749)を制限酵素NdeI及びSphIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpBRgapPを回収した。
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium beijerinckii NRRL B−593のゲノムDNAをテンプレートに用いて、aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(配列番号51)、及びgcggatccttataatataactactgctttaattaagtc(配列番号52)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素SphI、BamHIで消化することで約1.1kbpのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpBRgapPを制限酵素SphI及びBamHIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しIPAdhが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAP-IPAdhと命名した。
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium acetobutylicum ATCC824のゲノムDNAをテンプレートに用いて、caggatccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(配列番号53)、及びggaattcggtaccttacttaagataatcatatataacttcagc(配列番号54)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI、EcoRIで消化することで約700bpのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdhを制限酵素BamHI及びEcoRIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、adcが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpIaと命名した。
グルコース6リン酸−1−デヒドロゲナーゼ遺伝子(zwf)を取得するためにエシェリヒア・コリB株のゲノムDNA(GenBank accession No.CP000819)をテンプレートに用いてcaggatcccggagaaagtcttatggcggtaacgcaaacagcccagg(配列番号55)、及びcgtctagacggagaaagtcttatgaagcaaacagtttatatcgcc(配列番号56)を用いてPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI、XbaIで消化することで約1500bpのグルコース6リン酸1−デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-Iaを制限酵素BamHI及びXbaI消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地にて37℃で一晩培養し、得られたプラスミドをpGAP−Iazとした。
このプラスミドpIazを先に作製したエシェリヒア・コリB::atoDABコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで、37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpGAP−Iaz/B::atoDABを得た。
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼはGenBank accession number M55392に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはGenBank accession number AF157307に記載されている。
上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgagctacatatgcaatgattgacacgattccg(配列番号5)、及びcgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg(配列番号6)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素NdeI、SphIで消化することで約110bpのGAPDHプロモーターにあたるDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpBR322(GenBank accession number J01749)を制限酵素NdeI及びSphIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpBRgapPを回収した。
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium beijerinckii NRRL B−593のゲノムDNAをテンプレートに用いて、aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(配列番号51)、及びgcggatccttataatataactactgctttaattaagtc(配列番号52)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素SphI、BamHIで消化することで約1.1kbpのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpBRgapPを制限酵素SphI及びBamHIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しIPAdhが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAP-IPAdhと命名した。
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium acetobutylicum ATCC824のゲノムDNAをテンプレートに用いて、caggatccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(配列番号53)、及びggaattcggtaccttacttaagataatcatatataacttcagc(配列番号54)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI、EcoRIで消化することで約700bpのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdhを制限酵素BamHI及びEcoRIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、adcが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpIaと命名した。
グルコース6リン酸−1−デヒドロゲナーゼ遺伝子(zwf)を取得するためにエシェリヒア・コリB株のゲノムDNA(GenBank accession No.CP000819)をテンプレートに用いてcaggatcccggagaaagtcttatggcggtaacgcaaacagcccagg(配列番号55)、及びcgtctagacggagaaagtcttatgaagcaaacagtttatatcgcc(配列番号56)を用いてPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI、XbaIで消化することで約1500bpのグルコース6リン酸1−デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-Iaを制限酵素BamHI及びXbaI消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地にて37℃で一晩培養し、得られたプラスミドをpGAP−Iazとした。
このプラスミドpIazを先に作製したエシェリヒア・コリB::atoDABコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで、37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpGAP−Iaz/B::atoDABを得た。
[実施例3]
<3L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株及びpGAP-Iaaa/B△pgi株及びpGAP−Iaz/B::atoDAB△pgi株によるグルコースからのイソプロピルアルコール生産>
本実施例では、WO2009/008377号パンフレット図1に示される生産装置を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽には3リットル容のものを使用し、トラップ槽には10L容のものを使用した。培養槽、トラップ槽、注入管、連結管、排出管は、すべてガラス製のものとした。トラップ槽には、トラップ液としての水(トラップ水)を9Lの量で注入した。なお、培養槽には廃液管を設置して、糖や中和剤の流加により増量した培養液を適宜培養槽外に排出した。
<3L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株及びpGAP-Iaaa/B△pgi株及びpGAP−Iaz/B::atoDAB△pgi株によるグルコースからのイソプロピルアルコール生産>
本実施例では、WO2009/008377号パンフレット図1に示される生産装置を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽には3リットル容のものを使用し、トラップ槽には10L容のものを使用した。培養槽、トラップ槽、注入管、連結管、排出管は、すべてガラス製のものとした。トラップ槽には、トラップ液としての水(トラップ水)を9Lの量で注入した。なお、培養槽には廃液管を設置して、糖や中和剤の流加により増量した培養液を適宜培養槽外に排出した。
実施例2において得られたpGAP-Iaaa/B株及びpGAP-Iaaa/B△pgi株を、前培養としてアンピシリン50μg/mLを含むLB Broth, Miller培養液(Difco244620)100mLを入れた500mL容三角フラスコ植菌し、一晩、培養温度30℃、120rpmで攪拌培養を行った。前培養45mLを、以下に示す組成の培地855gの入った3L容の培養槽(ABLE社製培養装置BMS−PI)に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量0.9L/min、撹拌速度550rpm、培養温度30℃、pH7.0(NH3水溶液で調整)で行った。培養開始から8時間後までの間、45wt/wt%のグルコース水溶液を7.5g/L/時間の流速で添加した。その後は45wt/wt%のグルコース水溶液を15g/L/時間の流速で添加した。培養開始から120時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中の生成物の蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(9L)中の合算値である。培養後の生成物の濃度と、イソプロピルアルコールの純度をそれぞれ表1に示した。
<培地組成>
コーンスティープリカー(日本食品化工製):20g/L
Fe2SO4・7H2O:0.1g/L
K2HPO4:2g/L
KH2PO4:2g/L
MgSO4・7H2O:2g/L
(NH4)2SO4:2g/L
アデカノールLG126(旭電化工業)0.1g/L
(残部:水)
コーンスティープリカー(日本食品化工製):20g/L
Fe2SO4・7H2O:0.1g/L
K2HPO4:2g/L
KH2PO4:2g/L
MgSO4・7H2O:2g/L
(NH4)2SO4:2g/L
アデカノールLG126(旭電化工業)0.1g/L
(残部:水)
また、得られたpGAP-Iaaa/B株及びpGAP-Iaaa/B△pgi株のトラップ水をGC分析した結果、pGAP-Iaaa/B株のトラップ水にはアセトンが2.6質量%、イソプロパノールは4.6質量%含有されていることがわかった。また、pGAP-Iaaa/B△pgi株のトラップ水にはアセトンが0.24質量%、イソプロパノールは2.8質量%、pGAP-Iaz/B::atoDAB△pgi株のトラップ水にはアセトンが0.24質量%、イソプロパノールは2.6質量%含有されていることがわかった。
これらの結果により、大腸菌が本来有するグルコース−6−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子(pgi)を破壊することによって、グルコース−6−リン酸イソメラーゼの活性が完全に不活化し、イソプロピルアルコールの純度が向上することが確認された。 また、pgiを破壊すると共にグルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ遺伝子(zwf)の発現を強化することにより、更にイソプロピルアルコールの純度が向上することが分かった。
これらの遺伝子改変を行うことによって、生成物中のアセトン量を減らすことができるので、副生したアセトンをイソプロピルアルコールに変換するとしても、変換に必要な物質、例えば水素の量を低減させることができる。
これらの遺伝子改変を行うことによって、生成物中のアセトン量を減らすことができるので、副生したアセトンをイソプロピルアルコールに変換するとしても、変換に必要な物質、例えば水素の量を低減させることができる。
[比較例1]
<エシェリヒア・コリB株ΔpfkAΔpfkB株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのホスホフルクトキナーゼ−2(以下pfkBと呼ぶことがある)をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている(GenBank accession number K02500)。pfkBをコードする遺伝子(930bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ttggtacctttacatgctgtagcccagc(配列番号17)、cgtctagataggctgatttcagtctgg(配列番号18)、attctagaatcatcaccaacctgtcg(配列番号19)及びgatattgccgaaagcgatcc(配列番号20)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号17のプライマーは5’末端側にKpnI認識部位を、配列番号18および19のプライマーは5’末端側にXbaI認識部位を、配列番号20のプライマーは5’末端側にPstI認識部位をそれぞれ有している。
<エシェリヒア・コリB株ΔpfkAΔpfkB株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのホスホフルクトキナーゼ−2(以下pfkBと呼ぶことがある)をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている(GenBank accession number K02500)。pfkBをコードする遺伝子(930bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ttggtacctttacatgctgtagcccagc(配列番号17)、cgtctagataggctgatttcagtctgg(配列番号18)、attctagaatcatcaccaacctgtcg(配列番号19)及びgatattgccgaaagcgatcc(配列番号20)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号17のプライマーは5’末端側にKpnI認識部位を、配列番号18および19のプライマーは5’末端側にXbaI認識部位を、配列番号20のプライマーは5’末端側にPstI認識部位をそれぞれ有している。
エシェリヒア・コリMG1655株(ATCC700926)のゲノムDNAを調製し、得られたゲノムDNAを鋳型とし、配列番号17と配列番号18のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下pfkB−L断片と呼ぶことがある)。また、配列番号19と配列番号20のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下pfkB−R断片と呼ぶことがある)。これらのDNA断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、pfkB−L断片をKpnI及びXbaIで、pfkB−R断片をXbaI及びPstIでそれぞれ消化した。この消化断片2種と、温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)のKpnI及びPstI消化物とを混合し、T4DNAリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績社製)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、pfkBをコードする遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の2つの断片がpTH18cs1に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをXbaIで消化した後、T4DNAポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本DNA断片と、トランスポゾンTn10(GenBank accession number J01830)をテンプレートとして、cagctgactcgacatcttggttaccg(配列番号21)とcagctgcaagagggtcattatatttcg(配列番号22)のオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行いテトラサイクリン耐性遺伝子を得、このDNA断片をT4DNAポリヌクレオチドキナーゼ処理し、先の平滑末端処理したプラスミドと連結した。その後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlとテトラサイクリン20μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、pfkBをコードする遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の間にテトラサイクリン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認した。
こうして得られたプラスミドをエシェリヒア・コリB株(ATCC11303)に形質転換し、クロラムフェニコールを10μg/mlの濃度で含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をテトラサイクリン20μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をテトラサイクリン20μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをテトラサイクリン20μg/mlを含むLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にテトラサイクリン20μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをテトラサイクリン20μg/mlを含むLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、テトラサイクリンを含むLB寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらのクローンの染色体DNAを用いて、野生株B株においてpfkB遺伝子を含むpfkB遺伝子近傍領域の約3.0kbp断片を増幅させるプライマーペア配列番号17と配列番号20を使ってPCRを行い、pfkB遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子に置換されていることで約3.2kbp断片の増幅がえられる株を選抜した。得られた株をB株pfkB遺伝子欠失株(以下△pfkB株と略することがある)と命名した。
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのホスホフルクトキナーゼ−1(以下pfkAと呼ぶことがある)をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている(GenBank accession number U00096 4105575―4106537)。pfkAをコードする遺伝子(963bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、atctgcagtactagcgtcagttgatagc(配列番号23)、cgtctagatcctgctgaattgattcagg(配列番号24)、tctctagactgaaaccgatgacagaagc(配列番号25)及びaaggtaccaggcaatcagtacatcg(配列番号26)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号23のプライマーは5’末端側にPstI認識部位を、配列番号24および25のプライマーは5’末端側にXbaI認識部位を、配列番号26のプライマーは5’末端側にKpnI認識部位をそれぞれ有している。
エシェリヒア・コリMG1655株(ATCC700926)のゲノムDNAを調製し、得られたゲノムDNAを鋳型とし、配列番号23と配列番号24のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下pfkA−L断片と呼ぶことがある)。また、配列番号25と配列番号26のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下pfkA−R断片と呼ぶことがある)。これらのDNA断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、pfkA−L断片をPstI及びXbaIで、pfkA−R断片をXbaI及びKpnIでそれぞれ消化した。この消化断片2種と、温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)のKpnI及びPstI消化物とを混合し、T4DNAリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績社製)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、pfkAをコードする遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の2つの断片がpTH18cs1に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをXbaIで消化した後、T4DNAポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本DNA断片と、pUC4Kプラスミド(GenBank accession number X06404)(Pharmacia)をEcoRIで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにT4DNAポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったDNA断片とをT4DNAリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlとカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、pfkAをコードする遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の間にカナマイシン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認した。
こうして得られたプラスミドをエシェリヒア・コリΔpfkB株に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlとカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むLB寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらのクローンの染色体DNAを用いて、野生株B株においてpfkA遺伝子を含むpfkA遺伝子近傍領域の約3.0kbp断片を増幅させるプライマーペア配列番号7と配列番号10を使ってPCRを行い、pfkA遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約3.1kbp断片の増幅がえられる株を選抜した。得られた株をB株pfkA,pfkB遺伝子欠失株(以下△pfkAΔpfkB株と略することがある)と命名した。
なおエシェリヒア・コリMG1655株およびエシェリヒア・コリB株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
なおエシェリヒア・コリMG1655株およびエシェリヒア・コリB株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
<△pfkApfkB株に、エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来CoAトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターを導入した形質転換体の構築>
実施例2で作製したプラスミドpGAP-Iaaaを△pfkAΔpfkB株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B△pfkAΔpfkB株を得た。
実施例2で作製したプラスミドpGAP-Iaaaを△pfkAΔpfkB株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B△pfkAΔpfkB株を得た。
<3L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B△pfkAΔpfkB株によるグルコースからのイソプロピルアルコール生産>
実施例3と同様な方法でイソプロピルアルコールを生産させた。但し、菌体はpGAP-Iaaa/B△pfkAΔpfkB株を用いた。培養開始から120時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中の生成物の蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(9L)中の合算値である。培養後の生成物の濃度及びイソプロピルアルコールの純度を表2に示した。
実施例3と同様な方法でイソプロピルアルコールを生産させた。但し、菌体はpGAP-Iaaa/B△pfkAΔpfkB株を用いた。培養開始から120時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中の生成物の蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(9L)中の合算値である。培養後の生成物の濃度及びイソプロピルアルコールの純度を表2に示した。
この結果と実施例3の結果により、大腸菌が本来有する解糖系の酵素の1種であるグルコース−6−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子(pgi)を破壊した場合にはイソプロピルアルコールの純度が向上するのに反し、同様な解糖系の酵素であるホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子(pfkA及びpfkB)を破壊した場合には純度が低下することが確認された。
[実施例4]
<3L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Ia-cscA/GAPpatoDゲノム挿入株pgi破壊株によるスクロースからのイソプロピルアルコール生産>
(エシェリヒア・コリB株ゲノム上atoDプロモーターのGAPDHプロモーターへの置換)
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリMG1655株のCoAトランスフェラーゼ αサブユニットをコードする遺伝子(以下、atoDと略することがある)の塩基配列も報告されている。すなわちatoDはGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469〜2322131に記載されている。
<3L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Ia-cscA/GAPpatoDゲノム挿入株pgi破壊株によるスクロースからのイソプロピルアルコール生産>
(エシェリヒア・コリB株ゲノム上atoDプロモーターのGAPDHプロモーターへの置換)
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリMG1655株のCoAトランスフェラーゼ αサブユニットをコードする遺伝子(以下、atoDと略することがある)の塩基配列も報告されている。すなわちatoDはGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469〜2322131に記載されている。
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgctcaattgcaatgattgacacgattccg(配列番号27)、及びacagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(配列番号28)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素MfeI及びEcoRIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpUC19(GenBank accession number X02514)を制限酵素EcoRIで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー10個をそれぞれアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素EcoRI及びKpnIで消化した際、GAPDHプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、DNA配列を確認しGAPDHプロモーターが正しく挿入されたものをpUCgapPとした。得られたpUCgapPを制限酵素EcoRI及びKpnIで消化した。
さらにatoDを取得するために、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(配列番号29)、及びgcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg(配列番号30)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRI及びKpnIで消化することで約690bpのatoDフラグメントを得た。このDNAフラグメントを先に制限酵素EcoRI及びKpnIで消化したpUCgapPと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、atoDが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAPatoDと命名した。
なおエシェリヒア・コリMG1655株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
なおエシェリヒア・コリMG1655株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
上述した通り、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAにおけるatoDの塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリMG1655株のatoDの5’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、gctctagatgctgaaatccactagtcttgtc(配列番号31)とtactgcagcgttccagcaccttatcaacc(配列番号32)を用いて、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより約1.1kbpのDNA断片を増幅した。
また、エシェリヒア・コリMG1655株のGAPDHプロモーターの配列情報に基づいて作製されたggtctagagcaatgattgacacgattccg(配列番号33)とエシェリヒア・コリMG1655株のatoDの配列情報に基づいて作製された配列番号30のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターpGAPatoDを鋳型としてPCRを行い、GAPDHプロモーターとatoDからなる約790bpのDNAフラグメントを得た。
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素PstIとXbaI、XbaIとKpnIで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をPstIとKpnIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、DH5α株に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリB株(ATCC11303)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないLB液体培地で30℃で2時間培養し、抗生物質を含まないLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないLB寒天プレートとクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体DNAからPCRによりGAPDHプロモーターとatoDを含む約790bp断片を増幅させ、atoDプロモーター領域がGAPDHプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリB株atoD欠失GAPpatoDゲノム挿入株と命名した。
なお、エシェリシア・コリB株(ATCC11303)は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
なお、エシェリシア・コリB株(ATCC11303)は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
(エシェリヒア・コリGAPpatoDゲノム挿入株pgi破壊株の作製)
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ(以下pgiと呼ぶことがある)をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている(GenBank accession number X15196)。pgiをコードする遺伝子(1,650bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、caggaattcgctatatctggctctgcacg(配列番号34)、cagtctagagcaatactcttctgattttga g(配列番号35)、cagtctagatcatcgtcgatatgtaggcc(配列番号36)及びgacctgcagatcatccgtcagctgtacgc(配列番号37)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号1のプライマーは5’末端側にEcoRI認識部位を、配列番号2および3のプライマーは5’末端側にXbaI認識部位を、配列番号4のプライマーは5’末端側にPstI認識部位をそれぞれ有している。
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ(以下pgiと呼ぶことがある)をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている(GenBank accession number X15196)。pgiをコードする遺伝子(1,650bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、caggaattcgctatatctggctctgcacg(配列番号34)、cagtctagagcaatactcttctgattttga g(配列番号35)、cagtctagatcatcgtcgatatgtaggcc(配列番号36)及びgacctgcagatcatccgtcagctgtacgc(配列番号37)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号1のプライマーは5’末端側にEcoRI認識部位を、配列番号2および3のプライマーは5’末端側にXbaI認識部位を、配列番号4のプライマーは5’末端側にPstI認識部位をそれぞれ有している。
エシェリヒア・コリMG1655株(ATCC700926)のゲノムDNAを調製し、得られたゲノムDNAを鋳型とし、配列番号34と配列番号35のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下pgi−L断片と呼ぶことがある)。また、配列番号36と配列番号37のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下pgi−R断片と呼ぶことがある)。これらのDNA断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、pgi−L断片をEcoRI及びXbaIで、pgi−R断片をXbaI及びPstIでそれぞれ消化した。この消化断片2種と、温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)のEcoRI及びPstI消化物とを混合し、T4DNAリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績社製)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、pgiをコードする遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の2つの断片がpTH18cs1に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをXbaIで消化した後、T4DNAポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本DNA断片と、pUC4Kプラスミド(GenBank accession number X06404)(Pharmacia)をEcoRIで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにT4DNAポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったDNA断片とをT4DNAリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlとカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、pgiをコードする遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の間にカナマイシン体性遺伝子が正しく挿入されていることを確認した。
こうして得られたプラスミドを前述のエシェリヒア・コリB株atoD欠失GAPpatoDゲノム挿入株に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlとカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むLB寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRにより、エシェリヒア・コリB株atoD欠失GAPpatoDゲノム挿入株におけるpgi遺伝子を含むpgi遺伝子近傍領域の約3.7kbp断片を増幅させ、pgi遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約3.3kbp断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をGAPpatoDゲノム挿入株pgi遺伝子欠失株(以下GAPpatoDゲノム挿入△pgi株と略することがある)と命名した。
なおエシェリヒア・コリMG1655株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
なおエシェリヒア・コリMG1655株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
(クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリO157由来インベルターゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築)
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼはGenBank accession number M55392に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはGenBank accession number AF157307に記載されている。
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium beijerinckii NRRL B−593のゲノムDNAをテンプレートに用いて、aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(配列番号38)、及びgcggatccttataatataactactgctttaattaagtc(配列番号39)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素SphI、BamHIで消化することで約1.1kbpのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpBRgapPを制限酵素SphI及びBamHIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しIPAdhが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAP-IPAdhと命名した。
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼはGenBank accession number M55392に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはGenBank accession number AF157307に記載されている。
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium beijerinckii NRRL B−593のゲノムDNAをテンプレートに用いて、aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(配列番号38)、及びgcggatccttataatataactactgctttaattaagtc(配列番号39)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素SphI、BamHIで消化することで約1.1kbpのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpBRgapPを制限酵素SphI及びBamHIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しIPAdhが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAP-IPAdhと命名した。
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium acetobutylicum ATCC824のゲノムDNAをテンプレートに用いて、caggatccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(配列番号40)、及びggaattcggtaccttacttaagataatcatatataacttcagc(配列番号41)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI、EcoRIで消化することで約700bpのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdhを制限酵素BamHI及びEcoRIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、adcが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAP-Iaと命名した。
エシェリヒア・コリO157株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number AE005174)、エシェリヒア・コリO157株のインベルターゼをコードする遺伝子(以下、cscAと略することがある)の塩基配列も報告されている。すなわちcscAはGenBank accession number AE005174に記載のエシェリヒア・コリO157株ゲノム配列の3274383〜3275816に記載されている。
cscAを取得するために、エシェリヒア・コリO157株のゲノムDNAをテンプレートに用いてatggtaccgctggtggaacatatgacgcaatctcgattgcatg(配列番号42)、及びcgaattcttaacccagttgccagagtgc(配列番号43)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素KpnI及びEcoRIで消化することで約1470bpのcscAフラグメントを得た。このDNAフラグメントと先述のpGAP−Ia(クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター)を制限酵素KpnI及びEcoRIで消化したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、cscAが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAP-Ia-cscAと命名した。
(pGAP-Ia-cscA/GAPpatoDゲノム挿入△pgi株の構築)
前述のプラスミドpGAP-Ia-cscAをB株GAPpatoDゲノム挿入△pgi株のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpGAP-Ia-cscA/GAPpatoDゲノム挿入△pgi株(以下pGAP−Ia−cscA/BGAPpatoD△pgi株と略することがある)を得た。
前述のプラスミドpGAP-Ia-cscAをB株GAPpatoDゲノム挿入△pgi株のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpGAP-Ia-cscA/GAPpatoDゲノム挿入△pgi株(以下pGAP−Ia−cscA/BGAPpatoD△pgi株と略することがある)を得た。
(pGAP-Ia-cscA/GAPpatoDゲノム挿入△pgi株によるスクロースからのイソプロピルアルコール生産)
実施例3と同様にイソプロピルアルコールを生産した。但し、糖源はグルコースの代わりに50%(w/w)スクロースを使用した。培養開始から120時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中の生成物の蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(9L)中の合算値である。培養後の生成物の濃度と、イソプロピルアルコールの純度をそれぞれ表3に示した。
実施例3と同様にイソプロピルアルコールを生産した。但し、糖源はグルコースの代わりに50%(w/w)スクロースを使用した。培養開始から120時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中の生成物の蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(9L)中の合算値である。培養後の生成物の濃度と、イソプロピルアルコールの純度をそれぞれ表3に示した。
これらの結果により、スクロース加水分解酵素遺伝子をさらに有するイソプロピルアルコール生産大腸菌は、スクロースを原料とした場合にも、大腸菌が本来有するグルコース−6−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子(pgi)を破壊することによってイソプロピルアルコールの純度が向上することが確認された。また、生産されるイソプロピルアルコールの量も増加することが確認された。
すなわち、本発明によれば、イソプロピルアルコールを高い純度で生産するために有用なイソプロピルアルコール生産大腸菌及びイソプロピルアルコール生産方法を提供することができる。
2009年10月29日に出願の日本国出願番号第2009−249418号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (8)
- グルコース−6−リン酸イソメラーゼ活性が不活化されると共にイソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- さらに、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ活性が強化されている請求項1記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- 前記イソプロピルアルコール生産大腸菌が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与された大腸菌である請求項1又は請求項2のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、それぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも1種由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項3記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が、クロストリジウム属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項3記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項3記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- さらに、スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有する請求項1〜請求項6のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- 請求項1〜請求項7のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
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Also Published As
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