JPWO2015129475A1 - 比活性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
さらに、血糖センサーへの用途においては、より比活性の高い酵素が望まれる。比活性を向上させることによって、センサー上での反応性が向上し、より短い時間での測定が可能になる。また、使用する酵素量の低減によるコストの削減や、夾雑物質によるノイズの低減等の利点も期待されることから、比活性の高い酵素の開発は、産業上非常に有用である。
(1)配列番号1で示されるアミノ酸配列、配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号1で示されるアミノ酸配列または配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の(a)および/または(b)より選択されるアミノ酸に対応する位置で1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、比活性が向上していることを特徴とするFAD−GDH:
(a)配列番号1記載のアミノ酸配列における88位のアミノ酸、
(b)配列番号1記載のアミノ酸配列における554位のアミノ酸。
(2)配列番号1で示されるアミノ酸配列、配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号1で示されるアミノ酸配列または配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の(c)および/または(d)より選択されるアミノ酸置換を有することを特徴とするFAD−GDH:
(c)配列番号1記載のアミノ酸配列における88位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
(d)配列番号1記載のアミノ酸配列における554位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である。
(3)以下の(e)または(f)で表されるFAD−GDH活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において88位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換された改変タンパク質であるFAD−GDH:
(e)配列番号1記載のアミノ酸配列からなり、FAD−GDH活性を有するタンパク質、
(f)(e)のアミノ酸配列において、88位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、FAD−GDH活性を有するタンパク質。
(4)以下の(g)または(h)で表されるFAD−GDH活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において554位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換された改変タンパク質であるFAD−GDH:
(g)配列番号1記載のアミノ酸配列からなり、FAD−GDH活性を有するタンパク質、
(h)(g)のアミノ酸配列において、554位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、FAD−GDH活性を有するタンパク質。
(5)配列番号1で示されるアミノ酸配列、配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号1で示されるアミノ酸配列または配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号1の88位に対応する位置及び554位に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、比活性が向上していることを特徴とするFAD−GDH。
(6)配列番号1で示されるアミノ酸配列、配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号1で示されるアミノ酸配列または配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の(i)且つ(j)のアミノ酸置換を有することを特徴とするFAD−GDH:
(i)配列番号1記載のアミノ酸配列における88位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
(j)配列番号1記載のアミノ酸配列における554位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である。
(7)以下の(k)または(l)で表されるFAD−GDH活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において88位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸がアラニン、且つ、554位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換された改変タンパク質であるFAD−GDH:
(k)配列番号1記載のアミノ酸配列からなり、FAD−GDH活性を有するタンパク質、
(l)(k)のアミノ酸配列において、88位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸残基及び554位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、FAD−GDH活性を有するタンパク質。
(8)上記(1)〜(7)のいずれか1項に記載のFAD−GDHをコードするFAD−GDH遺伝子。
(9)上記(8)に記載のFAD−GDH遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組換え体DNA。
(10)上記(9)記載の組換え体DNAが導入されている宿主細胞。
(11)FAD−GDHを製造する方法であり、以下の工程を含む方法:
(m)上記(10)に記載の宿主細胞を培養する工程、
(n)前記宿主細胞中に含まれるFAD−GDH遺伝子を発現させる工程、および
(o)前記培養物からFAD−GDHを単離する工程。
(12)上記(1)〜(7)のいずれか1項に記載のFAD−GDHを用いるグルコース測定方法。
(13)上記(1)〜(7)のいずれか1項に記載のFAD−GDHを含むグルコースアッセイキット。
(14)上記(1)〜(7)のいずれか1項に記載のFAD−GDHを含むグルコースセンサー。
本発明のFAD−GDHは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
本発明のFAD−GDHの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート(PMS)および2,6−ジクロロインドフェノール(DCIP)を用いた以下の系を用いて測定することができる。
(反応1) D−グルコ−ス + PMS(酸化型)
→ D−グルコノ−δ−ラクトン + PMS(還元型)
(反応2) PMS(還元型) + DCIP(酸化型)
→ PMS(酸化型) + DCIP(還元型)
本発明のFAD−GDHの活性は、以下の手順に従って測定する。100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 2.05mL、1M D−グルコース溶液 0.6mLおよび2mM DCIP溶液 0.15mLを混合し、37℃で5分間保温する。次いで、15mM PMS溶液 0.1mLおよび酵素サンプル溶液0.1mLを添加し、反応を開始する。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)を求め、次式に従いGDH活性を算出する。この際、GDH活性は、37℃において濃度200mMのD−グルコース存在下で1分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を1Uと定義する。
本発明のFAD−GDHは、配列番号1で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば、好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号1記載のアミノ酸配列における88位または554位から選択されるアミノ酸に対応する位置で、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。
好ましくは、本発明のFAD−GDHにおける、88位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の88位に対応する位置でのアミノ酸がアラニンに置換される置換であり、554位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の554位に対応する位置でのアミノ酸がアスパラギン酸に置換される置換である。なお、配列番号1においては、本発明の置換を有さない88位のアミノ酸はシステインであり、554位のアミノ酸はグルタミン酸である。
目的とするアミノ酸置換導入方法としては、例えばランダムに変異を導入する方法あるいは想定した位置に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。前者の方法としては、エラープローンPCR法(Techniques,1,11−15,(1989))や、増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすいXL1−Redコンピテントセル(STRATAGENE社製)を用いる方法等がある。また、後者の方法として、目的とするタンパク質の結晶構造解析により立体構造を構築し、その情報をもとに目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、市販のQuick Change Site Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE社製)等により部位特異的変異を導入する方法がある。あるいは、後者の方法として、目的とするタンパク質と相同性の高い公知のタンパク質の立体構造を用いて、目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、部位特異的変異を導入する方法もある。
本発明における比活性の向上は、本明細書中に記載の活性測定方法に記載した条件において評価される。なお、本明細書における比活性測定時のpHは7.0であるが、これは本発明のFAD−GDHが血液中のグルコース(血糖値)を測定する目的で開発されたものであり、血液のpHが中性付近であることによる。このように実用になるべく近い条件で評価を行うことによって、より有用な酵素の取得が可能となる。
本発明のFAD−GDHを効率よく取得するためには、遺伝子工学的手法を利用する方法が好ましい。本発明のFAD−GDHをコードする遺伝子(以下、FAD−GDH遺伝子)を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いればよい。例えば、公知のFAD−GDHを改変することにより本発明のFAD−GDHを取得するには、FAD−GDH生産能を有する公知の微生物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNA又はmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNA又はcDNAを用いて、染色体DNA又はcDNAのライブラリーを作製することができる。
公知のFAD−GDH遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、FAD−GDH遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法;紫外線照射法;遺伝子工学的手法;又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは5−ブロモウラシル等を挙げることができる。この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異を公知の各種FAD−GDH遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは0.5〜12Mの上記薬剤濃度において、20〜80℃の反応温度下で10分間以上、好ましくは10〜180分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる(現代化学、p24〜30、1989年6月号)。
なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の熱安定性に優れた改変FAD−GDH遺伝子を合成することもできる。
本発明のFAD−GDHは、公知のFAD−GDHまたはそれらの公知の改変体を改変することにより取得することもできる。公知のFAD−GDHの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール(Mucor)属、アブシジア(Absidia)属、アクチノムコール(Actinomucor)属、シルシネラ(Circinella)属由来のFAD−GDH等が挙げられる。
Mucor属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Mucor prainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloides f. circinelloides、Mucor guilliermondii、Mucor hiemalis f. silvaticus、Mucor subtilissimus、Mucor dimorphosporus等が挙げられる。より具体的には、特許文献5に記載のMucor prainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloides f. circinelloides、Mucor guilliermondii NBRC9403、Mucor hiemalis f. silvaticus NBRC6754、Mucor subtilissimus NBRC6338、Mucor RD056860、Mucor dimorphosporus NBRC5395等が挙げられる。Absidia属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Absidia cylindrospora、Absidia hyalosporaを挙げることができる。より具体的には、特許文献5に記載のAbsidia cylindrospora、Absidia hyalosporaを挙げることができる。Actinomucor属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Actinomucor elegansを挙げることができる。より具体的には、特許文献5に記載のActinomucor elegansを挙げることができる。Circinella属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Circinella minor、Circinella mucoroides、Circinella muscae、Circinella rigida、Circinella simplex、Circinella umbellataを挙げることができる。より具体的には、Circinella minor NBRC6448、Circinella mucoroides NBRC4453、Circinella muscae NBRC6410、Circinella rigida NBRC6411、Circinella simplex NBRC6412、Circinella umbellata NBRC4452、Circinella umbellata NBRC5842、Circinella RD055423及びCircinella RD055422を挙げることができる。なお、NBRC菌株およびRD菌株はNBRC(独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター)の保管菌株である。
上述のように得られた本発明のFAD−GDH遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
原核宿主細胞の一例としては、エシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌K−12株、エシェリヒア・コリーBL21(DE3)、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5α、エシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600等(いずれもタカラバイオ社製)が挙げられる。それらを形質転換し、または、それらに形質導入して、DNAが導入された宿主細胞(形質転換体)を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えDNAの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル(例えばECOS Competent エシェリヒア・コリーBL21(DE3);ニッポンジーン製)を用いても良い。
本発明のFAD−GDHは、上述のように取得した本発明のFAD−GDHを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるFAD−GDH遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からFAD−GDHを単離することにより、製造すればよい。
上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の1種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第1カリウム、リン酸第2カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第2鉄、硫酸第2鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の1種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
培地の初発pHは、限定されないが、例えば、pH5〜9に調整することができる。
培養温度は、10〜42℃の培養温度、好ましくは25℃前後で培養することが望ましい。例えば、原核細胞では4〜24時間、真核細胞では1日から10日間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により培養を実施すればよい。
本発明はまた、本発明のFAD−GDHを含むグルコースアッセイキットを開示し、本発明のFAD−GDHを用いて血中のグルコース(血糖値)を測定することができる。
本発明のグルコースアッセイキットには、少なくとも1回のアッセイに十分な量の本発明に従う改変型FAD−GDHを含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明の改変型FAD−GDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含む。本発明のグルコース測定法やグルコースアッセイキットに用いる改変型FAD−GDHは、種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中に溶解されて提供することができる。
本発明はまた、本発明のFAD−GDHを用いるグルコースセンサーを開示する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のFAD−GDHを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のFAD−GDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
[試験例]
(1)各種の改変型FAD−GDHを発現する酵母形質転換体の作製
特許文献7に記載の方法に準じ、配列番号2のMucor prainii由来FAD−GDH遺伝子(野生型MpGDH遺伝子)をコードする組換え体プラスミド(pYES2C−Mp(野生型))を取得した。
得られた組換え体プラスミドpYE2C−Mpを鋳型として、各アミノ酸置換導入用の合成ヌクレオチド、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
すなわち、10×KOD−Plus−緩衝液を5μl、dNTPが各2mMになるよう調製されたdNTPs混合溶液を5μl、25mMのMgSO4溶液を2μl、鋳型となるpYE2C−Mpを50ng、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ15pmol、KOD−Plus−を1Unit加えて、滅菌水により全量を50μlとして「反応液」を調製した。サーマルサイクラー(エッペンドルフ社製)を用いて、調製した反応液を94℃で2分間インキュベートし、続いて、「94℃、15秒」−「55℃、30秒」−「68℃、8分」のサイクルを30回繰り返した。
その後、S.cerevisiae用形質転換キット(Invitrogen社製)を用いて、pYE2C−Mp(野生型)、および各種変異が導入されたpYES2C−Mp(改変型、例えば、実施例1におけるpYE2C−Mp−C88A、pYE2C−Mp−E554D等)をInv−Sc株(Invitrogen社製)に形質転換することにより、野生型MpGDHを発現する酵母形質転換体Sc−Mp(野生型)株、および各種の改変型MpGDHを発現する酵母形質転換株Sc−Mp(改変型、例えば、実施例1におけるSc−Mp−C88A、Sc−Mp−E554D等)株をそれぞれ取得した。
酵母形質転換体Sc−Mp(野生型)、および、各種の酵母形質転換体Sc−Mp(改変型、例えば、実施例1におけるSc−Mp−C88A、Sc−Mp−E554D等)を、各々、10mLの前培養用液体培地[0.67%(w/v)アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース(BD)、0.192%(w/v)ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物(sigma社製)、2.0%(w/v)ラフィノース]中で、30℃にて24時間培養した。その後、前培養液10mLを40mLの本培養用液体培地[0.67%(w/v)アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、0.192%(w/v)ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、2.5%(w/v)D−ガラクトース、0.75%(w/v)ラフィノース]に加えて、30℃で14時間培養した。この培養液を遠心分離(10,000×g、4℃、3分間)により菌体と培養上清に分離し、培養上清液にGDH活性があることを確認し、以下の操作に用いた。
回収した評価対象のFAD−GDHを含む培養上清液を遠心式フィルターユニット(Amicon Ultra−15 30K、MERCK MILLIPORE社製)により濃縮後、20mMのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)に置換した。
次に、回収した濃縮液を、150mMの塩化ナトリウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)で予め平衡化したSuperdex 200 10/300GL(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)のカラムにかけ、活性画分を回収することで精製酵素を取得した。
精製した酵素の比活性は、280nmにおける吸光度(A280)あたりの活性(U/A280)として、上述のGDH活性測定法を用いて測定した。そして、野生型MpGDHの比活性を100とした際の改変型MpGDHにおける「相対比活性」を算出した。相対比活性が100より大きいとき、その改変型MpGDHは比活性が向上していることがわかる。
(2)の方法で取得した精製酵素を用いて上述の活性測定法の基質をD−グルコースから同モル濃度のD−キシロースとした系に変えて活性を測定し、「D−グルコースへの反応性に対するD−キシロースへの反応性の割合(Xyl/Glc(%))」を算出した。これは、D−キシロースを基質として測定したときのFAD−GDH活性をD−グルコースを基質として測定したときのFAD−GDH活性で割った値を%表示した数値である。
上記試験例で記述した方法に従って、pYE2C−Mp(野生型)を鋳型プラスミドとして、表1に示した配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでPCR反応を行った。次いで、増幅されたDNAを含むベクターを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドDNA中のMpGDHをコードするDNAの塩基配列決定を行うことにより、配列番号1に記載のアミノ酸配列の88位のシステインがアラニンに、及び554位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換された組換え体プラスミドであるpYE2C−Mp−C88A、pYE2C−Mp−E554Dをそれぞれ取得した。
なお、これらの比活性が向上している改変型MpGDHにおいては、比活性が向上しているのみならず、Xyl/Glc(%)も良好であることが確認された。本実施例の野生型FAD−GDHは、Xyl/Glc(%)が2%を下回るという高い基質特異性を有する酵素であるが、本発明の比活性向上変異を導入した場合も、この良好な基質特異性が損なわれることなく維持されていることがわかった。特に、C88Aにおいては、野生型と比較して比活性が向上しているだけでなく、基質特異性も一層向上していることが確認され、この変異がFAD−GDHの性能を向上させる有用性の高い変異であることがわかった。
次に、C88AとE554Dの変異を両方有する変異体を作製し、比活性と基質特異性を評価した。具体的には、上記試験例で記述した方法に従って、pYE2C−Mp−C88Aを鋳型プラスミドとし、配列番号5、6の合成ヌクレオチドの組み合わせでPCR反応を行った。次いで、増幅されたDNAを含むベクターを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドDNA中のMpGDHをコードするDNAの塩基配列決定を行うことにより、88位のシステインがアラニンに置換され、且つ554位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換された二重変異体をコードする組換え体プラスミドであるpYE2C−Mp−C88A/E554Dを取得した。
なお、本発明の比活性が向上した変異酵素は、本明細書中に開示するように、本発明者らが先に見出した特許第4648993号公報に記載のケカビ由来FAD−GDHと同様、グルコースへの高い基質特異性も兼ね備え、D−キシロース等の糖化合物が夾雑する条件下でも正確にD−グルコース値を測定し得る有用性の高い酵素であると考えられる。
Claims (14)
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列、配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、
または配列番号1で示されるアミノ酸配列または配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の(a)および/または(b)より選択されるアミノ酸に対応する位置で1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、比活性が向上していることを特徴とするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ:
(a)配列番号1記載のアミノ酸配列における88位のアミノ酸、
(b)配列番号1記載のアミノ酸配列における554位のアミノ酸。 - 配列番号1で示されるアミノ酸配列、配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号1で示されるアミノ酸配列または配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の(c)および/または(d)より選択されるアミノ酸置換を有することを特徴とするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ:
(c)配列番号1記載のアミノ酸配列における88位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
(d)配列番号1記載のアミノ酸配列における554位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である。 - 以下の(e)または(f)で表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において88位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ:
(e)配列番号1記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(f)(e)のアミノ酸配列において、88位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 - 以下の(g)または(h)で表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において554位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ:
(g)配列番号1記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(h)(g)のアミノ酸配列において、554位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 - 配列番号1で示されるアミノ酸配列、配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号1で示されるアミノ酸配列または配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号1の88位に対応する位置及び554位に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、比活性が向上していることを特徴とするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。 - 配列番号1で示されるアミノ酸配列、配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号1で示されるアミノ酸配列または配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下の(i)且つ(j)のアミノ酸置換を有することを特徴とするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ:
(i)配列番号1記載のアミノ酸配列における88位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
(j)配列番号1記載のアミノ酸配列における554位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である。 - 以下の(k)または(l)で表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において88位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸がアラニン、且つ、554位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ:
(k)配列番号1記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(l)(k)のアミノ酸配列において、88位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸残基及び554位のグルタミン酸残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
- 請求項8に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組換え体DNA。
- 請求項9記載の組換え体DNAが導入されている宿主細胞。
- フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法であり、以下の工程を含む方法:
(m)請求項10に記載の宿主細胞を培養する工程、
(n)前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程、および
(o)前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを単離する工程。 - 請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定方法。
- 請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
- 請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
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