JP5661250B2 - 新規グルコース−６−リン酸定量方法および定量試薬 - Google Patents

Description

本発明は、グルコース−６−リン酸の定量方法、定量試薬、及び定量試薬キットに関する。

近年、細胞内、組織内または生体内の全代謝物を研究するメタボロミクスにおいて、特定の代謝産物や化合物の測定法の重要性が高まっており、さらには、このような測定手法は研究分野に限らず、臨床診断などの医療現場や食品の栄養素分析と非常に幅広い分野への適応が求められてきた。それぞれの試料は様々な物質が混在していることから、複数の手法による確認が重要とされ、多様な測定方法が求められていることはもちろんであるが、既存手法には大きな問題を抱えるものもあり、まったく新しい手法の創出が求められている分析領域も多く存在している。

例えば、グルコース−６−リン酸の既存測定方法としては、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを利用した手法が挙げられる（特許文献1）。前記手法では、ＮＡＤ（Ｐ）＋を共存させたグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼにより、グルコース−６−リン酸は酸化されて６−ホスホグルコン酸になり、ＮＡＤ（Ｐ）＋はＮＡＤ（Ｐ）Ｈとなる。

特開平７−５９５６６号公報

しかしながら、特許文献１記載の手法では３４０ｎｍの吸収強度の変化を分析することから、試料中に３４０ｎｍに吸収を持つ夾雑物が混在していた場合、グルコース−６−リン酸を測定することは困難であり、また、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの阻害物質が混入していてももちろん大きな問題となる。さらには、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋の選択性や、安定性なども無視することができないケースも多い。
本発明は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用しないグルコース−６−リン酸の新規な定量方法、定量試薬、及び定量試薬キットを提供することを解決すべき課題とする。

本発明者らは、これらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ＤＯＩ合成酵素が高い基質特異性および安定性を有することを発見し、且つ、簡便なアッセイ方法と組み合わせることが可能であること等を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の［１］〜［１０］に示すグルコース−６−リン酸の定量方法、定量試薬、定量試薬キット及び定量試薬キットに関するものである。
［１］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を用いてグルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースとリン酸へと変換する工程を含む、グルコース−６−リン酸の定量方法。
［２］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を用いてグルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースとリン酸へと変換する工程を含む、グルコース−６−リン酸に導くことが可能である物質又は補酵素の定量方法。
［３］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、グルコース−１−リン酸および／又はフルクトース−６−リン酸および／またはフルクトース−１，６−ビスリン酸に作用しない酵素である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、安定温度範囲が少なくとも４６℃まで安定である耐熱性酵素である、［１］から［３］の何れかに記載の方法。
［５］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、ｐＨ６．０〜 ８．０で安定な酵素である、［１］から［４］の何れかに記載の方法。
［６］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が下記の特性を有する酵素である、［１］から［２］の何れかに記載の方法。
（１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースへと変換する機能を有する。
（２）補酵素としてＮＡＤ⁺を利用
（３）至適ｐＨ範囲：７．０〜 ７．７
（４）至適温度範囲：５５ 〜 ７０ ℃
（５）分子量：３９０００〜４２０００
（６）補因子：Ｃｏ²⁺イオンの添加により活性向上
（７）安定温度範囲：少なくとも４６℃ まで安定である。
（８）安定ｐＨ範囲：少なくとも６．０〜 ８．０の範囲で安定である。
（９）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）
（１０）グルコース−１−リン酸および／又はフルクトース−６−リン酸および／またはフルクトース−１，６−ビスリン酸に作用しない。
［７］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、［１］から［２］の何れかに記載の方法。
［８］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有して且つ、高温安定性及び／又は広範囲ｐH安定性を持つ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、［１］から［６］の何れかに記載の方法。
［９］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を含む、［１］から［８］の何れかに記載の定量方法で使用するためのグルコース−６−リン酸定量試薬。
［１０］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を含む、［１］から［８］の何れかに記載の定量方法で使用するためのグルコース−６−リン酸定量試薬キット。

本発明の方法を用いると、信頼性の高いグルコース−６−リン酸の測定データを提供できる。

図１は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の至適ｐＨ範囲を示す（実施例３）。 図２は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定ｐＨ範囲を示す（実施例３）。 図３は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の至適温度範囲を示す（実施例３）。 図４は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定温度範囲を示す（実施例３）。 図５は、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定温度範囲を示す（比較例１）。 図６は、グルコース−６−リン酸初発濃度と、反応後に遊離した無機リン酸濃度との関係を示す。

以下、本発明について具体的に説明する。
[ＤＯＩ合成酵素]
本発明を実施するための形態（以下、本実施の形態という）のＤＯＩ合成酵素は、下記の特性を有し、
（１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソース（以下、ＤＯＩとする）へと変換する機能を有する。
また、下記に示す一部またはすべての特性を有する。
（２）補酵素としてＮＡＤ⁺を利用
（３）至適ｐＨ範囲：７．０〜 ７．７
（４）至適温度範囲：５５ 〜 ７０ ℃
（５）分子量：３９０００〜４２０００
（６）補因子：Ｃｏ²⁺イオンの添加により活性向上
さらには、下記に示す一部またはすべての特性を有することが好ましい。
（７）安定温度範囲：少なくとも４６℃ まで安定である。
（８）安定ｐＨ範囲：少なくとも６．０〜 ８．０の範囲で安定である。
（９）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）
（１０）グルコース−１−リン酸および／又はフルクトース−６−リン酸および／またはフルクトース−１，６−ビスリン酸に作用しない。

本実施の形態においてＤＯＩ合成酵素のアミノ酸配列に関しては特に限定されないが、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示す新規ＤＯＩ合成酵素は、耐熱性やｐＨ安定性などの面で優れた性能を有することからより好ましい。また、ＤＯＩ合成酵素の機能が維持する限りは、これらのアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよく、例えば、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性の範囲内で、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列の１個または複数個（例えば１から５０個、好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個）のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換してもよい。

ＤＯＩ合成酵素中のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異を生じさせる方法としては、ＰＣＲ法、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法やキメラ酵素を作製する手法等の公知の方法が利用できる。

[ＤＯＩ合成酵素遺伝子]
本実施の形態のＤＯＩ合成酵素遺伝子は、メタゲノムや微生物から単離・抽出した天然のものでも良く、また、その塩基配列に従ってＰＣＲ法、人工合成法等の公知の方法によって合成したものでも良い。また、新規ＤＯＩ酵素キメラ遺伝子の作成には、既知ＤＯＩ合成酵素遺伝子を組み合わせてもよく、例示される遺伝子としてはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ ＪＣＭ３２６８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ＮＢＲＣ１２７７３株などに由来するＤＯＩ合成酵素遺伝子が挙げられる。

配列番号１、３、５、７、９又は１１に新規ＤＯＩ合成酵素遺伝子の塩基配列を例示するが、これらに限定されることなく上記記載のＤＯＩ合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＯＩ合成酵素遺伝子を用いても良い。

[組換えベクター及び形質転換体]
本実施の形態の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本実施の形態の遺伝子を連結（挿入）して得ることができる。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。

前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis 等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラスミド（例えば YEp13, YEp24, YCp50, pYE52 等）などが、ファージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。

前記ベクターへの本実施の形態の遺伝子の挿入は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。

宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに詳述する。また、必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。

本実施の形態の形質転換体は、本実施の形態の組換えベクターを目的遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することによって得ることができる。ここで宿主としては、本実施の形態のDNAを発現できるものであれば特に限定されず、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、その他COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができる。

大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本実施の形態の組換えベクターが各細菌中で自律複製可能であるとともにプロモーター、リボゾーム結合配列、本実施の形態遺伝子、転写終結配列により構成されていることが望ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていても良い。大腸菌としてはエッシェリヒア・コリ（E. coli）K12、DH1、DH10B（Invitrogen社）、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL（ストラタジーン社）、TOP10F等が挙げられ、枯草菌としてはバチルス・ズブチリス（B. subtilis）MI114、207-21 等が挙げられる。

プロモーターとしては大腸菌等の宿主で機能するものであれば特に限定されず、例えばgapAプロモーター、gadAプロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌由来のプロモーターや、T7プロモーター等のファージ由来のプロモーターを用いることができる。

細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入できる方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 2110 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セルビシエ（S. cerevisiae）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等が用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母で発現しうるもの、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα 1プロモーター、PHO5プロモーター、AOXプロモーター等を挙げることができる。

酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. et al. : Methods. Enzymol., 194 : 180 (1990)）、スフェロプラスト法（Hinnen, A. et al. : Proc Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 1929 (1978)）、酢酸リチウム法（Itoh, H. : J. Bacteriol., 153 : 163 (1983)）等を挙げることができる。

[ＤＯＩ合成酵素の生産]
本実施の形態の酵素は、本実施の形態の形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から該酵素活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本実施の形態の形質転換体を培養する方法は、宿主に応じて決定すればよい。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。

培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加しても良い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加しても良い。

培養後、本実施の形態の酵素タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合は、細胞を破砕する。一方、本実施の形態のタンパク質が菌体外または細胞外に分泌される場合は、培養液をそのまま用いるか、遠心分離等によって回収する。

タンパク質の単離・精製には、例えば硫安沈澱、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独であるいは適宜組み合わせて用いればよい。

また本実施の形態のＤＯＩ合成酵素活性は、基質となり得る適当なグルコース−６−リン酸を含む反応液に該酵素を添加し、生成するＤＯＩを検出する方法によって確認することができる。生成するＤＯＩの確認は、非特許文献（Journal of Biotechnology 129, 502-509 (2007)）に記載の方法などを用いることができる。

ＤＯＩ合成酵素活性を測定する方法としては、例えば、１０００ｍＭグルコース−６−リン酸溶液２０μＬ、１００ｍＭＮＡＤ⁺溶液５０μＬ、１００ｍＭ塩化コバルト六水和物溶液５０μＬを含むｐＨ７．０の１５０ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液９００μＬに適当な濃度のＤＯＩ合成酵素液１００μＬを混合し、５〜６０分間程度反応させた後、酵素を失活させ、ＤＯＩを定量する方法などが挙げられる。

精製されたＤＯＩ合成酵素の精製度の確認や分子量の測定は、電気泳動やゲル濾過クロマトグラフィー等によって行うことができる。また、酵素の至適温度範囲あるいは至適ｐＨ範囲は、反応温度あるいは反応ｐＨを変化させて酵素活性を測定すればよい。さらにＤＯＩ合成酵素を種々のｐＨ条件下又は温度条件下に一定時間さらした後に酵素活性を測定することにより、安定ｐＨ範囲及び安定温度範囲を調べることができる。例えば、各ｐH条件におけるＤＯＩ合成酵素の評価には、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）を用いることができる。

至適ｐＨ範囲とは、最大活性を１００とするときの活性値が７０以上の範囲であり、安定ｐＨ範囲とは最大活性を１００とするときの活性値が７０以上の範囲である。また、至適温度範囲とは、最大活性を１００とするときの活性値が５０以上の範囲であり、安定温度範囲は最大活性を１００とするときの活性値が５０以上の範囲である。
本実施の形態におけるＤＯＩ合成酵素の高温安定性とは、安定温度範囲が４６℃以下、より好ましくは、５０℃以下、さらにより好ましくは６０℃以下、さらに特に好ましくは９５℃以下まで安定なことである。高温安定性を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素としては、例えば、５０℃で１時間インキュベートした後の残存酵素活性（最大活性を１００とする相対活性）が５０以上である酵素を選抜することができる。
本実施の形態における広範囲ｐＨ安定性を持つＤＯＩ合成酵素は、安定ｐＨ範囲が少なくともｐＨ６．０〜７．０、好ましくはｐＨ６．０〜７．４、より好ましくはｐＨ６．０〜７．７、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０、特により好ましくはｐＨ４．０〜９．０である特性を有する。

本実施の形態によれば、前述の酵素を用いる際には、本実施の形態の酵素の作用を阻害しないかぎり、特別に精製程度等は限定されず、精製された本実施の形態の酵素の他、その酵素含有物を用いてもよい。

[ＤＯＩ合成酵素を含む定量試薬とその使用]
本実施の形態においては、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を用いてグルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースとリン酸へと変換することによって、グルコース−６−リン酸を定量することができる。即ち、本実施の形態によれば、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を含むグルコース−６−リン酸定量試薬が提供される。

本実施の形態の定量試薬を用いて定量しうるグルコース−６−リン酸関連物質や補酵素としては、ＤＯＩ合成酵素の基質であるグルコース−６−リン酸を導けるものであればいずれでもよいが、定量の対象となるグルコース関連物質や補酵素としては、例えばラクトース、マルトース、グリコーゲン、スターチ、シュークロース、グルコース、フルクトース、マンノース、クレアチンリン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、マルトース−６−リン酸、フルクトース−２−リン酸、Ｌ−ソルボース−６−リン酸、グルコース−１−リン酸、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸、ウリジン二リン酸グルコース等が挙げられる。また、活性測定の対象となるグルコース関連酵素としては、例えばクレアチンキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アミログルコシダーゼ、インベルターゼ、トランスアルドラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、フルクトースジフォスファターゼ、グルコシダーゼ、アミラーゼなどが挙げられる。

さらに本実施の形態によれば、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を含む、グルコース−６−リン酸定量試薬キットが提供される。
該グルコース−６−リン酸定量試薬キットには、緩衝剤としてトリス−塩酸緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッドバッファー等の０．００５〜２ｍｏｌ／ｌ溶液が用いられ、他の酵素、発色剤および界面活性剤等が含有されていてもよい。

該定量試薬キットに含有されてもよい他の酵素としては、前記グルコース関連酵素の他に、例えばヌクレオシドジホスホキナーゼ、ペルオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウリカーゼ等が挙げられる。発色剤としては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを直接発色させる場合にはテトラゾリウム塩、例えばテトラゾリウムブルー、ニトロテトラゾリウムブルー等が挙げられ、過酸化水素に導いて発色させる場合にはペルオキシダーゼの存在下でｏ−ジアニシジン、４−メトキシ−１−ナフトール、2,2'−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸等の単独試薬、４−アミノアンチピリンとフェノール、ｐ−クロロフェノール、2,4,6−トリブロモフェノール等のフェノール系化合物、N,N −ジメチルアニリン、N,N −ジエチルアニリン等のアニリン系化合物またはN,N −ジエチル−ｍ−トルイジン等のトルイジン系化合物との組み合わせ試薬、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノヒドラゾンとN,N −ジメチルアニリンとの組み合わせ試薬、特開昭５７−２９２９７号公報あるいは特開昭５９−７４７１３号公報に記載の化合物等が挙げられ、界面活性剤としては、ポリエチレングリコール−モノ−ｐ−イソ−オクチルフェニルエーテル等が挙げられる。

該定量試薬キットは液体の状態ばかりでなく、全成分あるいは一部成分が凍結乾燥品の形で供給され、溶解液で該凍結乾燥品を溶解して最終的に作製されても構わない。この際に該定量試薬キットは、凍結乾燥品に含有されていても溶解液の側に含有されていても更にその両者に含有されていても構わない。

該定量試薬組成物および該定量試薬キットを用いた場合、ＤＯＩおよびリン酸が系内に生成するがこれらの濃度を定量することにより対象物質の濃度等を同定することができる。該定量試薬組成物および該定量試薬キットのグルコース−６−リン酸転換率は５０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。また、該定量試薬組成物および該定量試薬キットのグルコース−１−リン酸およびフルクトース−６−リン酸などの脱リン酸活性は、グルコース−６−リン酸を基質としたときの活性の１／１０以下、より好ましくは１／１００以下である。ＤＯＩを定量する方法としては、例えば、非特許文献（Journal of Biotechnology 129, 502-509 (2007)）に記載の方法が挙げられるが、好ましい簡便な手法としては、グルコース−６−リン酸からＤＯＩを生成する際に遊離するリン酸を、ｐ−メチルアミノフェノール還元法により測定する方法が挙げられる。本リン酸測定法は、すでに測定試薬キットとして市販されており（和光純薬工業株式会社、商品名：ホスファＣ−テストワコー）、その利用性は非常に高い。測定原理であるが、試料中の生成無機リン酸は添加する発色液中のモリブデン酸塩に結合してリンモリブデン酸となり、さらに硫酸ｐ−メチルアミノフェノールにより還元されモリブデンブルーとして青色を呈する。この青色の吸光度を測定することにより試料中の無機リン濃度を求めることができ、簡易的には目視での判断も可能である。

以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

［実施例１］
（１）染色体ＤＮＡの調製
常法に従ってＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株の染色体ＤＮＡを調製した。
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株をＮＲ寒天プレート（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ エルリッヒカツオエキス、１．５％ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ、ｐＨ７．０）で、３０℃、１日間培養してコロニーを形成させた。その１白金耳を、ＮＲ培地（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ エルリッヒカツオエキス、ｐＨ７．０）３０ｍＬを１５０ｍＬ三角フラスコに分注したものに接種して、３０℃、１８０ｒｐｍで１日間培養した。この培養液を、４℃で、１２，０００ｇ、１分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。

得られた菌体をＬｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコース）に懸濁し、よく洗浄した。遠心分離して菌体を回収した後、Ｌｙｓｉｓバッファーに再懸濁し、これにリゾチームを加え３７℃で４５分間インキュベートした。次いでＳＤＳとＲＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。そ\\Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、５０℃で６０分間穏やかに振盪した。ここで得られた溶液をフェノール−クロロホルム、クロロホルムで処理後、エタノール沈殿し、析出した核酸をガラスピペットに巻きつけて回収した。この核酸を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、ＴＥに再溶解した。この操作により、約１００μｇの染色体ＤＮＡを調製した。

（２）ＤＯＩ合成酵素遺伝子の単離
上記（１）において調製した染色体ＤＮＡからＤＯＩ合成酵素遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして、センスプライマーは配列番号１５の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは配列番号１６の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。

ここで得られたＰＣＲプライマーを用い、上記（１）において調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によるＤＯＩ合成酵素遺伝子の増幅を行い、１１０７塩基対からなるＰＣＲ産物を取得した。
ここで得られたＰＣＲ産物の遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーで解析することで確認し、配列番号１３の塩基配列を有する既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）遺伝子を得た。また、配列番号１４には、既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）のアミノ酸配列を示した。

（３）ＤＯＩ合成酵素遺伝子の発現プラスミドベクターの構築及び形質転換
上記（２）で取得したＰＣＲ産物の平滑末端化、リン酸化を行い、ｐＵＣ１９に大腸菌由来のｇａｐＡプロモーター、ＳＤ配列、ターミネーターを連結したプラスミドにライゲーションした。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写できるｇａｐＡプロモーターが導入されており、グルコースを含む培地で組換え微生物を培養した場合においてもＤＯＩ合成酵素遺伝子を効率的に発現・製造させることができる。
ここで得られたプラスミドベクターを、塩化カルシウム法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルにヒートショック法で形質転換し、組換え微生物を作製した。

（４）耐熱性ＤＯＩ合成酵素遺伝子の取得
上記（３）で取得したプラスミドベクターに対し、常法による変異導入を行うことで、配列番号１（ＤＯＩＳ−１）、配列番号３（ＤＯＩＳ−２）、配列番号５（ＤＯＩＳ−３）、配列番号７（ＤＯＩＳ−４）に記載の耐熱性ＤＯＩ合成酵素遺伝子を得ることができる。また、これらの遺伝子配列に対応するそれぞれのアミノ酸配列を配列番号２、４、６又は８に示した。ここで取得したＤＯＩ合成酵素遺伝子についても（３）と同様に形質転換体の取得を行った。

（５）広範囲ｐＨ安定型ＤＯＩ合成酵素遺伝子の取得
上記（３）で取得したプラスミドベクターに対し、常法による変異導入を行うことで、配列番号９（ＤＯＩＳ−５）、配列番号１１（ＤＯＩＳ−６）、に記載の広範囲ｐＨ安定型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を得ることができる。また、これらの遺伝子配列に対応するそれぞれのアミノ酸配列を配列番号１０及び１２に示した。

［実施例２］
［精製酵素の取得］
実施例１で作製したＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の形質転換体を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートで、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
次いで１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３〜８時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。

５００ｍＬ容の三角フラスコ３６本に、２ｇ／Ｌのグルコースと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を１００ｍＬずつ入れ、それぞれの三角フラスコに０．５ｍLの前培養液を添加し、３７℃で、１６時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。
次いでこの培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で数回洗浄しながら菌体を回収した。回収した菌体は、−８０℃で凍結保存した。

この凍結保存菌体を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁し、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ社製 卵白由来）を１８０ｍｇとデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＷａＫｏ社製 ウシ由来 組換え体溶液）を６０μＬ添加して、３７℃で、５時間、１２０ｒｐｍで振盪し、菌体破砕を行った。
菌体破砕後の溶液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して菌体残渣を除去し、上清を回収した。

この上清に硫酸アンモニウムを加えて３０％飽和とし、４℃でしばらく攪拌した後に、生じた沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して除去し、上清を回収した。
この上清にさらに硫酸アンモニウムを加えて４０．０％飽和とし、４℃でしばらく攪拌した後に、生じた沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、沈殿を回収した。次いでこの沈殿を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）に溶解させた。

この溶解液を４℃で、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）を加え、再度、濃縮するという脱塩操作を２〜３回繰り返した。
上記で得られた酵素溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．４Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。

上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、１０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁し、１０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ （ｈｉｇｈ ｓｕｂ）」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、１０〜０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．２Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。

上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物と０．１ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に充填した後、同様の緩衝液で溶出を行った。
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を得た。

上記、一連の精製酵素取得実験と同様にして、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を取得した。

［実施例３］
［新規ＤＯＩ合成酵素の評価］
実施例２で得られた精製ＤＯＩ合成酵素を用いて、その作用に関する実験を行った。
（１）至適ｐＨ範囲
各ｐＨにおける活性測定では、反応液に精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を適量添加し、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭ、各種緩衝液が１００ｍＭとなるようにして反応液を調整した。緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０〜７．７）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０） を使用した。反応温度は３０℃とし、生成するＤＯＩを定量することで活性を測定した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図１に示す。本発明酵素における至適ｐＨ範囲は、ｐＨ７．０〜 ７．７であった。

（２）安定ｐＨ範囲
ｐＨ５．５〜８．０の範囲の１００ｍＭの緩衝液を用いて、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０） を使用した。
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図２に示した。本酵素の安定ｐＨ範囲は、ｐＨ６．０〜 ８．０であり、非常に幅広いｐＨ範囲で安定であった。精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）も同様の結果を示した。

（３）至適温度範囲
反応温度１０〜７０℃の各反応温度条件において、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の酵素活性測定を実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図３に示す。至適温度範囲は５５〜７０℃であり、反応温度６５℃における比活性は１．８μｍｏｌ（ＤＯＩ）／ｍｉｎ／ｍｇ（酵素）と非常に高い値を示した。

（４）安定温度範囲
精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を添加して且つ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、温度範囲２５〜６０℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。

残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図４に示した。精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定温度範囲は５０℃以下であり、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）も同様の結果を示した。これらの高温安定性は、既知酵素にはない新規特性であった。

また、安定化剤として作用することが知られているＮＡＤ＋およびコバルトイオン非存在化でインキュベートした安定温度範囲試験を実施したところ、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）のインキュベート温度４６℃における相対活性は３８、インキュベート温度４２℃における相対活性は８９、インキュベート温度３７℃における相対活性は１００であった。

（５）分子量
分離ゲル濃度が１０％の「レディーゲルＪ」（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量を求めたところ、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の分子量は約４０，０００であり、アミノ酸配列から推定される分子量４０，６５６とほぼ一致した。

［比較例１］
［既知ＤＯＩ合成酵素の評価］
配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３−（４）安定温度範囲と同様にして以下実験を行った。
精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を添加して且つ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、温度範囲２５〜６０℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。

残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図５に示した。精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定温度範囲は４２℃以下であり、４６℃での相対活性は２３、５０℃での相対活性は０と著しく低い熱安定性を示した。

また、安定化剤として作用することが知られているＮＡＤ＋およびコバルトイオン非存在化でインキュベートした安定温度範囲試験を実施したところ、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）のインキュベート温度４２℃および４６℃における相対活性は０、インキュベート温度３７℃における相対活性は１４であった。本実験からも既存酵素が著しく低い熱安定性を有することが示された。

配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３−（２）安定ｐＨ範囲と同様にして以下実験を行った。
精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜７．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０） を使用した。

残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求めたところ、ｐH６における相対活性は２７と非常に低い値であった。

［実施例４］
［グルコース−６−リン酸の定量］
各種濃度（０．０２、０．１、０．５、１、３，５、１０ｍＭ）のグルコース−６−リン酸を含有した試料とＤＯＩ合成酵素を含有する定量試薬組成物を１：１で混合し、グルコース−６−リン酸の定量試験を実施した。定量試薬組成物は、適量のＤＯＩ合成酵素を含有し、且つ、１０ｍＭ ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）、１０ｍＭ 塩化コバルト六水和物、１５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を含んでなる。反応温度を３０℃とし、それぞれのグルコース−６−リン酸濃度条件において十分な時間反応させた。反応後、遊離する無機リン酸濃度を市販の試薬キット（和光純薬工業株式会社、商品名：ホスファＣ−テストワコー）で測定したところ、誤差５％の範囲内でグルコース−６−リン酸初発濃度と対応した。グルコース−６−リン酸初発濃度と、反応後に遊離した無機リン酸濃度との関係を図６に示す。一方、上記グルコース−6−リン酸と同様の条件で、フルクトース−６−リン酸およびグルコース−１−リン酸の反応試験を実施したところ、遊離の生成無機リン酸は検出されなかった（グルコース−６−リン酸を基質とした場合の活性の1１／１００以下）。

本発明は、研究分野、臨床診断などの医療現場および食品の栄養素分析と非常に幅広い分野で有効利用が期待される。

Claims (9)

1. ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を用いてグルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースとリン酸へと変換する工程を含む、グルコース−６−リン酸の定量方法。
2. ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、グルコース−１−リン酸および／又はフルクトース−６−リン酸および／またはフルクトース−１，６−ビスリン酸に作用しない酵素である、請求項１に記載の方法。
3. ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、安定温度範囲が少なくとも４６℃まで安定である耐熱性酵素である、請求項１又は２に記載の方法。
4. ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、ｐＨ６．０〜 ８．０で安定な酵素である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
5. ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が下記の特性を有する酵素である、請求項１に記載の方法。
   （１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースへと変換する機能を有する。
   （２）補酵素としてＮＡＤ⁺を利用
   （３）至適ｐＨ範囲：７．０〜 ７．７
   （４）至適温度範囲：５５ 〜 ７０ ℃
   （５）分子量：３９０００〜４２０００
   （６）補因子：Ｃｏ²⁺イオンの添加により活性向上
   （７）安定温度範囲：少なくとも４６℃ まで安定である。
   （８）安定ｐＨ範囲：６．０〜 ８．０
   （９）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）
   （１０）グルコース−１−リン酸および／又はフルクトース−６−リン酸および／またはフルクトース−１，６−ビスリン酸に作用しない。
6. ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、請求項１に記載の方法。
7. ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有して且つ、高温安定性及び／又は広範囲ｐH安定性を持つ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、請求項１から５の何れかに記載の方法。
8. ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を含む、請求項１から７の何れかに記載の定量方法で使用するためのグルコース−６−リン酸定量試薬。
9. ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を含む、請求項１から７の何れかに記載の定量方法で使用するためのグルコース−６−リン酸定量試薬キット。

Images