WO2010109916A1 - 新規２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素 - Google Patents

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WO2010109916A1
WO2010109916A1 PCT/JP2010/002210 JP2010002210W WO2010109916A1 WO 2010109916 A1 WO2010109916 A1 WO 2010109916A1 JP 2010002210 W JP2010002210 W JP 2010002210W WO 2010109916 A1 WO2010109916 A1 WO 2010109916A1
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deoxy
siro
amino acid
doi
inosose
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PCT/JP2010/002210
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小西一誠
今津晋一
Original Assignee
旭化成ケミカルズ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)

Definitions

  • the present invention relates to a thermostable 2-deoxy-siro-inosose synthase, a 2-deoxy-siro-inosose synthase gene, a recombinant vector, a transformant, and a method for producing 2-deoxy-siro-inosose.
  • DOI 2-deoxy-siro-inosose
  • DOI synthase 2-deoxy-siro-inosose synthase
  • DOI synthase was isolated and purified in 1997 from microorganisms belonging to Bacillus circulans, which is a butyrosine-producing bacterium (Non-patent Document 2), and its gene sequence has also been released (Patent Document 1). In addition to this, DOI synthase derived from Streptoallotichichus Malawistanus JCM3268 (Non-patent Document 3) has been discovered so far.
  • DOI synthase (BtrC) derived from a microorganism belonging to Bacillus circulans ⁇ ⁇ has a large problem in stability and the like, and the specific activity of DOI synthase derived from Streptoalloychus tribestanus JCM3268 strain is remarkably low, and industrial use is difficult. there were.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a DOI synthetase that is superior in properties such as stability to heat and pH compared to conventional enzymes, and to provide a DOI production method using the enzyme. .
  • the present invention relates to the following DOI synthetase, DOI synthetase gene, recombinant vector, transformant, and DOI production method.
  • 2-deoxy-shiro- having the following characteristics (1), (2), (4), (6) and (7) and having the following characteristics (3) and / or (5) Inosource synthase.
  • This enzyme has a function of converting glucose-6-phosphate into 2-deoxy-siro-inosose.
  • A the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 or 12;
  • B 80% or more homology with the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 or 12 and high temperature stability and / or wide-range pH stability An amino acid sequence; or
  • c including one or more amino acid deletions, additions, and / or substitutions with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12.
  • a 2-deoxy-siro-inosose synthase gene having a base sequence encoding any one of the following amino acid sequences.
  • a 2-deoxy-siro-inosose synthase gene having any of the following base sequences: (A) the nucleotide sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 or 11; (B) 80% or more homology to the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 or 11 and high temperature stability and / or wide-range pH stability A base sequence encoding 2-deoxy-siro-inosose synthase; or (c) one or a plurality of bases with respect to the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 or 11 A base sequence encoding 2-deoxy-siro-inosose synthase comprising deletion, addition, and / or substitution of and having high temperature stability and / or broad pH stability:
  • a recombinant vector comprising the 2-deoxy-siro-inosose synthase gene according to [6] or [7].
  • a method for producing 2-deoxy-siro-inosose wherein the 2-deoxy-siro-inosose synthase according to any one of [1] to [5] or [10] is used.
  • Glucose and glucose are used as constituents, using the 2-deoxy-siro-inosose synthase gene described in [6] or [7] or the transformant described in [9].
  • 2-deoxy-siro-inosose synthase gene described in [6] or [7] or the transformant described in [9].
  • 2-deoxy-siro-inosose using polysaccharides and / or glucose-6-phosphate as raw materials.
  • the enzyme can be used under high temperature conditions in the production of DOI. Furthermore, depending on the manufacturing conditions, strict temperature control during manufacturing becomes unnecessary. In addition, DOI can be produced under acidic conditions where the DOI is in a stable pH range. Furthermore, depending on manufacturing conditions, strict pH control at the time of manufacturing becomes unnecessary.
  • FIG. 1 shows the optimum pH range of purified DOI synthase (DOIS-1) (Example 3).
  • FIG. 2 shows the stable pH range of purified DOI synthase (DOIS-1) (Example 3).
  • FIG. 3 shows the optimum temperature range of purified DOI synthase (DOIS-1) (Example 3).
  • FIG. 4 shows the stable temperature range of purified DOI synthase (DOIS-1) (Example 3).
  • FIG. 5 shows the stable temperature range of purified DOI synthase (DOIS-1) (Example 3).
  • FIG. 6 shows the stable temperature range of purified known DOI synthase (BtrC) (Comparative Example 1).
  • FIG. 7 shows the stable pH range of purified known DOI synthase (BtrC) (Comparative Example 1).
  • the DOI synthase in the form for carrying out the present invention has the following characteristics: (1) Action: This enzyme has a function of converting glucose-6-phosphate into DOI. (2) Stability: shows high temperature stability and / or wide-range pH stability.
  • the DOI synthetase in the present invention has the following properties (1), (2), (4), (6) and (7), and the following properties (3) and / or (5):
  • Coenzyme Uses NAD + (7) Molecular weight: 39000-42000
  • the DOI synthase in the present invention has the following properties (8) and / or (9) in addition to the above properties.
  • Cofactor Increased activity by adding Co 2+ ions
  • the DOI synthetase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12 preferably has high temperature stability and / or wide-range pH stability characteristics.
  • the DOI synthetase having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12 preferably has excellent high-temperature stability and / or wide-range pH stability characteristics in the present embodiment.
  • the DOI synthetase is preferably at least 80% or more, more preferably 85, with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 or 12. % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 99% or more.
  • the DOI synthase contains one or a plurality of amino acids in at least one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 or 12. Deletions, substitutions and / or additions may be included.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted and / or added is preferably 1 to 50, more preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to The number is 5, more preferably 1 to 3.
  • Enzymes having an amino acid sequence, having excellent high temperature stability and / or broad pH stability characteristics and having DOI synthase activity are included in the present invention.
  • the homology of amino acid sequences in DOI synthase can be determined by, for example, the BESTFIT program (Devereux et al (1984) NucleicidAcids Research 12, p387-395) supplied by UWGCG Package, PILEUP or BLAST algorithm (Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36: 290-300; Altschul SF (1990) J Mol Biol 215: 403-10).
  • the DOI synthase gene of the present embodiment may be a natural gene isolated or extracted from a metagenome or a microorganism, or may be synthesized by a known method such as a PCR method or an artificial synthesis method according to its base sequence.
  • a known DOI synthase gene may be combined with the preparation of a novel DOI enzyme chimera gene.
  • Paenibacillus sp. Examples thereof include DOI synthase genes derived from the NBRC13157 strain, Streptoallotichus Malawistanus JCM3268, Streptomyces fradiae NBRC12773 strain, and the like.
  • the transformant can be cultured to obtain DOI synthase.
  • the DOI synthetase obtained from the DOI synthetase gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, or 11 has high temperature stability and / or wide-range pH stability characteristics. Is preferred.
  • the DOI synthetase gene is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably DOI synthase gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 or 11.
  • it may have a base sequence having a homology of 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 99% or more.
  • a DOI synthase gene encoding an enzyme having a wide range of pH stability characteristics and having DOI synthase activity is included in the present invention.
  • the DOI synthase gene is a deletion, addition, and / or deletion of one or more bases from the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, or 11.
  • substitution may be included.
  • a DOI synthetase gene having a base sequence encoding a DOI synthetase having a wide range of pH stability is included in the present invention.
  • the number of bases to be deleted, added and / or substituted is preferably 1 to 50, more preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to The number is 5, more preferably 1 to 3.
  • a DOI synthase gene having a base sequence encoding any of the following amino acid sequences (a), (b), or (c) may be used.
  • the recombinant vector of this embodiment can be obtained by linking (inserting) the gene of this embodiment into a known vector such as a plasmid.
  • the vector is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA.
  • plasmid DNA examples include plasmids derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), and yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YEp24, YCp50 , PYE52, etc.), and phage DNA includes ⁇ phage and the like.
  • Escherichia coli eg, pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, etc.
  • yeast-derived plasmids eg, YEp13, YEp24, YCp50 , PYE
  • the gene of the present embodiment is inserted into the vector by first cutting the purified DNA with an appropriate restriction enzyme, inserting it into an appropriate restriction enzyme site or multicloning site of the vector DNA, and ligating it to the vector. Is adopted.
  • the promoter is not particularly limited, and any promoter known to function in the host can be used. The promoter will be described in detail for each host in the transformant described later. If necessary, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a ribosome binding sequence (SD sequence), a terminator sequence and the like may be arranged.
  • the transformant of this embodiment can be obtained by introducing the recombinant vector of this embodiment into a host so that the target gene can be expressed.
  • the host is not particularly limited as long as it can express the DNA of the present embodiment.
  • the genus Escherichia such as Escherichia coli
  • the Bacillus genus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas putida and other Pseudomonas genus, Rhizobium meliloti and other genus Rhizobium genus
  • Saccharomyces cerevisiae yeast and other animal cells such as COS cells, CHO cells
  • insect cells such as Sf19 and Sf21 can be mentioned.
  • the host used as the transformant of the present embodiment preferably has a function of synthesizing glucose-6-phosphate from monosaccharides such as glucose, fructose, galactose, and xylose. Moreover, it is also preferable that it has a function which decomposes
  • the recombinant vector of the present embodiment can autonomously replicate in each bacterium, and a promoter, ribosome binding sequence, It is desirable that the gene is composed of the gene of the embodiment and a transcription termination sequence. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained.
  • Escherichia coli include Escherichia coli K12, DH1, DH10B (Invitrogen), BL21-CodonPlus (DE3) -RIL (Stratagene), TOP10F, and Bacillus subtilis (B Subtilis) MI114, 207-21 and the like.
  • the promoter is not particularly limited as long as it functions in a host such as Escherichia coli.
  • a promoter derived from Escherichia coli such as gapA promoter, gadA promoter, trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, or phage such as T7 promoter. Origin promoters can be used.
  • the method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it can introduce DNA into bacteria.
  • a method using calcium ions Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 2110 (1972)), electroporation method and the like.
  • yeast When yeast is used as a host, for example, S. cerevisiae, Pichia pastoris and the like are used.
  • promoters that can be expressed in yeast include gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MF ⁇ ⁇ 1 promoter, PHO5 promoter, AOX promoter and the like.
  • Examples of methods for introducing a recombinant vector into yeast include electroporation (Becker, DM et al.: Methods. Enzymol., 194: 180 (1990)), spheroplast method (Hinnen, A. et al. : Proc Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978)), lithium acetate method (Itoh, H.: J. Bacteriol., 153: 163 (1983)).
  • the enzyme of the present embodiment can be obtained by culturing the transformant of the present embodiment in an appropriate medium and collecting a protein having the enzyme activity from the culture.
  • the method for culturing the transformant of the present embodiment may be determined according to the host. For example, in the case of a transformant whose host is a microorganism such as Escherichia coli or yeast, any medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism and capable of efficiently culturing the transformant. For example, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • IAA indole acrylic acid
  • the enzyme protein of the present embodiment After culturing, if the enzyme protein of the present embodiment is produced in cells or cells, the cells are disrupted. On the other hand, when the protein of the present embodiment is secreted outside the cells or cells, the culture solution is used as it is or collected by centrifugation or the like.
  • ammonium sulfate precipitation for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like may be used alone or in appropriate combination.
  • the activity indicates that glucose-6-phosphate is converted to DOI.
  • the method for measuring the activity value is as follows.
  • the DOI synthetase activity of the present embodiment can be confirmed by a method of detecting the DOI produced by adding the enzyme to a reaction solution containing an appropriate glucose-6-phosphate that can serve as a substrate.
  • a method described in a non-patent document Journal of Biotechnology 129, 502-509 (2007)
  • DOI synthase activity As a method for measuring DOI synthase activity, it is suitable for 900 ⁇ L of 150 mM Bis-Tris buffer pH 7.0 containing 20 ⁇ L of 1000 mM glucose-6-phosphate solution, 50 ⁇ L of 100 mM NAD + solution, and 50 ⁇ L of 100 mM cobalt chloride hexahydrate solution.
  • a method is used in which 100 ⁇ L of DOI synthase solution with a concentration is mixed and reacted for about 5 to 60 minutes, then the enzyme is inactivated and DOI is quantified.
  • the confirmation of the degree of purification and molecular weight measurement of the purified DOI synthase can be performed by electrophoresis, gel filtration chromatography, or the like. Moreover, what is necessary is just to measure enzyme activity by changing reaction temperature or reaction pH for the optimal temperature range or optimal pH range of an enzyme. Furthermore, the stable pH range and the stable temperature range can be examined by measuring the enzyme activity after exposing the DOI synthase to various pH conditions or temperature conditions for a certain period of time. For example, Bis-Tris buffer (pH 5.5 to 8.0) and Tris buffer (pH 7.4 to 8.0) can be used for evaluation of DOI synthase under each pH condition.
  • the optimum pH range is a pH range in which the activity value showing the highest activity when measured by changing the pH is 100 and the activity value is 70 or more.
  • the stable pH range is a pH range in which the activity value showing the highest activity when measured by changing the pH is 100 and the activity value is 70 or more.
  • the optimal temperature range is a temperature range in which the activity value showing the highest activity when measured by changing the temperature is 100, and the activity value is 50 or more.
  • the stable temperature range is a temperature range in which the activity value showing the highest activity when measured by changing the temperature is 100, and the activity value is 50 or more.
  • the high temperature stability of the DOI synthase in the present embodiment means that the upper limit of the stable temperature range is 46 ° C., more preferably 50 ° C., more preferably 60 ° C., further preferably 70 ° C., more preferably 80 ° C., further preferably Is 90 ° C., particularly preferably 95 ° C.
  • the lower limit is not particularly limited, but the lower limit of the temperature range stable from normal operation is, for example, 20 ° C, preferably 10 ° C, preferably 5 ° C, and more preferably 1 ° C.
  • an enzyme having a residual enzyme activity of 50 or more after incubation at 50 ° C. for 1 hour can be selected.
  • the residual enzyme activity refers to a relative activity with the activity value showing the highest activity as 100.
  • temperature control is a very important factor because it is necessary to control the temperature within a temperature range where the enzyme has high activity.
  • strict temperature control is required to control the temperature to 37 ° C. or lower.
  • the DOI synthetase having a wide range of pH stability in the present embodiment preferably has a stable pH range of pH 6.0 to 7.0, more preferably pH 6.0 to 7.4, and more preferably pH 6.0 to 7. 7, more preferably pH 6.0 to 8.0, particularly preferably pH 4.0 to 9.0.
  • DOI synthesis conventionally, strict pH control is required to control pH to 6.0 to 7.0 from the viewpoint of high activity of bacteria.
  • a DOI synthetase having a wide range of pH stability is used, high activity can be maintained even in a wide range of pH, so that DOI can be produced without strict pH control.
  • the enzyme according to the present embodiment does not require high purity unless the action is inhibited. Therefore, purification is not essential and may contain other enzymes.
  • the DOI of the present embodiment can be obtained by a fermentation production method in which DOI is collected from a culture obtained by culturing the transformant of the present embodiment.
  • a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other organic nutrient sources can be used as a nutrient source for the culture.
  • the culture temperature may be any temperature at which the bacteria can grow.
  • the culture time is not particularly limited, but may be about 1 to 7 days. Then, what is necessary is just to collect
  • a polysaccharide comprising glucose as a constituent may be directly used as long as the transformant can assimilate, and more preferably a monosaccharide or starch, rice bran or molasses. Examples thereof include monosaccharides derived from raw materials containing saccharides, such as D-glucose.
  • an inducer may be added in a timely manner.
  • saccharides such as D-glucose, galactose, maltose, saccharose, trehalose, fats and oils, fatty acids, and n-paraffin
  • fats and oils include rapeseed oil, coconut oil, palm oil, and palm kernel oil.
  • fatty acids include saturated and unsaturated fatty acids such as hexanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, lauric acid, oleic acid, palmitic acid, linoleic acid, linolenic acid and myristic acid, and fatty acid derivatives such as esters and salts of these fatty acids. It is done.
  • Organic nutrient sources include amino acids such as adenine, histidine, leucine, uracil, tryptophan and the like.
  • nitrogen source examples include ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, peptone, meat extract, yeast extract and the like.
  • inorganic salts include sodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, magnesium sulfate, sodium chloride and the like.
  • DOI can be produced from glucose-6-phosphate by culturing a microorganism capable of expressing DOI synthase in a medium containing cobalt ions.
  • cobalt ions are preferably used as salts of divalent cobalt ions.
  • Specific examples include cobalt chloride, cobalt sulfate, and cobalt acetate.
  • the cobalt concentration in the culture should be in a range that is sufficient for the enzyme to have activity and does not inhibit the growth of microorganisms.
  • the cobalt concentration immediately after the start of the culture is preferably 0.1 to 200 mg / L, more preferably 0.1 to 100 mg / L, even more preferably in terms of cobalt chloride hexahydrate. It is preferably maintained within the range of 0.1 to 50 mg / L.
  • the term “immediately after the start of culture” refers to the range from the start of main culture until the bacterial liquid OD reaches 5.
  • the bacterial solution OD means the optical density of the culture solution, and in the present embodiment, indicates the absorption intensity of the culture solution with respect to 600 nm light.
  • the energy required for the growth of microorganisms which is a raw material for components such as proteins, nucleic acids, lipids, and vitamins in microbial cells as the concentration of cells in the culture increases.
  • the source of carbon such as glucose is insufficient.
  • a carbon source is supplied to the culture solution continuously or intermittently.
  • the added cobalt value is preferably controlled to 0.0003 to 70, more preferably 0.001 to 15, and further preferably 0.01 to 5.
  • the added cobalt value was calculated by the following formula.
  • Added cobalt value [total amount of cobalt chloride hexahydrate added to the culture solution (mg)] / culture solution amount (L) / bacterial solution OD
  • the added cobalt value is calculated in terms of cobalt chloride hexahydrate, and the cobalt salt is added so that the amount of cobalt ions is an appropriate value. Good.
  • Examples of methods for recovering DOI from the culture solution include the following methods.
  • the cells are removed from the culture solution with a centrifuge or a filtration device to obtain a culture supernatant.
  • the culture supernatant is further filtered to remove solids such as bacterial cells, and an ion exchange resin is added to the filtrate, followed by elution with distilled water.
  • ICP emission analysis, pH, etc. fractions containing no impurities are collected, and DOI can be recovered by removing the solvent of the aqueous solution.
  • the obtained DOI is analyzed by, for example, high performance liquid chromatography or nuclear magnetic resonance.
  • glucose-6-phosphate converted from glucose by glucokinase or the like can be mentioned, and glucose-- can be obtained by using the DOI synthase or the transformant of the present embodiment.
  • DOI can be obtained from 6-phosphate.
  • the reaction temperature for producing DOI using the DOI synthetase and / or transformant of the present embodiment is preferably 10 to 95 ° C., more preferably 20 to 20 ° C. from the viewpoint of reaction rate and enzyme stability. 70 ° C., more preferably 30 to 60 ° C.
  • the reaction pH can be adjusted over a wide range, and is preferably pH 2.0 to 10.0, more preferably pH 4.0 to 8.0, and still more preferably 6.0 to 8.0 from the viewpoint of enzyme stability. is there.
  • reaction time varies depending on the amount of the enzyme used, it is preferably 20 minutes to 200 hours, more preferably 6 to 80 hours, considering industrial use.
  • freezing treatment or various crushing treatments may be performed in advance.
  • present embodiment is not limited to the above reaction conditions and reaction forms, and can be selected as appropriate.
  • Example 1 (1) Preparation of chromosomal DNA Paenibacillus sp. Chromosomal DNA of NBRC13157 strain was prepared. Paenibacillus sp. NBRC13157 strain was cultured on NR agar plate (1% Bacto Tryptone, 0.2% Yeast Extract, 1% Erlich Skipjack extract, 1.5% Bacto Agar, pH 7.0) for 1 day to form colonies. It was.
  • the 1 platinum ear was inoculated into a 30 mL NR medium (1% Bacto Tryptone, 0.2% Yeast Extract, 1% Erlich skipjack extract, pH 7.0) dispensed into a 150 mL Erlenmeyer flask, 30 ° C., 180 rpm For 1 day. This culture solution was centrifuged at 12,000 g for 1 minute at 4 ° C., the supernatant was removed, and the cells were collected.
  • NR medium 1% Bacto Tryptone, 0.2% Yeast Extract, 1% Erlich skipjack extract, pH 7.0
  • the obtained cells were suspended in Lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM EDTA, 50 mM glucose) and washed thoroughly. The cells were collected by centrifugation, then resuspended in Lysis buffer, added with lysozyme, and incubated at 37 ° C. for 45 minutes. Then SDS and RNase were added and incubated at 37 ° C. for 45 minutes. Then, Proteinase K was added and gently shaken at 50 ° C. for 60 minutes. The solution obtained here was treated with phenol-chloroform and chloroform and then precipitated with ethanol. The precipitated nucleic acid was collected by winding it around a glass pipette. The nucleic acid was washed with 70% ethanol, dried and redissolved in TE. By this operation, about 100 ⁇ g of chromosomal DNA was prepared.
  • Lysis buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM
  • the sense primer is an oligo DNA having the sequence of SEQ ID NO: 15; Respectively synthesized oligo DNAs having the sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the PCR primer obtained here was used to amplify the DOI synthase gene by PCR using the chromosomal DNA prepared in (1) above as a template, and a PCR product consisting of 1107 base pairs was obtained.
  • the gene sequence of the PCR product obtained here was confirmed by analyzing with a DNA sequencer, and a known DOI synthase (BtrC) gene having the base sequence of SEQ ID NO: 13 was obtained.
  • the amino acid sequence corresponding to this gene is shown in SEQ ID NO: 14 (BtrC).
  • amino acid sequences corresponding to the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11 are represented by SEQ ID NO: 2 (DOIS-1), SEQ ID NO: 4 (DOIS- 2), SEQ ID NO: 6 (DOIS-3), SEQ ID NO: 8 (DOIS-4), SEQ ID NO: 10 (DOIS-5), and SEQ ID NO: 12 (DOIS-6).
  • the selection of a novel DOI synthetase can be carried out by measuring the activity of various DOI synthetases prepared by conventional methods after heat treatment or various pH treatments.
  • Example 2 [Acquisition of purified enzyme]
  • DOI synthetase (DOIS-1) prepared in Example 1 was cultured on an LB plate containing 100 mg / L ampicillin at 37 ° C. for 1 day to form colonies.
  • 30 mL of LB medium containing 100 mg / L ampicillin is placed in a 150 mL Erlenmeyer flask, and colonies are inoculated from the above plate with a platinum loop, and OD (600 nm) is about 0.5 at 37 ° C. for 3 to 8 hours.
  • rotary shaking culture was performed at 180 rpm, and this was used as a pre-culture solution for main culture.
  • the cryopreserved cells were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 0.2 mg / L cobalt chloride hexahydrate, 180 mg of lysozyme (derived from Sigma egg white) and deoxyribonuclease I (Wako).
  • 60 ⁇ L of a bovine-derived recombinant solution (manufactured by Co., Ltd.) was added and shaken at 120 rpm for 5 hours at 37 ° C. to disrupt the cells.
  • the solution after disrupting the cells was centrifuged at 10,000 g ⁇ 30 minutes at 4 ° C. to remove cell residues, and the supernatant was collected.
  • Ammonium sulfate was added to the supernatant to make it 30% saturated, and after stirring at 4 ° C. for a while, the resulting precipitate was removed by centrifugation at 10,000 g ⁇ 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered. To this supernatant, ammonium sulfate was further added to achieve 40.0% saturation. After stirring at 4 ° C. for a while, the resulting precipitate was centrifuged at 4 ° C. for 10,000 g ⁇ 30 minutes to remove the supernatant, and the precipitate was precipitated. Was recovered. Next, this precipitate was dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 0.2 mg / L cobalt chloride hexahydrate.
  • This lysate was concentrated at 4 ° C. using an ultrafiltration membrane having an average molecular weight cut-off of 10,000, and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 0.2 mg / L cobalt chloride hexahydrate. The desalting operation of adding and concentrating again was repeated 2-3 times.
  • the enzyme solution obtained above was adsorbed on “DEAE Sepharose FF” (GE Healthcare Biosciences) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7), and then 0-0.4M The enzyme was eluted by a concentration gradient method using 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing sodium chloride.
  • the active fraction of the DOI synthetase of the enzyme eluted above was collected, concentrated using an ultrafiltration membrane with an average molecular weight cut off of 10,000, and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7) containing 10 wt% ammonium sulfate. 7) and adsorbed on “HiTrap Phenyl FF (high sub)” (GE Healthcare Biosciences) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10 wt% ammonium sulfate. Then, the enzyme was eluted by a concentration gradient method using 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10 to 0% by weight of ammonium sulfate.
  • the active fraction eluted above was collected, concentrated using an ultrafiltration membrane with an average molecular weight cut off of 10,000, and equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) “MonoQ 5/50 GL” After adsorbing to (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.), the enzyme was eluted by a concentration gradient method of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 0 to 0.2 M sodium chloride.
  • the active fraction eluted above was collected, concentrated using an ultrafiltration membrane with an average molecular weight cut off of 10,000, and 50 mM Tris-HCl buffer containing 0.2 mg / L cobalt chloride hexahydrate and 0.1 M NaCl. After loading in “HiLoad 16/60 Superdex 200” (GE Healthcare Biosciences) equilibrated with the solution (pH 7.7), elution was performed with the same buffer. The active fractions eluted above were collected and concentrated using an ultrafiltration membrane having an average fractional molecular weight of 10,000 to obtain purified DOI synthase (DOIS-1).
  • DOIS-1 purified DOI synthase
  • DOI synthetase DOIS-2
  • DOI-3 purified DOI synthetase
  • DOIS-4 purified DOI synthetase
  • DOIS- 5 Purified DOI synthase (DOIS-6) and purified known DOI synthase (BtrC) were obtained.
  • Example 3 Evaluation of novel DOI synthase
  • Optimal pH range In measuring the activity at each pH, an appropriate amount of purified DOI synthase (DOIS-1) was added to the reaction solution, glucose-6-phosphate disodium salt (manufactured by Oriental Yeast) was 20 mM, NAD + ( The reaction solution was adjusted so that (oriental yeast) was 5 mM, cobalt chloride hexahydrate was 5 mM, and various buffers were 100 mM. As buffers, Bis-Tris buffer (pH 6.0 to 7.7) and Tris buffer (pH 7.4 to 8.0) were used. The reaction temperature was 30 ° C., and the activity was measured by quantifying the generated DOI. The relative activity was determined with the activity value showing the highest activity as 100, and the result is shown in FIG. The optimum pH range for the enzyme of the present invention was pH 7.0 to 7.7.
  • the relative activity was determined with the activity value showing the highest activity as 100, and the result is shown in FIG.
  • the stable pH range of this enzyme was pH 6.0 to 8.0, and purified DOI synthase (DOIS-2) and purified DOI synthase (DOIS-3) showed similar results. These wide-range pH stability was a novel characteristic not found in existing enzymes.
  • the molecular weight was determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using “Ready Gel J” (Nippon Bio-Rad Laboratories, Inc.) having a separation gel concentration of 10%, and purified DOI synthetase (DOIS-1 ) Has a molecular weight of about 40,000, which is almost the same as the molecular weight of 40,656 estimated from the amino acid sequence.
  • Example 4 Evaluation of novel DOI synthase
  • DOI synthase (DOIS-4) was added and 100 mM Bis-Tris buffer (pH 7.0) adjusted to 5 mM cobalt chloride hexahydrate was added at each temperature of 25 ° C. and 42 ° C. After incubation for 1 hour, the residual enzyme activity of each was measured.
  • Residual enzyme activity was measured by measuring 100 mM Bis-Tris buffer (pH 7.5) containing 20 mM glucose-6-phosphate disodium salt (oriental yeast), 5 mM NAD + (oriental yeast), and 5 mM cobalt chloride hexahydrate. In 0) at a reaction temperature of 30 ° C. Assuming that the residual activity upon incubation at 25 ° C. is 100, the activity value of incubation at 42 ° C. was a very high value of 74.
  • Example 6 Evaluation of novel DOI synthase
  • the activity value was 70 or more in the range of pH 6.5 to 8.0, and the residual activity at pH 6.0 was a very high value of 53. .
  • This high pH stability was a novel property not found in existing enzymes.
  • Example 7 "DOI production method" The transformant of DOI synthetase (DOIS-1) prepared in Example 1 was cultured on an LB plate containing 100 mg / L ampicillin at 37 ° C. for 1 day to form colonies. Next, 30 mL of LB medium containing 100 mg / L ampicillin is placed in a 150 mL Erlenmeyer flask, and colonies are inoculated from the above plate with a platinum loop, and OD (600 nm) is about 0.5 at 37 ° C. for 3 to 8 hours. Until this time, rotary shaking culture was performed at 180 rpm, and this was used as a pre-culture solution for main culture.
  • DOI synthesis a solution obtained by suspending the above frozen cells in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 0.2 mg / L cobalt chloride hexahydrate was used as a DOI synthesis catalyst.
  • the reaction solution composition of the DOI synthesis reaction is 85 mM for glucose-6-phosphate disodium salt (made by Oriental Yeast), 0.1 mM for NAD + (made by Oriental Yeast), 1 mM cobalt chloride hexahydrate, and the cell OD is At 30, the DOI synthesis reaction was started. The pH at the start of the reaction was adjusted to 7.7, and a synthetic reaction was carried out at a reaction temperature of 46 ° C. for 2.5 hours to produce 1% by weight of DOI. After completion of the reaction, hydrochloric acid was added to lower the pH to 6 or less. Next, this reaction solution was centrifuged at 4 ° C. for 10,000 g ⁇ 30 minutes to recover the supernatant, and filtered to remove the cell residue.
  • the DOI solution synthesized above uses a cation exchange resin obtained by regenerating Amberlite IR120BNa (manufactured by Organo) to H + type and an anion exchange resin obtained by regenerating Amberlite IRA96SB (manufactured by Organo) to OH ⁇ type.
  • a purification treatment was performed. In this purification treatment, column treatment and batch treatment were used in combination, and a fraction containing PDO, Co and Na not detected and containing a DOI solution was collected by ICP emission analysis.
  • Example 8 The transformant of DOI synthetase (DOIS-1) prepared in Example 1 was cultured on an LB plate containing 100 mg / L ampicillin at 37 ° C. for 1 day to form colonies. Next, 30 mL of LB medium containing 100 mg / L ampicillin is placed in a 150 mL Erlenmeyer flask, and colonies are inoculated from the plate with a platinum loop, and the OD is about 0.5 at 37 ° C. for 3 to 8 hours. Rotational shaking culture was performed at 180 rpm, and this was used as a pre-culture solution for main culture.
  • DOIS-1 DOI synthetase
  • Residual enzyme activity was measured by measuring 100 mM Bis-Tris buffer (pH 7.5) containing 20 mM glucose-6-phosphate disodium salt (oriental yeast), 5 mM NAD + (oriental yeast), and 5 mM cobalt chloride hexahydrate. In 0) at a reaction temperature of 30 ° C. The relative activity with the maximum activity of 100 was determined, and the results are shown in FIG. The stable temperature range of purified known DOI synthase (BtrC) was 42 ° C. or less, the relative activity at 46 ° C. was 23, and the relative activity at 50 ° C. was 0, indicating a very low thermal stability.
  • Residual enzyme activity was measured by measuring 100 mM Bis-Tris buffer (pH 7.5) containing 20 mM glucose-6-phosphate disodium salt (oriental yeast), 5 mM NAD + (oriental yeast), and 5 mM cobalt chloride hexahydrate. In 0) at a reaction temperature of 30 ° C. The relative activity with the maximum activity of 100 was determined, and the results are shown in FIG. As shown in FIG. 7, the relative activity at pH 6 was a very low value of 27, and it was almost completely inactivated at pH 5.5.
  • Residual enzyme activity was measured by measuring 100 mM Bis-Tris buffer (pH 7.5) containing 20 mM glucose-6-phosphate disodium salt (oriental yeast), 5 mM NAD + (oriental yeast), and 5 mM cobalt chloride hexahydrate. In 0) at a reaction temperature of 30 ° C. The activity value of incubation at 42 ° C. was 0, indicating that the residual activity upon incubation at 25 ° C. was 100, indicating extremely low thermal stability.
  • a highly useful DOI can be produced by an efficient manufacturing process as a precursor of an aromatic compound (catechol or the like) that is industrially useful.

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Abstract

　本発明の目的は、従来の酵素に比べて、熱やｐＨに対する安定性などの特性が優れるＤＯＩ合成酵素の提供、及び、該酵素を用いたＤＯＩ製造方法を提供することである。本発明によれば、下記（１）、（２）、（４）、（６）及び（７）の特性を有し、かつ下記（３）及び／又は（５）の特性を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素が提供される。 （１）作用：本酵素は、グルコース－６－リン酸を２－デオキシ－シロ－イノソースへと変換する機能を有する。 （２）至適ｐＨ範囲：７．０～ ７．７ （３）安定ｐＨ範囲：６．０～ ８．０ （４）至適温度範囲：５５ ～ ７０ ℃ （５）安定温度範囲：２０～４６℃ （６）補酵素：ＮＡＤ+を利用 （７）分子量：３９０００～４２０００

Description

新規２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素
　本発明は、耐熱性２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素、２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素遺伝子、組み換えベクター、形質転換体、及び２－デオキシ－シロ－イノソースの製造方法に関する。
　現在、カテコールなどの芳香族化合物の多くは、石油を原料として生産されているが、石油資源の枯渇問題や二酸化炭素排出量の削減などの観点から、バイオマスを利用した環境調和型の新規製造プロセスの開発が求められている。
　一方、２－デオキシ－シロ－イノソース（以下、ＤＯＩ）が、産業上有用とされる芳香族化合物（カテコール等）へと変換できることが見出され（非特許文献１）、さらには、このＤＯＩを、バイオマスの構成要素の一つであるグルコースから合成できることが報告された（非特許文献１）。本ＤＯＩ製造プロセスで重要となるのがグルコース－６－リン酸からＤＯＩへと変換する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素（以下、ＤＯＩ合成酵素）であり、ＤＯＩは上記芳香族化合物への変換のみならず各種有用化合物の中間体ともなり得ることから、ＤＯＩ合成酵素は非常に大きな注目を浴びている。
　ＤＯＩ合成酵素はブチロシン生産菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃirculans に属する微生物から１９９７年に単離精製（非特許文献２）され、続いて、その遺伝子配列も公開されている（特許文献１）。この他にもＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ　ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ　ＪＣＭ３２６８株（非特許文献３）由来のＤＯＩ合成酵素などがこれまでに発見されている。
特開２０００－２３６８８１号公報
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４１，１９３５－１９３８，２０００ Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　５０（５）, ４２４－４２８,  １９９７ Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　５９（６）, ３５８－３６１,  ２００６
　しかしながら、前記ＤＯＩ合成酵素の安定性と比活性などの各種特性は、満足のいくものではなく、また、数千トン規模の工業化製法に向けた酵素の解析や機能向上に関する研究はほとんどなされてこなかった。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃirculans に属する微生物に由来するＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）は、安定性等に大きな問題があり、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ　ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ　ＪＣＭ３２６８株由来のＤＯＩ合成酵素の比活性は著しく低く、工業的な利用は困難であった。本発明が解決しようとする課題は、従来の酵素に比べて、熱やｐＨに対する安定性などの特性が優れるＤＯＩ合成酵素の提供、及び、該酵素を用いたＤＯＩ製造方法を提供することである。
　これらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、従来の酵素に比べて熱及び／又はｐＨ安定性が向上したＤＯＩ合成酵素を発見し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下に示すＤＯＩ合成酵素、ＤＯＩ合成酵素遺伝子、組み換えベクター、形質転換体、及びＤＯＩ製造方法に関するものである。
［１］　下記（１）、（２）、（４）、（６）及び（７）の特性を有し、かつ下記（３）及び／又は（５）の特性を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
（１）作用：本酵素は、グルコース－６－リン酸を２－デオキシ－シロ－イノソースへと変換する機能を有する。
（２）至適ｐＨ範囲：７．０～ ７．７
（３）安定ｐＨ範囲：６．０～ ８．０
（４）至適温度範囲：５５ ～ ７０℃
（５）安定温度範囲：２０～４６℃
（６）補酵素：ＮＡＤ+を利用
（７）分子量：３９０００～４２０００
［２］　下記（８）の特性を有する、［１］に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
（８）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）
［３］　下記（９）の特性を有する、［１］又は［２］に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
（９）補因子：Ｃｏ2+イオンの添加により活性向上
［４］　安定温度範囲が、２０～６０℃である、［１］から［３］の何れか１項に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
［５］　下記の何れかのアミノ酸配列を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列
［６］　下記の何れかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素遺伝子。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列
［７］　下記の何れかの塩基配列を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素遺伝子。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素をコードする塩基配列；又は
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列に対して１個又は複数個の塩基の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素をコードする塩基配列：
［８］　［６］又は［７］に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素遺伝子を含む、組み換えベクター。
［９］　［６］又は［７］に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素遺伝子又は［８］に記載の組み換えベクターを宿主に導入することにより得られる形質転換体。
［１０］　［９］に記載の形質転換体を培養することにより得られる２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
［１１］　［１］から［５］又は［１０］の何れか１項に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素を用いることを特徴とする、２－デオキシ－シロ－イノソースの製造方法。
［１２］　　［６］又は［７］に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素遺伝子、又は［９］に記載の形質転換体を利用することを特徴とする、グルコース、グルコースを構成成分とする多糖類及び／又はグルコース－６－リン酸を原料とした２－デオキシ－シロ－イノソースの製造方法。
［１３］　コバルトイオンを含有する培地において２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素を発現可能な微生物を培養することを特徴とする、グルコース－６－リン酸から２－デオキシ－シロ－イノソースを製造する製造方法。
［１４］　グルコースを構成成分とする多糖類あるいはグルコースを含有する原料を用いることを特徴とする、［１３］に記載の方法。
［１５］　２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素が、［１］から［５］の何れかに記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素である、［１３］又は［１４］に記載の方法。
　本発明のＤＯＩ合成酵素を用いると、ＤＯＩの製造において、高温条件での酵素利用が可能となる。さらに、製造条件によっては、製造時の厳密な温度管理などが不要となる。また、ＤＯＩが安定なｐＨ領域である酸性条件下でのＤＯＩ製造が可能となる。さらに、製造条件によっては、製造時の厳密なｐＨ管理などが不要となる。
図１は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）の至適ｐＨ範囲を示す（実施例３）。 図２は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）の安定ｐＨ範囲を示す（実施例３）。 図３は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）の至適温度範囲を示す（実施例３）。 図４は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）の安定温度範囲を示す（実施例３）。 図５は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）の安定温度範囲を示す（実施例３）。 図６は、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定温度範囲を示す（比較例１）。 図７は、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定ｐＨ範囲を示す（比較例１）。
　以下、本発明について具体的に説明する。
 [ＤＯＩ合成酵素] 
　本発明を実施するための形態（以下、本実施の形態という）のＤＯＩ合成酵素は、下記の特性を有し、
（１）作用：本酵素は、グルコース－６－リン酸をＤＯＩへと変換する機能を有する。
（２）安定性：高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を示す。
　好ましくは、本発明におけるＤＯＩ合成酵素は、下記（１）、（２）、（４）、（６）及び（７）の特性を有し、かつ下記（３）及び／又は（５）の特性を有する。
（１）作用：本酵素は、グルコース－６－リン酸を２－デオキシ－シロ－イノソースへと変換する機能を有する。
（２）至適ｐＨ範囲：７．０～ ７．７
（３）安定ｐＨ範囲：６．０～ ８．０
（４）至適温度範囲：５５ ～ ７０ ℃
（５）安定温度範囲：２０～４６℃（好ましくは、２０～６０℃）
（６）補酵素：ＮＡＤ+を利用
（７）分子量：３９０００～４２０００
　さらに好ましくは、本発明におけるＤＯＩ合成酵素は、上記の特性に加えて、下記（８）及び／又は（９）の特性を有する。
（８）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）
（９）補因子：Ｃｏ2+イオンの添加により活性向上
　本発明のＤＯＩ合成酵素のアミノ酸配列の具体例を、配列番号２、４、６、８、１０、及び１２に示す。配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列を有するＤＯＩ合成酵素は、高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有していることが好ましい。配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列を有するＤＯＩ合成酵素は、本実施の形態において優れた高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有することが好ましい。
　本実施の形態においてＤＯＩ合成酵素は、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列と好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するたんぱく質でもよい。
　また、本実施の形態においてＤＯＩ合成酵素は、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸に欠失、置換及び／又は付加を含んでも良い。欠失、置換及び／又は付加されるアミノ酸の数は好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個である。
　配列番号２、４、６、８、１０、１２に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、優れた高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有し、かつＤＯＩ合成酵素活性を有する酵素は、本発明に含まれる。
　配列番号２、４、６、８、１０、１２に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸に欠失、置換及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、優れた高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有し、かつＤＯＩ合成酵素活性を有する酵素は、本発明に含まれる。
　ＤＯＩ合成酵素中のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異を生じさせる方法としては、ＰＣＲ法、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法やキメラ酵素を作製する手法等の公知の方法が利用できる。
　ＤＯＩ合成酵素中のアミノ酸配列の相同性は、例えば、ＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅが供給するＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ｐ３８７－３９５）や、ＰＩＬＥＵＰやＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０－３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－１０）などの配列分析用ツールを用いて算出し得る。
　また、上記の手法により得られたＤＯＩ合成酵素を、熱処理後に活性測定を行うことにより、高温安定性を保持する酵素を選別することが可能である。
[ＤＯＩ合成酵素遺伝子]
　本実施の形態のＤＯＩ合成酵素遺伝子は、メタゲノムや微生物から単離・抽出した天然のものでも良く、また、その塩基配列に従ってＰＣＲ法、人工合成法等の公知の方法によって合成したものでも良い。また、新規ＤＯＩ酵素キメラ遺伝子の作製には、既知ＤＯＩ合成酵素遺伝子を組み合わせてもよく、例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ　ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ　ＪＣＭ３２６８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ　ＮＢＲＣ１２７７３株などに由来するＤＯＩ合成酵素遺伝子が挙げられる。
　本実施の形態におけるＤＯＩ合成酵素遺伝子の塩基配列の具体例を、配列番号１、３、５、７、９又はは１１に示す。
　配列番号１、３、５、７、９又は１１に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも1つの遺伝子配列を有するＤＯＩ合成酵素遺伝子を含む組み換えベクターと宿主から形質転換体を得、得られた形質転換体を培養してＤＯＩ合成酵素を得ることができる。
　配列番号１、３、５、７、９又は１１に記載の塩基配列を有するＤＯＩ合成酵素遺伝子から得られるＤＯＩ合成酵素は、高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有していることが好ましい。
　本実施の形態においてＤＯＩ合成酵素遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９又は１１に記載の塩基配列を有するＤＯＩ合成酵素遺伝子と好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列を有していてもよい。配列番号１、３、５、７、９又は１１に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも1つの塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、優れた高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有し、かつＤＯＩ合成酵素活性を有する酵素をコードするＤＯＩ合成酵素遺伝子は、本発明に含まれる。
　本実施の形態においてＤＯＩ合成酵素遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列に対して１個又は複数個の塩基の欠失、付加、及び／又は置換を含んでもよい。配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列に対して１個又は複数個の塩基の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するＤＯＩ合成酵素をコードする塩基配列を有するＤＯＩ合成酵素遺伝子は本発明に含まれる。欠失、付加及び／又は置換される塩基の数は好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個である。
　本実施の形態においては、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＯＩ合成酵素遺伝子を用いてもよい。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列
[組換えベクター及び形質転換体]
　本実施の形態の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本実施の形態の遺伝子を連結（挿入）して得ることができる。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
　前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis 等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラスミド（例えば YEp13, YEp24, YCp50, pYE52 等）などが、ファージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。
　前記ベクターへの本実施の形態の遺伝子の挿入は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。
　宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに詳述する。また、必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。
　本実施の形態の形質転換体は、本実施の形態の組換えベクターを、目的遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することによって得ることができる。ここで宿主としては、本実施の形態のDNAを発現できるものであれば特に限定されず、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、その他COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができる。
　また、本実施の形態の形質転換体として利用する宿主は、グルコース－6－リン酸をグルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロースなどの単糖類から合成する機能を有するものが好ましい。また、必要に応じて、二つ以上の単糖が連結した多糖類を分解する機能を有することも好ましい。
　大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、ＤＯＩ合成酵素を効率的に発現させるという観点から、本実施の形態の組換えベクターが各細菌中で自律複製可能であるとともにプロモーター、リボゾーム結合配列、本実施の形態の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが望ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていても良い。大腸菌としてはエッシェリヒア・コリ（E. coli）K12、DH1、DH10B（Invitrogen社）、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL（ストラタジーン社）、TOP10F等が挙げられ、枯草菌としてはバチルス・ズブチリス（B. subtilis）MI114、207-21 等が挙げられる。
　プロモーターとしては大腸菌等の宿主で機能するものであれば特に限定されず、例えばgapAプロモーター、gadAプロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌由来のプロモーターや、T7プロモーター等のファージ由来のプロモーターを用いることができる。
　細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入できる方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 2110 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
　酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セルビシエ（S. cerevisiae）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等が用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母で発現しうるもの、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα 1プロモーター、PHO5プロモーター、AOXプロモーター等を挙げることができる。
　酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. et al. : Methods. Enzymol., 194 : 180 (1990)）、スフェロプラスト法（Hinnen, A. et al. : Proc Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 1929 (1978)）、酢酸リチウム法（Itoh, H. : J. Bacteriol., 153 : 163 (1983)）等を挙げることができる。
[ＤＯＩ合成酵素の生産]
　本実施の形態の酵素は、本実施の形態の形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から該酵素活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本実施の形態の形質転換体を培養する方法は、宿主に応じて決定すればよい。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
　培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加しても良い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加しても良い。
　培養後、本実施の形態の酵素タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合は、細胞を破砕する。一方、本実施の形態のタンパク質が菌体外または細胞外に分泌される場合は、培養液をそのまま用いるか、遠心分離等によって回収する。
　タンパク質の単離・精製には、例えば硫安沈澱、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独であるいは適宜組み合わせて用いればよい。
　また、活性とはグルコース－６－リン酸をＤＯＩへと変換することを示す。活性値の測定方法は以下に示すとおりである。
　本実施の形態のＤＯＩ合成酵素活性は、基質となり得る適当なグルコース－６－リン酸を含む反応液に該酵素を添加し、生成するＤＯＩを検出する方法によって確認することができる。生成するＤＯＩの確認は、非特許文献（Journal of Biotechnology 129, 502-509 (2007)）に記載の方法などを用いることができる。
　ＤＯＩ合成酵素活性を測定する方法としては、１０００ｍＭグルコース－６－リン酸溶液２０μＬ、１００ｍＭＮＡＤ+溶液５０μＬ、１００ｍＭ塩化コバルト六水和物溶液５０μＬを含むｐＨ７．０の１５０ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液９００μＬに適当な濃度のＤＯＩ合成酵素液１００μＬを混合し、５～６０分間程度反応させた後、酵素を失活させ、ＤＯＩを定量する方法を使用する。
　精製されたＤＯＩ合成酵素の精製度の確認や分子量の測定は、電気泳動やゲル濾過クロマトグラフィー等によって行うことができる。また、酵素の至適温度範囲あるいは至適ｐＨ範囲は、反応温度あるいは反応ｐＨを変化させて酵素活性を測定すればよい。さらにＤＯＩ合成酵素を種々のｐＨ条件下又は温度条件下に一定時間さらした後に酵素活性を測定することにより、安定ｐＨ範囲及び安定温度範囲を調べることができる。例えば、各ｐH条件におけるＤＯＩ合成酵素の評価には、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５～８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４～８．０）を用いることができる。
　至適ｐＨ範囲とは、ｐＨを変化させて測定した際に最も高活性を示した活性値を１００とし、活性値が７０以上であるｐＨ範囲である。
　安定ｐＨ範囲とはｐＨを変化させて測定した際に最も高活性を示した活性値を１００とし、活性値が７０以上のｐＨ範囲である。
　至適温度範囲とは、温度を変化させて測定した際に最も高活性を示した活性値を１００とし、活性値が５０以上である温度範囲である。
　安定温度範囲は温度を変化させて測定した際に最も高活性を示した活性値を１００とし、活性値が５０以上の温度範囲である。
　本実施の形態におけるＤＯＩ合成酵素の高温安定性とは、安定温度範囲の上限が４６℃、より好ましくは５０℃、さらに好ましくは６０℃、さらに好ましくは７０℃、さらに好ましくは８０℃、さらに好ましくは９０℃、特に好ましくは９５℃であることである。下限は特に限定しないが、通常の操作から安定な温度範囲の下限は例えば２０℃、好ましくは１０℃、好ましくは５℃、更に好ましくは１℃であればよい。
　本実施の形態の高温安定性を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素としては、例えば、５０℃で１時間インキュベートした後の残存酵素活性が５０以上である酵素を選抜することができる。残存酵素活性とは、最も高活性を示した活性値を１００とする相対活性を示す。
通常、工業的な酵素反応においては、酵素が高活性を有する温度範囲内に制御する必要があるため、温度の制御が非常に重要な因子である。
　ＤＯＩ合成において、従来菌の活性の観点から３７℃以下に温度制御する厳密な温度管理が必要であった。高温安定性を持つＤＯＩ合成酵素を用いると、高温の範囲においても高活性を保つことが可能であるため、厳密な温度管理を行うことなく、ＤＯＩの製造が可能である。
　本実施の形態における広範囲ｐＨ安定性を持つＤＯＩ合成酵素は、安定ｐＨ範囲が好ましくはｐＨ６．０～７．０、より好ましくはｐＨ６．０～７．４、より好ましくはｐＨ６．０～７．７、より好ましくはｐＨ６．０～８．０、特により好ましくはｐＨ４．０～９．０である特性を有する。
　ＤＯＩ合成において、従来、菌の高活性の観点からｐＨをｐＨ６．０～７．０に制御する厳密なｐＨ管理が必要であった。広範囲ｐＨ安定性を持つＤＯＩ合成酵素を用いると、広範囲のｐＨ範囲においても高活性を保つことが可能であるため、厳密なｐＨ管理を行うことなく、ＤＯＩの製造が可能である。
　本実施の形態の酵素は作用を阻害されないかぎり、純度が高いことを要しない。そのため、精製は必須ではなく、その他の酵素等を含んでも良い。
[ＤＯＩの生産]
　本実施の形態のＤＯＩは、本実施の形態の形質転換体を培養して得られる培養物からＤＯＩを採取する発酵生産法により得ることができる。
　前記培養の栄養源としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他有機栄養源を含む培地を使用することができる。培養温度はその菌の生育可能な温度であれば良い。培養時間には特に制限はないが、１日から７日程度でよい。その後、得られた培養菌体又は培養上清液からＤＯＩを回収すればよい。
　培養に用いる炭素源としては、形質転換体が資化できるものであればグルコースを構成成分とする多糖類を直接用いてもよく、より好ましくは、単糖類もしくはでんぷんや米ぬかや廃糖蜜などの多糖類を含む原料に由来する単糖類が挙げられ、具体的にはＤ－グルコースなどが挙げられる。また、プロモーターの発現が誘導型である場合には、適時誘導物質を添加すればよい。
　炭素源としては、Ｄ－グルコース、ガラクトース、マルトース、サッカロース、トレハロース等の糖類や油脂類や脂肪酸類さらにはｎ－パラフィン等を用いることができる。油脂としては、例えば、ナタネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油などがあげられる。脂肪酸としてはヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸などの飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩など脂肪酸誘導体などがあげられる。
　有機栄養源としては、アミノ酸類、例えば、アデニン、ヒスチジン、ロイシン、ウラシル、トリプトファンなどが挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
　本発明においては、コバルトイオンを含有する培地においてＤＯＩ合成酵素を発現可能な微生物を培養することによって、グルコース－６－リン酸からＤＯＩを製造することができる。
　本実施の形態におけるＤＯＩ生産法では、コバルトイオンは二価のコバルトイオンの塩として用いることが好ましい。具体的には、塩化コバルト、硫酸コバルト、酢酸コバルトなどが挙げられる。
　培養液中にコバルトイオンを添加すると、ＤＯＩ生産性は、コバルトイオンを添加しない培養に比べて向上する。コバルトイオンが過剰に培養液に添加された場合、微生物の生育阻害を引き起こすことがある。従って、培養中のコバルト濃度は該酵素が活性を有するに十分であり、かつ微生物に生育阻害を及ぼさない範囲がよい。宿主によるが、例えば大腸菌を用いた場合、培養開始直後のコバルト濃度は、好ましくは塩化コバルト６水和物換算で０．１～２００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１～１００ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは０．１～５０ｍｇ／Ｌの範囲内に維持することが好ましい。培養開始直後とは、本培養開始から菌液ＯＤが５に到達するまでの範囲を示す。菌液ＯＤとは培養液の光学密度を言い、本実施の形態においては、６００ｎｍの光に対する培養液の吸収強度を示す。
　高密度培養を適用した場合、培養液中の菌体濃度の上昇に伴い、微生物菌体中のタンパク質や核酸、脂質、ビタミン等の構成成分の原料であり、かつ、微生物の生育に必要なエネルギー源となるグルコース等の炭素源が不足する。こういった場合、炭素源を連続的に、あるいは断続的に培養液に供給する。本実施の形態では、さらに、コバルトイオンを添加し、該酵素の活性発現に必要なコバルトイオンを連続的に、あるいは断続的に適量供給することが好ましい。
　本実施の形態のＤＯＩ生産法においては、添加コバルト値を０．０００３～７０に制御することが好ましく、より好ましくは０．００１～１５、さらに好ましくは０．０１～５である。添加コバルト値は、以下の式により算出した。
添加コバルト値＝[培養液中への塩化コバルト６水和物総添加量（ｍｇ）]／培養液量（Ｌ）／菌液ＯＤ
　塩化コバルト６水和物以外のコバルト塩を用いた場合は、塩化コバルト６水和物換算で添加コバルト値を算出し、コバルトイオンの量が適切な値となるようにコバルト塩を添加してもよい。
ＤＯＩを培養液から回収する方法としては，次のような方法が挙げられる。
　培養終了後、培養液から遠心分離器や濾過装置などで菌体を除き、培養上清液を得る。この培養上清液に対してさらに濾過処理を行い、菌体等の固形物を除き、その濾液にイオン交換樹脂を添加し、蒸留水で溶出を行う。ＩＣＰ発光分析、ｐＨなどを測定しながら不純物を含まないフラクションを分取して、その水溶液の溶媒を取り除くことでＤＯＩを回収することができる。
　得られたＤＯＩの分析は、例えば、高速液体クロマトグラフィーや核磁気共鳴法などにより行う。
　また、前記発酵生産法以外の方法としては、グルコキナーゼなどによりグルコースから変換されるグルコース－６－リン酸を利用する方法が挙げられ、本実施の形態のＤＯＩ合成酵素あるいは形質転換体によりグルコース－６－リン酸からＤＯＩを得ることができる。
　本実施の形態のＤＯＩ合成酵素及び／又は形質転換体を用いてＤＯＩを製造する際の反応温度は、反応速度や酵素の安定性の点から、好ましくは１０～９５℃、より好ましくは２０～７０℃であり、さらに好ましくは３０～６０℃である。
　反応ｐＨは広範囲で調整可能であり、酵素の安定性の点から、好ましくはｐＨ２．０～１０．０、より好ましくはｐＨ４．０～８．０、さらに好ましくは６．０～８．０である。
　反応時間は酵素の使用量によっても異なるが、工業的利用を考慮した際、好ましくは通常２０分～２００時間、より好ましくは、６～８０時間である。形質転換体をＤＯＩ合成触媒として利用する際には、事前に、凍結処理や各種破砕処理を行っても良い。
　しかしながら、本実施の形態は以上の反応条件や反応形態に限定されるものではなく、適宜選択することができる。
　以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］
（１）染色体ＤＮＡの調製
　常法に従ってＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株の染色体ＤＮＡを調製した。
　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株をＮＲ寒天プレート（１％　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、１％　エルリッヒカツオエキス、１．５％　Ｂａｃｔｏ　Ａｇａｒ、ｐＨ７．０）で、３０℃、１日間培養してコロニーを形成させた。その１白金耳を、ＮＲ培地（１％　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、１％　エルリッヒカツオエキス、ｐＨ７．０）３０ｍＬを１５０ｍＬ三角フラスコに分注したものに接種して、３０℃、１８０ｒｐｍで１日間培養した。この培養液を、４℃で、１２，０００ｇ、１分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。
　得られた菌体をＬｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　グルコース）に懸濁し、よく洗浄した。遠心分離して菌体を回収した後、Ｌｙｓｉｓバッファーに再懸濁し、これにリゾチームを加え３７℃で４５分間インキュベートした。次いでＳＤＳとＲＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。その後Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを添加し、５０℃で６０分間穏やかに振盪した。ここで得られた溶液をフェノール－クロロホルム、クロロホルムで処理後、エタノール沈殿し、析出した核酸をガラスピペットに巻きつけて回収した。この核酸を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、ＴＥに再溶解した。この操作により、約１００μｇの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）ＤＯＩ合成酵素遺伝子の単離
　上記（１）において調製した染色体ＤＮＡからＤＯＩ合成酵素遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして、センスプライマーは配列番号１５の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは配列番号１６の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。
　ここで得られたＰＣＲプライマーを用い、上記（１）において調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によるＤＯＩ合成酵素遺伝子の増幅を行い、１１０７塩基対からなるＰＣＲ産物を取得した。
　ここで得られたＰＣＲ産物の遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーで解析することで確認し、配列番号１３の塩基配列を有する既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）遺伝子を得た。本遺伝子に対応するアミノ酸配列を配列番号１４（ＢｔｒＣ）に示した。
（３）ＤＯＩ合成酵素遺伝子の発現プラスミドベクターの構築及び形質転換
　上記（２）で取得したＰＣＲ産物の平滑末端化、リン酸化を行い、ｐＵＣ１９に大腸菌由来のｇａｐＡプロモーター、ＳＤ配列、ターミネーターを連結したプラスミドにライゲーションした。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写できるｇａｐＡプロモーターが導入されており、グルコースを含む培地で組換え微生物を培養した場合においてもＤＯＩ合成酵素遺伝子を効率的に発現・製造させることができる。
　ここで得られたプラスミドベクターを、塩化カルシウム法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルにヒートショック法で形質転換し、組換え微生物を作製した。
（４）新規ＤＯＩ合成酵素遺伝子の取得
　上記（３）で取得したプラスミドベクターに対し、常法による変異導入を行うことで、配列番号１（ＤＯＩＳ－１）、配列番号３（ＤＯＩＳ－２）、配列番号５（ＤＯＩＳ－３）、配列番号７（ＤＯＩＳ－４）、配列番号９（ＤＯＩＳ－５）および配列番号１１（ＤＯＩＳ－６）に記載の塩基配列を有する耐熱性ＤＯＩ合成酵素遺伝子を得ることができる。ここで取得したＤＯＩ合成酵素遺伝子についても（３）と同様に形質転換体の取得を行った。また、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１の塩基配列に対応するアミノ酸配列を、配列番号２（ＤＯＩＳ－１）、配列番号４（ＤＯＩＳ－２）、配列番号６（ＤＯＩＳ－３）、配列番号８（ＤＯＩＳ－４）、配列番号１０（ＤＯＩＳ－５）および配列番号１２（ＤＯＩＳ－６）に示した。
　新規ＤＯＩ合成酵素の選抜は、常法により作成した様々なＤＯＩ合成酵素を熱処理あるいは各種ｐＨ処理後に活性測定を行うなどして実施可能である。
［実施例２］
［精製酵素の取得］
　実施例１で作製したＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）の形質転換体を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートで、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
　次いで１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３～８時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。
　５００ｍＬ容の三角フラスコ３６本に、２ｇ／Ｌのグルコースと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を１００ｍＬずつ入れ、それぞれの三角フラスコに０．５ｍLの前培養液を添加し、３７℃で、１６時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。
　次いでこの培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で数回洗浄しながら菌体を回収した。回収した菌体は、－８０℃で凍結保存した。
　この凍結保存菌体を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁し、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ社製　卵白由来）を１８０ｍｇとデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＷａＫｏ社製　ウシ由来　組換え体溶液）を６０μＬ添加して、３７℃で、５時間、１２０ｒｐｍで振盪し、菌体破砕を行った。
　菌体破砕後の溶液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して菌体残渣を除去し、上清を回収した。
　この上清に硫酸アンモニウムを加えて３０％飽和とし、４℃でしばらく攪拌した後に、生じた沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して除去し、上清を回収した。
　この上清にさらに硫酸アンモニウムを加えて４０．０％飽和とし、４℃でしばらく攪拌した後に、生じた沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、沈殿を回収した。次いでこの沈殿を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）に溶解させた。
　この溶解液を４℃で、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）を加え、再度、濃縮するという脱塩操作を２～３回繰り返した。
　上記で得られた酵素溶液を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ」（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０～０．４Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
　上記で溶出した酵素のＤＯＩ合成酵素の活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、１０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁し、１０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＨｉＴｒａｐ　Ｐｈｅｎｙｌ　ＦＦ　（ｈｉｇｈ　ｓｕｂ）」（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、１０～０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
　上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＭｏｎｏＱ　５／５０　ＧＬ」（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０～０．２Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
　上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物と０．１ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＨｉＬｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００」（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス株式会社）に充填した後、同様の緩衝液で溶出を行った。
　上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）を得た。
　上記、一連の精製酵素取得実験と同様にして、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－２）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－３）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－４）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－５）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－６）および精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を取得した。
［実施例３］
［新規ＤＯＩ合成酵素の評価］
　実施例２で得られた精製ＤＯＩ合成酵素を用いて、その作用に関する実験を行った。
（１）至適ｐＨ範囲
　各ｐＨにおける活性測定では、反応液に精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）を適量添加し、グルコース－６－リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭ、各種緩衝液が１００ｍＭとなるようにして反応液を調整した。緩衝液としては、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０～７．７）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４～８．０）　を使用した。反応温度は３０℃とし、生成するＤＯＩを定量することで活性を測定した。最も高活性を示した活性値を１００とした相対活性を求め、この結果を図１に示す。本発明酵素における至適ｐＨ範囲は、ｐＨ７．０～ ７．７であった。
（２）安定ｐＨ範囲
　ｐＨ５．５～８．０の範囲の１００ｍＭの緩衝液を用いて、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５～８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４～８．０）を使用した。
　残存酵素活性測定は、グルコース－６－リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最も高活性を示した活性値を１００とした相対活性を求め、この結果を図２に示した。本酵素の安定ｐＨ範囲は、ｐＨ６．０～ ８．０であり、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－２）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－３）も同様の結果を示した。これらの広範囲ｐＨ安定性は、既存酵素にはない新規特性であった。
（３）至適温度範囲
　反応温度１０～７０℃の各反応温度条件において、グルコース－６－リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）の酵素活性測定を実施した。最も高活性を示した活性値を１００とした相対活性を求め、この結果を図３に示す。至適温度範囲は５５～７０℃であり、反応温度６５℃における比活性は１．８μｍｏｌ（ＤＯＩ）／ｍｉｎ／ｍｇ（酵素）と非常に高い値を示した。
（４）安定温度範囲
　精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）を添加して且つ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、温度範囲２５～６０℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
　残存酵素活性測定は、グルコース－６－リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最も高活性を示した活性値を１００とした相対活性を求め、この結果を図４に示した。精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）の安定温度範囲は５０℃以下であり、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－２）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－３）も同様の結果を示した。これらの高温安定性は、既知酵素にはない新規特性であった。
　また、安定化剤として作用することが知られているＮＡＤ＋およびコバルトイオン非存在化でインキュベートした安定温度範囲試験を実施したところ、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）のインキュベート温度４６℃における相対活性は３８、インキュベート温度４２℃における相対活性は８９、インキュベート温度３７℃における相対活性は１００であった。
（５）分子量
　分離ゲル濃度が１０％の「レディーゲルＪ」（日本バイオ・ラッド　ラボラトリーズ株式会社）を用いるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量を求めたところ、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）の分子量は約４０，０００であり、アミノ酸配列から推定される分子量４０，６５６とほぼ一致した。
［実施例４］
［新規ＤＯＩ合成酵素の評価］
　実施例２で得られた精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－４）を用いて、その作用に関する実験を行った。
（温度安定性の評価）
　精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－４）を添加して且つ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、２５℃および４２℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
　残存酵素活性測定は、グルコース－６－リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。２５℃でインキュベートした際の残存活性を１００とすると、４２℃インキュベートの活性値は７４という非常に高い値を示した。
（比活性の測定）
　また、反応温度６０℃における比活性は１．２μｍｏｌ（ＤＯＩ）／ｍｉｎ／ｍｇ（酵素）と非常に高い値を示した。

 [実施例５] 
［新規ＤＯＩ合成酵素の評価］
　実施例２で得られた精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－５）を用いて、その作用に関する実験を行った。
（ｐＨ安定性の評価）
　ｐＨ５．５～８．０の範囲の１００ｍＭの緩衝液を用いて、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－５）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５～８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４～８．０）　を使用した。
　残存酵素活性測定は、グルコース－６－リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図５に示した。図５に示すとおり、本酵素は非常に幅広いｐＨ領域で高い安定性を示した。この高い安定性は、既存酵素にはない新規特性であった。
[実施例６]
［新規ＤＯＩ合成酵素の評価］
　実施例２で得られた精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－６）を用いて、その作用に関する実験を行った。
（ｐＨ安定性の評価）
　ｐＨ５．５～８．０の範囲の１００ｍＭの緩衝液を用いて、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－６）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５～８．０）を使用した。
　残存酵素活性測定は、グルコース－６－リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を示したｐＨ８．０の残存活性を１００とすると、ｐＨ６．５～８．０の範囲では活性値は７０以上であり、ｐＨ６．０の残存活性は５３という非常に高い値を示した。この高いｐＨ安定性は、既存酵素にはない新規特性であった。
［実施例７］
「ＤＯＩの生産方法」
　実施例１で作製したＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）の形質転換体を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートで、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
　次いで１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３～８時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。
　５００ｍＬ容の三角フラスコ３６本に、２ｇ／Ｌのグルコースと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を１００ｍＬずつ入れ、それぞれの三角フラスコに０．５ｍLの前培養液を添加し、３７℃で、１６時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。
　次いでこの培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で数回洗浄しながら菌体を回収した。回収した菌体は、－８０℃で凍結保存した。
　ＤＯＩの合成には、ＤＯＩ合成触媒として、上記の凍結菌体を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁した液を使用した。ＤＯＩ合成反応の反応液組成は、グルコース－６－リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が８５ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が０．１ｍＭ、塩化コバルト六水和物が１ｍＭ、菌体ＯＤが３０として、ＤＯＩの合成反応を開始した。反応開始時のｐＨは７．７に調整し、反応温度４６℃で２．５時間合成反応を行うことで、１重量%のＤＯＩが生成した。反応終了後は、塩酸を添加し、ｐＨを６以下まで低下させた。次いでこの反応溶液を４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を回収し、フィルターろ過をして菌体残渣を除去した。
　上記で合成したＤＯＩ溶液は、アンバーライトＩＲ１２０ＢＮａ(オルガノ社製)をＨ+型に再生した陽イオン交換樹脂およびアンバーライトＩＲＡ９６ＳＢ(オルガノ社製)をＯＨ-型に再生した陰イオン交換樹脂を用いて精製処理を行った。本精製処理においては、カラム処理およびバッチ処理を併用し、ＩＣＰ発光分析法によりＰ、Ｃｏ、Ｎａが未検出で且つＤＯＩ溶液を含んだ画分を回収した。
　次いで、上記で得られたＤＯＩ溶液に、溶液中のＤＯＩ１ｇに対して０．５ｇの活性炭カルボラフィン（日本エンバイロケミカルズ社製）を添加し、１時間室温で攪拌して微量不純物を活性炭に吸着させた。1時間後、ろ過操作により活性炭を除去し、ＤＯＩ溶液を回収した。本ＤＯＩ溶液を減圧濃縮することで、ＤＯＩを濃縮し、凍結乾燥によりＤＯＩの粉末を得た。
[実施例８] 
　実施例１で作製したＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ－１）の形質転換体を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートで、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
　次いで１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３～８時間、ＯＤが０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。
　表１に示す異なる濃度の塩化コバルト６水和物を含んだ培地Ａ１００ｍＬを５００ｍＬ容の三角フラスコにそれぞれ入れ、さらに０．５ｍLの前培養液を添加し、３７℃で、１８時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。培養１８時間後の各培地条件の菌液ＯＤ、添加コバルト値およびコバルトイオン無添加培地の上清ＤＯＩ濃度を１００としたときの相対値（ＤＯＩ生産性）を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
比較例１
［既知ＤＯＩ合成酵素の評価］
　配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３－（４）安定温度範囲と同様にして以下実験を行った。
　精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を添加して且つ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、温度範囲２５～６０℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
　残存酵素活性測定は、グルコース－６－リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図６に示した。精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定温度範囲は４２℃以下であり、４６℃での相対活性は２３、５０℃での相対活性は０と著しく低い熱安定性を示した。
　また、安定化剤として作用することが知られているＮＡＤ＋およびコバルトイオン非存在化でインキュベートした安定温度範囲試験を実施したところ、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）のインキュベート温度４２℃および４６℃における相対活性は０、インキュベート温度３７℃における相対活性は１４であった。本実験からも既存酵素が著しく低い熱安定性を有することが示された。
　配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３－（２）安定ｐＨ範囲と同様にして以下実験を行った。
　精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５～７．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４～８．０）　を使用した。
　残存酵素活性測定は、グルコース－６－リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図５に示した。図７に示すとおり、ｐH６における相対活性は２７と非常に低い値であり、ｐH５．５ではほぼ完全に失活していた。
［比較例２］
［既知ＤＯＩ合成酵素の評価］
　配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３と同様にして以下実験を行った。
　精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を添加して且つ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、２５℃および４２℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
　残存酵素活性測定は、グルコース－６－リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。２５℃でインキュベートした際の残存活性を１００として、４２℃インキュベートの活性値は０となり、著しく低い熱安定性を示した。
　本発明により、産業上有用とされる芳香族化合物（カテコール等）の前駆体として利用価値の高いＤＯＩを効率的な製造プロセスで生産することができる。

Claims (15)

  1. 下記（１）、（２）、（４）、（６）及び（７）の特性を有し、かつ下記（３）及び／又は（５）の特性を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
    （１）作用：本酵素は、グルコース－６－リン酸を２－デオキシ－シロ－イノソースへと変換する機能を有する。
    （２）至適ｐＨ範囲：７．０～ ７．７
    （３）安定ｐＨ範囲：６．０～ ８．０
    （４）至適温度範囲：５５ ～ ７０℃
    （５）安定温度範囲：２０～４６℃
    （６）補酵素：ＮＡＤ+を利用
    （７）分子量：３９０００～４２０００
  2. 下記（８）の特性を有する、請求項１に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
    （８）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）
  3. 下記（９）の特性を有する、請求項１又は２に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
    （９）補因子：Ｃｏ2+イオンの添加により活性向上
  4. 安定温度範囲が、２０～６０℃である、請求項１から３の何れか１項に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
  5. 下記の何れかのアミノ酸配列を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
    （ａ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列；又は
    （ｃ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列
  6. 下記の何れかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素遺伝子。
    （ａ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列；又は
    （ｃ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列
  7. 下記の何れかの塩基配列を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素遺伝子。
    （ａ）配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列；
    （ｂ）配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素をコードする塩基配列；又は
    （ｃ）配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列に対して１個又は複数個の塩基の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有する２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素をコードする塩基配列：
  8. 請求項６又は７に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素遺伝子を含む、組み換えベクター。
  9. 請求項６又は７に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素遺伝子又は請求項８に記載の組み換えベクターを宿主に導入することにより得られる形質転換体。
  10. 請求項９に記載の形質転換体を培養することにより得られる２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素。
  11. 請求項１から５又は１０の何れか１項に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素を用いることを特徴とする、２－デオキシ－シロ－イノソースの製造方法。
  12. 請求項６又は７に記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素遺伝子、又は請求項９に記載の形質転換体を利用することを特徴とする、グルコース、グルコースを構成成分とする多糖類及び／又はグルコース－６－リン酸を原料とした２－デオキシ－シロ－イノソースの製造方法。
  13. コバルトイオンを含有する培地において２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素を発現可能な微生物を培養することを特徴とする、グルコース－６－リン酸から２－デオキシ－シロ－イノソースを製造する製造方法。
  14. グルコースを構成成分とする多糖類あるいはグルコースを含有する原料を用いることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  15. ２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素が、請求項１から５の何れかに記載の２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素である、請求項１３又は１４に記載の方法。
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