WO2015129475A1 - 比活性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

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WO2015129475A1
WO2015129475A1 PCT/JP2015/053889 JP2015053889W WO2015129475A1 WO 2015129475 A1 WO2015129475 A1 WO 2015129475A1 JP 2015053889 W JP2015053889 W JP 2015053889W WO 2015129475 A1 WO2015129475 A1 WO 2015129475A1
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amino acid
acid sequence
seq
flavin
glucose dehydrogenase
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PCT/JP2015/053889
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康子 荒木
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キッコーマン株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose

Definitions

  • the present invention relates to a flavin-binding glucose dehydrogenase with improved specific activity, a glucose measurement method using the same, and a flavin-binding glucose dehydrogenase production method.
  • Blood glucose level (blood glucose level) is an important marker of diabetes.
  • an apparatus for self blood glucose measurement (Self Monitoring of Blood Glucose: SMBG) using an electrochemical biosensor is widely used.
  • enzymes using glucose as a substrate such as glucose oxidase (GOD)
  • GOD glucose oxidase
  • GDH glucose dehydrogenases
  • NAD nicotinamide dinucleotide
  • NADP nicotinamide dinucleotide phosphate
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • NAD (P) -GDH has the problem that the stability of the enzyme is poor and the addition of a coenzyme is necessary, and PQQ-GDH has a low substrate specificity, and other than glucose to be measured.
  • PQQ-GDH has a low substrate specificity, and other than glucose to be measured.
  • sugar compounds such as maltose, D-galactose, and D-xylose
  • sugar compounds other than glucose in the measurement sample affect the measurement value, and an accurate measurement value cannot be obtained. There is a point.
  • GDH of a type using a coenzyme other than the above has been attracting attention.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • FAD-GDH flavin adenine dinucleotide
  • FAD-GDH derived from the genus Aspergillus with reduced activity on D-xylose has also been disclosed (for example, see Patent Document 4).
  • the above enzyme has a characteristic of low reactivity with one or several sugar compounds other than D-glucose, it is reactive with any of maltose, D-galactose, and D-xylose. Is not sufficiently low.
  • FAD-GDH found from the genus Mucor which is a kind of mold, has an excellent property that it has sufficiently low reactivity with any of maltose, D-galactose, and D-xylose. (See, for example, Patent Document 5).
  • this GDH it is possible to accurately measure the glucose concentration without being affected by the sugar compounds even under conditions where maltose, D-galactose, and D-xylose are present (for example, Patent Documents). 5).
  • Such excellent substrate specificity is one of the characteristics that show the practical advantage of the fungus-derived FAD-GDH.
  • Patent Document 6 describes a modified mold fungus-derived FAD-GDH having improved heat resistance.
  • Patent Document 7 describes a modified mold fungus-derived FAD-GDH having improved specificity by further reducing the reactivity to maltose and xylose.
  • an enzyme with higher specific activity is desired for use in a blood glucose sensor. By improving the specific activity, the reactivity on the sensor is improved, and the measurement can be performed in a shorter time. Further, since advantages such as cost reduction by reducing the amount of enzyme to be used and noise reduction by contaminants are expected, development of an enzyme with high specific activity is very useful industrially.
  • JP 2007-289148 A Japanese Patent No. 4494978 International Publication No. 07/139013 JP 2008-237210 A Japanese Patent No. 4648993 International Publication No. 12/169512 Pamphlet International Publication No. 13/65770 Pamphlet
  • An object of the present invention is to provide FAD-GDH with improved specific activity.
  • FAD-GDH with improved specific activity can be obtained by introducing mutations into known FAD-GDH.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence 70% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 70% It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the same amino acid sequence as described above, and one or a position corresponding to an amino acid selected from the following (a) and / or (b): FAD-GDH characterized in that it has more amino acid substitutions and has a higher specific activity than before the substitutions: (A) the amino acid at position 88 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (B) the amino acid at position 554 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (2) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, amino acid sequence 70% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence represented by SEQ
  • a FAD-GDH (E) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having FAD-GDH activity; (F) in the amino acid sequence of (e), consisting of amino acids in which one or several amino acids other than the amino acid residue at the position corresponding to the cysteine residue at position 88 are deleted, substituted, or added; A protein having GDH activity.
  • Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 70% It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the same amino acid sequence as described above, and has an amino acid substitution at a position corresponding to position 88 and position 554 of SEQ ID NO: 1.
  • FAD-GDH characterized in that the specific activity is improved as compared with that before the substitution.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 the amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 70% FAD-GDH characterized in that it consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the same amino acid sequence, and has the following amino acid substitutions (i) and (j): (I) the amino acid at the position corresponding to position 88 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is alanine, (J) The amino acid at the position corresponding to position 554 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is aspartic acid.
  • the amino acid at the position corresponding to the cysteine residue at position 88 in the amino acid sequence constituting the protein having FAD-GDH activity represented by the following (k) or (l) is alanine, and glutamic acid at position 554 FAD-GDH, a modified protein in which the amino acid at the position corresponding to the residue is substituted with aspartic acid:
  • K a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having FAD-GDH activity;
  • L In the amino acid sequence of (k), one or several amino acids other than the amino acid residue at the position corresponding to the cysteine residue at position 88 and the amino acid residue at the position corresponding to the glutamic acid residue at position 554 Is a protein having FAD-GDH activity consisting of amino acids deleted, substituted or added.
  • a FAD-GDH gene encoding the FAD-GDH described in any one of (1) to (7) above.
  • (9) A recombinant DNA characterized by inserting the FAD-GDH gene according to (8) above into a vector DNA.
  • (10) A host cell into which the recombinant DNA according to (9) has been introduced.
  • (11) A method for producing FAD-GDH, comprising the following steps: (M) culturing the host cell according to (10) above, (N) expressing the FAD-GDH gene contained in the host cell, and (o) isolating FAD-GDH from the culture.
  • (12) A glucose measurement method using the FAD-GDH described in any one of (1) to (7) above.
  • (13) A glucose assay kit comprising the FAD-GDH according to any one of (1) to (7) above.
  • (14) A glucose sensor comprising FAD-GDH according to any one of (1) to (7) above.
  • FAD-GDH with improved specific activity can be provided.
  • the FAD-GDH of the present invention catalyzes a reaction in which a hydroxyl group of glucose is oxidized to produce glucono- ⁇ -lactone in the presence of an electron acceptor.
  • the activity of the FAD-GDH of the present invention is measured using this principle of action, for example, using the following system using phenazine methosulfate (PMS) and 2,6-dichloroindophenol (DCIP) as electron acceptors. can do.
  • reaction 1 PMS (reduced form) is generated with the oxidation of glucose.
  • reaction 2 DCIP is reduced as PMS (reduced form) is oxidized.
  • the disappearance degree of this “DCIP (oxidized type)” is detected as the amount of change in absorbance at a wavelength of 600 nm, and the enzyme activity can be determined based on this amount of change.
  • the activity of the FAD-GDH of the present invention is measured according to the following procedure. Mix 2.05 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.6 mL of 1M D-glucose solution and 0.15 mL of 2 mM DCIP solution, and incubate at 37 ° C. for 5 minutes.
  • the GDH activity is defined as 1 U as the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute in the presence of 200 mM D-glucose at 37 ° C.
  • 3.0 is the reaction reagent + enzyme reagent solution volume (mL)
  • 16.3 is the millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / ⁇ mol) under the activity measurement conditions
  • 0.1 is the enzyme solution solution volume.
  • ML 1.0
  • cm optical path length of the cell
  • ⁇ A600 blank is the absorbance at 600 nm per minute when the reaction is started by adding the buffer used for enzyme dilution instead of the enzyme sample solution.
  • the amount of decrease, df represents the dilution factor.
  • the FAD-GDH of the present invention has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or high identity with the amino acid sequence, for example, preferably 70% or more, more preferably 75% or more, still more preferably 80% or more, Preferably 85% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more of the same amino acid sequence, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, It has one or more amino acid substitutions at a position corresponding to an amino acid selected from position 88 or position 554 in the amino acid sequence described in No. 1.
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 88 in the FAD-GDH of the present invention is a substitution in which the amino acid at the position corresponding to position 88 is substituted with alanine, and corresponds to position 554.
  • the amino acid substitution at the position is a substitution in which the amino acid at the position corresponding to the above-mentioned position 554 is substituted with aspartic acid.
  • the amino acid at position 88 without substitution according to the present invention is cysteine, and the amino acid at position 554 is glutamic acid.
  • FAD-GDH of the present invention more preferable examples include multiple mutants having a combination of a plurality of substitutions as described above.
  • a double mutant having two substitutions in combination as described above is included in the present invention. By accumulating such mutations, FAD-GDH with further improved specific activity can be produced.
  • substitutions at positions other than the above-mentioned various substitutions can be combined.
  • Such substitution positions are introduced in combination with the above-described substitution sites, even when those substitutions are introduced alone, even if they do not have a significant effect as in the above-mentioned substitution sites, It can be synergistic.
  • the FAD-GDH of the present invention can be used for mutations that improve substrate specificity, mutations that improve thermal stability, pH, specific substances, etc. in addition to the mutations that improve specific activity as described above.
  • Known mutations aiming at producing other kinds of effects such as an effect of improving the tolerance of can be arbitrarily combined. Even when such different types of mutations are combined, those FAD-GDHs are included in the present invention as long as the effects of the present invention can be exhibited.
  • the FAD-GDH of the present invention first obtains a gene encoding an amino acid sequence close to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by an arbitrary method, and at a position equivalent to the predetermined position of SEQ ID NO: 1. It can also be obtained by introducing an amino acid substitution at any position.
  • the intended amino acid substitution introduction method include a method of introducing mutations at random or a method of introducing site-specific mutations at assumed positions.
  • Examples of the former method include error-prone PCR (Techniques, 1, 11-15, (1989)), XL1-Red competent cells (STRATAGENE) that are prone to errors in plasmid replication and prone to modification during propagation. There is a method of using.
  • a three-dimensional structure is constructed by crystal structure analysis of the target protein, amino acids that are expected to give the desired effect are selected based on the information, and a commercially available Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit is selected.
  • a site-specific mutation is introduced by selecting an amino acid that is expected to give a target effect using a three-dimensional structure of a known protein having high homology with the target protein. .
  • the position corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 here is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with SEQ ID NO: 1 (preferably 70% or more, more preferably 75% or more. , More preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more), and alignment with other FAD-GDH having an amino acid sequence. Means the same position in. Amino acid sequence identity should be calculated using GENETYX-Mac (Software Development, Inc.) maximum matching and search homology programs, or DNASIS Pro (Hitachi Soft) maximum matching, multiple alignment programs, etc. Can do.
  • amino acid sequences are compared using a known algorithm such as Lippmann-Person method, and FAD-GDH is used. Can be performed by giving maximum identity to the conserved amino acid residues present in the amino acid sequence.
  • FAD-GDH By aligning the amino acid sequence of FAD-GDH in this way, the position of the corresponding amino acid residue in each FAD-GDH sequence can be determined regardless of insertion or deletion in the amino acid sequence. Is possible.
  • the corresponding position is considered to exist at the same position in the three-dimensional structure, and it can be estimated that the FAD-GDH as a target has a similar effect.
  • the FAD-GDH of the present invention is expected to have various variations within the above range of identity, but as long as they have the FAD-GDH activity described in the present specification, they are all of the present invention.
  • FAD-GDH having such an amino acid sequence is FAD-GDH having high specific activity and is industrially useful.
  • the amino acid at the position corresponding to position 88 is alanine, or that the amino acid at the position corresponding to position 554 is aspartic acid. Whether or not it is an artificial replacement operation is not important. For example, when a desired substitution is introduced into a protein in which the amino acid at the above position is originally different from the residue desired in the present invention, such as the protein described in SEQ ID NO: 1, using a known technique. If desired, these desired amino residues are introduced by substitution.
  • the FAD-GDH of the present invention can be obtained without going through a step of artificial substitution.
  • the improvement in specific activity in the present invention is evaluated under the conditions described in the activity measurement method described in the present specification.
  • the pH at the time of measuring the specific activity in this specification is 7.0, which was developed by the FAD-GDH of the present invention for the purpose of measuring glucose in blood (blood glucose level). This is because the pH of the solution is near neutral.
  • the FAD-GDH of the present invention is compared with FAD-GDH in which the amino acid at a specific position described in the present invention is not the specific amino acid of the present invention under the reaction conditions described in the activity measurement method described in the present specification.
  • the specific activity is improved.
  • the improvement in specific activity is greater than 100, preferably 105 or more, when the specific activity of FAD-GDH in which the amino acid at the specific position described in the present invention is not the specific amino acid of the present invention is defined as 100. More preferably, it is 110 or more, More preferably, it is 120 or more.
  • FAD-GDH having performances more suitable for practical use can be obtained with respect to other enzyme properties.
  • the ratio of reactivity to D-xylose with respect to reactivity to D-glucose (Xyl / Glc (%)) and / or the ratio of reactivity to maltose with respect to reactivity to D-glucose (Mal / Glc) (%)) Is preferably 2% or less.
  • the thermal stability is preferably such that the residual activity after heat treatment at pH 7.0, 40 ° C. for 15 minutes is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more.
  • the Km value is 100 mM or less, more preferably 90 mM or less. These properties are preferable from the viewpoint of generally required performance of FAD-GDH, and among FAD-GDH of the present invention, FAD having other preferable properties that are generally required. -It can be said that GDH has a particularly high industrial value.
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention (hereinafter referred to as FAD-GDH gene).
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention (hereinafter referred to as FAD-GDH gene)
  • a generally used gene cloning method may be used.
  • a known method such as Current Protocols in, for example, can be obtained from known microbial cells or various cells having the ability to produce FAD-GDH.
  • Chromosomal DNA or mRNA can be extracted by the method described in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989). Furthermore, cDNA can be synthesized using mRNA as a template. A chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • a suitable probe DNA is synthesized, and using this, a FAD-GDH gene having a high specific activity is selected from a chromosomal DNA or cDNA library, or Based on the above amino acid sequence, an appropriate primer DNA is prepared, and a target gene encoding FAD-GDH having a high specific activity is obtained by an appropriate polymerase chain reaction (PCR method) such as 5′RACE method or 3′RACE method.
  • PCR method polymerase chain reaction
  • DNA containing the fragments can be amplified, and these DNA fragments can be ligated to obtain DNA containing the full length of the target FAD-GDH gene.
  • various mutant genes obtained by introducing mutations into the gene encoding the known FAD-GDH can be used.
  • a method of selecting using the enzymatic scientific properties of the expressed FAD-GDH as an index may be employed.
  • the known FAD-GDH gene mutation treatment can be carried out by any known method depending on the intended mutant form. That is, a method in which a FAD-GDH gene or a recombinant DNA in which the gene is incorporated is brought into contact with and acting on a mutagen; an ultraviolet irradiation method; a genetic engineering method; or a method using a protein engineering method, etc. Can be widely used.
  • Examples of the mutagen used in the mutation treatment include hydroxylamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfite, hydrazine, formic acid, and 5-bromouracil. be able to.
  • Conditions for this contact / action can be determined according to the type of drug used, and are not particularly limited as long as a desired mutation can actually be induced in various known FAD-GDH genes.
  • a desired mutation can be induced by contact and action at a reaction temperature of 20 to 80 ° C. for 10 minutes or more, preferably 10 to 180 minutes, preferably at a drug concentration of 0.5 to 12M. Even in the case of performing ultraviolet irradiation, it can be carried out according to a conventional method as described above (Hyundai Kagaku, p24-30, June 1989 issue).
  • a method generally known as Site-Specific Mutagenesis can be used.
  • Kramer method Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene, 37, 73 (1985)
  • Eckstein method Nucleic Acids Res., 13, 8749 ( (1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986)
  • Kunkel method Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 82, 488 (1985).
  • a technique known as a general polymerase chain reaction can be used (Technique, 1, 11 (1989)).
  • a desired modified FAD-GDH gene having excellent thermal stability can also be directly synthesized by an organic synthesis method or an enzyme synthesis method.
  • a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter, Inc.
  • CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter, Inc.
  • the FAD-GDH of the present invention can also be obtained by modifying a known FAD-GDH or a known variant thereof.
  • known FAD-GDH-derived microorganisms include microorganisms that are classified into the subfamily Pleurotus, preferably Pleurotus, more preferably Pleuromyceae, and more preferably the family Pleurotus.
  • Specific examples include FAD-GDH derived from the genus Mucor, the genus Absidia, the genus Actinomucor, the genus Circinella, and the like.
  • microorganisms classified into the genus Mucor examples include Mucor plainii, Mucor javanicus, Mucor circinolides f. circinelloides, Mucor guilliermondii, Mucor heimalis f. Silvaticus, Mucor subtilissimus, Mucor dimorphosporus and the like. More specifically, Mucor plainii, Mucor javanicus, Mucor circinolides f. circinelloides, Mucor guilliermondii NBRC 9403, Mucor himalis f.
  • Circinella minor examples include Circinella minor, Circinella mucoloides, Circinella muscae, Circinella rigida, and Circinella simplex. More specifically, mention may be made of Circinella minor NBRC6448, Circinella mucoroides NBRC4453, Circinella muscae NBRC6410, Circinella rigida NBRC6411, Circinella simplex NBRC6412, Circinella umbellata NBRC4452, Circinella umbellata NBRC5842, Circinella RD055423 and Circinella RD055422. In addition, NBRC strain and RD strain are storage strains of NBRC (Independent Administrative Institution Product Evaluation Technology Infrastructure Biotechnology Center).
  • the FAD-GDH gene of the present invention obtained as described above is incorporated into a vector such as a bacteriophage, a cosmid, or a plasmid used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells by a conventional method, and is compatible with each vector.
  • the host cell to be transformed can be transformed or transduced by conventional methods.
  • prokaryotic host cells examples include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli K-12, Escherichia coli BL21 (DE3), Escherichia coli JM109, Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600 and the like ( Both are manufactured by Takara Bio Inc.). They are transformed or transduced to obtain host cells into which DNA has been introduced (transformants).
  • Escherichia coli K-12 Escherichia coli BL21 (DE3)
  • Escherichia coli JM109 Escherichia coli DH5 ⁇
  • Escherichia coli W3110 Escherichia coli C600 and the like
  • a method for transferring the recombinant vector into such a host cell for example, when the host cell is a microorganism belonging to Escherichia coli, a method of transferring the recombinant DNA in the presence of calcium ions can be employed.
  • An electroporation method may be used.
  • commercially available competent cells for example, ECOS Competent Escherichia Collie BL21 (DE3); manufactured by Nippon Gene
  • yeast An example of a eukaryotic host cell is yeast.
  • microorganisms classified as yeast include yeasts belonging to the genus Zygosaccharomyces, the genus Saccharomyces, the genus Pichia, the genus Candida, and the like.
  • the inserted gene may include a marker gene to enable selection of transformed cells. Examples of the marker gene include genes that complement the auxotrophy of the host, such as URA3 and TRP1.
  • the inserted gene preferably contains a promoter or other control sequence (for example, enhancer sequence, terminator sequence, polyadenylation sequence, etc.) capable of expressing the gene of the present invention in the host cell. Specific examples of the promoter include GAL1 promoter and ADH1 promoter.
  • a method for transformation into yeast known methods, for example, a method using lithium acetate (Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269 (1995)) and electroporation (J Microbiol Methods 55 (2003) 481). -484) and the like can be preferably used, but the present invention is not limited to this, and transformation may be performed using various arbitrary methods including a spheroplast method and a glass bead method.
  • eukaryotic host cells include mold cells such as the genus Aspergillus and the genus Trichoderma.
  • the inserted gene contains a promoter capable of expressing the gene of the present invention in the host cell (eg, tef1 promoter) and other regulatory sequences (eg, secretory signal sequence, enhancer sequence, terminator sequence, polyadenylation sequence, etc.). Is desirable.
  • the inserted gene may contain a marker gene for enabling selection of transformed cells, for example, niaD, pyrG.
  • the inserted gene may contain a homologous recombination region for insertion into an arbitrary chromosomal site.
  • a known method for example, a method using polyethylene glycol and calcium chloride after protoplast formation (Mol. Gen. Genet., 218, 99-104 (1989)) is preferably used. Can do.
  • the FAD-GDH of the present invention is obtained by culturing the host cell producing the FAD-GDH of the present invention obtained as described above, expressing the FAD-GDH gene contained in the host cell, and then What is necessary is just to manufacture by isolating FAD-GDH.
  • Examples of the culture medium for culturing the host cells include yeast extract, tryptone, peptone, meat extract, corn steep liquor, or one or more nitrogen sources such as soybean or wheat bran leachate, sodium chloride, potassium monophosphate
  • One or more inorganic salts such as dibasic potassium phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate were added, and saccharide raw materials, vitamins, etc. were added as necessary Things are used.
  • the initial pH of the medium is not limited, but can be adjusted to, for example, pH 5-9.
  • the culture temperature is 10 to 42 ° C., preferably around 25 ° C.
  • the culture may be performed by aeration and agitation deep culture, shaking culture, stationary culture, or the like for 4 to 24 hours for prokaryotic cells and 1 to 10 days for eukaryotic cells.
  • the FAD-GDH of the present invention is collected from the culture.
  • an ordinary known enzyme collecting means may be used.
  • the cells are subjected to ultrasonic disruption treatment, grinding treatment, or the like, or the enzyme is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme, or shaken or left in the presence of toluene or the like for lysis. This enzyme can be discharged out of the cells. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc.
  • nucleic acid is removed with streptomycin sulfate, protamine sulfate, manganese sulfate or the like, and then ammonium sulfate, alcohol, acetone or the like is added thereto.
  • the fraction is collected and the precipitate is collected to obtain the FAD-GDH crude enzyme of the present invention.
  • the crude FAD-GDH enzyme of the present invention can be further purified using any known means.
  • a purified enzyme preparation for example, a gel filtration method using Sephadex, Ultrogel or biogel; an adsorption elution method using an ion exchanger; an electrophoresis method using a polyacrylamide gel; an adsorption using hydroxyapatite Elution method; Sedimentation method such as sucrose density gradient centrifugation; Affinity chromatography method; Fractionation method using molecular sieve membrane, hollow fiber membrane, etc.
  • the FAD-GDH enzyme preparation of the present invention can be obtained.
  • the present invention also discloses a glucose assay kit containing the FAD-GDH of the present invention, and blood glucose (blood glucose level) can be measured using the FAD-GDH of the present invention.
  • the glucose assay kit of the present invention comprises a modified FAD-GDH according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay.
  • the glucose assay kit of the present invention contains, in addition to the modified FAD-GDH of the present invention, a buffer solution necessary for the assay, a mediator, and a glucose standard solution for preparing a calibration curve.
  • the modified FAD-GDH used in the glucose measurement method and glucose assay kit of the present invention can be provided in various forms, for example, as a lyophilized reagent or dissolved in an appropriate storage solution.
  • the glucose concentration can be measured, for example, as follows.
  • the reaction layer of the glucose assay kit includes FAD-GDH, an electron acceptor, and N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis) as a reaction accelerator.
  • ADA N- (2-acetamido) imidodiacetic acid
  • -Tris N- (2-acetamido) imidodiacetic acid
  • -Tris a liquid or solid composition containing one or more substances selected from the group consisting of sodium carbonate and imidazole is retained.
  • a pH buffer and a coloring reagent are added as necessary.
  • a sample containing glucose is added to this and allowed to react for a certain time.
  • the absorbance corresponding to the maximum absorption wavelength of the dye that is polymerized and formed by receiving electrons from the electron acceptor or the electron acceptor that fades upon reduction is monitored.
  • the rate method from the rate of change of absorbance per time, in the case of the endpoint method, the calibration was made in advance using a standard concentration glucose solution from the change in absorbance up to the point when all the glucose in the sample was oxidized. Based on the calibration curve, the glucose concentration in the sample can be calculated.
  • DCPIP 2,6-dichlorophenolindophenol
  • glucose can be quantified by monitoring the decrease in absorbance at 600 nm.
  • PMS phenazine methosulfate
  • NTB nitrotetrazolium blue
  • the amount of diformazan produced is determined by measuring absorbance at 570 nm to calculate the glucose concentration.
  • the electron acceptor and the coloring reagent used are not limited to these.
  • the present invention also discloses a glucose sensor using the FAD-GDH of the present invention.
  • the electrode a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like is used, and the FAD-GDH of the present invention is immobilized on the electrode. Immobilization methods include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, etc., or ferrocene or a derivative thereof.
  • FAD-GDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
  • the measurement of glucose concentration can be performed as follows. Put buffer in constant temperature cell and maintain at constant temperature.
  • As the mediator potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, or the like can be used.
  • As the working electrode an electrode on which the modified FAD-GDH of the present invention is immobilized is used, and a counter electrode (for example, platinum electrode) and a reference electrode (for example, Ag / AgCl electrode) are used.
  • a counter electrode for example, platinum electrode
  • a reference electrode for example, Ag / AgCl electrode
  • 1.5 U FAD-GDH of the present invention is immobilized on a glassy carbon (GC) electrode, and the response current value with respect to the glucose concentration is measured.
  • a glassy carbon (GC) electrode In the electrolytic cell, 1.8 ml of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) and 0.2 ml of 1M potassium hexacyanoferrate (III) aqueous solution (potassium ferricyanide) are added.
  • the GC electrode is connected to potentiostat BAS100B / W (manufactured by BAS), the solution is stirred at 37 ° C., and +500 mV is applied to the silver-silver chloride reference electrode.
  • a 1M D-glucose solution is added to these systems to a final concentration of 5, 10, 20, 30, 40, and 50 mM, and a steady-state current value is measured for each addition.
  • This current value is plotted against a known glucose concentration (5, 10, 20, 30, 40, 50 mM) to create a calibration curve. Accordingly, glucose can be quantified with the enzyme-immobilized electrode using the FAD-linked glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the specific activity and substrate specificity of the modified FAD-GDH were evaluated according to the methods of the following test examples unless otherwise specified.
  • Test example (1) Production of yeast transformants that express various modified FAD-GDH A set encoding a Mucor plaini-derived FAD-GDH gene (wild-type MpGDH gene) of SEQ ID NO: 2 according to the method described in Patent Document 7. A recombinant plasmid (pYES2C-Mp (wild type)) was obtained.
  • PCR reaction was carried out under the following conditions using a synthetic nucleotide for introducing each amino acid substitution, KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • a part of the reaction solution after the treatment was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, and it was confirmed that about 8 kbp of DNA was specifically amplified.
  • the amplified DNA was treated with a restriction enzyme DpnI (manufactured by New England Biolabs) and then transformed into a competent cell of Escherichia coli JM109 strain (manufactured by Nippon Gene) according to the attached protocol. Subsequently, each obtained transformant was applied to an LB-amp agar medium and cultured.
  • the grown colonies were inoculated into an LB-amp liquid medium and cultured with shaking, and various plasmid DNAs containing about 8 kbp of amplified DNA (about 8 kbp) according to the attached protocol using GenElute Plasmid Miniprep Kit (manufactured by Sigma). For example, pYE2C-Mp-C88A, pYE2C-Mp-E554D, etc. in Example 1 were isolated.
  • pYE2C-Mp wild type
  • pYES2C-Mp into which various mutations were introduced
  • Mp-E554D and the like are transformed into Inv-Sc strain (manufactured by Invitrogen) to express the yeast transformant Sc-Mp (wild type) strain expressing wild type MpGDH and various modified MpGDH Yeast transformed strains Sc-Mp (modified types such as Sc-Mp-C88A and Sc-Mp-E554D in Example 1) were obtained.
  • the collected culture supernatant containing FAD-GDH to be evaluated was concentrated by a centrifugal filter unit (Amicon Ultra-15 30K, manufactured by MERCK MILLIPORE), and then replaced with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0). .
  • the collected concentrated solution is applied to a column of Superdex 200 10 / 300GL (manufactured by GE Healthcare Bioscience) pre-equilibrated with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 150 mM sodium chloride.
  • the purified enzyme was obtained by collecting the fractions.
  • the specific activity of the purified enzyme was measured as the activity (U / A280) per absorbance (A280) at 280 nm using the above-mentioned GDH activity measurement method. And "relative specific activity" in modified MpGDH when the specific activity of wild type MpGDH was set to 100 was calculated. When the relative specific activity is greater than 100, it can be seen that the modified MpGDH has improved specific activity.
  • Recombinant plasmids pYE2C-Mp-C88A and pYE2C-Mp-E554D were obtained in which the cysteine at position 88 in the amino acid sequence was replaced with alanine and the glutamic acid at position 554 was replaced with aspartic acid.
  • C88A means that C (Cys) at position 88 is replaced with A (Ala).
  • mutants having both C88A and E554D mutations were prepared, and the specific activity and substrate specificity were evaluated.
  • a PCR reaction was performed with a combination of synthetic nucleotides of SEQ ID NOS: 5 and 6 using pYE2C-Mp-C88A as a template plasmid.
  • E. coli strain JM109 was transformed with the vector containing the amplified DNA, and the nucleotide sequence of the DNA encoding MpGDH in the plasmid DNA retained by the grown colonies was determined, whereby the cysteine at position 88 was alanine.
  • PYE2C-Mp-C88A / E554D which is a recombinant plasmid encoding a double mutant in which the glutamic acid at position 554 was replaced with aspartic acid, was obtained.
  • C88A / E554D means that C (Cys) at position 88 is replaced with A (Ala), E (Glu) at position 554 is replaced with D (Asp), and “/” is both Means having a substitution of
  • the mutant enzyme with improved specific activity of the present invention is glucose, as is the case with the fungus-derived FAD-GDH described in Japanese Patent No. 4648993 previously discovered by the present inventors. It is also considered to be a highly useful enzyme that can accurately measure D-glucose values even under conditions where sugar compounds such as D-xylose are contaminated.

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Abstract

　本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位または５５４位に対応する位置におけるアミノ酸置換の１以上を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを提供する。

Description

比活性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
　本発明は、比活性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、それを用いたグルコース測定方法およびフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法に関する。
　血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病患者が自己の血糖値を管理するための装置としては、電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定（Ｓｅｌｆ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＭＢＧ）機器が広く利用されている。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のグルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。
　一方、グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が知られている。具体的には、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするタイプのＧＤＨ（ＮＡＤ（Ｐ）－ＧＤＨ）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ－ＧＤＨ）が見出されており、ＳＭＢＧ機器のバイオセンサに使用されている。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）－ＧＤＨは、酵素の安定性が乏しく、かつ、補酵素の添加が必要という問題を有し、また、ＰＱＱ－ＧＤＨは基質特異性が低く、測定対象であるグルコース以外にも、マルトース、Ｄ－ガラクトースおよびＤ－キシロースなどの糖化合物に対して作用してしまうため、測定サンプル中のグルコース以外の糖化合物が測定値に影響し、正確な測定値が得られないという問題点が存在する。
　近年、ＰＱＱ－ＧＤＨをバイオセンサとして用いたＳＭＢＧ機器を用いて、輸液投与を受けていた糖尿病患者の血糖値を測定する際に、ＰＱＱ－ＧＤＨが輸液中に含まれるマルトースにも作用して、実際の血糖値よりも高い測定値が得られ、この値に基づく処置が原因となって患者が低血糖等を発症した例が報告されている。また、同様の事象はガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者にも起こり得ることも判明している（例えば、非特許文献１参照）。これを受け、厚生労働省医薬食品局は、グルコース溶液に各糖類を添加した場合における血糖測定値への影響を調査する目的で交差反応性試験を行ったところ、６００ｍｇ／ｄＬのマルトース、３００ｍｇ／ｄＬのＤ－ガラクトース、あるいは、２００ｍｇ／ｄＬのＤ－キシロース添加を行った場合には、ＰＱＱ－ＧＤＨ法を用いた血糖測定キットの測定値は、実際のグルコース濃度より２．５～３倍ほど高い値を示した。すなわち、測定試料中に存在し得るマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースにより測定値が不正確になることが判明し、このような測定誤差の原因となる糖化合物の影響を受けず、グルコースを特異的に測定可能な基質特異性の高いＧＤＨの開発が切に望まれている。
　上記のような背景の下、上記以外の補酵素を利用するタイプのＧＤＨが着目されるようになってきている。例えば、基質特異性に関する詳細な記載はないが、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のＧＤＨについての報告（例えば、非特許文献２～５参照）が知られている。また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ－ＧＤＨ）が開示されており（例えば、特許文献１～３参照）、さらにＤ－キシロースに対する作用性を低減させたアスペルギルス属由来のＦＡＤ－ＧＤＨも開示されている（例えば、特許文献４参照）。
　しかし、上記の酵素は、Ｄ－グルコースではない１種または数種の糖化合物に対して反応性が低いという特性を示すものの、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという特性を有してはいない。これらに対して、ケカビの一種であるムコール（Ｍｕｃｏｒ）属から見出されたＦＡＤ－ＧＤＨは、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという優れた特性を有することが示されている（例えば、特許文献５参照）。このＧＤＨを用いれば、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースが存在する条件下においても、それらの糖化合物による影響を受けることなくグルコース濃度を正確に測定することが可能であり（例えば、特許文献５参照）。このような優れた基質特異性は、ケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨの実用上の優位性を示す特徴のひとつである。
　ＦＡＤ－ＧＤＨの血糖センサーへの用途を考慮すると、センサーチップ作製時には加熱乾燥処理工程が含まれる場合があるため、耐熱性の高いＦＡＤ－ＧＤＨが一般的に求められている。そこで、特許文献６では、耐熱性が向上した改変型ケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨについて記載されている。また、特許文献７では、マルトースやキシロースへの反応性をさらに低下させることで特異性が向上した改変型ケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨについて記載されている。
　さらに、血糖センサーへの用途においては、より比活性の高い酵素が望まれる。比活性を向上させることによって、センサー上での反応性が向上し、より短い時間での測定が可能になる。また、使用する酵素量の低減によるコストの削減や、夾雑物質によるノイズの低減等の利点も期待されることから、比活性の高い酵素の開発は、産業上非常に有用である。
特開２００７－２８９１４８号公報 特許第４４９４９７８号公報 国際公開第０７／１３９０１３号 特開２００８－２３７２１０号公報 特許第４６４８９９３号公報 国際公開第１２／１６９５１２号パンフレット 国際公開第１３／６５７７０号パンフレット
医薬品・医療用具等安全性情報２０６号（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｓａｆｅｔｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｎｏ．２０６）、２００４年１０月、厚生労働省医薬食品局 Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　Ｉ．　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　ｐ－ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ，　Ｔ．　Ｃ．　Ｂａｋ，　ａｎｄ　Ｒ．　Ｓａｔｏ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１３９，　２６５－２７６　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＩ．　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１３９，　２７７－２９３　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＩＩ．　Ｇｅｎｅｒａｌ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１４６，　３１７－３２７　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＶ．　Ｈｉｓｔｉｄｙｌ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ａｓ　ａｎ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　ａｎｄ　Ｒ．　Ｓａｔｏ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１４６，　３２８－３３５　（１９６７）．
　本発明は、比活性が向上したＦＡＤ－ＧＤＨを提供することを課題とする。
　上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、公知のＦＡＤ－ＧＤＨに変異を導入することにより、比活性が向上したＦＡＤ－ＧＤＨが得られることを見出した。
　すなわち、本発明は以下に関する。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
　配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の（ａ）および／または（ｂ）より選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、比活性が向上していることを特徴とするＦＡＤ－ＧＤＨ：
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のアミノ酸、
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５５４位のアミノ酸。
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
　配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の（ｃ）および／または（ｄ）より選択されるアミノ酸置換を有することを特徴とするＦＡＤ－ＧＤＨ：
（ｃ）配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
（ｄ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５５４位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である。
（３）以下の（ｅ）または（ｆ）で表されるＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ－ＧＤＨ：
（ｅ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質、
（ｆ）（ｅ）のアミノ酸配列において、８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（４）以下の（ｇ）または（ｈ）で表されるＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において５５４位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換された改変タンパク質であるＦＡＤ－ＧＤＨ：
（ｇ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質、
（ｈ）（ｇ）のアミノ酸配列において、５５４位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
　配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１の８８位に対応する位置及び５５４位に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、比活性が向上していることを特徴とするＦＡＤ－ＧＤＨ。
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
　配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の（ｉ）且つ（ｊ）のアミノ酸置換を有することを特徴とするＦＡＤ－ＧＤＨ：
（ｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
（ｊ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５５４位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である。
（７）以下の（ｋ）または（ｌ）で表されるＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸がアラニン、且つ、５５４位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換された改変タンパク質であるＦＡＤ－ＧＤＨ：
（ｋ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質、
（ｌ）（ｋ）のアミノ酸配列において、８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸残基及び５５４位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（８）上記（１）～（７）のいずれか１項に記載のＦＡＤ－ＧＤＨをコードするＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子。
（９）上記（８）に記載のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
（１０）上記（９）記載の組換え体ＤＮＡが導入されている宿主細胞。
（１１）ＦＡＤ－ＧＤＨを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
（ｍ）上記（１０）に記載の宿主細胞を培養する工程、
（ｎ）前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を発現させる工程、および
（ｏ）前記培養物からＦＡＤ－ＧＤＨを単離する工程。
（１２）上記（１）～（７）のいずれか１項に記載のＦＡＤ－ＧＤＨを用いるグルコース測定方法。
（１３）上記（１）～（７）のいずれか１項に記載のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
（１４）上記（１）～（７）のいずれか１項に記載のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースセンサー。
　本発明によれば、比活性が向上したＦＡＤ－ＧＤＨを提供できる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の系を用いて測定することができる。
（反応１）　Ｄ－グルコ－ス　＋　ＰＭＳ（酸化型）
　　　　　　　　→　Ｄ－グルコノ－δ－ラクトン　＋　ＰＭＳ（還元型）
（反応２）　ＰＭＳ（還元型）　＋　ＤＣＩＰ（酸化型）
　　　　　　　　→　ＰＭＳ（酸化型）　＋　ＤＣＩＰ（還元型）
　（反応１）において、グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定する。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ２．０５ｍＬ、１Ｍ Ｄ－グルコース溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ－グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５%以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位または５５４位から選択されるアミノ酸に対応する位置で、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。
　好ましくは、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおける、８８位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の８８位に対応する位置でのアミノ酸がアラニンに置換される置換であり、５５４位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の５５４位に対応する位置でのアミノ酸がアスパラギン酸に置換される置換である。なお、配列番号１においては、本発明の置換を有さない８８位のアミノ酸はシステインであり、５５４位のアミノ酸はグルタミン酸である。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの中で、さらに好ましいものの例として、上記のような置換を複数組み合わせて有する多重変異体が挙げられる。上記のような置換を２箇所組み合わせて有する２重変異体が本発明に包含される。このような変異の蓄積により、比活性がさらに向上したＦＡＤ－ＧＤＨを作出することができる。
　また、上記のような多重変異体を作出するにあたっては、上述の各種の置換以外の位置における置換を組み合わせることもできる。このような置換の位置は、単独で置換を導入した場合には、上述の置換部位におけるもののように顕著な効果を奏さないものであっても、上述の置換部位と組み合わせて導入することによって、相乗的に効果を奏するものであり得る。
　また、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨには、上述のような、比活性を向上させる変異のほかに、基質特異性を向上させる変異や、熱安定性を向上させる変異、ｐＨや特定の物質などへの耐性を向上させる効果などのような、別種の効果を奏することを目的とした公知の変異を任意に組み合わせてもよい。このような別種の変異を組み合わせた場合であっても、本発明の効果を発揮し得るものである限り、それらのＦＡＤ－ＧＤＨは本発明に包含される。
　後述のとおり、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、例えば、まず任意の方法で、配列番号１のアミノ酸配列に近いアミノ酸配列をコードする遺伝子を入手し、配列番号１の所定の位置と同等の位置におけるいずれかの位置においてアミノ酸置換を導入することにより得ることもできる。
　目的とするアミノ酸置換導入方法としては、例えばランダムに変異を導入する方法あるいは想定した位置に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。前者の方法としては、エラープローンＰＣＲ法（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１，１１－１５，（１９８９））や、増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすいＸＬ１－Ｒｅｄコンピテントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法等がある。また、後者の方法として、目的とするタンパク質の結晶構造解析により立体構造を構築し、その情報をもとに目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、市販のＱｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等により部位特異的変異を導入する方法がある。あるいは、後者の方法として、目的とするタンパク質と相同性の高い公知のタンパク質の立体構造を用いて、目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、部位特異的変異を導入する方法もある。
　また、ここでいう、例えば、「配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置」とは、配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号１と同一性（好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５%以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を持つアミノ酸配列を有する他のＦＡＤ－ＧＤＨとをアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ－Ｍａｃ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、又はＤＮＡＳＩＳ　Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
　また、ここでいう、例えば、「配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置」を特定する方法としては、例えば、リップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、ＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。ＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、対応するアミノ酸残基の各ＦＡＤ－ＧＤＨ配列における配列中の位置を決めることが可能である。対応する位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるＦＡＤ－ＧＤＨに関して類似した効果を有することが推定できる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨには、上記の同一性の範囲内で各種のバリエーションが想定されるが、それらが本明細書に記載するＦＡＤ―ＧＤＨ活性を有するものである限り、それらは全て本発明のＦＡＧ－ＧＤＨに含まれ得る。このようなアミノ酸配列を有するＦＡＤ－ＧＤＨは、比活性の高いＦＡＤ－ＧＤＨであり、産業上有用である。
　また、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおいては、上述の８８位に対応する位置でのアミノ酸がアラニンであること、または上述の５５４位に対応する位置でのアミノ酸がアスパラギン酸であることが重要なのであって、それが人為的な置換操作によるものか否かは重要でない。例えば、配列番号１記載のタンパク質のように、上記の位置のアミノ酸が本発明で所望される残基とは元々異なっているタンパク質に公知の技術を用いて所望の置換を導入していく場合であれば、これらの所望されるアミノ残基は置換により導入される。一方、公知のペプチド全合成により所望のタンパク質を入手する場合、または、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするように遺伝子配列を全合成し、これに基づき所望のタンパク質を入手する場合、あるいは、天然型として見出されたものの中に元々そのような配列を有するものがあった場合等には、人為的な置換という工程を経ることなく、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを得ることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおける比活性の向上）
　本発明における比活性の向上は、本明細書中に記載の活性測定方法に記載した条件において評価される。なお、本明細書における比活性測定時のｐＨは７．０であるが、これは本発明のＦＡＤ－ＧＤＨが血液中のグルコース（血糖値）を測定する目的で開発されたものであり、血液のｐＨが中性付近であることによる。このように実用になるべく近い条件で評価を行うことによって、より有用な酵素の取得が可能となる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、本明細書中に記載の活性測定方法に記載した反応条件下で、本発明に記載の特定の位置のアミノ酸が本発明の特定のアミノ酸ではないＦＡＤ－ＧＤＨと比較して、比活性が向上していることを特徴とする。具体的には、比活性の向上は、本発明に記載の特定の位置のアミノ酸が本発明の特定のアミノ酸ではないＦＡＤ－ＧＤＨの比活性を１００とした時に、１００より大きい、好ましくは１０５以上、より好ましくは１１０以上、さらに好ましくは１２０以上であることを特徴とする。
　また、上述のように比活性が向上していることに加えて、その他の酵素諸性質に関しても、実用により適した性能を兼ね備えているＦＡＤ－ＧＤＨを取得できれば、さらに好ましい。例えば、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））、および／またはＤ－グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））が２％以下であることが好ましい。例えば、熱安定性は、ｐＨ７．０、４０℃、１５分間熱処理後の残存活性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であることが好ましい。例えば、Ｋｍ値は１００ｍＭ以下であり、より好ましくは９０ｍＭ以下であることが好ましい。これらの性質は、ＦＡＤ－ＧＤＨの一般的に求められる性能という点で好ましいものであり、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの中で、このような一般的に求められるその他の好ましい性質をも兼ね備えたＦＡＤ－ＧＤＨは、特に産業上の価値が高いということができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子の取得）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを効率よく取得するためには、遺伝子工学的手法を利用する方法が好ましい。本発明のＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子（以下、ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子）を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いればよい。例えば、公知のＦＡＤ－ＧＤＨを改変することにより本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを取得するには、ＦＡＤ－ＧＤＨ生産能を有する公知の微生物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（ＷＩＬＥＹ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　ついで、公知のＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列情報に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーから比活性の高いＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、比活性の高いＦＡＤ－ＧＤＨをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
　公知のＦＡＤ－ＧＤＨを改変して、本発明の比活性に優れたＦＡＤ－ＧＤＨを取得する方法としては、公知のＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子に変異を導入して得られる各種の変異遺伝子から発現されるＦＡＤ－ＧＤＨの酵素科学的性質を指標に選択を行う方法を採用し得る。
　公知のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
　上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５－ブロモウラシル等を挙げることができる。この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異を公知の各種ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５～１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０～８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０～１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４～３０、１９８９年６月号）。
　蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，　ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，　Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
　また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。
　なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の熱安定性に優れた改変ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を合成することもできる。
　上記のような任意の方法により選択された本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定または確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いれば良い。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの由来となる天然型ＦＡＤ－ＧＤＨの例）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、公知のＦＡＤ－ＧＤＨまたはそれらの公知の改変体を改変することにより取得することもできる。公知のＦＡＤ－ＧＤＨの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属由来のＦＡＤ－ＧＤＨ等が挙げられる。
　Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｍｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｆ．　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ．　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ等が挙げられる。より具体的には、特許文献５に記載のＭｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｆ．　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　ＮＢＲＣ９４０３、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ．　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ　ＮＢＲＣ６７５４、Ｍｕｃｏｒ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ　ＮＢＲＣ６３３８、Ｍｕｃｏｒ　ＲＤ０５６８６０、Ｍｕｃｏｒ　ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ　ＮＢＲＣ５３９５等が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｂｓｉｄｉａ　ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ　ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｂｓｉｄｉａ　ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ　ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ　ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ　ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｉｎｏｒ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｓｃａｅ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｒｉｇｉｄａ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｕｍｂｅｌｌａｔａを挙げることができる。より具体的には、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｉｎｏｒ　ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ　ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｓｃａｅ　ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｒｉｇｉｄａ　ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｕｍｂｅｌｌａｔａ　ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｕｍｂｅｌｌａｔａ　ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ＲＤ０５５４２２を挙げることができる。なお、ＮＢＲＣ菌株およびＲＤ菌株はＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター）の保管菌株である。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
　上述のように得られた本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
　原核宿主細胞の一例としては、エシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌Ｋ－１２株、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００等（いずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。それらを形質転換し、または、それらに形質導入して、ＤＮＡが導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）；ニッポンジーン製）を用いても良い。
　真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　５，　２５５－２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５５　（２００３）４８１－４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
　真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のようなカビ細胞が挙げられる。挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター（例えばｔｅｆ１プロモーター）及びその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。また、挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子、例えばｎｉａＤ、ｐｙｒＧが含まれていても良い。さらに、挿入遺伝子には、任意の染色体部位へ挿入するための相同組換え領域が含まれていても良い。糸状菌への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２１８，　９９－１０４（１９８９））を好適に用いることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの製造）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、上述のように取得した本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からＦＡＤ－ＧＤＨを単離することにより、製造すればよい。
　上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　培地の初発ｐＨは、限定されないが、例えば、ｐＨ５～９に調整することができる。
　培養温度は、１０～４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後で培養することが望ましい。例えば、原核細胞では４～２４時間、真核細胞では１日から１０日間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により培養を実施すればよい。
　培養終了後、該培養物より本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、もしくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの粗酵素を得る。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ酵素標品を得ることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いたグルコース測定方法）
　本発明はまた、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを開示し、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いて血中のグルコース（血糖値）を測定することができる。
　本発明のグルコースアッセイキットには、少なくとも１回のアッセイに十分な量の本発明に従う改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含む。本発明のグルコース測定法やグルコースアッセイキットに用いる改変型ＦＡＤ－ＧＤＨは、種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中に溶解されて提供することができる。
　グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のよう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＦＡＤ－ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ－（２－アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
　この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、例えば、２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する電子受容体および発色試薬はこれらに限定されない。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースセンサー）
　本発明はまた、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いるグルコースセンサーを開示する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤ－ＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
　グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作成したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
　具体的な一例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に本発明の１．５ＵのＦＡＤ－ＧＤＨを固定化し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．８ｍｌ、及び、１Ｍ　ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液０．２ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ　Ｄ－グルコース溶液を終濃度が５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線が作成する。これより本発明のＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能となる。
　以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
　本発明において、改変型ＦＡＤ－ＧＤＨの比活性および基質特異性の評価は、特に記載がない限り、以下の試験例の方法に従い行った。
［試験例］
（１）各種の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを発現する酵母形質転換体の作製
　特許文献７に記載の方法に準じ、配列番号２のＭｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ由来ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子（野生型ＭｐＧＤＨ遺伝子）をコードする組換え体プラスミド（ｐＹＥＳ２Ｃ－Ｍｐ（野生型））を取得した。
　得られた組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを鋳型として、各アミノ酸置換導入用の合成ヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
　すなわち、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとして「反応液」を調製した。サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、調製した反応液を９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５５℃、３０秒」－「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。
　上記処理後の反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約８ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。増幅されたＤＮＡを、制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理後、添付のプロトコールに従って、大腸菌ＪＭ１０９株（ニッポンジーン社製）のコンピテントセルに混合することにより形質転換を行った。次いで、取得した形質転換体をそれぞれＬＢ－ａｍｐ寒天培地に塗布し、培養を行った。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ液体培地に接種して振とう培養し、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ｓｉｇｍａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って、約８ｋｂｐの増幅されたＤＮＡを含む各種のプラスミドＤＮＡ（例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ５５４Ｄ等）を単離した。次いで、これらの各種プラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、それぞれの配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列における所定の位置のアミノ酸が置換されていることを確認した。このようにして、所定のアミノ酸が置換された改変型ＭｐＧＤＨをコードする酵母発現用ベクターｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ５５４Ｄ等）を取得した。
　その後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ（野生型）、および各種変異が導入されたｐＹＥＳ２Ｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ５５４Ｄ等）をＩｎｖ－Ｓｃ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に形質転換することにより、野生型ＭｐＧＤＨを発現する酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ（野生型）株、および各種の改変型ＭｐＧＤＨを発現する酵母形質転換株Ｓｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるＳｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｅ５５４Ｄ等）株をそれぞれ取得した。
（２）各種酵母発現ＦＡＤ－ＧＤＨの精製及び比活性の測定
　酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ（野生型）、および、各種の酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるＳｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｅ５５４Ｄ等）を、各々、１０ｍＬの前培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース（ＢＤ）、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物（ｓｉｇｍａ社製）、２．０％（ｗ／ｖ）ラフィノース]中で、３０℃にて２４時間培養した。その後、前培養液１０ｍＬを４０ｍＬの本培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、２．５％（ｗ／ｖ）Ｄ－ガラクトース、０．７５％（ｗ／ｖ）ラフィノース]に加えて、３０℃で１４時間培養した。この培養液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、３分間）により菌体と培養上清に分離し、培養上清液にＧＤＨ活性があることを確認し、以下の操作に用いた。
　回収した評価対象のＦＡＤ－ＧＤＨを含む培養上清液を遠心式フィルターユニット(Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５　３０Ｋ、ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製)により濃縮後、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に置換した。
　次に、回収した濃縮液を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００　１０／３００ＧＬ（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）のカラムにかけ、活性画分を回収することで精製酵素を取得した。
　精製した酵素の比活性は、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）あたりの活性（Ｕ／Ａ２８０）として、上述のＧＤＨ活性測定法を用いて測定した。そして、野生型ＭｐＧＤＨの比活性を１００とした際の改変型ＭｐＧＤＨにおける「相対比活性」を算出した。相対比活性が１００より大きいとき、その改変型ＭｐＧＤＨは比活性が向上していることがわかる。
（３）基質特異性評価
　（２）の方法で取得した精製酵素を用いて上述の活性測定法の基質をＤ－グルコースから同モル濃度のＤ－キシロースとした系に変えて活性を測定し、「Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））」を算出した。これは、Ｄ－キシロースを基質として測定したときのＦＡＤ－ＧＤＨ活性をＤ－グルコースを基質として測定したときのＦＡＤ－ＧＤＨ活性で割った値を％表示した数値である。
（改変型ＭｐＧＤＨの比活性および基質特異性の評価）
　上記試験例で記述した方法に従って、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ（野生型）を鋳型プラスミドとして、表１に示した配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の８８位のシステインがアラニンに、及び５５４位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換された組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ５５４Ｄをそれぞれ取得した。
　次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ５５４Ｄを用いて、試験例（１）、（２）の項目に従って、Ｉｎｖ－Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ株、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｅ５５４Ｄ株）の培養、精製を行い、比活性（Ｕ／Ａ２８０）を測定後、相対比活性を算出した。
　続いて、上記の試験例（３）の項目の手順に基づき、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。
　なお、例えば、表１において、「Ｃ８８Ａ」は８８位のＣ（Ｃｙｓ）をＡ（Ａｌａ）に置換することを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示すとおり、配列番号１の野生型ＭｐＧＤＨに対する８８位、または５５４位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｃ８８Ａ、またはＥ５５４Ｄの部位特異的変異を導入することにより、比活性が向上することが確認された。具体的には、比較例である野生型における比活性を１００とした場合に、Ｃ８８Ａは１１９、Ｅ５５４Ｄでは１０７と比活性が向上した。
　なお、これらの比活性が向上している改変型ＭｐＧＤＨにおいては、比活性が向上しているのみならず、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）も良好であることが確認された。本実施例の野生型ＦＡＤ－ＧＤＨは、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）が２％を下回るという高い基質特異性を有する酵素であるが、本発明の比活性向上変異を導入した場合も、この良好な基質特異性が損なわれることなく維持されていることがわかった。特に、Ｃ８８Ａにおいては、野生型と比較して比活性が向上しているだけでなく、基質特異性も一層向上していることが確認され、この変異がＦＡＤ－ＧＤＨの性能を向上させる有用性の高い変異であることがわかった。
（変異の組み合わせ導入に関する検討）
　次に、Ｃ８８ＡとＥ５５４Ｄの変異を両方有する変異体を作製し、比活性と基質特異性を評価した。具体的には、上記試験例で記述した方法に従って、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａを鋳型プラスミドとし、配列番号５、６の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、８８位のシステインがアラニンに置換され、且つ５５４位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換された二重変異体をコードする組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｅ５５４Ｄを取得した。
　次いで、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｅ５５４Ｄを用いて、試験例（１）、（２）の項目に従って、Ｉｎｖ－Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｅ５５４Ｄ株）の培養、精製を行い、比活性（Ｕ／Ａ２８０）を測定後、相対比活性を算出した。
　続いて、上記の試験例（３）の項目の手順に基づき、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。
　なお、表２において、「Ｃ８８Ａ／Ｅ５５４Ｄ」は、８８位のＣ（Ｃｙｓ）をＡ（Ａｌａ）、５５４位のＥ（Ｇｌｕ）をＤ（Ａｓｐ）にそれぞれ置換すること、「／」はその両方の置換を有することを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表２に示すとおり、配列番号１のアミノ酸にＣ８８Ａを導入した上に、さらにＥ５５４Ｄのアミノ酸置換を組み合わせることで、比活性がより向上することが確認された。さらに、該二重変異体では野生型より基質特異性も向上していることがわかった。
　上記の通り、本発明の変異体は、変異を導入する前の酵素と比較して比活性が向上していることがわかった。このような特性を備えたＦＡＤ－ＧＤＨは、反応性の向上による測定時間の短縮、酵素使用量の低減によるコスト削減、及び、夾雑物質のノイズ低減による正確性の向上をもたらし、公知のグルコース測定用酵素を用いた測定方法や測定試薬と比較して、より実用性の高い測定方法や測定試薬、測定キットやセンサーの提供が可能となることが期待される。
　なお、本発明の比活性が向上した変異酵素は、本明細書中に開示するように、本発明者らが先に見出した特許第４６４８９９３号公報に記載のケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨと同様、グルコースへの高い基質特異性も兼ね備え、Ｄ－キシロース等の糖化合物が夾雑する条件下でも正確にＤ－グルコース値を測定し得る有用性の高い酵素であると考えられる。

Claims (14)

  1. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、
    　または配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の（ａ）および/または（ｂ）より選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、比活性が向上していることを特徴とするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    （ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のアミノ酸、
    （ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５５４位のアミノ酸。
  2. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
    　配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の（ｃ）および／または（ｄ）より選択されるアミノ酸置換を有することを特徴とするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    （ｃ）配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
    （ｄ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５５４位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である。
  3. 　以下の（ｅ）または（ｆ）で表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    （ｅ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
    （ｆ）（ｅ）のアミノ酸配列において、８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  4. 　以下の（ｇ）または（ｈ）で表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において５５４位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    （ｇ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
    （ｈ）（ｇ）のアミノ酸配列において、５５４位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  5. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
    　配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１の８８位に対応する位置及び５５４位に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、比活性が向上していることを特徴とするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  6. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
    　配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の（ｉ）且つ（ｊ）のアミノ酸置換を有することを特徴とするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    （ｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
    （ｊ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５５４位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である。
  7. 　以下の（ｋ）または（ｌ）で表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸がアラニン、且つ、５５４位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    （ｋ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
    （ｌ）（ｋ）のアミノ酸配列において、８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸残基及び５５４位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
  9. 　請求項８に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
  10. 　請求項９記載の組換え体ＤＮＡが導入されている宿主細胞。
  11. 　フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
    （ｍ）請求項１０に記載の宿主細胞を培養する工程、
    （ｎ）前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程、および
    （ｏ）前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを単離する工程。
  12. 　請求項１～請求項７のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定方法。
  13. 　請求項１～請求項７のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
  14. 　請求項１～請求項７のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
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