JP2022133274A - フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、センサーチップの作製時における過酷な熱条件に供する可能性を想定すると、さらなる熱安定性を付与する試みが継続的に求められている。
(1)配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列(配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列)において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、以下のアミノ酸:
配列番号1記載のアミノ酸配列における175位のアミノ酸、
配列番号1記載のアミノ酸配列における214位のアミノ酸、
配列番号1記載のアミノ酸配列における192位のアミノ酸、
配列番号1記載のアミノ酸配列における212位のアミノ酸、
配列番号1記載のアミノ酸配列における218位のアミノ酸、及び/又は
配列番号1記載のアミノ酸配列における226位のアミノ酸
に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするFAD-GDH、
ただし、配列番号28、30又は32で示されるアミノ酸配列からなるFAD-GDHを除く。
(2)配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、以下のアミノ酸:
配列番号1記載のアミノ酸配列における175位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号1記載のアミノ酸配列における214位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号1記載のアミノ酸配列における192位に対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
配列番号1記載のアミノ酸配列における212位に対応する位置のアミノ酸がロイシン、メチオニンのいずれかである、
配列番号1記載のアミノ酸配列における218位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、及び/又は
配列番号1記載のアミノ酸配列における226位に対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン、アラニン、セリン、システイン、バリンのいずれかである
に対応する位置でアミノ酸置換を有することを特徴とするFAD-GDH、
ただし、配列番号28、30又は32で示されるアミノ酸配列からなるFAD-GDHを除く。
(3)配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号1記載のアミノ酸配列における466位のアミノ酸に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするFAD-GDH。
(4)配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号1記載のアミノ酸配列における466位のアミノ酸に対応する位置がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換され、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするFAD-GDH。
(5)配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、又は配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個アミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に対応する位置のアミノ酸が、以下:
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸である、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がリジンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がセリンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がグルタミンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する
位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がバリンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がトリプトファンである、又は
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンである
のいずれかに記載されるアミノ酸残基であるFAD-GDH。
(6)上記(1)~(5)のいずれかに記載のFAD-GDHをコードするFAD-GDH遺伝子。
(7)上記(6)に記載のFAD-GDH遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組換え体DNA。
(8)上記(7)記載の組換え体DNAが導入されている宿主細胞。
(9)FAD-GDHを製造する方法であり、以下の工程を含む方法:
上記(8)に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるFAD-GDH遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からFAD-GDHを単離する工程。
(10)上記(1)~(5)のいずれかに記載のFAD-GDHを用いるグルコース測定方法。
(11)上記(1)~(5)のいずれかに記載のFAD-GDHを含むグルコースアッセイキット。
(12)上記(1)~(5)のいずれかに記載のFAD-GDHを含むグルコースセンサー。
本発明のFAD-GDHは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ-Δ-ラクトンを生成する反応を触媒する。
本発明のFAD-GDHの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート(PMS)および2,6-ジクロロインドフェノール(DCIP)を用いた以下の系を用いて測定することができる。
(反応1) D-グルコ-ス + PMS(酸化型)
→ D-グルコノ-Δ-ラクトン + PMS(還元型)
(反応2) PMS(還元型) + DCIP(酸化型)
→ PMS(酸化型) + DCIP(還元型)
本発明のFAD-GDHの活性は、以下の手順に従って測定する。100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 2.05mL、1M D-グルコース溶液 0.6mLおよび2mM DCIP溶液 0.15mLを混合し、37℃で5分間保温する。次いで、15mM PMS溶液 0.1mLおよび酵素サンプル溶液0.1mLを添加し、反応を開始する。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)を求め、次式に従いGDH活性を算出する。この際、GDH活性は、37℃において濃度200mMのD-グルコース存在下で1分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を1Uと定義する。
本発明のFAD-GDHは、配列番号1で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば、好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号1記載のアミノ酸配列における175位、214位、192位、212位、218位、226位、466位から選択されるアミノ酸に対応する位置で、1つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。
好ましくは、本発明のFAD-GDHにおける、上述の175位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の175位に対応する位置でのアミノ酸がシステインに置換される置換であり、214位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の214位に対応する位置でのアミノ酸がシステインに置換される置換であり、192位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の192位に対応する位置でのアミノ酸がプロリンに置換される置換であり、212位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の212位に対応する位置でのアミノ酸がロイシン、メチオニンに置換される置換であり、218位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の218位に対応する位置でのアミノ酸がヒスチジンに置換される置換であり、226位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の226位に対応する位置でのアミノ酸がスレオニン、アスパラギン、セリン、システイン、アラニン、バリンに置換される置換であり、466位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の466位に対応する位置でのアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換される置換である。なお、配列番号1においては、本発明の置換を有さない175位のアミノ酸はアラニンであり、214位のアミノ酸はアスパラギンであり、192位のアミノ酸はセリンであり、212位のアミノ酸はイソロイシンであり、218位のアミノ酸はアラニンであり、226位のアミノ酸はイソロイシンであり、466位のアミノ酸はグリシンである。配列番号28においては、本発明の置換を有さない配列番号1の175位に対応する位置は170位のスレオニンであり、配列番号1の214位に対応する位置は209位のアスパラギンであり、配列番号1の218位に対応する位置は213位のセリンであり、配列番号1の226位に対応する位置は221位のイソロイシンであり、配列番号1の466位に対応する位置は461位のグリシンである。配列番号30においては、本発明の置換を有さない配列番号1の175位に対応する位置は172位のバリンであり、配列番号1の214位に対応する位置は211位のアスパラギンであり、配列番号1の466位に対応する位置は463位のグリシンである。配列番号32においては、本発明の置換を有さない配列番号1の175位に対応する位置は171位のバリンであり、配列番号1の214位に対応する位置は210位のアスパラギン酸であり、配列番号1の466位に対応する位置は463位のグリシンである。
目的とするアミノ酸置換導入方法としては、例えばランダムに変異を導入する方法あるいは想定した位置に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。前者の方法としては、エラープローンPCR法(Techniques,1,11-15,(1989))や、増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすいXL1-Redコンピテントセル(STRATAGENE社製)を用いる方法等がある。また、後者の方法として、目的とするタンパク質の結晶構造解析により立体構造を構築し、その情報をもとに目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、市販のQuick Change Site Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE社製)等により部位特異的変異を導入する方法がある。あるいは、後者の方法として、目的とするタンパク質と相同性の高い公知のタンパク質の立体構造を用いて、目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、部位特異的変異を導入する方法もある。
(相同性領域について)
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、GENETYX Ver.11(ゼネティックス社製)のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはDNASIS Pro(日立ソリューションズ社製)のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、2以上のGDHをアライメントしたときに、該2以上のGDHにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
また、2以上のGDHにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域(保存領域)を決定できる。
本明細書において「相同性領域」とは、2以上のGDHをアライメントしたときに、ある基準となるGDHと比較対象のGDHの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上又は10以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図1では全長アミノ酸配列の配列同一性が70%以上であるGDHをアライメントした。このうち、配列番号1で示されるMucor属GDHを基準として第31位~41位は同一アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号1で示されるMucor属GDHを基準として58~62位、71~85位、106~116位、119~127位、132~134位、136~144位、150~153位、167~171位、219~225位、253~262位、277~281位、301~303位、305~312位、314~319位、324~326位、332~337位、339~346位、348~354位、386~394位、415~417位、454~459位、476~484位、486~491位、508~511位、518~520位、522~524位、526~528位、564~579位、584~586位、592~595位、597~599位、607~617位、及び625~630位は相同性領域に該当しうる。
本発明のGDHは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するGDHとアライメントしたときに50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。さらに、本発明のGDH変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号1における相同性領域のアミノ酸配列と80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上の配列同一性を有する。
また、相同性領域を基準に本発明の突然変異の位置を特定することができる。例えば、配列番号1の175位又はそれに対応する位置は、167~171位の相同性領域からC末端方向に4アミノ酸離れた位置として特定することができる。
本発明における耐熱性の向上は、本明細書中に記載の活性測定方法及び熱安定性測定方法に記載した条件において評価される。なお、本明細書における熱処理時のpHは7.0であるが、これは本発明のFAD-GDHが血液中のグルコース(血糖値)を測定する目的で開発されたものであり、血液のpHが中性付近であることによる。このように実用になるべく近い条件で評価を行うことによって、より有用な酵素の取得が可能となる。
本発明のFAD-GDHを効率よく取得するためには、遺伝子工学的手法を利用するのが好ましい。本発明のFAD-GDHをコードする遺伝子(以下、FAD-GDH遺伝子)を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いればよい。例えば、公知のFAD-GDHを出発物質とし、それを改変することにより本発明のFAD-GDHを取得するには、FAD-GDH生産能を有する公知の微生物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNA又はmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNA又はcDNAを用いて、染色体DNA又はcDNAのライブラリーを作製することができる。
出発物質であるFAD-GDH遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、FAD-GDH遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法;紫外線照射法;遺伝子工学的手法;又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは5-ブロモウラシル等を挙げることができる。
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をMucor属由来FAD-GDH遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは0.5~12Mの上記薬剤濃度において、20~80℃の反応温度下で10分間以上、好ましくは10~180分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる(現代化学、p24~30、1989年6月号)。
なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の熱安定性に優れた改変FAD-GDH遺伝子を合成することもできる。
本発明のFAD-GDHは、公知のFAD-GDHを改変することにより取得することもできる。公知のFAD-GDHの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール(Mucor)属、アブシジア(Absidia)属、アクチノムコール(Actinomucor)属、シルシネラ(Circinella)属由来のFAD-GDH等が挙げられる。
Mucor属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Mucor prainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloides f. circinelloides、Mucor guilliermondii、Mucor hiemalis f. silvaticus、Mucor subtilissimus、Mucor dimorphosporus等が挙げられる。より具体的には、特許文献5に記載のMucor prainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloides f. circinelloides、Mucor guilliermondii NBRC9403、Mucor hiemalis f. silvaticus NBRC6754、Mucor subtilissimus NBRC6338、Mucor RD056860、Mucor dimorphosporus NBRC5395等が挙げられる。Absidia属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Absidia cylindrospora、Absidia hyalosporaを挙げることができる。より具体的には、特許文献5に記載のAbsidia cylindrospora、Absidia hyalosporaを挙げることができる。Actinomucor属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Actinomucor elegansを挙げることができる。より具体的には、特許文献5に記載のActinomucor elegansを挙げることができる。Circinella属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Circinella minor、Circinella mucoroides、Circinella muscae、Circinella rigida、Circinella simplex、Circinella umbellataを挙げることができる。より具体的には、Circinella minor NBRC6448、Circinella mucoroides NBRC4453、Circinella muscae NBRC6410、Circinella rigida NBRC6411、Circinella simplex NBRC6412、Circinella umbellata NBRC4452、Circinella umbellata NBRC5842、Circinella RD055423及びCircinella RD055422を挙げることができる。なお、NBRC菌株およびRD菌株はNBRC(独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター)の保管菌株である。
上述のように得られた本発明のFAD-GDH遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
原核宿主細胞の一例としては、エシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌K-12株、エシェリヒア・コリーBL21(DE3)、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5α、エシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600等(いずれもタカラバイオ社製)が挙げられる。それらを形質転換し、又は、それらに形質導入して、DNAが導入された宿主細胞(形質転換体)を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えDNAの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル(例えばECOS Competent エシェリヒア・コリーBL21(DE3);ニッポンジーン製)を用いても良い。
(ハイスループットスクリーニング)
GDHはさらに、機能性GDH変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したGDH遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、又は液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ(例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005)、イーストディスプレイ(例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34)、バクテリアルディスプレイ(例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007)等を用いて、変異GDHの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。GDHバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の領域や位置又はそれらに対応する領域や位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約10の7乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際にはGDH活性の有無を利用しうる。これには例えば上記のGDHが作用すれば発色する組成とした反応液を用いてもよい。例えばDCIPを用いる場合は、96ウェルプレート、192ウェルプレート、384ウェルプレート、9600ウェルプレート等及びプレートリーダーを用いて600nmの吸光度を測定してもよい。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
本発明のFAD-GDHは、上述のように取得した本発明のFAD-GDHを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるFAD-GDH遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からFAD-GDHを単離することにより、製造すればよい。
上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の1種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第1カリウム、リン酸第2カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第2鉄、硫酸第2鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の1種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
培地の初発pHは、限定されないが、例えば、pH6~9に調整することができる。
培養は、10~42℃の培養温度、好ましくは25℃前後の培養温度で4~24時間、さらに好ましくは25℃前後の培養温度で4~8時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
本発明はまた、本発明のFAD-GDHを含むグルコースアッセイキットを開示し、本発明のFAD-GDHを用いて血中のグルコース(血糖値)を測定することができる。
本発明のグルコースアッセイキットには、少なくとも1回のアッセイに十分な量の本発明に従う改変型FAD-GDHを含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明の改変型FAD-GDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含む。本発明のグルコース測定法やグルコースアッセイキットに用いる改変型FAD-GDHは、種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、又は適切な保存溶液中に溶解されて提供することができる。
本発明はまた、本発明のFAD-GDHを用いるグルコースセンサーを開示する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のFAD-GDHを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のFAD-GDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
[試験例]
(1)各種の改変型FAD-GDHを発現する酵母形質転換体の作製
特許文献8に記載の方法に準じ、配列番号2のMucor prainii由来FAD-GDH遺伝子(野生型MpGDH遺伝子)をコードする組換え体プラスミド(pYES2C-Mp(野生型))を取得した。
得られた組換え体プラスミドpYES2C-Mpを鋳型として、各アミノ酸置換導入用の合成ヌクレオチド、KOD-Plus-(東洋紡績社製)を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
すなわち、10×KOD-Plus-緩衝液を5μl、dNTPが各2mMになるよう調製されたdNTPs混合溶液を5μl、25mMのMgSO4溶液を2μl、鋳型となるpYES2C-Mpを50ng、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ15pmol、KOD-Plus-を1Unit加えて、滅菌水により全量を50μlとして「反応液」を調製した。サーマルサイクラー(エッペンドルフ社製)を用いて、調製した反応液を94℃で2分間インキュベートし、続いて、「94℃、15秒」-「55℃、30秒」-「68℃、8分」のサイクルを30回繰り返した。
その後、S.cerevisiae用形質転換キット(Invitrogen社製)により、pYES2C-Mp(野生型)、および各種変異が導入されたpYES2C-Mp(改変型、例えば、pYES2C-Mp-A175C/N214C等)を用いてINVSc1株(Invitrogen社製)を形質転換することにより、野生型MpGDHを発現する酵母形質転換体Sc-Mp(野生型)株、および各種の改変型MpGDHを発現する酵母形質転換株Sc-Mp(改変型、例えば、Sc-Mp-A175C/N214C等)株をそれぞれ取得した。
酵母形質転換体Sc-Mp(野生型)、および、各種の酵母形質転換体Sc-Mp(改変型、例えば、Sc-Mp-A175C/N214C等)を、各々、5mLの前培養用液体培地[0.67%(w/v)アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース(BD)、0.192%(w/v)ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物(sigma社製)、2.0%(w/v)ラフィノース]中で、30℃にて24時間培養した。その後、前培養液1mLを4mLの本培養用液体培地[0.67%(w/v)アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、0.192%(w/v)ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、2.5%(w/v)D-ガラクトース、0.75%(w/v)ラフィノース]に加えて、30℃で16時間培養する。この培養液を遠心分離(10,000×g、4℃、3分間)により菌体と培養上清に分離し、培養上清液を熱安定性の評価に用いた。
FAD-GDHの熱安定性評価は、まず、上述のように回収した評価対象のFAD-GDHを含む培養上清液を約1U/mlになるように酵素希釈液(100mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0))にて希釈する。そして、この酵素溶液(0.1ml)を2本用意し、そのうち1本は4℃で保存し、もう1本には、45℃、15分間の加温処理を施した。加温処理後、各サンプルのFAD-GDH活性を測定し、4℃で保存したものの酵素活性を100としたときの、45℃、15分間処理後の活性値を「活性残存率(%)」として算出した。この活性残存率(%)を、各種FAD-GDHの耐熱性評価の指標とした。
野生型MpGDHを発現するSc-Mp(野生型)株の培養上清を用いて、野生型MpGDHの熱安定性を評価した結果、野生型MpGDHの45℃、15分熱処理後の残存活性率は0%であった。よって、各種改変型MpGDHの熱処理後の残存活性率が0%より高かった場合に、MpGDHの熱安定性が向上していると判断することができる。
基質特異性についても、熱安定性と同様に、上記(2)の方法に従って回収した各種酵母培養上清液を用いて評価を行った。まず、上述の活性測定法の基質をD-グルコースから同モル濃度のマルトースとした系に変えてそれぞれの基質に対する活性を測定した。そして、これらの値から、「D-グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合(Mal/Glc(%))」を算出した。また、各種変異体における部位特異的変異導入前のMucor属由来FAD-GDHにおけるMal/Glc(%)の値を100%とした時に部位特異的変異導入後の改変型FAD-GDHが示す相対的な基質特異性を表す「Mal/Glc比率」を算出した。「Mal/Glc比率が100を下回る改変型FAD-GDHにおいては、部位特異的変異導入前のFAD-GDHと比較して、マルトースへの反応性が低下し、基質特異性が高まっていることを示し、その度合は、数値が小さくなるほど大きい。
Sc-Mp(野生型)株にて発現させた野生型MpGDHの(Mal/Glc(%))は、0.8%であった。このような基質特異性は、従来知られたその他のFAD-GDHと比較しても非常に優れているが、多量の酵素が存在する条件下では、一定濃度以上で存在するマルトースへの反応性が若干ながら確認され、依然として改善の余地が存在する。
上記試験例で記述した方法に従って、pYES2C-Mp(野生型)を鋳型プラスミドとして、表1、2に示した配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでPCR反応を行った。次いで、増幅されたDNAを含むベクターを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドDNA中のMpGDHをコードするDNAの塩基配列決定を行うことにより、配列番号1に記載のアミノ酸配列の175位のアラニンがシステイン及び214位のアスパラギンがシステインに、192位のセリンがプロリンに、212位のイソロイシンがロイシンに、218位のアラニンがヒスチジンに、226位のイソロイシンがスレオニン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、又はバリンに、466位のグリシンがアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換された組換え体プラスミドであるpYES2C-Mp-A175C/N214C、pYES2C-Mp-S192P、pYES2C-Mp-I212L、pYES2C-Mp-A218H、pYES2C-Mp-I226T、pYES2C-Mp-I226N、pYES2C-Mp-I226S、pYES2C-Mp-I226A、pYES2C-Mp-I226C、pYES2C-Mp-I226V、pYES2C-Mp-G466D、pYES2C-Mp-G466E、pYES2C-Mp-G466R、pYES2C-Mp-G466K、pYES2C-Mp-G466H、pYES2C-Mp-G466N、pYES2C-Mp-G466S、pYES2C-Mp-G466Q、pYES2C-Mp-G466T、pYES2C-Mp-G466C、pYES2C-Mp-G466A、pYES2C-Mp-G466Y、pYES2C-Mp-G466F、pYES2C-Mp-G466M、pYES2C-Mp-G466V、pYES2C-Mp-G466L、pYES2C-Mp-G466W、pYES2C-Mp-G466Iをそれぞれ取得した。
さらに、これらの熱安定性が向上しているFAD-GDHは、高い基質特異性も維持されていることがわかった。すなわち、表1に記載した本発明の熱安定性向上変異を有する改変型酵素は、野生型FAD-GDHが有する基質特異性に対し負の影響をほとんど与えることなく、場合によっては、野生型酵素の基質特異性を上回るようなものも含み得ることがわかった。
また、表2に示すとおり、配列番号1の野生型MpGDHに対する466位への部位特異的変異導入、具体的には、G466D、G466E、G466R、G466K、G466N、G466Q、G466T、G466C、G466A、G466Y、G466F、G466M、G466V、G466L、G466W、G466S、G466H、G466Iの部位特異的変異を導入することにより、FAD-GDHのMal/Glc(%)が低減されることが確認された。
次に、実施例2に示すような変異を多重的に有する変異体を作製し、それらにおける熱安定性向上効果と基質特異性改善効果を検証した。具体的には、上記試験例で記述した方法に従って、pYES2C-Mp-A175C/N214Cを鋳型プラスミドとし、表2に記載の配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでPCR反応を行った。次いで、増幅されたDNAを含むベクターを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドDNA中のMpGDHをコードするDNAの塩基配列決定を行うことにより、175位のアラニンがシステインに置換され、214位のアスパラギンがシステインに置換されたことを特徴とし、さらに別のアミノ酸置換を兼ね備えた下記の多重変異体を作製した。具体的には、配列番号1に記載のアミノ酸配列の175位のアラニンがシステインに置換され、214位のアスパラギンがシステインに置換されかつ、466位のグリシンがグルタミン酸に置換された3重変異体をコードする組換え体プラスミドであるpYES2C-Mp-A175C/N214C/G466Dを取得した。
実施例1、2と同様の手法を用いて、pYES2C-MpGDH-M1を鋳型プラスミドとし、表4、5に記載の配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでPCR反応を行った。次いで、増幅されたDNAを含むベクターを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドDNA中のMpGDHをコードするDNAの塩基配列決定を行うことにより、175位のアラニンがシステインに置換され、かつ、214位のアスパラギンがシステインに置換された多重変異体をコードする組換え体プラスミドpYES2C-MpGDH-M1-A175C/N214Cを作製した。また、466位のグリシンがアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリンに置換された変異体をコードする組換え体プラスミドpYES2C-MpGDH-M1-G466D、pYES2C-MpGDH-M1-G466E、pYES2C-MpGDH-M1-G466R、pYES2C-MpGDH-M1-G466K、pYES2C-MpGDH-M1-G466H、pYES2C-MpGDH-M1-G466N、pYES2C-MpGDH-M1-G466Sを作製した。さらに、175位のアラニンがシステインに置換され、214位のアスパラギンがシステインに置換され、かつ、466位のグリシンがアスパラギン酸に置換された多重変異体をコードする組換え体プラスミドpYES2C-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466Dを作製した。
次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型MpGDH-M1をコードする組換え体プラスミドを用いて、試験例(2)の項目に従って、INVSc1株の形質転換及び取得された形質転換株(Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/S192P株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/I212L株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/I212M株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/A218H株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/I226T株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/I226N株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/I226S株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/I226A株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/I226C株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/I226V株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/I212L/A218H株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D/I212M/A218H株、Sc-MpGDH-M1-G466D株、Sc-MpGDH-M1-G466E株、Sc-MpGDH-M1-G466R株、Sc-MpGDH-M1-G466K株、Sc-MpGDH-M1-G466H株、Sc-MpGDH-M1-G466N株、Sc-MpGDH-M1-G466S株、Sc-MpGDH-M1-A175C/N214C/G466D株)の培養を行い、培養上清中のGDH活性を測定した。
また、表5に示すとおり、配列番号3のMpGDH-M1に対する466位への部位特異的変異導入、具体的には、G466D、G466E、G466R、G466K、G466H、G466N、G466Sの部位特異的変異を導入することにより、FAD-GDHのMal/Glc(%)が低減されることが確認された。
特開2017-000137号公報において、MpGDHと78%の同一性を有する、配列番号28のMucor guilliermondii由来のGDH(以下、MgGDH)の配列情報が公開されている。そこで、実施例1で見出したアミノ酸置換をMgGDHに対して導入することで、同様に熱安定性が向上する、又は、マルトースへの反応性が低減するかどうかを以下のように検証することにした。
MgGDHのアミノ酸配列は配列番号28に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号29に示す。実施例1と同様に、配列番号52、53、54、55の合成オリゴヌクレオチドを用いてPCR反応を行い、配列番号28記載のアミノ酸配列の170位のスレオニンをシステインに、209位のアスパラギンをシステインに置換した変異体であるMgGDH/T170C/N209C、221位のイソロイシンをスレオニン、セリンに置換した変異体であるMgGDH/I221T、MgGDH/I221S、213位のセリンをヒスチジンに置換した変異体であるMgGDH/S213HをコードするDNAコンストラクトを得た。続いて、実施例1と同様に、表6記載のプライマーを用いて目的遺伝子を作製し、MgGDH及びMgGDH/T170C/N209C、MgGDH/I221T、MgGDH/I221S、MgGDH/S213Hをコードする遺伝子が挿入された組換え体プラスミドpYES2C-Mg、pYES2C-Mg-T170C/N209C、pYES2C-Mg-I221T、pYES2C-Mg-I221S、pYES2C-Mg-S213Hを用いて、試験例(2)の項目に従って、INVSc1株の形質転換及び取得された形質転換株(Sc-MpGDH-Mg株、Sc-MpGDH-Mg-T170C/N209C株、Sc-MpGDH-Mg-I221T株、Sc-MpGDH-Mg-I221S株、Sc-MpGDH-Mg-S213H株)の培養を行い、培養上清中のGDH活性を測定した。同様にして、表7記載のプライマーを用いて目的遺伝子を作製し、配列番号28記載のアミノ酸配列の461位のグリシンをアスパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、セリンに置換した変異体であるMgGDH/G461D、MgGDH/G461R、MgGDH/G461K、MgGDH/G461H、MgGDH/G461Sについても形質転換及び取得された形質転換株の培養を行い、培養上清中のGDH活性を測定した。
表7に示すとおり、配列番号28のMgGDHに対する461位への部位特異的変異導入、具体的には、G461D、G461R、G461K、G461H、G461Sの部位特異的変異を導入することにより、FAD-GDHのMal/Glc(%)が低減されることが確認された。
特開2013-116102号公報において、MpGDHと78%の同一性を有する、配列番号30のMucor hiemalis由来のGDH(以下、MhGDH)の配列情報が公開されている。そこで、実施例1で見出したアミノ酸置換をMhGDHに対して導入することで、同様に熱安定性が向上する、又は、マルトースへの反応性が低減するかどうかを以下のように検証することにした。
MhGDHのアミノ酸配列は配列番号30に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号31に示す。実施例1と同様に、配列番号58、59、60、61の合成オリゴヌクレオチドを用いてPCR反応を行い、配列番号30記載のアミノ酸配列の172位のバリンをシステインに、211位のアスパラギンをシステインに置換した変異体であるMhGDH/V172C/N211CをコードするDNAコンストラクトを得た。続いて、実施例1と同様に、MhGDH及びMhGDH/V172C/N211Cをコードする遺伝子が挿入された組換え体プラスミドpYES2C-Mh、pYES2C-Mh-V172C/N211Cを用いて、試験例(2)の項目に従って、INVSc1株の形質転換及び取得された形質転換株(Sc-MpGDH-Mh株、Sc-MpGDH-Mh-V172C/N211C株)の培養を行い、培養上清中のGDH活性を測定した。同様にして、表9記載のプライマーを用いて目的遺伝子を作製し、配列番号30記載のアミノ酸配列の463位のグリシンをアスパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、セリンに置換した変異体であるMhGDH/G463D、MhGDH/G463R、MhGDH/G463K、MhGDH/G463H、MhGDH/G463Sについても形質転換及び取得された形質転換株の培養を行い、培養上清中のGDH活性を測定した。
特開2013-176363号公報において、MpGDHと73%の同一性を有する、配列番号32のMucor RD056860由来のGDH(以下、MrdGDH)の配列情報が公開されている。そこで、実施例1で見出したアミノ酸置換をMrdGDHに導入することで、同様に熱安定性が向上する、又は、マルトースへの反応性が低減するかどうかを以下のように検証することにした。
MrdGDHのアミノ酸配列は配列番号32に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号33に示す。実施例1と同様に、配列番号62、63、64、65の合成オリゴヌクレオチドを用いてPCR反応を行い、配列番号32記載のアミノ酸配列の171位のバリンをシステインに、210位のアスパラギン酸をシステインに置換した変異体であるMrdGDH/V171C/D210CをコードするDNAコンストラクトを得た。続いて、実施例1と同様に、MrdGDH及びMrdGDH/V171C/D210Cをコードする遺伝子が挿入された組換え体プラスミドpYES2C-Mrd、pYES2C-Mrd-V171C/D210Cを用いて、試験例(2)の項目に従って、INVSc1株の形質転換及び取得された形質転換株(Sc-Mrd株、Sc-Mrd-V171C/D210C株)の培養を行い、培養上清中のGDH活性を測定した。同様にして、表11記載のプライマーを用いて目的遺伝子を作製し、配列番号32記載のアミノ酸配列の463位のグリシンをアスパラギン酸、システイン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリンに置換した変異体であるMrdGDH/G463D、MrdGDH/G463C、MrdGDH/G463R、MrdGDH/G463K、MrdGDH/G463H、MrdGDH/G463N、MrdGDH/G463Sについても形質転換及び取得された形質転換株の培養を行い、培養上清中のGDH活性を測定した。
表11に示すとおり、配列番号32のMgGDHに対する463位への部位特異的変異導入、具体的には、G463D、G463C、G463R、G463K、G463H、G463N、G463Sの部位特異的変異を導入することにより、FAD-GDHのMal/Glc(%)が低減されることが確認された。
Claims (12)
- 配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列(配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列)において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、以下のアミノ酸:
配列番号1記載のアミノ酸配列における175位のアミノ酸、
配列番号1記載のアミノ酸配列における214位のアミノ酸、
配列番号1記載のアミノ酸配列における192位のアミノ酸、
配列番号1記載のアミノ酸配列における212位のアミノ酸、
配列番号1記載のアミノ酸配列における218位のアミノ酸、及び/又は
配列番号1記載のアミノ酸配列における226位のアミノ酸
に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするFAD-GDH、
ただし、配列番号28、30又は32で示されるアミノ酸配列からなるFAD-GDHを除く。 - 配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、以下のアミノ酸:
配列番号1記載のアミノ酸配列における175位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号1記載のアミノ酸配列における214位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号1記載のアミノ酸配列における192位に対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
配列番号1記載のアミノ酸配列における212位に対応する位置のアミノ酸がロイシン、メチオニンのいずれかである、
配列番号1記載のアミノ酸配列における218位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、及び/又は
配列番号1記載のアミノ酸配列における226位に対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン、アラニン、セリン、システイン、バリンのいずれかである
に対応する位置でアミノ酸置換を有することを特徴とするFAD-GDH、
ただし、配列番号28、30又は32で示されるアミノ酸配列からなるFAD-GDHを除く。 - 配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号1記載のアミノ酸配列における466位のアミノ酸に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするFAD-GDH。
- 配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号1記載のアミノ酸配列における466位のアミノ酸に対応する位置がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換され、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするFAD-GDH。
- 配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、又は配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列において1もしくは数個アミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に対応する位置のアミノ酸が、以下:
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸である、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がリジンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がセリンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がグルタミンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がバリンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がトリプトファンである、又は
配列番号1又は3記載のアミノ酸配列における175位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、214位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、466位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンである
のいずれかに記載されるアミノ酸残基であるFAD-GDH。 - 請求項1~5のいずれかに記載のFAD-GDHをコードするFAD-GDH遺伝子。
- 請求項6に記載のFAD-GDH遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組換え体DNA。
- 請求項7記載の組換え体DNAが導入されている宿主細胞。
- FAD-GDHを製造する方法であり、以下の工程を含む方法:
請求項8に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるFAD-GDH遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からFAD-GDHを単離する工程。 - 請求項1~5のいずれか1項に記載のFAD-GDHを用いるグルコース測定方法。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のFAD-GDHを含むグルコースアッセイキット。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のFAD-GDHを含むグルコースセンサー。
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