KR101410069B1

KR101410069B1 - 신규 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소

Info

Publication number: KR101410069B1
Application number: KR1020137000768A
Authority: KR
Inventors: 가즈노부 고니시; 신이치 이마즈
Original assignee: 아사히 가세이 케미칼즈 가부시키가이샤
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2014-06-25
Also published as: US20120100584A1; WO2010109916A1; KR20110110372A; US20140206050A1; EP2412807B1; JP5579700B2; CN102361978A; CN103320401A; JP2013135697A; TWI408229B; EP2759594A1; JP5654078B2; EP2412807A4; JPWO2010109916A1; TW201035319A; EP2412807A1; US8703466B2; KR20130019452A; KR101588099B1; KR20130111639A

Abstract

본 발명의 목적은 종래의 효소에 비해서, 열이나 pH에 대한 안정성 등의 특성이 우수한 DOI 합성 효소의 제공, 및 상기 효소를 이용한 DOI 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따르면, 하기 (1), (2), (4), (6) 및 (7)의 특성을 가지며, 또한 하기 (3) 및/또는 (5)의 특성을 갖는 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소가 제공된다:
(1) 작용: 본 효소는 글루코오스-6-인산을 2-데옥시-실로-이노소스로 변환하는 기능을 갖는다.
(2) 최적 pH 범위: 7.0∼7.7
(3) 안정 pH 범위: 6.0∼8.0
(4) 최적 온도 범위: 55∼70 ℃
(5) 안정 온도 범위: 20∼46℃
(6) 보조효소: NAD⁺를 이용
(7)분자량: 39000∼42000.

Description

신규 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소{NOVEL 2-DEOXY-SCYLLO-INOSOSE SYNTHASE}

본 발명은 내열성 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소, 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소 유전자, 재조합 벡터, 형질 전환체, 및 2-데옥시-실로-이노소스의 제조 방법에 관한 것이다.

현재, 카테콜 등의 방향족 화합물의 대부분은 석유를 원료로 하여 생산되고 있지만, 석유 자원의 고갈 문제나 이산화탄소 배출량의 삭감 등의 관점에서, 바이오매스를 이용한 환경 조화형의 신규 제조 프로세스의 개발이 요구되고 있다.

한편, 2-데옥시-실로-이노소스(이하, DOI)를 산업상 유용하다고 하는 방향족 화합물(카테콜 등)로 변환할 수 있는 것이 발견되었고(비특허문헌 1), 더욱, 이 DOI를 바이오매스의 구성 요소의 하나인 글루코오스로부터 합성할 수 있는 것이 보고되었다(비특허문헌 1). 본 DOI 제조 프로세스에서 중요한 것이 글루코오스-6-인산으로부터 DOI로 변환하는 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소(이하, DOI 합성 효소)이며, DOI는 상기 방향족 화합물로의 변환뿐만 아니라 각종 유용 화합물의 중간체도 될 수 있기 때문에, DOI 합성 효소는 매우 큰 주목을 받고 있다.

DOI 합성 효소는 부티로신 생산균인 바실러스 실큘란스(Bacillus circulans)에 속하는 미생물로부터 1997년에 단리 정제(비특허문헌 2)되고, 계속해서, 그 유전자 서열도 공개되어 있다(특허문헌 1). 이 이외에도 스트렙토알로테이커스 힌더스타너스(Streptoalloteichus hindustanus) JCM3268주(비특허문헌 3) 유래의 DOI 합성 효소 등이 지금까지 발견되어 있다.

[선행기술문헌]

[특허문헌]

특허문헌 1: 일본 특허 공개 제2000-236881호 공보

[비특허문헌]

비특허문헌 1: Tetrahedron Letters 41, 1935-1938, 2000

비특허문헌 2: The Journal of Antibiotics 50(5), 424-428, 1997

비특허문헌 3: The Journal of Antibiotics 59(6), 358-361, 2006

그러나, 상기 DOI 합성 효소의 안정성과 비활성 등의 각종 특성은 만족할만한 것이 아니며, 또한, 수천톤 규모의 공업화 제법을 겨냥한 효소의 해석이나 기능 향상에 관한 연구는 거의 이루어져 오지 않았다. 예컨대, 바실러스 실큘란스(Bacillus circulans)에 속하는 미생물에 유래하는 DOI 합성 효소(BtrC)는 안정성 등에 큰 문제가 있고, 스트렙토알로테이커스 힌더스타너스(Streptoalloteichus hindustanus) JCM3268주 유래의 DOI 합성 효소의 비활성은 현저히 낮아, 공업적인 이용은 곤란하였다. 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 종래의 효소에 비해서, 열이나 pH에 대한 안정성 등의 특성이 우수한 DOI 합성 효소의 제공 및 상기 효소를 이용한 DOI 제조 방법을 제공하는 것이다.

이들 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 거듭한 결과, 본 발명자들은 종래의 효소에 비해서 열 및/또는 pH 안정성이 향상된 DOI 합성 효소를 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하에 나타내는 DOI 합성 효소, DOI 합성 효소 유전자, 재조합 벡터, 형질 전환체 및 DOI 제조 방법에 관한 것이다.

[1] 하기 (1), (2), (4), (6) 및 (7)의 특성을 가지며, 또한 하기 (3) 및/또는 (5)의 특성을 갖는 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소:

(1) 작용: 본 효소는 글루코오스-6-인산을 2-데옥시-실로-이노소스로 변환하는 기능을 갖는다.

(2) 최적 pH 범위: 7.0∼7.7

(3) 안정 pH 범위: 6.0∼8.0

(4) 최적 온도 범위: 55∼70℃

(5) 안정 온도 범위: 20∼46℃

(6) 보조효소: NAD⁺를 이용

(7) 분자량: 39000∼42000

[2] 하기 (8)의 특성을 갖는 [1]에 기재된 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소:

(8) 비활성: 1.0 μ㏖/분/㎎ 이상(반응 온도 65℃).

[3] 하기 (9)의 특성을 갖는 [1] 또는 [2]에 기재된 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소.

(9) 보조인자: Co² ⁺ 이온의 첨가에 의해 활성 향상.

[4] 안정 온도 범위가 20∼60℃인 [1] 내지 [3] 중 어느 1항에 기재된 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소.

[5] 하기 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소:

(a) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열;

(b) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 상동성을 가지며, 또한 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성을 갖는 아미노산 서열; 또는

(c) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산의 결실, 부가, 및/또는 치환을 포함하며, 또한 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성을 갖는 아미노산 서열.

[6] 하기 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 갖는 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소 유전자.

[7] 하기 중 어느 하나의 염기 서열을 갖는 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소 유전자:

(a) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나에 기재된 염기 서열;

(b) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나에 기재된 염기 서열에 대하여 80％ 이상의 상동성을 가지며, 또한 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성을 갖는 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소를 코딩하는 염기 서열; 또는

(c) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나에 기재된 염기 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 염기의 결실, 부가, 및/또는 치환을 포함하며, 또한 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성을 갖는 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소를 코딩하는 염기 서열:

[8] [6] 또는 [7]에 기재된 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터.

[9] [6] 또는 [7]에 기재된 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소 유전자 또는 [8]에 기재된 재조합 벡터를 숙주에게 도입함으로써 얻어지는 형질 전환체.

[10] [9]에 기재된 형질 전환체를 배양함으로써 얻어지는 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소.

[11] [1] 내지 [5] 또는 [10] 중 어느 1항에 기재된 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 2-데옥시-실로-이노소스의 제조 방법.

[12] [6] 또는 [7]에 기재된 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소 유전자, 또는 [9]에 기재된 형질 전환체를 이용하는 것을 특징으로 하는 글루코오스, 글루코오스를 구성 성분으로 하는 다당류 및/또는 글루코오스-6-인산을 원료로 한 2-데옥시-실로-이노소스의 제조 방법.

[13] 코발트 이온을 함유하는 배지에서 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소를 발현 가능한 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 글루코오스-6-인산으로부터 2-데옥시-실로-이노소스를 제조하는 제조 방법.

[14] 글루코오스를 구성 성분으로 하는 다당류 혹은 글루코오스를 함유하는 원료를 이용하는 것을 특징으로 하는 [13]에 기재된 방법.

[15] 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소가 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소인 [13] 또는 [14]에 기재된 방법.

본 발명의 DOI 합성 효소를 이용하면, DOI의 제조에서 고온 조건의 효소 이용이 가능해진다. 더욱, 제조 조건에 따라서는 제조 시의 엄밀한 온도 관리 등이 불필요해진다. 또한, DOI가 안정적인 pH 영역인 산성 조건 하에서의 DOI 제조가 가능해진다. 더욱, 제조 조건에 따라서는 제조 시의 엄밀한 pH 관리 등이 불필요해진다.

도 1은 정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)의 최적 pH 범위를 나타낸다(실시예 3).
도 2는 정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)의 안정 pH 범위를 나타낸다(실시예 3).
도 3은 정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)의 최적 온도 범위를 나타낸다(실시예 3).
도 4는 정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)의 안정 온도 범위를 나타낸다(실시예 3).
도 5는 정제 DOI 합성 효소(DOIS-5)의 안정 pH 범위를 나타낸다(실시예 5).
도 6은 정제 기지 DOI 합성 효소(BtrC)의 안정 온도 범위를 나타낸다(비교예 1).
도 7은 정제 기지 DOI 합성 효소(BtrC)의 안정 pH 범위를 나타낸다(비교예 1).

이하, 본 발명에 대해서 구체적으로 설명한다.

[DOI 합성 효소]

본 발명을 실시하기 위한 형태(이하, 본 실시형태라고 함)의 DOI 합성 효소는 하기의 특성을 갖는다:

(1) 작용: 본 효소는 글루코오스-6-인산을 DOI로 변환하는 기능을 갖는다.

(2) 안정성: 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성을 나타낸다.

바람직하게는, 본 발명에 있어서의 DOI 합성 효소는 하기 (1), (2), (4), (6) 및 (7)의 특성을 가지며, 또한 하기 (3) 및/또는 (5)의 특성을 갖는다.

(2) 최적 pH 범위: 7.0∼7.7

(3) 안정 pH 범위: 6.0∼8.0

(4) 최적 온도 범위: 55∼70℃

(5) 안정 온도 범위: 20∼46℃(바람직하게는, 20∼60℃)

(6) 보조효소: NAD⁺를 이용

(7) 분자량: 39000∼42000.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 DOI 합성 효소는 상기 특성에 더하여, 하기 (8) 및/또는 (9)의 특성을 갖는다.

(8) 비활성: 1.0 μ㏖/분/㎎ 이상(반응 온도 65℃)

(9) 보조인자: Co² ⁺ 이온의 첨가에 의해 활성 향상

본 발명의 DOI 합성 효소의 아미노산 서열의 구체예를 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 및 12에 나타낸다. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 DOI 합성 효소는 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성의 특성을 갖고 있는 것이 바람직하다. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 DOI 합성 효소는 본 실시형태에 있어서 우수한 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성의 특성을 갖는 것이 바람직하다.

본 실시형태에 있어서 DOI 합성 효소는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열과 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 상동성을 갖는 단백질이어도 좋다.

또한, 본 실시형태에 있어서 DOI 합성 효소는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열에서 1개 또는 복수개의 아미노산에 결실, 치환 및/또는 부가를 포함하여도 좋다. 결실, 치환 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 바람직하게는 1∼50개, 더욱 바람직하게는 1∼30개, 더욱 바람직하게는 1∼20개, 더욱 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다.

서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열과 80％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 우수한 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성의 특성을 가지고, 또한 DOI 합성 효소 활성을 갖는 효소는 본 발명에 포함된다.

서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산에 결실, 치환 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 우수한 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성의 특성을 가지고, 또한 DOI 합성 효소 활성을 갖는 효소는 본 발명에 포함된다.

DOI 합성 효소 중의 아미노산에 결실, 치환, 부가 등의 변이를 발생시키는 방법으로서는, PCR법, 실수 유발 PCR(error prone PCR)법, DNA 셔플링법이나 키메라 효소를 제작하는 방법 등의 공지의 방법이 이용할 수 있다.

DOI 합성 효소 중의 아미노산 서열의 상동성은 예컨대, UWGCG Package가 공급하는 BESTFIT 프로그램(Devereux et al(1984) Nucleic Acids Research 12, p 387-395)이나, PILEUP나 BLAST 알고리즘(Altschul S.F.(1993) J Mol Evol 36: 290-300; Altschul S.F.(1990) J Mol Biol 215:403-10) 등의 서열 분석용 툴을 이용하여 산출할 수 있다.

또한, 상기 방법에 의해 얻어진 DOI 합성 효소를 열처리 후에 활성 측정을 행함으로써, 고온 안정성을 유지하는 효소를 선별하는 것이 가능하다.

[DOI 합성 효소 유전자]

본 실시형태의 DOI 합성 효소 유전자는 메타게놈이나 미생물로부터 단리·추출한 천연의 것이어도 좋고, 또한, 그의 염기 서열에 따라서 PCR법, 인공 합성법 등의 공지의 방법에 따라 합성한 것이어도 좋다. 또한, 신규 DOI 효소 키메라 유전자의 제작에는 기지 DOI 합성 효소 유전자를 조합시켜도 좋고, 예컨대, 패니바실러스 종(Paenibacillus sp .) NBRC13157주, 스트렙토알로테이커스 힌더스타너스(Streptoalloteichus hindustanus) JCM3268, 스트렙토마이세스 프라디아(Streptomyces fradiae) NBRC12773주 등에 유래하는 DOI 합성 효소 유전자를 들 수 있다.

본 실시형태에 있어서의 DOI 합성 효소 유전자의 염기 서열의 구체예를 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11에 나타낸다.

서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11에 기재된 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 서열을 갖는 DOI 합성 효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 숙주로부터 형질 전환체를 얻고, 얻어진 형질 전환체를 배양하여 DOI 합성 효소를 얻을 수 있다.

서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11에 기재된 염기 서열을 갖는 DOI 합성 효소 유전자로부터 얻어지는 DOI 합성 효소는 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성의 특성을 갖고 있는 것이 바람직하다.

본 실시형태에 있어서 DOI 합성 효소 유전자는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11에 기재된 염기 서열을 갖는 DOI 합성 효소 유전자와 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 갖고 있어도 좋다. 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11에 기재된 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 염기 서열과 80％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 가지며, 우수한 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성의 특성을 가지고, 또한 DOI 합성 효소 활성을 갖는 효소를 코딩하는 DOI 합성 효소 유전자는 본 발명에 포함된다.

본 실시형태에 있어서 DOI 합성 효소 유전자는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나에 기재된 염기 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 염기의 결실, 부가, 및/또는 치환을 포함하여도 좋다. 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나에 기재된 염기 서열에 대해서 1개 또는 복수개의 염기의 결실, 부가, 및/또는 치환을 포함하며, 또한 고온 안정성 및/또는 광범위 pH 안정성을 갖는 DOI 합성 효소를 코딩하는 염기 서열을 갖는 DOI 합성 효소 유전자는 본 발명에 포함된다. 결실, 부가 및/또는 치환되는 염기의 수는 바람직하게는 1∼50개, 더욱 바람직하게는 1∼30개, 더욱 바람직하게는 1∼20개, 더욱 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다.

본 실시형태에서는 하기 (a), (b) 또는 (c) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 갖는 DOI 합성 효소 유전자를 이용하여도 좋다:

[재조합 벡터 및 형질 전환체]

본 실시형태의 재조합 벡터는 플러스미드 등의 공지의 벡터에 본 실시형태의 유전자를 연결(삽입)하여 얻을 수 있다. 상기 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대 플러스미드 DNA, 파지 DNA 등을 들 수 있다.

상기 플러스미드 DNA로서는 대장균 유래의 플러스미드(예컨대 pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis 등), 고초균 유래의 플러스미드(예컨대 pUB110, pTP5 등), 효모 유래의 플러스미드(예컨대 YEp13, YEp24, YCp50, pYE52 등) 등이, 파지 DNA로서는 λ 파지 등을 들 수 있다.

상기 벡터에의 본 실시형태의 유전자의 삽입은 우선, 정제된 DNA를 적당한 제한 효소로 절단하고, 벡터 DNA가 적당한 제한 효소 부위 또는 멀티 클로닝 사이트에 삽입하여 벡터에 연결하는 방법이 채용된다.

숙주 내에서 외래 유전자를 발현시키기 위해서는 구조 유전자의 앞에, 적당한 프로모터를 배치시킬 필요가 있다. 상기 프로모터는 특별히 한정되지 않고, 숙주 내에서 기능하는 것이 알려져 있는 임의의 것을 이용할 수 있다. 또한 프로모터에 대해서는, 후술하는 형질 전환체에 있어서, 숙주마다 상세하게 설명한다. 또한, 필요하면 인핸서 등의 시스엘리멘트, 스플라이싱 시그널, 폴리A 부가 시그널, 리보솜 결합 서열(SD 서열), 터미네이터 서열 등을 배치시켜도 좋다.

본 실시형태의 형질 전환체는 본 실시형태의 재조합 벡터를 목적 유전자가 발현될 수 있도록 숙주 중에 도입함으로써 얻을 수 있다. 여기서 숙주로서는 본 실시형태의 DNA를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 등의 에스케리치아속, 바실루스·서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 바실루스속, 슈도모나스·푸티다(Pseudomonas putida) 등의 슈도모나스속, 리조븀·멜리로티(Rhizobium meliloti) 등의 리조븀속에 속하는 세균, 또한 사카로마이세스·세레비제(Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모, 기타 COS 세포, CHO 세포 등의 동물 세포, 혹은 Sf19, Sf21 등의 곤충 세포를 들 수 있다.

또한, 본 실시형태의 형질 전환체로서 이용하는 숙주는, 글루코오스-6-인산을 글루코오스, 프럭토스, 갈락토오스, 크실로오스 등의 단당류로부터 합성하는 기능을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 필요에 따라, 2개 이상의 단당이 연결한 다당류를 분해하는 기능을 갖는 것도 바람직하다.

대장균 등의 세균을 숙주로 하는 경우는, DOI 합성 효소를 효율적으로 발현시킨다고 하는 관점에서, 본 실시형태가 재조합 벡터가 각 세균 중에서 자율 복제 가능하며 프로모터, 리보솜 결합 서열, 본 실시형태의 유전자, 전사 종결 서열에 의해 구성되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있어도 좋다. 대장균으로서는 에스케리치아 콜라이(E. coli) K12, DH1, DH10B(Invitrogen사), BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(스트라테이진사), TOP10F 등을 들 수 있고, 고초균으로서는 바실루스·서브틸리스(B. subtilis) MI114, 207-21 등을 들 수 있다.

프로모터로서는 대장균 등의 숙주로 기능하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대 gapA 프로모터, gadA 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등의 대장균 유래의 프로모터나, T7 프로모터 등의 파지 유래의 프로모터를 이용할 수 있다.

세균으로의 재조합 벡터의 도입 방법은 세균에 DNA를 도입할 수 있는 방법이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 칼슘 이온을 이용하는 방법(Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110(1972)), 전기 천공법 등을 들 수 있다.

효모를 숙주로 하는 경우는 예컨대 사카로마이세스·세레비제(S. cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 등이 이용된다. 이 경우, 프로모터로서는 효모로 발현될 수 있는 것, 예컨대 gal1 프로모터, gal10 프로모터, 히트쇼크 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, PHO5 프로모터, AOX 프로모터 등을 들 수 있다.

효모로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는 예컨대 전기 천공법(Becker, D.M. et al.: Methods. Enzymol., 194: 180(1990)), 스페로플라스트법(Hinnen, A. et al.: Proc Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929(1978)), 초산리튬법(Itoh, H.: J. Bacteriol., 153: 163(1983)) 등을 들 수 있다.

[DOI 합성 효소의 생산]

본 실시형태의 효소는 본 실시형태의 형질 전환체를 적당한 배지에서 배양하고, 그 배양물로부터 해당 효소 활성을 갖는 단백질을 채취함으로써 얻을 수 있다. 본 실시형태의 형질 전환체를 배양하는 방법은, 숙주에 따라 결정하면 좋다. 예컨대, 대장균이나 효모 등의 미생물을 숙주로 하는 형질 전환체의 경우는, 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 함유하며, 형질 전환체를 효율적으로 배양할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지 중 어느 것을 이용하여도 좋다.

배양 중은 필요에 따라 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가하여도 좋다. 프로모터로서 유도성인 것을 이용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양하는 경우는 필요에 따라 유도 물질을 배지에 첨가하여도 좋다. 예컨대, lac 프로모터를 이용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양하는 경우는 이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 등을, trp 프로모터를 이용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양하는 경우는 인돌아크릴산(IAA) 등을 배지에 첨가하여도 좋다.

배양 후, 본 실시형태의 효소 단백질이 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우는 세포를 파쇄한다. 한편, 본 실시형태의 단백질이 균체 외 또는 세포 외에 분비되는 경우는 배양액을 그대로 이용하거나, 원심 분리 등에 의해 회수한다.

단백질의 단리·정제에는 예컨대 유안 침전, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등을 단독으로 혹은 적절하게 조합하여 이용하면 좋다.

또한, 활성이란 글루코오스-6-인산을 DOI로 변환하는 것을 나타낸다. 활성값의 측정 방법은 이하에 나타내는 대로이다.

본 실시형태의 DOI 합성 효소 활성은 기질이 될 수 있는 적당한 글루코오스-6-인산을 포함하는 반응액에 해당 효소를 첨가하고, 생성되는 DOI를 검출하는 방법에 따라 확인할 수 있다. 생성되는 DOI의 확인은 비특허문헌(Journal of Biotechnology 129, 502-509(2007))에 기재된 방법 등을 이용할 수 있다.

DOI 합성 효소 활성을 측정하는 방법으로서는 1000 mM 글루코오스-6-인산 용액 20 μL, 100 mM NAD⁺ 용액 50 μL, 100 mM 염화코발트 육수화물 용액 50 μL를 포함하는 pH 7.0의 150 mM Bis-Tris 완충액 900 μL에 적당한 농도의 DOI 합성 효소액 100 μL를 혼합하고, 5∼60분간 정도 반응시킨 후, 효소를 실활시켜, DOI를 정량하는 방법을 사용한다.

정제된 DOI 합성 효소의 정제도의 확인이나 분자량의 측정은 전기 영동이나 겔 여과 크로마토그래피 등에 따라 행할 수 있다. 또한, 효소의 최적 온도 범위 혹은 최적 pH 범위는 반응 온도 혹은 반응 pH를 변화시켜 효소 활성을 측정하면 좋다. 더욱 DOI 합성 효소를 여러가지 pH 조건 하 또는 온도 조건 하에서 일정 시간 노출시킨 후에 효소 활성을 측정함으로써, 안정 pH 범위 및 안정 온도 범위를 조사할 수 있다. 예컨대, 각 pH 조건에 있어서의 DOI 합성 효소의 평가에는, Bis-Tris 완충액(pH 5.5∼8.0) 및 Tris 완충액(pH 7.4∼8.0)을 이용할 수 있다.

최적 pH 범위란, pH를 변화시켜 측정하였을 때에 가장 고활성을 나타낸 활성값을 100으로 하며, 활성값이 70 이상인 pH 범위이다.

안정 pH 범위란 pH를 변화시켜 측정하였을 때에 가장 고활성을 나타낸 활성값을 100으로 하며, 활성값이 70 이상인 pH 범위이다.

최적 온도 범위란, 온도를 변화시켜 측정하였을 때에 가장 고활성을 나타낸 활성값을 100으로 하며, 활성값이 50 이상인 온도 범위이다.

안정 온도 범위는 온도를 변화시켜 측정하였을 때에 가장 고활성을 나타낸 활성값을 100으로 하며, 활성값이 50 이상인 온도 범위이다.

본 실시형태에 있어서의 DOI 합성 효소의 고온 안정성이란, 안정 온도 범위의 상한이 46℃, 보다 바람직하게는 50℃, 더욱 바람직하게는 60℃, 더욱 바람직하게는 70℃, 더욱 바람직하게는 80℃, 더욱 바람직하게는 90℃, 특히 바람직하게는 95℃인 것이다. 하한은 특별히 한정하지 않지만, 통상의 조작으로부터 안정적인 온도 범위의 하한은 예컨대 20℃, 바람직하게는 10℃, 바람직하게는 5℃, 더욱 바람직하게는 1℃이면 좋다.

본 실시형태의 고온 안정성을 갖는 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소로서는, 예컨대, 50℃에서 1시간 인큐베이트한 후의 잔존 효소 활성이 50 이상인 효소를 선발할 수 있다. 잔존 효소 활성이란, 가장 고활성을 나타낸 활성값을 100으로 하는 상대 활성을 나타낸다.

통상, 공업적인 효소 반응에서는 효소를 고활성을 갖는 온도 범위 내에 제어할 필요가 있기 때문에, 온도의 제어가 매우 중요한 인자이다.

DOI 합성에서, 종래 균의 활성의 관점에서 37℃ 이하로 온도 제어하는 엄밀한 온도 관리가 필요하였다. 고온 안정성을 갖는 DOI 합성 효소를 이용하면, 고온의 범위에서도 고활성을 유지하는 것이 가능하기 때문에, 엄밀한 온도 관리를 행하는 일없이, DOI의 제조가 가능하다.

본 실시형태에 있어서의 광범위 pH 안정성을 갖는 DOI 합성 효소는, 안정 pH 범위가 바람직하게는 pH 6.0∼7.0, 보다 바람직하게는 pH 6.0∼7.4, 보다 바람직하게는 pH 6.0∼7.7, 보다 바람직하게는 pH 6.0∼8.0, 특히 보다 바람직하게는 pH 4.0∼9.0인 특성을 갖는다.

DOI 합성에 있어서, 종래, 균의 고활성의 관점에서 pH를 pH 6.0∼7.0으로 제어하는 엄밀한 pH 관리가 필요하였다. 광범위 pH 안정성을 갖는 DOI 합성 효소를 이용하면, 광범위한 pH 범위에서도 고활성을 유지하는 것이 가능하기 때문에, 엄밀한 pH 관리를 행하는 일없이, DOI의 제조가 가능하다.

본 실시형태의 효소는 작용이 저해되지 않는 한, 순도가 높은 것이 필요하지 않다. 그 때문에, 정제는 필수가 아니며, 그 외의 효소 등을 포함하여도 좋다.

[DOI의 생산]

본 실시형태의 DOI는 본 실시형태의 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 DOI를 채취하는 발효 생산법에 따라 얻을 수 있다.

상기 배양의 영양원으로서는 탄소원, 질소원, 무기 염류, 기타 유기 영양원을 포함하는 배지를 사용할 수 있다. 배양 온도는 그 균을 생육 가능한 온도이면 좋다. 배양 시간에는 특별히 제한은 없지만, 1일에서 7일 정도로 좋다. 그 후, 얻어진 배양 균체 또는 배양 상청액으로부터 DOI를 회수하면 좋다.

배양에 이용하는 탄소원으로서는 형질 전환체가 자화할 수 있는 것이면 글루코오스를 구성 성분으로 하는 다당류를 직접 이용하여도 좋고, 보다 바람직하게는, 단당류 혹은 전분이나 쌀겨나 폐당밀 등의 다당류를 포함하는 원료에 유래하는 단당류를 들 수 있으며, 구체적으로는 D-글루코오스 등을 들 수 있다. 또한, 프로모터의 발현이 유도형인 경우에는 적시 유도 물질을 첨가하면 좋다.

탄소원으로서는 D-글루코오스, 갈락토오스, 말토스, 사카로스, 트레할로오스 등의 당류나 유지류나 지방산류 더욱 n-파라핀 등을 이용할 수 있다. 유지로서는 예컨대, 카놀라유, 야자유, 팜유, 팜핵유 등을 들 수 있다. 지방산으로서는 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 라우린산, 올레인산, 팔미틴산, 리놀레산, 리놀렌산, 미리스트산 등의 포화·불포화 지방산, 혹은 이들 지방산의 에스테르나 염 등 지방산 유도체 등을 들 수 있다.

유기 영양원으로서는 아미노산류, 예컨대, 아데닌, 히스티딘, 류신, 우라실, 트립토판 등을 들 수 있다.

질소원으로서는 예컨대, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염의 외에, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스 등을 들 수 있다. 무기 염류로서는 예컨대, 인산수소나트륨, 인산이수소칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 코발트 이온을 함유하는 배지에서 DOI 합성 효소를 발현 가능한 미생물을 배양함으로써, 글루코오스-6-인산으로부터 DOI를 제조할 수 있다.

본 실시형태에서의 DOI 생산법에서는 코발트 이온은 2가의 코발트 이온의 염으로서 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 염화코발트, 황산코발트, 초산코발트 등을 들 수 있다.

배양액 중에 코발트 이온을 첨가하면, DOI 생산성은 코발트 이온을 첨가하지 않는 배양에 비해서 향상된다. 코발트 이온이 지나치게 배양액에 첨가된 경우, 미생물의 생육 저해를 야기하는 경우가 있다. 따라서, 배양 중의 코발트 농도는 해당 효소가 활성을 갖기에 충분하며, 또한 미생물에 생육 저해를 끼치지 않는 범위가 좋다. 숙주에 따르지만, 예컨대 대장균을 이용한 경우, 배양 개시 직후의 코발트 농도는, 바람직하게는 염화코발트6수화물 환산으로 0.1∼200 ㎎/L, 보다 바람직하게는 0.1∼100 ㎎/L, 더욱 보다 바람직하게는 0.1∼50 ㎎/L의 범위 내로 유지하는 것이 바람직하다. 배양 개시 직후란, 본 배양 개시로부터 균액 OD가 5에 도달하기까지의 범위를 나타낸다. 균액 OD란 배양액의 광학 밀도를 말하며, 본 실시형태에 있어서는, 600 ㎚의 광에 대한 배양액의 흡수 강도를 나타낸다.

고밀도 배양을 적용한 경우, 배양액 중의 균체 농도의 상승에 따라, 미생물 균체 내의 단백질이나 핵산, 지질, 비타민 등의 구성 성분의 원료이며, 또한, 미생물의 생육에 필요한 에너지원이 되는 글루코오스 등의 탄소원이 부족하다. 이와 같은 경우, 탄소원을 연속적으로, 혹은 단속적으로 배양액에 공급한다. 본 실시형태에서는, 더욱, 코발트 이온을 첨가하고, 해당 효소의 활성 발현에 필요한 코발트 이온을 연속적으로, 혹은 단속적으로 적량 공급하는 것이 바람직하다.

본 실시형태의 DOI 생산법에서는, 첨가 코발트값을 0.0003∼70으로 제어하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.001∼15, 더욱 바람직하게는 0.01∼5이다. 첨가 코발트값은 이하의 식에 따라 산출하였다.

첨가 코발트값=[배양액 중에의 염화코발트6수화물 총첨가량(㎎)]/배양액량(L)/균액 OD

염화코발트6수화물 이외의 코발트염을 이용한 경우는 염화코발트6수화물 환산으로 첨가 코발트값을 산출하고, 코발트 이온의 양이 적절한 값이 되도록 코발트염을 첨가하여도 좋다.

DOI를 배양액으로부터 회수하는 방법으로서는 다음과 같은 방법을 들 수 있다.

배양 종료 후, 배양액으로부터 원심 분리기나 여과 장치 등으로 균체를 제거하고, 배양 상청액을 얻는다. 이 배양 상청액에 대하여 더욱 여과 처리를 행하고, 균체 등의 고형물을 제거하며, 그 여액에 이온 교환 수지를 첨가하고, 증류수로 용출을 행한다. ICP 발광 분석, pH 등을 측정하면서 불순물을 포함하지 않는 프랙션을 분취하여, 그 수용액의 용매를 제거함으로써 DOI를 회수할 수 있다.

얻어진 DOI의 분석은 예컨대, 고속 액체 크로마토그래피나 핵자기 공명법 등에 따라 행한다.

또한, 상기 발효 생산법 이외의 방법으로서는 글루코키나제 등에 의해 글루코오스로부터 변환되는 글루코오스-6-인산을 이용하는 방법을 들 수 있고, 본 실시형태의 DOI 합성 효소 혹은 형질 전환체에 의해 글루코오스-6-인산으로부터 DOI를 얻을 수 있다.

본 실시형태의 DOI 합성 효소 및/또는 형질 전환체를 이용하여 DOI를 제조할 때의 반응 온도는 반응 속도나 효소의 안정성의 점에서, 바람직하게는 10∼95℃, 보다 바람직하게는 20∼70℃이며, 더욱 바람직하게는 30∼60℃이다.

반응 pH는 광범위하며 조정 가능하고, 효소의 안정성의 점에서, 바람직하게는 pH 2.0∼10.0, 보다 바람직하게는 pH 4.0∼8.0, 더욱 바람직하게는 6.0∼8.0이다.

반응 시간은 효소의 사용량에 따라서도 다르지만, 공업적 이용을 고려하였을 때, 바람직하게는 통상 20분∼200시간, 보다 바람직하게는 6∼80시간이다. 형질 전환체를 DOI 합성 촉매로서 이용할 때에는, 사전에, 동결 처리나 각종 파쇄 처리를 행하여도 좋다.

그러나, 본 실시형태는 이상의 반응 조건이나 반응 형태에 한정되는 것이 아니며, 적절하게 선택할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 조금도 한정되는 것이 아니다.

실시예

[실시예 1]

(1) 염색체 DNA의 조제

통상법에 따라 패니바실러스 종(Paenibacillus sp .) NBRC13157주의 염색체 DNA를 조제하였다.

패니바실러스 종 NBRC13157주를 NR 한천 플레이트(1％ 박토 트립톤, 0.2％ 효모 추출물, 1％ 에를리히 가다랑어 엑기스, 1.5％ 박토 아가, pH 7.0)에서, 30℃, 1일간 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 그 1 백금이(白金耳)를, NR 배지(1％ 박토 트립톤, 0.2％ 효모 추출물, 1％ 에를리히 가다랑어 엑기스, pH 7.0) 30 mL를 150 mL 삼각 플라스크에 나누어 주입한 것에 접종하여, 30℃, 180 rpm으로 1일간 배양하였다. 이 배양액을, 4℃에서, 12,000 g, 1분간 원심 분리하여 상청을 제거하고, 균체를 회수하였다.

얻어진 균체를 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 20 mM EDTA, 50 mM 글루코오스)에 현탁하여, 잘 세정하였다. 원심 분리하여 균체를 회수한 후, 용해 버퍼에 재현탁하고, 이것에 리소자임을 부가하여 37℃에서 45분간 인큐베이트하였다. 계속해서 SDS와 RNase를 첨가하고, 37℃에서 45분간 인큐베이트하였다. 그 후 프로테이나제 K를 첨가하고, 50℃에서 60분간 잔잔하게 진탕하였다. 여기서 얻어진 용액을 페놀-클로로포름, 클로로포름으로 처리 후, 에탄올 침전하고, 석출한 핵산을 유리 피펫에 권취하여 회수하였다. 이 핵산을 70％ 에탄올로 세정 후, 건조하고, TE에 재용해하였다. 이 조작에 의해, 약 100 ㎍의 염색체 DNA를 조제하였다.

(2) DOI 합성 효소 유전자의 단리

상기 (1)에 있어서 조제한 염색체 DNA로부터 DOI 합성 효소 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로서, 센스 프라이머는 서열번호 15의 서열을 갖는 올리고 DNA를, 안티센스 프라이머는 서열번호 16의 서열을 갖는 올리고 DNA를 각각 합성하였다.

여기서 얻어진 PCR 프라이머를 이용하며, 상기 (1)에 있어서 조제한 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR법에 따른 DOI 합성 효소 유전자의 증폭을 행하고, 1107 염기쌍으로 이루어지는 PCR 산물을 취득하였다.

여기서 얻어진 PCR 산물의 유전자 서열을 DNA 시퀀서로 해석함으로써 확인하고, 서열번호 13의 염기 서열을 갖는 기지 DOI 합성 효소(BtrC) 유전자를 얻었다. 본 유전자에 대응하는 아미노산 서열을 서열번호 14(BtrC)에 나타내었다.

(3) DOI 합성 효소 유전자의 발현 플러스미드 벡터의 구축 및 형질 전환

상기 (2)에서 취득한 PCR 산물의 평활 말단화, 인산화를 행하고, pUC19에 대장균 유래의 gapA 프로모터, SD 서열, 터미네이터를 연결한 플러스미드에 결찰하였다. 이 플러스미드 벡터에는 대장균 중에서 외래 유전자로서 연결된 유전자를 효율적으로 전사할 수 있는 gapA 프로모터가 도입되어 있고, 글루코오스를 포함하는 배지에서 재조합 미생물을 배양한 경우에 있어서도 DOI 합성 효소 유전자를 효율적으로 발현·제조시킬 수 있다.

여기서 얻어진 플러스미드 벡터를, 염화칼슘법으로 조제한 대장균 JM109주의 컴피턴트 세포에 히트쇼크법으로 형질 전환하여, 재조합 미생물을 제작하였다.

(4) 신규 DOI 합성 효소 유전자의 취득

상기 (3)에서 취득한 플러스미드 벡터에 대하여, 통상법에 따른 변이 도입을 행함으로써, 서열번호 1(DOIS-1), 서열번호 3(DOIS-2), 서열번호 5(DOIS-3), 서열번호 7(DOIS-4), 서열번호 9(DOIS-5) 및 서열번호 11(DOIS-6)에 기재된 염기 서열을 갖는 내열성 DOI 합성 효소 유전자를 얻을 수 있다. 여기서 취득한 DOI 합성 효소 유전자에 대해서도 (3)과 마찬가지로 형질 전환체의 취득을 행하였다. 또한, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11의 염기 서열에 대응하는 아미노산 서열을, 서열번호 2(DOIS-1), 서열번호 4(DOIS-2), 서열번호 6(DOIS-3), 서열번호 8(DOIS-4), 서열번호 10(DOIS-5) 및 서열번호 12(DOIS-6)에 나타내었다.

신규 DOI 합성 효소의 선발은 통상법에 따라 작성한 여러가지 DOI 합성 효소를 열처리 혹은 각종 pH 처리 후에 활성 측정을 행하는 등 하여 실시 가능하다.

[실시예 2]

[정제 효소의 취득]

실시예 1에서 제작한 DOI 합성 효소(DOIS-1)의 형질 전환체를 100 ㎎/L의 암피실린을 포함하는 LB 플레이트에서, 37℃, 1일간 배양하여, 콜로니를 형성시켰다.

계속해서 100 ㎎/L의 암피실린을 포함하는 LB 배지 30 mL를 150 mL 용량의 삼각 플라스크에 넣고, 상기 플레이트로부터 콜로니를 백금이로 접종하며, 37℃에서, 3∼8시간, OD(600 ㎚)가 0.5 정도가 될 때까지 180 rpm으로 회전 진탕 배양을 행하고, 이것을 본 배양의 전배양액으로 하였다.

500 mL 용량의 삼각 플라스크 36개에, 2 g/L의 글루코오스와 100 ㎎/L의 암피실린을 포함하는 LB 배지를 100 mL씩 넣고, 각각의 삼각 플라스크에 0.5 mL의 전배양액을 첨가하며, 37℃에서, 16시간, 180 rpm으로 회전 진탕 배양을 행하였다.

계속해서 이 배양액을, 4℃에서, 10,000 g×30분간 원심 분리하여 상청을 제거하고, 0.2 ㎎/L 염화코발트육수화물을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)으로 수회 세정하면서 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 -80℃로 동결 보존하였다.

이 동결 보존 균체를 0.2 ㎎/L 염화코발트육수화물을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)으로 현탁하고, 리소자임(Sigma사 제조 난백 유래)을 180 ㎎과 데옥시리보뉴클레아제 I(WaKo사 제조 소 유래 재조합체 용액)를 60 μL 첨가하여, 37℃에서, 5시간, 120 rpm으로 진탕하여, 균체 파쇄를 행하였다.

균체 파쇄 후의 용액을, 4℃에서, 10,000 g×30분간 원심 분리하여 균체 잔사를 제거하고, 상청을 회수하였다.

이 상청에 황산암모늄을 부가하여 30％ 포화로 하고, 4℃에서 잠시 교반한 후에, 발생한 침전을, 4℃에서, 10,000 g×30분간 원심 분리하여 제거하고, 상청을 회수하였다.

이 상청에 더욱 황산암모늄을 부가하여 40.0％ 포화로 하고, 4℃에서 잠시 교반한 후에, 발생한 침전을, 4℃에서, 10,000 g×30분간 원심 분리하여 상청을 제거하고, 침전을 회수하였다. 계속해서 이 침전을 0.2 ㎎/L 염화코발트육수화물을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)에 용해시켰다.

이 용해액을 4℃에서, 평균 분획 분자량 10,000의 초여과막을 이용하여 농축하고, 0.2 ㎎/L 염화코발트육수화물을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)을 부가하여, 재차, 농축한다고 하는 탈염 조작을 2∼3회 반복하였다.

상기에서 얻어진 효소 용액을, 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)으로 평형화한 「DEAE Sepharose FF」(GE 헬스케어 바이오사이언스 주식회사)에 흡착시킨 후, 0∼0.4 M의 염화나트륨을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)의 농도 구배법에 따라 효소를 용출시켰다.

상기에서 용출된 효소의 DOI 합성 효소의 활성 분획을 모아, 평균 분획 분자량 10,000의 초여과막을 이용하여 농축하고, 10 중량％의 황산암모늄을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)으로 현탁하며, 10 중량％의 황산암모늄을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)으로 평형화한 「HiTrap Phenyl FF(high sub)」(GE 헬스케어 바이오사이언스 주식회사)에 흡착시킨 후, 10∼0 중량％의 황산암모늄을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)의 농도 구배법에 따라 효소를 용출시켰다.

상기에서 용출된 활성 분획을 모아, 평균 분획 분자량 10,000의 초여과막을 이용하여 농축하고, 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)으로 평형화한 「MonoQ 5/50 GL」(GE 헬스케어 바이오사이언스 주식회사)에 흡착시킨 후, 0∼0.2 M의 염화나트륨을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)의 농도 구배법에 따라 효소를 용출시켰다.

상기에서 용출된 활성 분획을 모아, 평균 분획 분자량 10,000의 초여과막을 이용하여 농축하고, 0.2 ㎎/L 염화코발트육수화물과 0.1 MNaCl을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)으로 평형화한 「HiLoad 16/60 Superdex 200」(GE 헬스케어 바이오사이언스 주식회사)에 충전한 후, 동일한 완충액으로 용출을 행하였다.

상기에서 용출된 활성 분획을 모아, 평균 분획 분자량 10,000의 초여과막을 이용하여 농축하고, 정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)를 얻었다.

상기, 일련의 정제 효소 취득 실험과 동일하게 하여, 정제 DOI 합성 효소(DOIS-2), 정제 DOI 합성 효소(DOIS-3), 정제 DOI 합성 효소(DOIS-4), 정제 DOI 합성 효소(DOIS-5), 정제 DOI 합성 효소(DOIS-6) 및 정제 기지 DOI 합성 효소(BtrC)를 취득하였다.

[실시예 3]

[신규 DOI 합성 효소의 평가]

실시예 2에서 얻어진 정제 DOI 합성 효소를 이용하여, 그 작용에 관한 실험을 행하였다.

(1) 최적 pH 범위

각 pH에서의 활성 측정에서는 반응액에 정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)를 적량 첨가하고, 글루코오스-6-인산이나트륨염(오리엔탈코보 제조)이 20 mM, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM, 각종 완충액이 100 mM가 되도록 하여 반응액을 조정하였다. 완충액으로서는, Bis-Tris 완충액(pH 6.0∼7.7) 및 Tris 완충액(pH 7.4∼8.0)을 사용하였다. 반응 온도는 30℃로 하며, 생성되는 DOI를 정량함으로써 활성을 측정하였다. 가장 고활성을 나타낸 활성값을 100으로 한 상대 활성을 구하고, 이 결과를 도 1에 나타낸다. 본 발명 효소에서의 최적 pH 범위는, pH 7.0∼7.7이었다.

(2) 안정 pH 범위

pH 5.5∼8.0의 범위의 100 mM의 완충액을 이용하여, 정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)를 각 pH에서 30℃, 60분간 인큐베이트하고, 그 잔존 효소 활성을 측정하였다. 인큐베이트에 이용한 완충액으로서는 Bis-Tris 완충액(pH 5.5∼8.0) 및 Tris 완충액(pH 7.4∼8.0)을 사용하였다.

잔존 효소 활성 측정은 글루코오스-6-인산이나트륨염(오리엔탈코보 제조)이 20 mM, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되는 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0) 중에서, 반응 온도 30℃로 실시하였다. 가장 고활성을 나타낸 활성값을 100으로 한 상대 활성을 구하고, 이 결과를 도 2에 나타내었다. 본 효소의 안정 pH 범위는 pH 6.0∼8.0이며, 정제 DOI 합성 효소(DOIS-2) 및 정제 DOI 합성 효소(DOIS-3)도 동일한 결과를 나타내었다. 이들의 광범위 pH 안정성은 기존 효소에는 없는 신규 특성이었다.

(3) 최적 온도 범위

반응 온도 10∼70℃의 각 반응 온도 조건에서, 글루코오스-6-인산이나트륨염(오리엔탈코보 제조)이 20 mM, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되는 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0) 중에서, 정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)의 효소 활성 측정을 실시하였다. 가장 고활성을 나타낸 활성값을 100으로 한 상대 활성을 구하고, 이 결과를 도 3에 나타낸다. 최적 온도 범위는 55∼70℃이며, 반응 온도 65℃에 있어서의 비활성은 1.8 μ㏖(DOI)/분/㎎(효소)로 매우 높은 값을 나타내었다.

(4) 안정 온도 범위

정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)를 첨가하고 또한, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되도록 조정한 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0)을, 온도 범위 25∼60℃의 각 온도에서 1시간 인큐베이트한 후, 각각의 잔존 효소 활성을 측정하였다.

잔존 효소 활성 측정은 글루코오스-6-인산이나트륨염(오리엔탈코보 제조)이 20 mM, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되는 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0) 중에서, 반응 온도 30℃로 실시하였다. 가장 고활성을 나타낸 활성값을 100으로 한 상대 활성을 구하고, 이 결과를 도 4에 나타내었다. 정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)의 안정 온도 범위는 50℃ 이하이며, 정제 DOI 합성 효소(DOIS-2) 및 정제 DOI 합성 효소(DOIS-3)도 동일한 결과를 나타내었다. 이들의 고온 안정성은 기지 효소에는 없는 신규 특성이었다.

또한, 안정화제로서 작용하는 것이 알려져 있는 NAD+ 및 코발트 이온 비존재화로 인큐베이트한 안정 온도 범위 시험을 실시한 바, 정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)의 인큐베이트 온도 46℃에 있어서의 상대 활성은 38, 인큐베이트 온도 42℃에 있어서의 상대 활성은 89, 인큐베이트 온도 37℃에 있어서의 상대 활성은 100이었다.

(5) 분자량

분리 겔 농도가 10％인 「레이디 겔 J」(일본바이오·래드 래브러토리즈 주식회사)를 이용하는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 의해, 분자량을 구한 바, 정제 DOI 합성 효소(DOIS-1)의 분자량은 약 40,000이며, 아미노산 서열로부터 추정되는 분자량 40,656과 거의 일치하였다.

[실시예 4]

[신규 DOI 합성 효소의 평가]

실시예 2에서 얻어진 정제 DOI 합성 효소(DOIS-4)를 이용하여, 그 작용에 관한 실험을 행하였다.

(온도 안정성의 평가)

정제 DOI 합성 효소(DOIS-4)를 첨가하고 또한, 염화코발트육수화물이 5 mM 가 되도록 조정한 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0)을, 25℃ 및 42℃의 각 온도에서 1시간 인큐베이트한 후, 각각의 잔존 효소 활성을 측정하였다.

*잔존 효소 활성 측정은, 글루코오스-6-인산이나트륨염(오리엔탈코보 제조)이 20 mM, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되는 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0) 중에서, 반응 온도 30℃로 실시하였다. 25℃에서 인큐베이트하였을 때의 잔존 활성을 100이라고 하면, 42℃ 인큐베이트의 활성값은 74라고 하는 매우 높은 값을 나타내었다.

(비활성의 측정)

또한, 반응 온도 60℃에 있어서의 비활성은 1.2 μ㏖(DOI)/분/㎎(효소)로 매우 높은 값을 나타내었다.

[실시예 5]

[신규 DOI 합성 효소의 평가]

실시예 2에서 얻어진 정제 DOI 합성 효소(DOIS-5)를 이용하여, 그 작용에 관한 실험을 행하였다.

(pH 안정성의 평가)

pH 5.5∼8.0의 범위의 100 mM의 완충액을 이용하여, 정제 DOI 합성 효소(DOIS-5)를 각 pH에서 30℃, 60분간 인큐베이트하고, 그 잔존 효소 활성을 측정하였다. 인큐베이트에 이용한 완충액으로서는, Bis-Tris 완충액(pH 5.5∼8.0) 및 Tris 완충액(pH 7.4∼8.0)을 사용하였다.

잔존 효소 활성 측정은, 글루코오스-6-인산이나트륨염(오리엔탈코보 제조)이 20 mM, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되는 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0) 중에서, 반응 온도 30℃로 실시하였다. 최대활성을 100으로 하는 상대 활성을 구하고, 이 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타내는 바와 같이, 본 효소는 매우 폭넓은 pH 영역에서 높은 안정성을 나타내었다. 이 높은 안정성은, 기존 효소에는 없는 신규 특성이었다.

[실시예 6]

[신규 DOI 합성 효소의 평가]

실시예 2에서 얻어진 정제 DOI 합성 효소(DOIS-6)를 이용하여, 그 작용에 관한 실험을 행하였다.

(pH 안정성의 평가)

pH 5.5∼8.0의 범위의 100 mM의 완충액을 이용하여, 정제 DOI 합성 효소(DOIS-6)를 각 pH에서 30℃, 60분간 인큐베이트하고, 그 잔존 효소 활성을 측정하였다. 인큐베이트에 이용한 완충액으로서는 Bis-Tris 완충액(pH 5.5∼8.0)을 사용하였다.

잔존 효소 활성 측정은 글루코오스-6-인산이나트륨염(오리엔탈코보 제조)이 20 mM, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되는 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0) 중에서, 반응 온도 30℃로 실시하였다. 최대활성을 나타낸 pH 8.0의 잔존 활성을 100이라고 하면, pH 6.5∼8.0의 범위에서는 활성값은 70 이상이며, pH 6.0의 잔존 활성은 53이라고 하는 매우 높은 값을 나타내었다. 이 높은 pH 안정성은 기존 효소에는 없는 신규 특성이었다.

[실시예 7]

「DOI의 생산 방법」

500 mL 용량의 삼각 플라스크 36개에, 2 g/L의 글루코오스와 100 ㎎/L의 암피실린을 포함하는 LB 배지를 100 mL씩 넣고, 각각의 삼각 플라스크에 0.5 mL의 전배양액을 첨가하여, 37℃에서 16시간 180 rpm으로 회전 진탕 배양을 행하였다.

계속해서 이 배양액을 4℃에서, 10,000 g×30분간 원심 분리하여 상청을 제거하고, 0.2 ㎎/L 염화코발트육수화물을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)으로 수회 세정하면서 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 -80℃로 동결 보존하였다.

DOI의 합성에는, DOI 합성 촉매로서, 상기 동결 균체를 0.2 ㎎/L 염화코발트육수화물을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.7)으로 현탁한 액을 사용하였다. DOI 합성 반응의 반응액 조성은 글루코오스-6-인산이나트륨염(오리엔탈코보 제조)을 85 mM, NAD+(오리엔탈코보 제조)를 0.1 mM, 염화코발트육수화물을 1 mM, 균체 OD를 30으로 하여, DOI의 합성 반응을 개시하였다. 반응 개시 시의 pH는 7.7로 조정하고, 반응 온도 46℃에서 2.5시간 합성 반응을 행함으로써, 1 중량％의 DOI가 생성되었다. 반응 종료 후는 염산을 첨가하고, pH를 6 이하까지 저하시켰다. 계속해서 이 반응 용액을 4℃에서, 10,000 g×30분간 원심 분리하여 상청을 회수하고, 필터 여과를 하여 균체 잔사를 제거하였다.

상기에서 합성한 DOI 용액은 앰버라이트 IR120BNa(오르가노사 제조)를 H⁺형으로 재생한 양이온 교환 수지 및 앰버라이트 IRA96SB(오르가노사 제조)를 OH^-형으로 재생한 음이온 교환 수지를 이용하여 정제 처리를 행하였다. 본 정제 처리에 있어서는, 컬럼 처리 및 일괄 처리를 병용하고, ICP 발광 분석법에 따라 P, Co, Na가 미검출이며 또한 DOI 용액을 포함한 분획을 회수하였다.

계속해서, 상기에서 얻어진 DOI 용액에, 용액 중의 DOI 1 g에 대하여 0.5 g의 활성탄 카르보라핀(니혼엔바이로케미컬즈사 제조)을 첨가하고, 1시간 실온에서 교반하여 미량 불순물을 활성탄에 흡착시켰다. 1시간 후, 여과 조작에 의해 활성탄을 제거하고, DOI 용액을 회수하였다. 본 DOI 용액을 감압 농축함으로써, DOI를 농축하고, 동결 건조에 의해 DOI의 분말을 얻었다.

[실시예 8]

계속해서 100 ㎎/L의 암피실린을 포함하는 LB 배지 30 mL를 150 mL 용량의 삼각 플라스크에 넣고, 상기 플레이트로부터 콜로니를 백금이로 접종하며, 37℃에서, 3∼8시간, OD가 0.5 정도가 될 때까지 180 rpm으로 회전 진탕 배양을 행하여, 이것을 본 배양의 전배양액으로 하였다.

표 1에 나타내는 다른 농도의 염화코발트6수화물을 포함한 배지(A) 100 mL를 500 mL 용량의 삼각 플라스크에 각각 넣고, 더욱 0.5 mL의 전배양액을 첨가하며, 37℃에서, 18시간, 180 rpm으로 회전 진탕 배양을 행하였다. 배양 18시간 후의 각 배지 조건의 균액 OD, 첨가 코발트값 및 코발트 이온 무첨가 배지의 상청 DOI 농도를 100으로 하였을 때의 상대값(DOI 생산성)을 표 2에 나타내었다.

배지(A)
인산이수소칼륨	2 g/L
인산수소이암모늄	3 g/L
황산마그네슘칠수화물	0.2 mg/L
티아민염산염	20 mg/L
효모 엑기스	3 g/L
글루코오스	10 g/L
염화코발트육수화물	0∼20 mg/L
(*)증류수로 용해하여, pH 7.0으로 조정

염화코발트6수화물 첨가 농도(mg/L)	균액 OD	첨가 코발트값	상대값(DOI 생산성)
0	4.2	0.00	100
0.1	4.3	0.02	114
0.5	4.4	0.11	118
1	4.3	0.23	124
3	4.2	0.71	131
5	4.3	1.17	125
7	4.0	1.77	114
10	4.3	2.30	122
20	4.6	4.37	122

비교예 1

[기지 DOI 합성 효소의 평가]

서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 정제 기지 DOI 합성 효소(BtrC)에 관해서, 실시예 3-(4) 안정 온도 범위와 동일하게 하여 이하의 실험을 행하였다.

정제 기지 DOI 합성 효소(BtrC)를 첨가하고 또한, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되도록 조정한 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0)을, 온도 범위 25∼60℃의 각 온도에서 1시간 인큐베이트한 후, 각각의 잔존 효소 활성을 측정하였다.

잔존 효소 활성 측정은 글루코오스-6-인산이나트륨염(오리엔탈코보 제조)이 20 mM, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되는 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0) 중에서, 반응 온도 30℃로 실시하였다. 최대 활성을 100으로 하는 상대 활성을 구하고, 이 결과를 도 6에 나타내었다. 정제 기지 DOI 합성 효소(BtrC)의 안정 온도 범위는 42℃ 이하이며, 46℃에서의 상대 활성은 23, 50℃에서의 상대 활성은 0으로 현저하게 낮은 열안정성을 나타내었다.

또한, 안정화제로서 작용하는 것이 알려져 있는 NAD+ 및 코발트 이온 비존재화로 인큐베이트한 안정 온도 범위 시험을 실시한 바, 정제 기지 DOI 합성 효소(BtrC)의 인큐베이트 온도 42℃ 및 46℃에 있어서의 상대 활성은 0, 인큐베이트 온도 37℃에 있어서의 상대 활성은 14였다. 본 실험으로부터도 기존 효소가 현저하게 낮은 열안정성을 갖는 것이 나타났다.

서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 정제 기지 DOI 합성 효소(BtrC)에 관해서, 실시예 3-(2) 안정 pH 범위와 동일하게 하여 이하의 실험을 행하였다.

정제 기지 DOI 합성 효소(BtrC)를 각 pH에서 30℃, 60분간 인큐베이트하고, 그 잔존 효소 활성을 측정하였다. 인큐베이트에 이용한 완충액으로서는 Bis-Tris 완충액(pH 5.5∼7.0) 및 Tris 완충액(pH 7.4∼8.0)을 사용하였다.

잔존 효소 활성 측정은 글루코오스-6-인산이나트륨염(오리엔탈코보 제조)이 20 mM, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되는 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0) 중에서, 반응 온도 30℃로 실시하였다. 최대 활성을 100으로 하는 상대 활성을 구하고, 이 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타내는 바와 같이, pH 6에 있어서의 상대 활성은 27로 매우 낮은 값이며, pH 5.5에서는 거의 완전하게 실활되어 있었다.

[비교예 2]

[기지 DOI 합성 효소의 평가]

서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 정제 기지 DOI 합성 효소(BtrC)에 관해서, 실시예 3과 동일하게 하여 이하의 실험을 행하였다.

정제 기지 DOI 합성 효소(BtrC)를 첨가하고 또한, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되도록 조정한 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0)을, 25℃ 및 42℃의 각 온도에서 1시간 인큐베이트한 후, 각각의 잔존 효소 활성을 측정하였다.

잔존 효소 활성 측정은, 글루코오스-6-인산이나트륨염(오리엔탈코보 제조)이 20 mM, NAD+(오리엔탈코보 제조)가 5 mM, 염화코발트육수화물이 5 mM가 되는 100 mM Bis-Tris 완충액(pH 7.0) 중에서, 반응 온도 30℃로 실시하였다. 25℃에서 인큐베이트하였을 때의 잔존 활성을 100으로 하여, 42℃ 인큐베이트의 활성값은 0이 되며, 현저하게 낮은 열안정성을 나타내었다.

[산업상 이용가능성]

본 발명에 따라, 산업상 유용하다고 되는 방향족 화합물(카테콜 등)의 전구체로서 이용 가치가 높은 DOI를 효율적인 제조 프로세스로 생산할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Asahi Kasei Chemicals Corporation <120>　Novel 2-deoxy-scyllo-inosose synthetase <130> F109209-WO <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1107) <400> 1 atg acg act aaa caa att tgt ttt gcg gac cgg tgt ttt aac ttt gca 48 Met Thr Thr Lys Gln Ile Cys Phe Ala Asp Arg Cys Phe Asn Phe Ala 1 5 10 15 ttc ggc gaa cag att ttg gaa tcg att gcc gcc tat att cac cgg gat 96 Phe Gly Glu Gln Ile Leu Glu Ser Ile Ala Ala Tyr Ile His Arg Asp 20 25 30 gaa ttc gat caa tat atc gtg att tcg gac tcg ggg gta ccg gac tcg 144 Glu Phe Asp Gln Tyr Ile Val Ile Ser Asp Ser Gly Val Pro Asp Ser 35 40 45 att gtt cat cat gcg gcc gaa tac ttc ggc aga ctc gcc cct gta cat 192 Ile Val His His Ala Ala Glu Tyr Phe Gly Arg Leu Ala Pro Val His 50 55 60 att ctt cgc ttt cag ggc gga gaa gaa tac aaa aca ctt gca acc gtg 240 Ile Leu Arg Phe Gln Gly Gly Glu Glu Tyr Lys Thr Leu Ala Thr Val 65 70 75 80 aca aat ttg caa gag cag gca att gct ctg gga gcc aac cga aga acc 288 Thr Asn Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Leu Gly Ala Asn Arg Arg Thr 85 90 95 gct atc gta gcg gtt ggc gga ggg tta acc gga aac gtt gcc gga gtg 336 Ala Ile Val Ala Val Gly Gly Gly Leu Thr Gly Asn Val Ala Gly Val 100 105 110 gcg gcc ggc atg atg ttt cgc ggg att gcg ctt att cac gtt ccg acc 384 Ala Ala Gly Met Met Phe Arg Gly Ile Ala Leu Ile His Val Pro Thr 115 120 125 acg ttt ttg gcg gcc tcc gat tcg gtt ctt tcg att aag cag gct gtt 432 Thr Phe Leu Ala Ala Ser Asp Ser Val Leu Ser Ile Lys Gln Ala Val 130 135 140 aat tta acg agc gga aag aac ctg gtc ggc ttt tat tat ccg cca cgc 480 Asn Leu Thr Ser Gly Lys Asn Leu Val Gly Phe Tyr Tyr Pro Pro Arg 145 150 155 160 ttc gtg ttc gcc gat acc cga atc ttg gcg gag tcg ccg ccc cgt cag 528 Phe Val Phe Ala Asp Thr Arg Ile Leu Ala Glu Ser Pro Pro Arg Gln 165 170 175 gtg aaa gcg gga atg tgc gag ctg gta aaa aat atg ctg att ctg gaa 576 Val Lys Ala Gly Met Cys Glu Leu Val Lys Asn Met Leu Ile Leu Glu 180 185 190 aac gag cac atg gaa ttt aca gag gat gat tta aat gca gcc aat gtg 624 Asn Glu His Met Glu Phe Thr Glu Asp Asp Leu Asn Ala Ala Asn Val 195 200 205 tat act ccg agg cag ctg gag acg ttt atc aac ttc tgc ata tcg gcc 672 Tyr Thr Pro Arg Gln Leu Glu Thr Phe Ile Asn Phe Cys Ile Ser Ala 210 215 220 aaa atg tcg gta tta agc gaa gat att tac gag aaa aag aag ggc ctg 720 Lys Met Ser Val Leu Ser Glu Asp Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Gly Leu 225 230 235 240 atc ttt gag tac ggc cat acg atc ggt cat gcg atc gag ctt gcc gag 768 Ile Phe Glu Tyr Gly His Thr Ile Gly His Ala Ile Glu Leu Ala Glu 245 250 255 cag gga ggg atc acg cac gga gaa gcc att gca gtg ggc atg att tac 816 Gln Gly Gly Ile Thr His Gly Glu Ala Ile Ala Val Gly Met Ile Tyr 260 265 270 gcc gct aaa ata gcg aac cgg atg aac ctg ctg tcc gaa cag gac gtg 864 Ala Ala Lys Ile Ala Asn Arg Met Asn Leu Leu Ser Glu Gln Asp Val 275 280 285 tcc acc cat tac tgg ctt tta aat aaa atc ggg gcc ttg cag gag ctt 912 Ser Thr His Tyr Trp Leu Leu Asn Lys Ile Gly Ala Leu Gln Glu Leu 290 295 300 ccg ctc cga gcg gac gcg gat tcg gtc ttc cat tat tta atc cac gat 960 Pro Leu Arg Ala Asp Ala Asp Ser Val Phe His Tyr Leu Ile His Asp 305 310 315 320 aac aag agg ggc tac att aag ctg gat gag gat aat ttg ggt atg att 1008 Asn Lys Arg Gly Tyr Ile Lys Leu Asp Glu Asp Asn Leu Gly Met Ile 325 330 335 tta ctt gag gga atc ggt cga ccg gcg gtt cat aac caa tcg ctg ctt 1056 Leu Leu Glu Gly Ile Gly Arg Pro Ala Val His Asn Gln Ser Leu Leu 340 345 350 aca ccg gtc aag aaa tcg ctc ata aaa gaa gtg atc cgg gaa ggg ctg 1104 Thr Pro Val Lys Lys Ser Leu Ile Lys Glu Val Ile Arg Glu Gly Leu 355 360 365 taa 1107 <210> 2 <211> 368 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 2 Met Thr Thr Lys Gln Ile Cys Phe Ala Asp Arg Cys Phe Asn Phe Ala 1 5 10 15 Phe Gly Glu Gln Ile Leu Glu Ser Ile Ala Ala Tyr Ile His Arg Asp 20 25 30 Glu Phe Asp Gln Tyr Ile Val Ile Ser Asp Ser Gly Val Pro Asp Ser 35 40 45 Ile Val His His Ala Ala Glu Tyr Phe Gly Arg Leu Ala Pro Val His 50 55 60 Ile Leu Arg Phe Gln Gly Gly Glu Glu Tyr Lys Thr Leu Ala Thr Val 65 70 75 80 Thr Asn Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Leu Gly Ala Asn Arg Arg Thr 85 90 95 Ala Ile Val Ala Val Gly Gly Gly Leu Thr Gly Asn Val Ala Gly Val 100 105 110 Ala Ala Gly Met Met Phe Arg Gly Ile Ala Leu Ile His Val Pro Thr 115 120 125 Thr Phe Leu Ala Ala Ser Asp Ser Val Leu Ser Ile Lys Gln Ala Val 130 135 140 Asn Leu Thr Ser Gly Lys Asn Leu Val Gly Phe Tyr Tyr Pro Pro Arg 145 150 155 160 Phe Val Phe Ala Asp Thr Arg Ile Leu Ala Glu Ser Pro Pro Arg Gln 165 170 175 Val Lys Ala Gly Met Cys Glu Leu Val Lys Asn Met Leu Ile Leu Glu 180 185 190 Asn Glu His Met Glu Phe Thr Glu Asp Asp Leu Asn Ala Ala Asn Val 195 200 205 Tyr Thr Pro Arg Gln Leu Glu Thr Phe Ile Asn Phe Cys Ile Ser Ala 210 215 220 Lys Met Ser Val Leu Ser Glu Asp Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Gly Leu 225 230 235 240 Ile Phe Glu Tyr Gly His Thr Ile Gly His Ala Ile Glu Leu Ala Glu 245 250 255 Gln Gly Gly Ile Thr His Gly Glu Ala Ile Ala Val Gly Met Ile Tyr 260 265 270 Ala Ala Lys Ile Ala Asn Arg Met Asn Leu Leu Ser Glu Gln Asp Val 275 280 285 Ser Thr His Tyr Trp Leu Leu Asn Lys Ile Gly Ala Leu Gln Glu Leu 290 295 300 Pro Leu Arg Ala Asp Ala Asp Ser Val Phe His Tyr Leu Ile His Asp 305 310 315 320 Asn Lys Arg Gly Tyr Ile Lys Leu Asp Glu Asp Asn Leu Gly Met Ile 325 330 335 Leu Leu Glu Gly Ile Gly Arg Pro Ala Val His Asn Gln Ser Leu Leu 340 345 350 Thr Pro Val Lys Lys Ser Leu Ile Lys Glu Val Ile Arg Glu Gly Leu 355 360 365 <210> 3 <211> 1113 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1113) <400> 3 atg acg act aaa caa att tgt ttt gcg gac cgg tgt ttt aac ttt gca 48 Met Thr Thr Lys Gln Ile Cys Phe Ala Asp Arg Cys Phe Asn Phe Ala 1 5 10 15 ttc ggc gaa cag att ttg gaa tcg att gcc gcc tat att cac cgg gat 96 Phe Gly Glu Gln Ile Leu Glu Ser Ile Ala Ala Tyr Ile His Arg Asp 20 25 30 gaa ttc gat caa tat atc gtg att tcg gac tcg ggg gta ccg gac tcg 144 Glu Phe Asp Gln Tyr Ile Val Ile Ser Asp Ser Gly Val Pro Asp Ser 35 40 45 att gtt cat cat gcg gcc gaa tac ttc ggc aga ctc gcc cct gta cat 192 Ile Val His His Ala Ala Glu Tyr Phe Gly Arg Leu Ala Pro Val His 50 55 60 att ctt cgc ttt cag ggc gga gaa gaa tac aaa aca ctt gca acc gtg 240 Ile Leu Arg Phe Gln Gly Gly Glu Glu Tyr Lys Thr Leu Ala Thr Val 65 70 75 80 aca aat ttg caa gag cag gca att gct ctg gga gcc aac cga aga acc 288 Thr Asn Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Leu Gly Ala Asn Arg Arg Thr 85 90 95 gct atc gta gcg gtt ggc gga ggg tta acc gga aac gtt gcc gga gtg 336 Ala Ile Val Ala Val Gly Gly Gly Leu Thr Gly Asn Val Ala Gly Val 100 105 110 gcg gcc ggc atg atg ttt cgc ggg att gcg ctt att cac gtt ccg acc 384 Ala Ala Gly Met Met Phe Arg Gly Ile Ala Leu Ile His Val Pro Thr 115 120 125 acg ttt ttg gcg gcc tcc gat tcg gtt ctt tcg att aag cag gct gtt 432 Thr Phe Leu Ala Ala Ser Asp Ser Val Leu Ser Ile Lys Gln Ala Val 130 135 140 aat tta acg agc gga aag aac ctg gtc ggc ttt tat tat ccg cca cgc 480 Asn Leu Thr Ser Gly Lys Asn Leu Val Gly Phe Tyr Tyr Pro Pro Arg 145 150 155 160 ttc gtg ttc gcc gat acc cga atc ttg gcg gag tcg ccg ccc cgt cag 528 Phe Val Phe Ala Asp Thr Arg Ile 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 ttacagccct tcccggatc 19 31

Claims

염화코발트 6수화물 환산으로 0.1~20 mg/L의 범위로 코발트 이온을 함유하는 배지에서 서열번호 2, 4, 6 또는 8 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 2-데옥시-실로-이노소스 합성 효소를 발현 가능한 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 글루코오스-6-인산으로부터 2-데옥시-실로-이노소스를 제조하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 글루코오스를 구성 성분으로 하는 다당류 또는 글루코오스를 함유하는 원료를 미생물의 배양에 필요한 탄소원으로서 이용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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