WO2013065770A1 - 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ Download PDF

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WO2013065770A1
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amino acid
position corresponding
seq
acid sequence
gdh
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PCT/JP2012/078283
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康子 荒木
敦 一柳
惠一 市川
浩三 廣川
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キッコーマン株式会社
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

Definitions

  • the present invention relates to a flavin-binding glucose dehydrogenase with improved substrate specificity, its gene and recombinant DNA, and a method for producing a flavin-binding glucose dehydrogenase with improved substrate specificity.
  • Blood glucose level (blood glucose level) is an important marker of diabetes.
  • an apparatus for self blood glucose measurement (Self Monitoring of Blood Glucose: SMBG) using an electrochemical biosensor is widely used.
  • enzymes using D-glucose as a substrate such as glucose oxidase (GOD) have been used for biosensors used in SMBG devices.
  • GOD glucose oxidase
  • GOD glucose oxidase
  • GDH glucose dehydrogenases
  • NAD nicotinamide dinucleotide
  • NADP nicotinamide dinucleotide phosphate
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • NAD (P) -GDH has the problem that the stability of the enzyme is poor and the addition of a coenzyme is necessary, and PQQ-GDH has a low substrate specificity, and D-glucose which is a measurement target
  • PQQ-GDH has a low substrate specificity
  • D-glucose which is a measurement target
  • sugar compounds such as maltose, D-galactose and D-xylose
  • sugar compounds other than D-glucose in the measurement sample affect the measurement value, and an accurate measurement value is obtained. There is a problem that it is not possible.
  • Non-Patent Documents 2 to 5 have reports on GDH derived from Aspergillus oryzae.
  • Patent Documents 1 to 3 include a flavin-binding type using flavin adenine dinucleotide (FAD) derived from Aspergillus as a coenzyme. Glucose dehydrogenase (hereinafter FAD-GDH) has been disclosed.
  • FAD-GDH flavin adenine dinucleotide
  • the above enzyme has a characteristic of low reactivity with one or several sugar compounds other than D-glucose, it is reactive with any of maltose, D-galactose, and D-xylose. Is not sufficiently low.
  • FAD-GDH found from the genus Mucor, which is a kind of mold, has a sufficiently low reactivity with any of maltose, D-galactose, and D-xylose. (See, for example, Patent Document 4).
  • the measurement time is shortened by further improving the measurement sensitivity, the measurement system is further reduced in scale, and the required measurement sample is continuously reduced. It has been pursued.
  • the amount of glucose measurement enzyme mounted on the glucose sensor is increased.
  • the maltose and D-xylose present at a certain concentration or more are used.
  • the reactivity has been confirmed to some extent.
  • the activity on D-xylose is introduced by introducing amino acid substitution into FAD-GDH derived from Aspergillus genus.
  • a method for obtaining a reduced FAD-GDH variant has been disclosed (see, for example, Patent Documents 5 to 6).
  • the Aspergillus genus FAD-GDH is considerably more reactive with D-xylose than the natural Mucor genus FAD-GDH, and has the Aspergillus genus FAD-GDH variants disclosed so far.
  • the substrate specificity is sufficient.
  • the substrate specificity for D-glucose is excellent, it is difficult to act on sugar compounds other than D-glucose, such as D-xylose and maltose, and these D-glucoses are used when measured for D-glucose. It is an object of the present invention to provide a novel FAD-GDH that is not easily affected even when sugar compounds other than glucose coexist.
  • the modified FAD-GDH obtained by substituting a specific amino acid residue in the Mucor genus-derived FAD-GDH is specific to D-glucose.
  • the present invention has been completed by finding that it is excellent in properties, hardly acts on D-xylose and maltose, and is hardly affected by the presence of these sugar compounds other than D-glucose.
  • the present invention is as follows.
  • the flavin-binding glucose dehydrogenase according to (1) above which has one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of the amino acid at the position selected from either cysteine or threonine.
  • the amino acid at the position corresponding to valine at position 232 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is glutamic acid, the amino acid at the position corresponding to threonine at position 387 is alanine, and the amino acid at the position corresponding to isoleucine at position 545
  • the amino acid is threonine, and the amino acid at the position corresponding to tryptophan at position 569 is tyrosine;
  • the amino acid at the position corresponding to valine at position 232 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is glutamic acid, the amino acid at the position corresponding to threonine at position 387 is alanine, and the amino acid at the position corresponding to isoleucine at position 545
  • the amino acid is threonine, and the amino acid at the position corresponding to serine at position 612 is cysteine
  • a host cell comprising the recombinant vector according to (8) above.
  • (11) A method for measuring glucose, comprising using the flavin-binding glucose dehydrogenase described in (1) to (6) above.
  • (12) A glucose assay kit comprising the flavin-binding glucose dehydrogenase described in (1) to (6) above.
  • (13) A glucose sensor comprising the flavin-binding glucose dehydrogenase described in (1) to (6) above.
  • FAD-GDH having excellent substrate specificity and reduced reactivity to D-xylose and / or maltose.
  • the FAD-GDH of the present invention catalyzes the reaction of oxidizing the hydroxyl group of D-glucose to produce glucono- ⁇ -lactone in the presence of an electron acceptor, as in the case of known wild type or mutant FAD-GDH.
  • the activity of the FAD-GDH of the present invention utilizes this principle of action, for example, using the following measurement system using phenazine methosulfate (PMS) and 2,6-dichloroindophenol (DCIP) as electron acceptors. Can be measured.
  • the flavin-binding GDH activity is calculated according to the following formula.
  • the flavin-binding GDH activity is defined as 1 U as the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute in the presence of 200 mM D-glucose at 37 ° C.
  • 3.0 is the reaction reagent + enzyme reagent solution volume (mL)
  • 16.3 is the millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / ⁇ mol) under the activity measurement conditions
  • 0.1 is the enzyme solution solution volume.
  • ML 1.0 is the optical path length of the cell (cm)
  • ⁇ A600 blank is the absorbance per minute at 600 nm when the reaction is started by adding 10 mM acetate buffer (pH 5.0) instead of the enzyme sample solution.
  • Df represents the dilution factor.
  • the FAD-GDH of the present invention has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or has high identity with the amino acid sequence, for example, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, most Preferably, an amino acid sequence that is 95% or more identical, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, the position corresponding to position 78 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, Position corresponding to 79th position, position corresponding to 81st position, position corresponding to 121st position, position corresponding to 122nd position, position corresponding to 123rd position, position corresponding to 465th position, and position 612 Having one or more amino acid substitutions at the position corresponding to the amino acid at the position selected from the position corresponding to the position And butterflies.
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 78 described above is a substitution in which the methionine at the position corresponding to position 78 is substituted with any one of cysteine, asparagine, glutamic acid, and glutamine.
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 79 is a substitution in which tyrosine at the position corresponding to position 79 is substituted with either phenylalanine or asparagine, and at the position corresponding to position 81 described above.
  • the amino acid substitution is a substitution in which glutamine at the position corresponding to position 81 is substituted with any of leucine, phenylalanine or asparagine, and the amino acid substitution at the position corresponding to position 121 described above corresponds to position 121 Leucine at the position to be substituted with either cysteine or methionine, and the 122 position described above
  • the amino acid substitution at the corresponding position is a substitution in which the valine at the position corresponding to position 122 is substituted with threonine, alanine or cysteine, and the amino acid substitution at the position corresponding to position 123 described above is Tryptophan at the position corresponding to position 123 is a substitution in which cysteine, phenylalanine, histidine, valine, or serine is substituted, and the amino acid substitution at the position corresponding to position 465 is a position corresponding to position 465 In which glutamic acid is substituted with arginine, aspartic acid, or isoleucine, and
  • FAD-GDHs of the present invention more preferred examples include multiple mutants having a combination of a plurality of the substitutions as described above.
  • the present invention includes double mutants having two substitutions as described above, triple mutants having three substitutions, and multiple mutants having many mutations in combination. By accumulating such mutations, FAD-GDH having a further reduced effect on D-xylose and / or maltose can be produced.
  • substitutions at positions other than the above-mentioned various substitutions can be combined. Such substitution positions are introduced in combination with the above-described substitution sites, even when those substitutions are introduced alone, even if they do not have a significant effect as in the above-mentioned substitution sites, It can be synergistic.
  • the FAD-GDH of the present invention has a mutation that improves heat stability, resistance to pH, specific substances, etc. in addition to the above-described mutation that hardly acts on D-xylose and maltose. You may combine arbitrarily the well-known mutation aiming at producing another kind of effect like the effect to improve. Even when such different types of mutations are combined, those FAD-GDHs are included in the present invention as long as the effects of the present invention can be exhibited.
  • an amino acid at a position corresponding to tryptophan at position 569 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine, and this mutation is combined with another mutation.
  • a mutant in which the amino acid at the position corresponding to methionine at position 78 is either glutamic acid or asparagine can be mentioned.
  • the amino acid at the position corresponding to tryptophan at position 569 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is tyrosine, and the position corresponding to leucine at position 121 is The mutant whose amino acid is methionine is mentioned.
  • an amino acid at a position corresponding to tryptophan at position 569 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is tyrosine, and a position corresponding to valine at position 122 is used. The mutant whose amino acid is cysteine is mentioned.
  • the amino acid at the position corresponding to tryptophan at position 569 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is tyrosine and the amino acid at the position corresponding to tryptophan at position 123 is used.
  • a mutant whose amino acid is either phenylalanine or valine is mentioned.
  • the amino acid at the position corresponding to tryptophan at position 569 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is tyrosine, and the position corresponding to serine at position 612 Examples include mutants in which the amino acid is either cysteine or threonine.
  • the amino acid at the position corresponding to tryptophan at position 569 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is tyrosine
  • the amino acid at the position corresponding to methionine at position 78 is A variant that is asparagine and in which the amino acid at the position corresponding to serine at position 612 is cysteine is mentioned.
  • the amino acid at the position corresponding to tryptophan at position 123 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is phenylalanine, and the position corresponding to leucine at position 121 The mutant whose amino acid is methionine is mentioned.
  • the amino acid at the position corresponding to tryptophan at position 123 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is phenylalanine, and the position corresponding to serine at position 612 The mutant whose amino acid is threonine is mentioned.
  • the amino acid at the position corresponding to tryptophan at position 123 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is valine, and the position corresponding to leucine at position 121 is used.
  • the mutant whose amino acid is methionine is mentioned.
  • the amino acid at the position corresponding to valine at position 232 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is glutamic acid, and the position corresponding to threonine at position 387 is used.
  • the amino acid at the position corresponding to valine at position 232 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is glutamic acid, and the position corresponding to threonine at position 387 is used.
  • the amino acid at the position corresponding to valine at position 232 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is glutamic acid, and the position corresponding to threonine at position 387 is used.
  • the amino acid at the position corresponding to valine at position 232 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is glutamic acid, and the position corresponding to threonine at position 387 is used.
  • the amino acid is alanine
  • the amino acid at the position corresponding to glutamic acid at position 465 is aspartic acid
  • the amino acid at the position corresponding to isoleucine at position 545 is threonine
  • corresponds to tryptophan at position 568 A variant in which the amino acid at the position is tyrosine is exemplified.
  • the FAD-GDH of the present invention first obtains a gene encoding an amino acid sequence close to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by an arbitrary method, and at a position equivalent to the predetermined position of SEQ ID NO: 1. It can also be obtained by introducing an amino acid substitution at any position.
  • the intended amino acid substitution introduction method include a method of introducing mutations at random or a method of introducing site-specific mutations at assumed positions.
  • Examples of the former method include error-prone PCR (Techniques, 1, 11-15, (1989)), XL1-Red competent cells (STRATAGENE) that are prone to errors in plasmid replication and prone to modification during propagation. There is a method of using.
  • a three-dimensional structure is constructed by crystal structure analysis of the target protein, amino acids that are expected to give the desired effect are selected based on the information, and a commercially available Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit is selected.
  • a site-specific mutation is introduced by selecting an amino acid that is expected to give a target effect using a three-dimensional structure of a known protein having high homology with the target protein. .
  • the position corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 here is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and preferably SEQ ID NO: 1 (preferably 80% or more, more preferably 85% or more And more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more), when aligned with other FAD-GDH having an amino acid sequence, it means the same position in the alignment.
  • Amino acid sequence identity should be calculated using GENETYX-Mac (Software Development, Inc.) maximum matching and search homology programs, or DNASIS Pro (Hitachi Soft) maximum matching, multiple alignment programs, etc. Can do.
  • amino acid sequences are compared using a known algorithm such as the Lippman-Person method, and the largest conserved amino acid residue in the amino acid sequence of FAD-GDH is determined. This can be done by giving identity.
  • aligning the amino acid sequences of FAD-GDH by such a method it is possible to determine the same position in each FAD-GDH sequence regardless of insertion or deletion in the amino acid sequence.
  • the “identical positions” identified in this way are considered to be present at the same positions in the three-dimensional structure, and it can be estimated that they have a similar effect on the substrate specificity of the target FAD-GDH.
  • FAD-GDH of the present invention Various variations of the FAD-GDH of the present invention are assumed within the above-mentioned range of identity, but the enzymatic scientific properties of various FAD-GDH are the same as the FAD-GDH of the present invention described in the present specification. As long as they are all included in the FAD-GDH of the present invention.
  • FAD-GDH having such an amino acid sequence has high substrate specificity and is hardly affected by the presence of sugar compounds other than D-glucose, such as D-xylose and maltose, and is industrially useful. It is.
  • the amino acid at the position corresponding to position 78 is cysteine, asparagine, glutamic acid, or glutamine, or the amino acid at the position corresponding to position 79 is phenylalanine or asparagine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 81 is either leucine, phenylalanine or asparagine, or the amino acid at the position corresponding to position 121 is either cysteine or methionine.
  • amino acid at the position corresponding to position 122 is either threonine, alanine, or cysteine
  • the amino acid at the position corresponding to position 123 is any of cysteine, phenylalanine, histidine, valine, or serine.
  • the amino acid at the corresponding position is any one of arginine, aspartic acid and isoleucine, or the amino acid at the position corresponding to position 568 is either phenylalanine or tyrosine, or the amino acid at the position corresponding to position 612 Is cysteine or threonine, and it is not important whether it is due to an artificial substitution.
  • the desired amino residue is introduced by substitution.
  • a desired protein is obtained by known total peptide synthesis, or when a gene sequence is totally synthesized to encode a protein having a desired amino acid sequence and a desired protein is obtained based on this, or In the case where, for example, one originally found as a natural type has such a sequence, the FAD-GDH of the present invention can be obtained without going through a step of artificial substitution.
  • the FAD-GDH of the present invention is characterized by having a high substrate specificity.
  • the FAD-GDH of the present invention is directed against maltose, D-galactose, and D-xylose, similar to the Mucor genus-derived FAD-GDH described in Japanese Patent No. 4648993 previously discovered by the present inventors. It is characterized by extremely low reactivity. Specifically, when the reactivity to D-glucose is 100%, the reactivity to maltose, D-galactose and D-xylose is all 2% or less.
  • FAD-GDH used in the present invention has such a high substrate specificity, samples of patients who have been administered an infusion solution containing maltose and patients undergoing galactose tolerance test and xylose absorption test are also available. It is possible to accurately measure the amount of D-glucose without being affected by sugar compounds such as maltose, D-galactose, and D-xylose contained in the measurement sample. Furthermore, since the FAD-GDH of the present invention has a higher substrate specificity for D-glucose than the Mucor genus-derived FAD-GDH described in Japanese Patent No. 4648993, it can be further industrialized. Expected usefulness.
  • the FAD-GDH of the present invention has a very low measurement value when measurement is performed using a sugar compound such as maltose, D-galactose, D-xylose instead of D-glucose as a substrate. It is preferable that D-glucose can be accurately measured even under conditions where sugar compounds such as maltose, D-galactose, and D-xylose are contaminated. Specifically, when the reactivity with respect to D-glucose in the absence of the contaminating sugar compound is 100%, at least one selected from maltose, D-galactose, and D-xylose is selected as the contaminating sugar compound.
  • the measured value when present is 96% to 103%, and even when three kinds of maltose, D-galactose and D-xylose are present simultaneously as the contaminating sugar compound, the measured value is 96% to 104%. preferable.
  • FAD-GDH having such characteristics is used, it is possible to accurately measure the amount of D-glucose even when maltose, D-galactose or D-xylose is present in the measurement sample. is there.
  • the enzymatic chemical properties of various FAD-GDH can be examined using known methods for identifying various properties of the enzyme, for example, the methods described in the following examples.
  • Various properties of the enzyme can be examined to some extent in the culture solution of microorganisms that produce various FAD-GDH and in the middle of the purification process, and more specifically, can be examined using the purified enzyme.
  • the modified FAD-GDH of the present invention is a ratio of reactivity to D-xylose at the same molar concentration with respect to reactivity to D-glucose (Xyl / Glc (%)) under the reaction conditions based on the activity measuring method described above. ) And / or the ratio of reactivity to maltose at the same molar concentration relative to reactivity to D-glucose (Mal / Glc (%)) is preferably reduced compared to before introducing amino acid substitutions, Is reduced by 20% or more, more preferably 30% or more, further preferably 40% or more, and most preferably 50% or more.
  • FAD-GDH of the present invention only one of Xyl / Glc (%) or Mal / Glc (%) may be reduced to a preferable degree as compared with FAD-GDH before introducing an amino acid substitution. Alternatively, both of them may be reduced to a preferable degree. It is more preferable if the reactivity to both substrates is reduced.
  • FAD-GDH of the present invention is originally an enzyme with excellent substrate specificity for D-glucose, it is comparable to normal fasting blood glucose level ( ⁇ 126 mg / dL [7 mM]).
  • ⁇ 126 mg / dL [7 mM] normal fasting blood glucose level
  • it is assumed that almost no measurement value suggesting the influence of the coexistence is detected. Therefore, when measuring the reactivity to D-xylose and maltose in the FAD-GDH of the present invention, for example, under the condition where D-xylose and / or maltose coexist in an excessive concentration such as 200 mM.
  • the ratio of reactivity to D-xylose at the same molar concentration relative to the reactivity to D-glucose (Xyl / Glc (%)), and the reaction to maltose at the same molar concentration relative to the reactivity to D-glucose. Since the sex ratio (Mal / Glc (%)) varies depending on the type of transformant, its culture conditions, enzyme activity measurement conditions, etc., it is necessary to compare the respective values before and after introduction of amino acid substitution under the same conditions. There is.
  • the FAD-GDH of the present invention can also be obtained by modifying a known protein as a starting material.
  • a desired FAD-GDH by using a starting material having many similarities to the enzymatic properties desired for the FAD-GDH of the present invention.
  • the starting material as described above include known FAD-GDH.
  • known FAD-GDH-derived microorganisms include microorganisms that are classified into the subfamily Pleurotus, preferably Pleurotus, more preferably Pleuromyceae, and more preferably the family Pleurotus.
  • FAD-GDH from the genus Mucor, Absidia, and Actinomucor is suitable as an example of a starting material for obtaining the FAD-GDH of the present invention.
  • microorganisms classified into the genus Mucor and specific preferred microorganisms include Mucor ⁇ ⁇ ⁇ prainii, Mucor javanicus or Mucor ⁇ ⁇ circinelloides f. Circinelloides ), Mucor dimorphosporus. More specifically, Mucor prainii NISL0103, Mucor javanicus NISL0111 or Mucor circinelloides f. Circinelloides NISL0117 can be mentioned. Specific examples of preferable microorganisms that are classified into the genus Absidia include Absidiasicylindrospora and Absidia hyalospora.
  • Absidia cylindrospora NISL0211 and Absidia hyalospora NISL0218 can be mentioned.
  • specific microorganisms that are classified into the genus Actinomucor include Actinomucor elegans. More specifically, Actinomucor elegans NISL9082 can be mentioned.
  • the above-mentioned strains are storage strains of NISL (Noda Institute of Scientific and Industrial Research) and can be sold through a predetermined procedure.
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention (hereinafter referred to as FAD-GDH gene).
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention (hereinafter referred to as FAD-GDH gene)
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention (hereinafter referred to as FAD-GDH gene)
  • FAD-GDH gene a generally used gene cloning method may be used.
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention
  • FAD-GDH gene a generally used gene cloning method
  • chromosomal DNA or mRNA can be extracted by the method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989).
  • cDNA can be synthesized using mRNA as a template.
  • a chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • a suitable probe DNA is synthesized and used to select a FAD-GDH gene with high substrate specificity from a chromosomal DNA or cDNA library, or Based on the above amino acid sequence, an appropriate primer DNA is prepared, and FAD-GDH having a high substrate specificity is encoded by an appropriate polymerase chain reaction (PCR method) such as 5′RACE method or 3′RACE method. It is also possible to amplify a DNA containing the gene fragment and to link these DNA fragments to obtain a DNA containing the full length of the target FAD-GDH gene.
  • PCR method polymerase chain reaction
  • FAD-GDH As a method for obtaining FAD-GDH having high substrate specificity according to the present invention using known FAD-GDH as a starting material, mutations are introduced into the gene encoding FAD-GDH, which is the starting material, and expressed from various mutant genes. It is possible to adopt a method of performing selection based on the enzymatic scientific properties of FAD-GDH. Mutation treatment of the starting FAD-GDH gene can be performed by any known method depending on the intended mutant form. That is, a method in which a FAD-GDH gene or a recombinant DNA in which the gene is incorporated is brought into contact with and acting on a mutagen; an ultraviolet irradiation method; a genetic engineering method; or a method using a protein engineering method, etc. Can be widely used.
  • Examples of the mutagen used in the mutation treatment include hydroxylamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfite, hydrazine, formic acid, and 5-bromouracil. be able to.
  • the various conditions for contact and action are not particularly limited as long as conditions according to the type of drug to be used and the like can actually induce a desired mutation in the Mucor genus-derived FAD-GDH gene.
  • a desired mutation can be induced by contact and action at a reaction temperature of 20 to 80 ° C. for 10 minutes or more, preferably 10 to 180 minutes, preferably at a drug concentration of 0.5 to 12M. Even in the case of performing ultraviolet irradiation, it can be carried out according to a conventional method as described above (Hyundai Kagaku, p24-30, June 1989 issue).
  • a method generally known as Site-Specific Mutagenesis can be used.
  • Kramer method Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene, 37, 73 (1985)
  • Eckstein method Nucleic Acids Res., 13, 8749 ( (1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986)
  • Kunkel method Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 82, 488 (1985).
  • a technique known as a general polymerase chain reaction can be used (Technique, 1, 11 (1989)).
  • a desired modified FAD-GDH gene with high substrate specificity can also be directly synthesized by an organic synthesis method or an enzyme synthesis method.
  • a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter, Inc.
  • CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter, Inc.
  • the FAD-GDH gene of the present invention obtained as described above is incorporated into a vector such as a bacteriophage, a cosmid, or a plasmid used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells by a conventional method, and is compatible with each vector.
  • the host cell to be transformed can be transformed or transduced by conventional methods.
  • a eukaryotic host cell is yeast.
  • microorganisms classified as yeast include yeasts belonging to the genus Zygosaccharomyces, the saccharomyces genus, the Pichia genus, and the Candida genus.
  • the inserted gene may include a marker gene to enable selection of transformed cells.
  • the marker gene include genes that complement the auxotrophy of the host, such as URA3 and TRP1.
  • the inserted gene preferably contains a promoter or other control sequence (for example, enhancer sequence, terminator sequence, polyadenylation sequence, etc.) capable of expressing the gene of the present invention in the host cell.
  • Specific examples of the promoter include GAL1 promoter and ADH1 promoter.
  • known methods for example, a method using lithium acetate (Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269 (1995)) and electroporation (J Microbiol Methods 55 (2003) 481). -484) and the like can be preferably used, but the present invention is not limited to this, and transformation may be performed using various arbitrary methods including a spheroplast method and a glass bead method.
  • eukaryotic host cells include mold cells such as the genus Aspergillus and the genus Trichoderma.
  • the inserted gene contains a promoter capable of expressing the gene of the present invention in the host cell (eg, tef1 promoter) and other regulatory sequences (eg, secretory signal sequence, enhancer sequence, terminator sequence, polyadenylation sequence, etc.). Is desirable.
  • the inserted gene may contain a marker gene for enabling selection of transformed cells, for example, niaD, pyrG.
  • the inserted gene may contain a homologous recombination region for insertion into an arbitrary chromosomal site.
  • a known method for example, a method using polyethylene glycol and calcium chloride after protoplast formation (Mol. Gen. Genet., 218, 99-104 (1989)) is preferably used. Can do.
  • prokaryotic host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli K-12, Escherichia coli BL21 (DE3), Escherichia coli JM109, Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, etc. Both are manufactured by Takara Bio Inc.). They are transformed or transduced to obtain host cells into which DNA has been introduced (transformants).
  • a method for transferring the recombinant vector into such a host cell for example, when the host cell is a microorganism belonging to Escherichia coli, a method of transferring the recombinant DNA in the presence of calcium ions can be employed.
  • An electroporation method may be used.
  • commercially available competent cells for example, ECOS Competent Escherichia Collie BL21 (DE3); manufactured by Nippon Gene
  • the FAD-GDH of the present invention is obtained by culturing a host cell that produces the FAD-GDH of the present invention obtained as described above, expressing a flavin-binding glucose dehydrogenase gene contained in the host cell, and then The flavin-binding glucose dehydrogenase may be isolated from the product.
  • a YPD bactopeptone 2%, bactoextract 1%, glucose 2%) liquid medium widely used in the culture of Saccharomyces cerevisiae is preferably used.
  • the carbon source used in the medium may be any assimilable carbon compound, and examples thereof include glucose, starch hydrolysate, glycerin, fructose, and molasses.
  • the nitrogen source may be any available nitrogen compound, and examples thereof include yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, soy flour, malt extract, amino acid, ammonium sulfate, and ammonium nitrate.
  • various salts such as salt, potassium chloride, magnesium sulfate, manganese chloride, ferrous sulfate, 1st potassium phosphate, 2nd potassium phosphate, sodium carbonate, calcium chloride, are mentioned, for example.
  • vitamins and antifoaming agents may be added as necessary.
  • Examples of the medium for culturing the prokaryotic host cell include one or more nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean or wheat bran leachate, sodium chloride, phosphate first Add one or more inorganic salts such as potassium, dibasic potassium phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate, and add sugar raw materials, vitamins, etc. as necessary. Used.
  • nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean or wheat bran leachate, sodium chloride
  • phosphate first Add one or more inorganic salts such as potassium, dibasic potassium phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate, and add sugar raw materials, vitamins, etc. as necessary. Used.
  • the culture conditions may vary depending on the microorganism to be cultured.
  • the initial pH of the medium is adjusted to pH 5-10
  • the culture temperature is 20-40 ° C.
  • the culture time is 15-25 hours, and 1-2. It can be set appropriately for days, 3 to 7 days, etc., and is carried out by aeration / agitation deep culture, shaking culture, static culture or the like.
  • a culture medium and culture conditions for culturing yeast belonging to the genus Tigosaccharomyces a medium of bactopeptone 2%, bacto yeast extract 1%, glucose 2% was used at 30 ° C. and 200 rpm for 24 hours. Shake is mentioned.
  • Escherichia coli is cultured at a culture temperature of 10 to 42 ° C., preferably at a culture temperature of around 25 ° C. for 4 to 24 hours, more preferably at a culture temperature of around 25 ° C. for 4 to 8 hours, What is necessary is just to implement by shaking culture, stationary culture, etc.
  • a normal enzyme collecting means can be used.
  • the enzyme is present in the microbial cell, it is preferable to separate the microbial cell from the culture by, for example, filtration, centrifugation, or the like, and collect the enzyme from the microbial cell.
  • a method of destroying bacterial cells using normal disruption means such as an ultrasonic crusher, French press, dynomill, a method of lysing bacterial cell walls using a cell wall lytic enzyme such as lysozyme, Triton X-100, etc.
  • the method of extracting an enzyme from a microbial cell using these surfactants can be used alone or in combination.
  • the cells When the enzyme is present outside the cells, for example, the cells may be separated by an operation such as filtration or centrifugation, and the supernatant may be collected. Next, the insoluble matter is removed by filtration or centrifugation to obtain an enzyme extract.
  • an enzyme extract In order to isolate and purify flavin-binding GDH from the resulting extract as necessary, after removing nucleic acid as necessary, ammonium sulfate, alcohol, acetone, etc. are added to the fraction, and then precipitated. The product can be collected to obtain the FAD-GDH crude enzyme of the present invention.
  • the crude FAD-GDH enzyme of the present invention can be further purified using any known means.
  • a purified enzyme preparation for example, a gel filtration method using Sephadex, Ultrogel or biogel; an adsorption elution method using an ion exchanger; an electrophoresis method using a polyacrylamide gel; an adsorption using hydroxyapatite Elution method; Sedimentation method such as sucrose density gradient centrifugation; Affinity chromatography method; Fractionation method using molecular sieve membrane, hollow fiber membrane, etc.
  • the FAD-GDH enzyme preparation of the present invention can be obtained.
  • the present invention also discloses a glucose assay kit containing the FAD-GDH of the present invention.
  • the FAD-GDH of the present invention can be used to detect D-glucose (blood glucose in blood). Value) can be measured.
  • the glucose assay kit of the present invention comprises the modified FAD-GDH according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay.
  • the glucose assay kit of the present invention comprises, in addition to the modified FAD-GDH of the present invention, buffers necessary for the assay, mediators, D-glucose standard solutions for creating a calibration curve, and use of Includes guidelines.
  • the modified FAD-GDH according to the present invention can be provided in various forms, for example as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution.
  • the D-glucose concentration can be measured, for example, as follows.
  • the reaction layer of the glucose assay kit includes FAD-GDH, an electron acceptor, and N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis) as a reaction accelerator.
  • ADA N- (2-acetamido) imidodiacetic acid
  • -Tris a liquid or solid composition containing one or more substances selected from the group consisting of sodium carbonate and imidazole is retained.
  • a pH buffer and a coloring reagent are added as necessary.
  • a sample containing D-glucose is added thereto and allowed to react for a certain time.
  • the absorbance corresponding to the maximum absorption wavelength of the dye that is polymerized and formed by receiving electrons from the electron acceptor or the electron acceptor that fades upon reduction is monitored.
  • the standard concentration of D-glucose solution is used in advance from the rate of change of absorbance per time, and in the case of the endpoint method, from the change in absorbance up to the point when all D-glucose in the sample is oxidized.
  • the D-glucose concentration in the sample can be calculated based on the calibration curve prepared in the above.
  • a mediator and coloring reagent for example, 2,6-dichloroindophenol (DCIP) is added as an electron acceptor, and D-glucose can be quantified by monitoring the decrease in absorbance at 600 nm. . Further, phenazine methosulfate (PMS) is added as an electron acceptor, and nitrotetrazolium blue (NTB) is further added as a coloring reagent, and the amount of diformazan produced is determined by measuring absorbance at 570 nm, and the D-glucose concentration is calculated. It is possible. Needless to say, the electron acceptor and the coloring reagent used are not limited to these.
  • the present invention also discloses a glucose sensor using the FAD-GDH of the present invention.
  • the electrode a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on this electrode. Immobilization methods include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, etc., or ferrocene or a derivative thereof.
  • the modified FAD-GDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
  • the measurement of D-glucose concentration can be performed as follows. Put buffer in constant temperature cell and maintain at constant temperature. As the mediator, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, or the like can be used. As the working electrode, an electrode on which the modified FAD-GDH of the present invention is immobilized is used, and a counter electrode (for example, platinum electrode) and a reference electrode (for example, Ag / AgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing D-glucose is added and the increase in current is measured. The D-glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration D-glucose solution.
  • 1.5 U FAD-GDH of the present invention is immobilized on a glassy carbon (GC) electrode, and the response current value with respect to the D-glucose concentration is measured.
  • a glassy carbon (GC) electrode In the electrolytic cell, 1.8 ml of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) and 0.2 ml of 1M potassium hexacyanoferrate (III) aqueous solution (potassium ferricyanide) are added.
  • the GC electrode is connected to a potentiostat BAS100B / W (manufactured by BAS), the solution is stirred at 37 ° C., and +500 mV is applied to the silver-silver chloride reference electrode.
  • a 1M DD-glucose solution is added to these systems to a final concentration of 5, 10, 20, 30, 40, and 50 mM, and a steady-state current value is measured for each addition. This current value is plotted against a known D-glucose concentration (5, 10, 20, 30, 40, 50 mM) to create a calibration curve.
  • D-glucose can be quantified with an enzyme-immobilized electrode using the FAD-linked glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the FAD-GDH of the present invention is excellent in substrate specificity even when compared with the conventional Mucor genus FAD-GDH, and thus has excellent effects particularly when applied to the glucose sensor as described above. It is expected to play.
  • the enzyme reaction is performed under special conditions where a larger amount of enzyme is loaded than when applied to a liquid reagent kit. This is because the necessity for reducing the influence is particularly high.
  • the PCR reaction solution was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, and about 2 kb “DNA fragment for insert” was purified using RECOCHIP (manufactured by TakaRa).
  • RECOCHIP Saccharomyces cerevisiae expression plasmid pYES2 / CT (manufactured by Invitrogen) was treated with restriction enzyme KpnI (manufactured by New England Biolabs), and the reaction solution after restriction enzyme treatment was electrophoresed on 1.0% agarose gel, About 6 kb “DNA fragment for vector” was purified using RECOCHIP (manufactured by TakaRa).
  • the purified “DNA fragment for insert” and “DNA fragment for vector” are ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) according to the attached protocol.
  • the recombinant plasmid pYE2C-Mp was prepared.
  • the GAL1 promoter is a D-galactose-inducible promoter, and gene expression downstream of the promoter is induced by culturing in a medium containing D-galactose and not containing D-glucose.
  • This culture broth was separated into cells and culture supernatant by centrifugation (10,000 ⁇ g, 4 ° C., 3 minutes), and GDH activity was measured by the above-mentioned enzyme activity measurement method.
  • the GDH activity was 13.1 U / mL.
  • this activity measurement method was used to measure the activity in a system in which the substrate was replaced with D-glucose and maltose or D-xylose at the same molar concentration, the respective activity values were 0.114 U / mL and 0.215 U. / ML.
  • the Mucor genus-derived FAD-GDH expressed in the Sc-Mp strain “reactivity to maltose relative to the reactivity to D-glucose (Mal / Glc (%))” and “response to D-glucose”
  • the ratio of reactivity to D-xylose to sex (Xyl / Glc (%)) "was found to be 0.87% and 1.64%, respectively.
  • (Mal / Glc (%)) and (Xyl / Glc (%)) of Mucor genus FAD-GDH expressed in the Sc-Mp strain represent FAD-GDH produced in the original genus Mucor genus.
  • the Mucor genus-derived FAD-GDH expressed in the Sc-Mp strain already has a sufficiently excellent substrate specificity for D-glucose as compared with various known FAD-GDH.
  • the enzyme was found to be a preferred starting material in an effort to further improve substrate specificity through modification.
  • glucose oxidase (PDB ID: 1 GPE) derived from Penicilliumamagasakiense (P.IDamagasakiense), but the identity is as low as 32% It was a numerical value.
  • the amino acid sequence of the glucose oxidase of P. amagasakiense is shown in SEQ ID NO: 5. It is unusual for one skilled in the art to predict that between proteins that are as low as this degree, they will have similar functions. Furthermore, for those skilled in the art, a comparison between amino acid sequences that are known to have low identity as described above indicates that the amino acid at the same position in the other sequence corresponding to the position of the amino acid in one sequence has the same functional effect. It is not normal to expect to be able to perform. As described above, it is difficult to say that known proteins that actually hit with this degree of identity are the same enzymes.
  • the active center of oxidoreductase using flavin as a coenzyme is located around the re-plane of the isoalloxazine ring. Therefore, on the three-dimensional structure analysis software PyMOL 0.99rc6 available on the website, the three-dimensional structure of glucose oxidase derived from P. amagasakiense is displayed, and the amino acids located so as to surround the re-plane of the FAD isoalloxazine ring, It was assumed to be an amino acid located in the vicinity of the substrate binding site of glucose oxidase derived from P. asakiamagasakiense.
  • amagasakiense are the 79-position tyrosine of SEQ ID NO: 1 in the Mucor genus FAD-GDH It was predicted to correspond to glycine at position 120, arginine at position 666, and histidine at position 613, and these amino acids were predicted to be located in the vicinity of the substrate binding site in Mucor-derived FAD-GDH.
  • the inventors have developed a basic policy for creating the FAD-GDH of the present invention based on the above-described examination.
  • the low identity between the Mucor genus FAD-GDH and the P. amagasakiense glucose oxidase and the substrate binding site in the P. amagasakiense glucose oxidase were only determined based on indirect assumptions. Considering this fact, it cannot be said that there is a high probability that the actual three-dimensional structure of the enzyme will give the result as predicted above. Even if the amino acids at several positions in the FAD-GDH derived from the genus Mucor are actually the same residues at the corresponding positions, this is because of the three-dimensional characteristics of glucose oxidase derived from P.
  • amagasakiense It is common knowledge of those skilled in the art that it is not necessarily related to the effect. Therefore, the knowledge of the present invention has exceeded the normal recognition and prediction of those skilled in the art, and even when a search is actually conducted according to this policy, it is quite necessary to obtain the knowledge of the present invention. It required a lot of trial and error.
  • the PCR reaction was performed using the synthetic nucleotides of SEQ ID NOS: 6 and 7, KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) under the following conditions.
  • a part of the reaction solution was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, and it was confirmed that about 8 kbp of DNA was specifically amplified.
  • the DNA thus obtained was treated with the restriction enzyme DpnI (manufactured by New England Biolabs), and the remaining template DNA was cleaved, and then ligated to a vector to transform E. coli JM109 strain (manufactured by Nippon Gene). It applied to LB-amp agar medium. The grown colonies were inoculated into an LB-amp liquid medium and cultured with shaking. Plasmid DNA was isolated using GenElute Plasmid Miniprep Kit (manufactured by Sigma) according to the attached protocol.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding FAD-GDH in the plasmid was determined using a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 (manufactured by Beckman Coulter), and the tyrosine at position 79 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 was changed to alanine.
  • a recombinant plasmid (pYE2C-Mp-Y79A) encoding a substituted modified Mucor genus FAD-GDH was obtained.
  • a PCR reaction is performed using each of the synthetic nucleotide combinations of SEQ ID NOs shown in Table 1, E. coli JM109 strain is transformed with the vector containing the amplified DNA, and the grown colonies are retained.
  • 79th tyrosine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is alanine
  • 79th tyrosine is valine
  • 79th position Tyrosine is proline
  • 79th tyrosine is cysteine
  • 79th tyrosine is asparagine
  • 79th tyrosine is glutamine
  • 79th tyrosine is serine
  • 79th tyrosine is threonine
  • tyrosine at position 79 is phenylalanine
  • tyrosine at position 79 is tri Tophan
  • the glycine at position 120 is methionine
  • the arginine at position 666 is histidine
  • the arginine at position 566 is methionine
  • the arginine at position 566 is tyrosine
  • the arginine at position 566 is glutamine
  • the arginine at position 566 is glutamate.
  • PYE2C- a recombinant plasmid in which the arginine at position 613 is replaced by lysine, the histidine at position 613 is replaced by lysine, the histidine at position 613 is replaced by arginine, the histidine at position 613 is replaced by asparagine, and the histidine at position 613 is replaced by aspartic acid.
  • modified FAD-GDH into which a target site-specific mutation was introduced using recombinant plasmid pYE2C-Mp as a template in accordance with Example 2.
  • a recombinant plasmid encoding was generated.
  • Table 2 shows representative examples of the prepared variants. Specifically, these variants have the glycine at position 77 of SEQ ID NO: 1 as alanine, the methionine at position 78 as cysteine, the methionine at position 78 as aspartic acid, and the methionine at position 78 as asparagine.
  • Methionine is glutamic acid
  • methionine at position 78 is glutamine
  • glutamine at position 81 is leucine
  • glutamine at position 81 is phenylalanine
  • glutamine at position 81 is asparagine
  • leucine at position 121 is cysteine
  • leucine at position 121 is cysteine
  • leucine at position 121 Is methionine
  • valine 122 is threonine
  • valine 122 is isoleucine
  • valine 122 is alanine
  • valine 122 is methionine
  • valine 122 is cysteine
  • tryptophan 123 is cysteine
  • tryptophan at position 123 is phenylalani
  • tryptophan at position 123 is histidine
  • tryptophan at position 123 is valine
  • tryptophan at position 123 is serine
  • aspartic acid at position 568 is glutamic acid
  • tryptophan at position 568 is
  • the recombinant plasmids were pYE2C-Mp-G77A, pYE2C-Mp-M78C, pYE2C-Mp-M78D, pYE2C-Mp-M78N, pYE2C-Mp-M78E, pYE2C-Mp-M78Q, pYE2C-Mp-Q81Lp p-Q81F, pYE2C-Mp-Q81N, pYE2C-Mp-L121C, pYE2C-Mp-L121M, pYE2C-Mp-V122T, pYE2C-Mp-V122I, pYE2C-Mp-V122A, pYE2C-Mp-V122M, pYE2C-Mp-V122M V122C, pYE2C-Mp-W123C, pYE2C-M
  • the methionine at position 78 of SEQ ID NO: 1 is glutamic acid
  • the methionine at position 78 is glutamine
  • the glutamine at position 81 is leucine
  • the glutamine at position 81 is phenylalanine
  • the glutamine at position 81 is asparagine
  • position 121 Leucine in methionine, valine at position 122 as threonine, valine at position 122 as isoleucine, valine at position 122 as alanine, valine at position 122 as cysteine, tryptophan at position 123 as cysteine, tryptophan at position 123
  • tryptophan at position 123 To the phenylalanine, tryptophan at position 123 to histidine, tryptophan at position 123 to valine, tryptophan at position 123 to serine, tryptophan at position 569 to phenylalanine, tryptophan at position 569 to tyrosine, serine at position 6
  • methionine at position 78 of SEQ ID NO: 1 is glutamic acid
  • methionine at position 78 is glutamine
  • glutamine at position 81 is leucine
  • glutamine at position 81 is phenylalanine
  • glutamine at position 81 is asparagine
  • leucine at position 121 is leucine at position 121.
  • tryptophan at position 123 is valine
  • tryptophan at position 123 is serine
  • tryptophan at position 569 is phenylalanine
  • tryptophan at position 569 is tyrosine
  • serine at position 612 is cysteine
  • serine at position 612 is threonine.
  • methionine at position 78 in Sequence Listing No. 1 is cysteine, methionine at position 78 is aspartic acid, methionine at position 78 is asparagine, methionine at position 78 is glutamic acid, methionine at position 78 is glutamine, position 81 Glutamine is leucine, glutamine at position 81 is asparagine, leucine at position 121 is cysteine, leucine at position 121 is methionine, tryptophan at position 123 is cysteine, tryptophan at position 123 is phenylalanine, and tryptophan at position 123 Histidine, 123 tryptophan as valine, 123 tryptophan as serine, 569 tryptophan as phenylalanine, 569 tryptophan as tyrosine, 612 serine as cysteine and 612 serine By substituting threonine, Xyl / Glc (%) and Xyl / /
  • methionine at position 78 in Sequence Listing No. 1 is cysteine
  • methionine at position 78 is asparagine
  • methionine at position 78 is glutamic acid
  • methionine at position 78 is glutamine
  • glutamine at position 81 is asparagine
  • position 121 is asparagine
  • methionine at position 78 is glutamic acid
  • methionine at position 78 is glutamine
  • glutamine at position 81 is asparagine
  • leucine at position 121 is methionine
  • tryptophan at position 123 is cysteine
  • tryptophan at position 123 is phenylalanine
  • Tryptophan at position 123 is histidine
  • tryptophan at position 123 is valine
  • tryptophan at position 123 is serine
  • tryptophan at position 569 is phenylalanine
  • tryptophan at position 569 is tyrosine
  • serine at position 612 is cysteine
  • position 612 In the modified FAD-GDH in which serine is replaced with threonine, the Mal / Glc ratio (%) and the Xyl / Glc ratio (%) are both 20% or more, more prominently 40% or more, 50% or more, Very noticeable too In 60% reduction or more, it was found to have an extremely high substrate
  • tryptophan at position 569 of SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine
  • methionine at position 78 of SEQ ID NO: 1 is replaced with cysteine
  • methionine at position 78 is replaced with asparagine
  • methionine at position 78 Is glutamic acid
  • methionine at position 78 is glutamine
  • tyrosine at position 79 is phenylalanine
  • tyrosine at position 79 is asparagine
  • glutamine at position 81 is asparagine
  • leucine at position 121 is methionine
  • valine at position 122 is cysteine.
  • a mutant in which tryptophan at position 123 is substituted with phenylalanine, tryptophan at position 123 with valine, serine at position 612 with cysteine, and serine at position 612 with threonine and includes a gene encoding each of them.
  • the recombinant plasmid was designated as pYE2C-MpY-M.
  • a mutant in which the target site-specific mutation was introduced multiple times was obtained by the combination of synthetic nucleotides shown in Table 3 using the recombinant plasmid pYE2C-MpY-S612C as a template.
  • Table 3 shows representative examples of the prepared modified products. Specifically, in these variants, tryptophan at position 569 in SEQ ID NO: 1 is replaced with tyrosine, serine at position 612 in SEQ ID NO: 1 is replaced with cysteine, and methionine at position 78 is replaced with asparagine.
  • a recombinant plasmid containing the genes encoding each was designated pYE2C-MpYC-M78N.
  • a mutant in which the target site-specific mutation was introduced in a multiple manner was obtained by the combination of synthetic nucleotides shown in Table 3 using the recombinant plasmid pYE2C-Mp-W123F as a template.
  • Table 3 shows representative examples of the prepared modified products. Specifically, these variants are mutants in which tryptophan at position 123 in SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine, leucine at position 121 in SEQ ID NO: 1 is replaced with methionine, and serine at position 612 is replaced with threonine.
  • the recombinant plasmids containing the genes encoding them were designated as pYE2C-MpF-L121M and pYE2C-MpF-S612T.
  • a mutant in which the target site-specific mutation was introduced multiple times was obtained by the combination of synthetic nucleotides shown in Table 3 using the recombinant plasmid pYE2C-Mp-W123V as a template.
  • Table 3 shows representative examples of the prepared modified products. Specifically, these variants are variants in which tryptophan at position 123 of SEQ ID NO: 1 is substituted with valine, leucine at position 121 of SEQ ID NO: 1 is replaced with methionine, and serine at position 612 is replaced with threonine.
  • These recombinant plasmids containing the genes encoding them were designated as pYE2C-MpV-L121M and pYE2C-MpV-S612T.
  • the tryptophan at position 569 of SEQ ID NO: 1 was compared with the double mutant in which tryptophan at position 569 in SEQ ID NO: 1 was replaced with tyrosine and serine at position 612 was replaced with cysteine. Is substituted with tyrosine, serine at position 612 is replaced with cysteine, and methionine at position 79 is further replaced with asparagine. Mal / Glc (%), Mal / Glc ratio (%), Xyl / Glc Both (%) and Xyl / Glc ratio (%) were found to be more reduced. In this multiple mutant, the effect of each mutation point is added, and it can be said that superior substrate specificity is exhibited.
  • Example 5 Evaluation of substrate specificity of various modified FAD-GDH derived from the genus Mucor by enzyme electrode measurement
  • the obtained recombinant plasmids pYE2C-Mp-W569Y, pYE2C-MpY-V122C, pYE2C-MpY-W123V, pYE2C-MpY-S612C, pYE2C -MpYC-M78N was used to transform each Inv-Sc strain, and each transformant was transformed into a pre-culture liquid medium [0.67% (w / v) amino acid-free yeast nitrogen base (BD), 0 192% (w / v) uracil-free yeast synthesis dropout medium additive (manufactured by Sigma), 2.0% (w / v) raffinose] was cultured at 30 ° C.
  • BD amino acid-free yeast nitrogen base
  • the total amount of the preculture solution was 1 L of a liquid medium for main culture [0.67% (w / v) amino acid-free yeast nitrogen base, 0.192% (w / v) uracil-free yeast synthesis dropout medium] Additives, 2.5% (w / v) D-galactose, 0.75% (w / v) raffinose] and incubated at 30 ° C. for 16 hours.
  • the culture solution was separated into cells and culture supernatant by centrifugation (12,000 ⁇ g, 4 ° C., 30 minutes), and the culture supernatant was collected. Thereafter, the collected culture supernatant is subjected to an ultrafiltration treatment with an ultrafiltration membrane AIP-1013 (manufactured by Asahi Kasei Chemicals). Subsequently, the activity of the enzyme solution is 1000 U / M using AMICON Ultra-15 10K (manufactured by MILLIPORE). It concentrated until it became more than mL.
  • a solution obtained by dissolving 2 ⁇ L of a phosphate buffer solution (pH 6.0) having a final concentration of about 100 mM and various crude enzyme concentrates of 1000 U / mL in 2 ⁇ L is placed on the enzyme electrode by allowing to stand at 35 ° C. for 20 minutes.
  • any Mucor genus modified FAD-GDH there is a good correlation between the D-glucose concentration and the current response value. From this, any Mucor derived modified FAD- It was found that GDH is also excellent in the quantitativeness of D-glucose. However, Xyl / Glc (%) of the modified FAD-GDH having the single mutation of only W569Y is 4%, whereas Xyl / Glc (%) of the modified FAD-GDH having the mutation of W569Y / V122C is 4%. Was 19%, and the reactivity to maltose was hardly shown, but the reactivity to D-xylose was found to be remarkable.
  • Example 2 (Prediction of amino acids located near the substrate binding site in Mucor genus FAD-GDH and production of improved Mucor genus FAD-GDH by mutagenesis, and verification of substrate specificity improvement effect 2)
  • the three-dimensional structure of glucose oxidase derived from P. amagasakiense was displayed, and aspartic acid at position 428 was further predicted as a candidate for an amino acid positioned so as to surround the re-plane of the isoalloxazine ring of FAD. From FIG. 1, it is predicted that the aspartic acid at position 428 of the glucose oxidase derived from P.
  • amagasakiense corresponds to the aspartic acid at position 471 of SEQ ID NO: 1 in the Mucor genus FAD-GDH, and this amino acid is derived from the genus Mucor. It was predicted to be located in the vicinity of the substrate binding site in FAD-GDH. Therefore, it was decided to introduce site-specific mutations into SEQ ID NO: 1 for the aspartic acid at position 471 and its surrounding amino acids to be substituted with various amino acids.
  • the modification in which the target site-specific mutation was introduced using the recombinant plasmid pYE2C-Mp as a template according to Example 2 A recombinant plasmid encoding type FAD-GDH was generated.
  • Table 5 shows representative examples of the prepared variants. Specifically, these modified forms were prepared in the following manner. Specifically, glutamic acid at position 465 of SEQ ID NO: 1 was aspartic acid, glutamic acid at position 465 was glycine, glutamic acid at position 465 was isoleucine, and glutamic acid at position 465 was arginine.
  • Glutamic acid in position 465 glutamic acid in position 465 at serine, glutamic acid at position 465, threonine at position 465, glutamic acid at position 465, tryptophan at position 465, and asparagine at position 469 at aspartic acid.
  • Asparagine is glutamine
  • aspartic acid at position 469 is glutamic acid
  • aspartic acid at position 471 is asparagine
  • aspartic acid at position 471 is glutamic acid
  • aspartic acid at position 471 is glutamine
  • glutamine at position 473 is glutamic acid.
  • Glutamine at position 3 is asparagine
  • Glutamine at position 473 is aspartic acid
  • Asparagine at position 474 is aspartic acid
  • Asparagine at position 474 is glutamine
  • Asparagine at position 474 is glutamic acid
  • Asparagine at position 475 is aspartic acid
  • a mutant plasmid in which the asparagine at position 475 is replaced with glutamine and the asparagine at position 475 is substituted with glutamic acid, and recombinant plasmids containing the genes encoding each of them are pYE2C-Mp-E465D, pYE2C-Mp-E465G, and pYE2C.
  • Example 2 the (Xyl / Glc) ratio (%) was measured. The results are shown in Table 5. A mutant with a measured value of “ ⁇ ” indicates that the GDH activity is significantly reduced or the GDH activity is lost.
  • the Mal / Glc ratio (%) was 79% and 72%, respectively, and Mal / Glc Both the ratio (%) and the Xyl / Glc ratio (%) were reduced by 20% or more, indicating that they have extremely high substrate specificity.
  • the recombinant plasmid pYE2C-Mp was used as a template according to Example 2.
  • Plasmid YE2C-Mp-V232E / T387A / I545T was constructed.
  • the valine at position 232 of SEQ ID NO: 1 is converted to glutamic acid
  • V232E / T387A / I545T / W569Y, V232E / T387A / I545T / S612C, V232E / T387A / I545T / S612T, V232E / T387A / E465D / I545T / W569Y are excellent in heat resistance and substrate specificity. I understood.
  • V232E / T387A / I545T / W569Y and V232E / T387A / E465D / I545T / W569Y have 20% or more reduced reactivity to maltose and xylose compared to V232E / T387A / I545T. Since the heat resistance was also improved, it was found to be a very excellent mutant.
  • the FAD-GDH of the present invention has a sufficiently high substrate specificity to D-glucose and a sufficient reactivity to sugar compounds other than D-glucose, such as D-xylose and maltose. Since it is low, the D-glucose concentration can be accurately measured even when measuring D-glucose in a sample under a condition that contains a large amount of sugar compounds other than D-glucose, or under conditions where the enzyme concentration is high, For example, in application to a glucose sensor or the like, it is expected that measurement with higher accuracy and sensitivity can be performed compared to the case of using a conventional FAD-GDH.

Abstract

　本発明は、Ｄ－グルコースに対する基質特異性が高く、Ｄ－キシロースおよび／またはマルトースへの反応性が低減したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼに関する。より具体的には、Ｍｕｃｏｒ属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの７８位、７９位、８１位、１２１位、１２２位、１２３位、５６９位および６１２位に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを提供する。　本発明は、グルコースセンサー等の、多量の酵素を搭載した条件下で使用する場合においても、Ｄ－キシロースおよび／またはマルトースが共存したときの影響を受けにくく、Ｄ－グルコース量を正確に測定することができる。

Description

基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
　本発明は、基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、その遺伝子および組換え体ＤＮＡ、並びに基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造法に関する。
　血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病患者が自己の血糖値を管理するための装置としては、電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定（Ｓｅｌｆ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＭＢＧ）機器が広く利用されている。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のＤ－グルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。
　一方、Ｄ－グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ）が知られている。具体的には、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするタイプのＧＤＨ（ＮＡＤ（Ｐ）－ＧＤＨ）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ－ＧＤＨ）が見出されており、ＳＭＢＧ機器のバイオセンサに使用されている。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）－ＧＤＨは、酵素の安定性が乏しく、かつ、補酵素の添加が必要という問題を有し、また、ＰＱＱ－ＧＤＨは基質特異性が低く、測定対象であるＤ－グルコース以外にも、マルトース、Ｄ－ガラクトースおよびＤ－キシロースなどの糖化合物に対して作用してしまうため、測定サンプル中のＤ－グルコース以外の糖化合物が測定値に影響し、正確な測定値が得られないという問題点が存在する。
　近年、ＰＱＱ－ＧＤＨをバイオセンサとして用いたＳＭＢＧ機器を用いて、輸液投与を受けていた糖尿病患者の血糖値を測定する際に、ＰＱＱ－ＧＤＨが輸液中に含まれるマルトースにも作用して、実際の血糖値よりも高い測定値が得られ、この値に基づく処置が原因となって患者が低血糖等を発症した例が報告されている。また、同様の事象はガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者にも起こり得ることも判明している（例えば、非特許文献１参照）。これを受け、厚生労働省医薬食品局は、Ｄ－グルコース溶液に各糖類を添加した場合における血糖測定値への影響を調査する目的で交差反応性試験を行ったところ、６００ｍｇ／ｄＬのマルトース、３００ｍｇ／ｄＬのＤ－ガラクトース、あるいは、２００ｍｇ／ｄＬのＤ－キシロース添加を行った場合には、ＰＱＱ－ＧＤＨ法を用いた血糖測定キットの測定値は、実際のＤ－グルコース濃度より２．５～３倍ほど高い値を示すことがわかった。すなわち、測定試料中に存在し得るマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースにより測定値が不正確になることが判明し、このような測定誤差の原因となる糖化合物の影響を受けず、Ｄ－グルコースを特異的に測定可能な基質特異性の高いＧＤＨの開発が切に望まれている。
　上記のような背景の下、上記以外の補酵素を利用するタイプのＧＤＨが着目されるようになってきている。例えば、非特許文献２～５にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来のＧＤＨについての報告があり、例えば、特許文献１～３にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤ－ＧＤＨ）が開示されている。
　しかし、上記の酵素は、Ｄ－グルコースではない１種または数種の糖化合物に対して反応性が低いという特性を示すものの、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという特性を有してはいない。これらに対して、出願人は、ケカビの一種であるムコール（Ｍｕｃｏｒ）属から見出されたＦＡＤ－ＧＤＨが、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという優れた特性を有することを見出している（例えば、特許文献４参照）。また、このＧＤＨを用いれば、一定濃度範囲のマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースが存在する条件下においても、それらの糖化合物による影響を受けることなくＤ－グルコース濃度を正確に測定することが可能であることを確認している（例えば、特許文献４参照）。このような優れた基質特異性は、Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの実用上の優位性を示す大きな特徴である。
　一方で、自己血糖測定における利便性をより向上させるために、測定感度のさらなる向上による測定時間短縮化や、測定系のさらなる小スケール化、必要とされる測定サンプルの少量化等が継続的に追求されている。例えば、測定感度を向上させるための一手段としては、グルコースセンサー上に搭載するグルコース測定酵素の量を増加させることも想定される。しかしながら、このような使用法において予測される、多量の酵素が存在する条件下では、前述のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨを用いた場合においても、一定濃度以上で存在するマルトースやＤ－キシロースへの反応性が若干ながら確認され、Ｄ－グルコース以外の糖化合物に対する反応性を低下させる取り組みにおいては、依然として改善の余地が存在する。
　ＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性を向上させることを目的として、既存のＦＡＤ－ＧＤＨを改変する試みとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨに対してアミノ酸置換を導入することによりＤ－キシロースに対する作用性が低減したＦＡＤ－ＧＤＨ改変体を得る方法が開示されている（例えば、特許文献５～６参照）。しかしながら、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨは、天然型のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨと比べてＤ－キシロースへの反応性がかなり高く、これまでに開示されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨ改変体をもってしても、その基質特異性は十分であるとは言い難い。
特開２００７－２８９１４８号公報 特許第４４９４９７８号公報 国際公開第０７／１３９０１３号 特許第４６４８９９３号公報 特開２００８－２３７２１０号公報 国際公開第０９／０８４６１６号
医薬品・医療用具等安全性情報２０６号（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｓａｆｅｔｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｎｏ．２０６）、２００４年１０月、厚生労働省医薬食品局 Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　Ｉ．　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　ｐ－ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ，　Ｔ．　Ｃ．　Ｂａｋ，　ａｎｄ　Ｒ．　Ｓａｔｏ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１３９，　２６５－２７６　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＩ．　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１３９，　２７７－２９３　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＩＩ．　Ｇｅｎｅｒａｌ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１４６，　３１７－３２７　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＶ．　Ｈｉｓｔｉｄｙｌ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ａｓ　ａｎ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　ａｎｄ　Ｒ．　Ｓａｔｏ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１４６，　３２８－３３５　（１９６７）．
　本発明では、Ｄ－グルコースに対する基質特異性に優れ、Ｄ－グルコース以外の糖化合物、例えば、Ｄ－キシロースやマルトース等に作用しにくく、Ｄ－グルコースの測定に用いたときに、これらのＤ－グルコース以外の糖化合物が共存したときにも影響を受けにくい新規なＦＡＤ－ＧＤＨを提供することを課題とする。
　本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおける特定のアミノ酸残基を置換することによって得られる改変型ＦＡＤ－ＧＤＨが、Ｄ－グルコースに対する特異性に優れ、Ｄ－キシロースやマルトースに作用しにくく、これらのＤ－グルコース以外の糖化合物が共存したときの影響を受けにくいことを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列において、以下の（ａ）～（ｉ）：
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列における７８位のメチオニンに対応する位置、
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列における７９位のチロシンに対応する位置、
（ｃ）配列番号１記載のアミノ酸配列における８１位のグルタミンに対応する位置、
（ｄ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２１位のロイシンに対応する位置、
（ｅ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２２位のバリンに対応する位置、
（ｆ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置、
（ｇ）配列番号１記載のアミノ酸配列における４６５位のグルタミン酸に対応する位置、
（ｈ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置、及び
（ｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列における６１２位のセリンに対応する位置
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））、および／またはＤ－グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））が低減していることを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（２）以下（ｊ）～（ｒ）：
（ｊ）配列番号１記載のアミノ酸配列における７８位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、グルタミン、システイン又はアスパラギンのいずれかである、
（ｋ）配列番号１記載のアミノ酸配列における７９位のチロシンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニン又はアスパラギンのいずれかである、
（ｌ）配列番号１記載のアミノ酸配列における８１位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、フェニルアラニン又はアスパラギンのいずれかである、
（ｍ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がシステイン又はメチオニンのいずれかである、
（ｎ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アラニン又はシステインのいずれかである、
（ｏ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がシステイン、ファニルアラニン、ヒスチジン、バリン又はセリンのいずれかである、
（ｐ）配列番号１記載のアミノ酸配列における４６５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン酸又はイソロイシンのいずれかである、
（ｑ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がファニルアラニン又はチロシンのいずれかである、及び
（ｒ）配列番号１記載のアミノ酸配列における６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がシステイン又はスレオニンのいずれかである
よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する、上記（１）に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファン残基に対応する位置のアミノ酸がチロシンに置換されたことを特徴とする、上記（１）に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（４）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファン残基に対応する位置のアミノ酸がファニルアラニン又はバリンに置換されたことを特徴とする、上記（１）に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（５）以下（ｗ）～（ａｉ）：
（ｗ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、７８位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギンのいずれかである、
（ｘ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、１２１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
（ｙ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、１２２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がシステインである、
（ｚ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニン又はバリンのいずれかである、
（ａａ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がシステイン又はスレオニンのいずれかである、
（ａｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、７８位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がシステインである、
（ａｃ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンであり、かつ、１２１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
（ａｄ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
（ａｅ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がバリンであり、かつ、１２１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
（ａｆ）配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
（ａｇ）配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がシステインである、
（ａｈ）配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、又は
（ａｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、４６５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
のアミノ酸置換を有する、上記（１）に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（６）Ｄ－グルコースの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））および／またはＤ－グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））が、前記の置換を導入する前と比較して２０％以上低減していることを特徴とする上記（１）～（５）記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（７）上記（１）～（６）のいずれかに記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
（８）上記（７）記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
（９）上記（８）記載の組換え体ベクターを含む宿主細胞。
（１０）以下の工程：
（ａｊ）上記（９）に記載の宿主細胞を培養する工程、
（ａｋ）前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程、及び
（ａｌ）前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを単離する工程
を含むフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法。
（１１）上記（１）～（６）に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とするグルコース測定方法。
（１２）上記（１）～（６）に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
（１３）上記（１）～（６）に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
　本発明によれば、Ｄ－キシロースおよび／またはマルトースへの反応性が低減した、基質特異性に優れたＦＡＤ－ＧＤＨを提供することができる。
マルチプルアライメントプログラムを利用してアラインメントしたＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨおよびP. amagasakiense由来グルコース酸化酵素のアミノ酸配列の比較結果を示す図である。 改変型Ｍｕｃｏｒ由来ＧＤＨ（Ｗ５６９Ｙ）を用いて、酵素電極測定により測定した、基質濃度に対する電流応答値のプロットを示す図である。 改変型Ｍｕｃｏｒ由来ＧＤＨ（Ｗ５６９Ｙ／Ｖ１２２Ｃ）を用いて、酵素電極測定により測定した、基質濃度に対する電流応答値のプロットを示す図である。 改変型Ｍｕｃｏｒ由来ＧＤＨ（Ｗ５６９Ｙ／Ｗ１２３Ｖ）を用いて、酵素電極測定により測定した、基質濃度に対する電流応答値のプロットを示す図である。 改変型Ｍｕｃｏｒ由来ＧＤＨ（Ｗ５６９Ｙ／Ｓ６１２Ｃ）を用いて、酵素電極測定により測定した、基質濃度に対する電流応答値のプロットを示す図である。 改変型Ｍｕｃｏｒ由来ＧＤＨ（Ｗ５６９Ｙ／Ｓ６１２Ｃ／Ｍ７８Ｎ）を用いて、酵素電極測定により測定した、基質濃度に対する電流応答値のプロットを示す図である。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、公知の野生型または変異型ＦＡＤ－ＧＤＨ同様、電子受容体存在下でＤ－グルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の測定系を用いて測定することができる。
（反応１）　Ｄ－グルコ－ス　＋　ＰＭＳ（酸化型）
　　　　　　　　→　Ｄ－グルコノ－δ－ラクトン　＋　ＰＭＳ（還元型）
（反応２）　ＰＭＳ（還元型）　＋　ＤＣＩＰ（酸化型）
　　　　　　　　→　ＰＭＳ（酸化型）　＋　ＤＣＩＰ（還元型）
　具体的には、まず、（反応１）において、Ｄ－グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。そして、続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
　具体的には、フラビン結合型ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定することができる。５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５） ２．０５ｍＬ、１Ｍ Ｄ－グルコース溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いフラビン結合型ＧＤＨ活性を算出する。この際、フラビン結合型ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ－グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１記載のアミノ酸配列における７８位に相当する位置、７９位に相当する位置、８１位に相当する位置、１２１位に相当する位置、１２２位に相当する位置、１２３位に相当する位置、４６５位に相当する位置、５６９位に相当する位置および６１２位に相当する位置から選択される位置のアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。
　好ましくは、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおける、上述の７８位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、７８位に相当する位置のメチオニンがシステイン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミンのいずれかに置換される置換であり、上述の７９位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、７９位に相当する位置のチロシンがフェニルアラニン、アスパラギンのいずれかに置換される置換であり、上述の８１位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、８１位に相当する位置のグルタミンがロイシン、フェニルアラニン、アスパラギンのいずれかに置換される置換であり、上述の１２１位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、１２１位に相当する位置のロイシンがシステイン、メチオニンのいずれかに置換される置換であり、上述の１２２位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、１２２位に相当する位置のバリンがスレオニン、アラニン、システインのいずれかに置換される置換であり、上述の１２３位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、１２３位に相当する位置のトリプトファンがシステイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、バリン、セリンのいずれかに置換される置換であり、上述の４６５位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、４６５位に相当する位置のグルタミン酸がアルギニン、アスパラギン酸、イソロイシンのいずれかに置換される置換であり、上述の５６９位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、５６９位に相当する位置のトリプトファンがフェニルアラニン、チロシンのいずれかに置換される置換であり、上述の６１２位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、６１２位に相当する位置のセリンがシステイン、スレオニンのいずれかに置換される置換である。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの中で、さらに好ましいものの例として、上記のような置換を複数組み合わせて有する多重変異体が挙げられる。例えば、上記のような置換を２箇所組み合わせて有する２重変異体、３箇組み合わせて有する３重変異体、さらに多数の変異を組み合わせて有する多重変異体が本発明に包含される。このような変異の蓄積により、Ｄ－キシロースおよび／またはマルトースへの作用性がさらに低減したＦＡＤ－ＧＤＨを作出することができる。
　また、上記のような多重変異体を作出するにあたっては、上述の各種の置換以外の位置における置換を組み合わせることもできる。このような置換の位置は、単独で置換を導入した場合には、上述の置換部位におけるもののように顕著な効果を奏さないものであっても、上述の置換部位と組み合わせて導入することによって、相乗的に効果を奏するものであり得る。
　また、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨには、上述のような、Ｄ－キシロースやマルトースに作用しにくいという変異のほかに、熱安定性を向上させる変異や、ｐＨや特定の物質などへの耐性を向上させる効果などのような、別種の効果を奏することを目的とした公知の変異を任意に組み合わせてもよい。このような別種の変異を組み合わせた場合であっても、本発明の効果を発揮し得るものである限り、それらのＦＡＤ－ＧＤＨは本発明に包含される。
　例えば、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列の５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸をチロシンに置換し、この変異にさらに別の変異を組み合わせて導入した変異体を挙げることができ、具体的な別の変異としては、７８位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギンのいずれかである変異体が挙げられる。あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、１２１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである変異体が挙げられる。あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、１２２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がシステインである変異体が挙げられる。あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、バリンのいずれかである変異体が挙げられる。
　あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がシステイン、スレオニンのいずれかである変異体が挙げられる。あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、７８位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がシステインである変異体が挙げられる。あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンであり、かつ、１２１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである変異体が挙げられる。あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである変異体が挙げられる。あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がバリンであり、かつ、１２１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである変異体が挙げられる。
　あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである変異体が挙げられる。あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がシステインである変異体が挙げられる。あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである変異体が挙げられる。あるいは、本発明の好ましい多重変異ＦＡＤ－ＧＤＨの例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、４６５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、かつ、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである変異体が挙げられる。
　後述のとおり、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、例えば、まず任意の方法で、配列番号１のアミノ酸配列に近いアミノ酸配列をコードする遺伝子を入手し、配列番号１の所定の位置と同等の位置におけるいずれかの位置においてアミノ酸置換を導入することにより得ることもできる。
　目的とするアミノ酸置換導入方法としては、例えばランダムに変異を導入する方法あるいは想定した位置に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。前者の方法としては、エラープローンＰＣＲ法（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１，１１－１５，（１９８９））や、増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすいＸＬ１－Ｒｅｄコンピテントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法等がある。また、後者の方法として、目的とするタンパク質の結晶構造解析により立体構造を構築し、その情報をもとに目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、市販のＱｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等により部位特異的変異を導入する方法がある。あるいは、後者の方法として、目的とするタンパク質と相同性の高い公知のタンパク質の立体構造を用いて、目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、部位特異的変異を導入する方法もある。
　また、ここでいう、例えば、「配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置」とは、配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号１と同一性（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を持つアミノ酸配列を有する他のＦＡＤ－ＧＤＨとをアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ－Ｍａｃ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、又はＤＮＡＳＩＳ　Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
　「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、ＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。ＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、各ＦＡＤ－ＧＤＨ配列における同一の位置を決めることが可能である。このようにして特定された「同一の位置」は、三次元構造中で同じ位置に存在すると考えられ、対象となるＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性に関して類似した効果を有することが推定できる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨには、上記の同一性の範囲内で各種のバリエーションが想定されるが、各種ＦＡＤ－ＧＤＨの酵素科学的性質が本明細書に記載する本発明のＦＡＤ―ＧＤＨと同様である限り、それらは全て本発明のＦＡＤ－ＧＤＨに含まれ得る。このようなアミノ酸配列を有するＦＡＤ－ＧＤＨは、基質特異性が高く、かつ、Ｄ－グルコース以外の糖化合物、例えば、Ｄ－キシロースやマルトース等が共存したときにも影響を受けにくく、産業上有用である。
　また、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおいては、上述の７８位に相当する位置のアミノ酸がシステイン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミンのいずれかであること、または、７９位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、アスパラギンのいずれかであること、または、８１位に相当する位置のアミノ酸がロイシン、フェニルアラニン、アスパラギンのいずれかであること、または、１２１位に相当する位置のアミノ酸がシステイン、メチオニンのいずれかであること、または、１２２位に相当する位置のアミノ酸がスレオニン、アラニン、システインのいずれかであること、または、１２３位に相当する位置のアミノ酸がシステイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、バリン、セリンのいずれかであること、または、４６５位に相当する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン酸、イソロイシンのいずれかであること、または、５６９位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシンのいずれかであること、または、６１２位に相当する位置のアミノ酸がシステイン、スレオニンのいずれかであることが重要なのであって、それが人為的な置換操作によるものか否かは重要でない。例えば、上記の位置のアミノ酸が本発明で所望される残基とは元々異なっているタンパク質を出発物質として、そこに公知の技術を用いて所望の置換を導入していく場合であれば、これらの所望されるアミノ残基は置換により導入される。一方、公知のペプチド全合成により所望のタンパク質を入手する場合、または、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするように遺伝子配列を全合成し、これに基づき所望のタンパク質を入手する場合、あるいは、天然型として見出されたものの中に元々そのような配列を有するものがあった場合等には、人為的な置換という工程を経ることなく、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを得ることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおける基質特異性の向上）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、高い基質特異性を有することを特徴とする。具体的には、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、本発明者らが先に見出した特許第４６４８９９３号公報に記載のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨと同様に、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースに対する反応性が極めて低いことを特徴とする。具体的には、Ｄ－グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ－ガラクトースおよびＤ－キシロースに対する反応性がいずれも２％以下であることを特徴とする。本発明に用いるＦＡＤ－ＧＤＨは、このような高い基質特異性を有するため、マルトースを含む輸液の投与を受けている患者や、ガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者の試料についても、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ－グルコース量を測定することが可能となる。さらに、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、特許第４６４８９９３号公報に記載のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨを比較して、さらに高いＤ－グルコースに対する基質特異性を有するものであるため、一層の産業上の有用性が期待される。
　また、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、上述のようにＤ－グルコースの代わりにマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の糖化合物を基質として測定を行った際の測定値が非常に低く、さらに、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の糖化合物が夾雑する条件下でも正確にＤ－グルコースを測定できることが好ましい。具体的には、それらの夾雑糖化合物が存在しない条件でのＤ－グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースから選択される１以上が存在する場合の測定値が９６％～１０３％であり、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ－ガラクトースおよびＤ－キシロースの３種が同時に存在する場合でも、測定値が９６％～１０４％であることが好ましい。
　このような特性を有するＦＡＤ－ＧＤＨを用いた場合には、測定試料中にマルトースやＤ－ガラクトース、Ｄ－キシロースが存在している状況でも、Ｄ－グルコース量を正確に測定することが可能である。
　各種のＦＡＤ－ＧＤＨが有する酵素化学的性質は、酵素の諸性質を特定するための公知の手法、例えば、以下の実施例に記載の方法を用いて調べることができる。酵素の諸性質は、各種のＦＡＤ－ＧＤＨを生産する微生物の培養液や、精製工程の途中段階において、ある程度調べることもでき、より詳細には、精製酵素を用いて調べることができる。
　本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨは、前述の活性測定方法に基づく反応条件下で、Ｄ－グルコースへの反応性に対する同モル濃度のＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））および／または、Ｄ－グルコースへの反応性に対する同モル濃度のマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））が、アミノ酸置換を導入する前と比較して低減している、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、最も好ましくは５０％以上低減していることを特徴とする。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）またはＭａｌ／Ｇｌｃ（％）のいずれか片方のみがアミノ酸置換を導入する前のＦＡＤ－ＧＤＨと比べて好ましい程度に低減していてもよく、あるいは、その両方が、好ましい程度に低減していてもよい。両方の基質に対する反応性がいずれも低減しているものであれば、より好ましい。
　また、上述のように、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、元々Ｄ－グルコースに対する基質特異性が優れた酵素であるため、通常の空腹時血糖値（≦１２６ｍｇ／ｄＬ[７ｍＭ]）と同程度のモル濃度のＤ－キシロース及びマルトースを用いて行う反応性の測定においては、その共存の影響を示唆する測定値がほとんど検出されないことが想定される。そこで、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおけるＤ－キシロースおよびマルトースへの反応性を測定する際には、例えば、２００ｍＭ等の過剰量の濃度でＤ－キシロースおよび／またはマルトースを共存させた条件下で、同モル濃度のＤ－グルコースへの反応性が２Ｕ/ｍｌ以上、好ましくは５Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは１０Ｕ／ｍｌ以上である多量の酵素液を用いて測定を行うことが好ましい。このような条件で測定を行うことにより、グルコースセンサー上に多量の酵素を搭載した際と同等な条件を想定した、共存物質の影響を検討することができる。
　なお、Ｄ－グルコースへの反応性に対する同モル濃度のＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））、および、Ｄ－グルコースへの反応性に対する同モル濃度のマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））は、形質転換体の種類やその培養条件、あるいは酵素活性測定条件等によって異なるため、同一の条件下において、アミノ酸置換導入前後のそれぞれの値を比べる必要がある。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの由来となる天然型ＦＡＤ－ＧＤＨの例）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、公知のタンパク質を出発物質として、それを改変することにより取得することもできる。特に、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨに望まれる酵素科学的性質と類似点が多い出発物質を利用することは、所望のＦＡＤ－ＧＤＨを取得する上で有利である。
　上述のような出発物質の例としては、公知のＦＡＤ－ＧＤＨを挙げることができる。公知のＦＡＤ－ＧＤＨの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属由来のＦＡＤ－ＧＤＨは、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを取得するための出発物質の一例として好適である。
　Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、ムコール・プライニ（Mucor prainii）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）もしくはムコール・シルシネロイデス・ｆ・シルシネロイデス（Mucor circinelloides f. circinelloides）、ムコール・ダイモルフォスポラス（Mucor dimorphosporus）が挙げられる。より具体的には、Mucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0111もしくはMucor circinelloides f. circinelloides NISL0117が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、アブシジア・シリンドロスポラ（Absidia cylindrospora）、アブシジア・ヒアロスポラ（Absidia hyalospora）を挙げることができる。より具体的には、Absidia cylindrospora NISL0211、Absidia hyalospora NISL0218を挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、アクチノムコール・エレガンス（Actinomucor elegans）を挙げることができる。より具体的には、Actinomucor elegans NISL9082を挙げることができる。なお、上記の菌株はＮＩＳＬ（公益財団法人　野田産業科学研究所）の保管菌株であり、所定の手続きを経ることにより、分譲を受けることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子の取得）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを効率よく取得するためには、遺伝子工学的手法を利用するのが好ましい。本発明のＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子（以下、ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子）を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いればよい。例えば、公知のＦＡＤ－ＧＤＨを出発物質とし、それを改変することにより本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを取得するには、ＦＡＤ－ＧＤＨ生産能を有する公知の微生物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（ＷＩＬＥＹ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　次いで、公知のＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列情報に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーから基質特異性の高いＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、基質特異性の高いＦＡＤ－ＧＤＨをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることもできる。
　公知のＦＡＤ－ＧＤＨを出発物質として、本発明の基質特異性が高いＦＡＤ－ＧＤＨを取得する方法として、出発物質であるＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるＦＡＤ－ＧＤＨの酵素科学的性質を指標に選択を行う方法を採用し得る。
　出発物質であるＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
　上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５－ブロモウラシル等を挙げることができる。
　この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５～１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０～８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０～１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４～３０、１９８９年６月号）。
　蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，　ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，　Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
　また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。
　なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の基質特異性の高い改変ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を合成することもできる。
　上記のような任意の方法により選択された本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定または確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いれば良い。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
　上述のように得られた本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
　例えば、真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。
　挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　５，　２５５－２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５５　（２００３）４８１－４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
　また、例えば、真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のようなカビ細胞が挙げられる。挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター（例えばｔｅｆ１プロモーター）及びその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。また、挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子、例えばｎｉａＤ、ｐｙｒＧが含まれていても良い。さらに、挿入遺伝子には、任意の染色体部位へ挿入するための相同組換え領域が含まれていても良い。糸状菌への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Mol. Gen. Genet., 218, 99-104(1989)）を好適に用いることができる。
　原核宿主細胞の一例としては、エッシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌Ｋ－１２株、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００等（いずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。それらを形質転換し、または、それらに形質導入して、ＤＮＡが導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）；ニッポンジーン製）を用いても良い。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの製造）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、上述のように取得した本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを単離することにより、製造すればよい。
　上記真核宿主細胞を培養するためには、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養において広く用いられているＹＰＤ（バクトペプトン　２％，バクトイースト・エクストラクト　１％，グルコース　２％）液体培地を好適に用いることができると考えられるが、その他にも、添加することにより本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨの製造量を向上させることができる栄養源や成分があれば、単独で、あるいは組み合わせてそれらを添加してもよい。
　培地に使用する炭素源としては、同化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、デンプン加水分解物、グリセリン、フラクトース、糖蜜などが挙げられる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、マルツエキス、アミノ酸、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどが挙げられる。無機物としては、例えば、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸第１鉄、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、炭酸ナトリウム、塩化カルシウムなどの種々の塩が挙げられる。その他、必要に応じてビタミン類、消泡剤などを添加してもよい。
　上記原核宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　培養条件は、培養する微生物により異なっても良いが、例えば、培地の初発ｐＨは、ｐＨ５～１０に調整し、培養温度は、２０～４０℃、培養時間は、１５～２５時間、１～２日間、あるいは３～７日間等、適宜設定することができ、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などにより実施する。
　例えば、チゴサッカロマイセス属の酵母を培養する場合の培地および培養条件の一例として、バクトペプトン　２％，バクトイースト・エクストラクト　１％，グルコース　２％の培地を用いた、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間の振盪が挙げられる。例えば、エシェリヒア・コリーの培養は、１０～４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で４～２４時間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で４～８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
　培養終了後、該培養物あるいは培養菌体内部からフラビン結合型ＧＤＨを採取するには、通常の酵素の採取手段を用いることができる。
　上記酵素が菌体内に存在する場合には、培養物から、例えば、濾過、遠心分離などの操作により菌体を分離し、この菌体から酵素を採取するのが好ましい。例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミルなどの、通常の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ－１００などの界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などを単独または組み合わせて採用することができる。
　上記酵素が菌体外に存在する場合には、例えば、濾過、遠心分離などの操作により菌体を分離し、上清を回収すればよい。次いで、濾過または遠心分離などにより不溶物を取りのぞき、酵素抽出液を得る。得られた抽出液から、フラビン結合型ＧＤＨを、必要に応じて単離、精製するには、必要により核酸を除去したのち、これに硫酸アンモニウム、アルコール、アセトンなどを添加して分画し、沈殿物を採取し、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの粗酵素を得ることができる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ酵素標品を得ることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いたＤ－グルコース測定方法）
　本発明はまた、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを開示し、例えば、このようなグルコースアッセイキットを用いることにより、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いて血中のＤ－グルコース（血糖値）を測定することができる。
　本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを、少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのＤ－グルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＦＡＤ－ＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
　Ｄ－グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のように行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＦＡＤ－ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ－（２－アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにＤ－グルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のＤ－グルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のＤ－グルコース溶液を用いて作製したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のＤ－グルコース濃度を算出することができる。
　この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、たとえば２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでＤ－グルコースの定量が可能である。また、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、Ｄ－グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する電子受容体および発色試薬はこれらに限定されない。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースセンサー）
　本発明はまた、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いるグルコースセンサーを開示する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
　Ｄ－グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、Ｄ－グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のＤ－グルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のＤ－グルコース濃度を計算することができる。
　具体的な一例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に本発明の１．５ＵのＦＡＤ－ＧＤＨを固定化し、Ｄ－グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．８ｍｌ、及び、１Ｍ　ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液０．２ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀－塩化銀参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ　Ｄ－Ｄ－グルコース溶液を終濃度が５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のＤ－グルコース濃度（５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線が作成する。これより本発明のＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でＤ－グルコースの定量が可能となる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、従来のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨと比較した場合でも、基質特異性が優れているために、特に、上記のようなグルコースセンサーに対し応用する場合に、優れた効果を奏することが期待される。グルコースセンサーにおいては、液状試薬キット等に応用する場合と比較して、より多量の酵素を搭載する特殊な条件下で酵素反応が行われることが想定され、このような条件下では、共存物質の影響を低減する必要性が特に高いことが求められるためである。
　以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
（酵母発現系におけるＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性評価）
（１）Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨを発現する酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ株の作製
　特許文献４に記載の方法に準じ、配列番号２のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子（特許文献４ではＭｐＧＤＨ遺伝子と記載）をコードする組換え体プラスミド（ｐｕｃ－ＭＧＤ）を取得した。これを鋳型として、配列番号３、４の合成ヌクレオチド、Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付のプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（ＴａｋａＲａ社製）を用いて、約２ｋｂの「インサート用ＤＮＡ断片」を精製した。
　また、Saccharomyces cerevisiaeの発現用プラスミドｐＹＥＳ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、制限酵素処理後の反応液を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（ＴａｋａＲａ社製）を用いて、約６ｋｂの「ベクター用ＤＮＡ断片」を精製した。
　続いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて添付のプロトコールに従って、精製した「インサート用ＤＮＡ断片」および「ベクター用ＤＮＡ断片」を連結し、ＧＡＬ１プロモーター下でＭｐＧＤＨを発現するための組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを作製した。なお、ＧＡＬ１プロモーターはＤ－ガラクトース誘導性のプロモーターであり、Ｄ－ガラクトースを含み、かつ、Ｄ－グルコースを含まない培地で培養することにより、プロモーター下流の遺伝子発現が誘導される。そして、このｐＹＥＳ２Ｃ－Ｍｐが配列番号２の遺伝子配列をコードしていることをマルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）により確認した。その後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐをＩｎｖ－Ｓｃ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に形質転換することにより、配列番号１のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨを発現する酵母形質転換株Ｓｃ－Ｍｐ株を取得した。
（２）Ｓｃ－Ｍｐ株におけるＧＤＨ活性の確認と基質特異性評価
　酵母形質転換株Ｓｃ－Ｍｐ株を、５ｍＬの前培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース（ＢＤ）、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物（ｓｉｇｍａ社製）、２．０％（ｗ／ｖ）ラフィノース]中で、３０℃にて２４時間培養した。その後、前培養液１ｍＬを４ｍＬの本培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、２．５％（ｗ／ｖ）Ｄ－ガラクトース、０．７５％（ｗ／ｖ）ラフィノース]に加えて、３０℃で１６時間培養した。
　この培養液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、３分間）により菌体と培養上清に分離し、前述の酵素活性測定法により、ＧＤＨ活性を測定したところ、培養上清中のＧＤＨ活性は１３．１Ｕ／ｍＬであった。次に、この活性測定法を、基質をＤ－グルコースに代えて同モル濃度のマルトースまたはＤ－キシロースとした系において活性を測定したところ、それぞれの活性値は０．１１４Ｕ／ｍＬおよび０．２１５Ｕ／ｍＬであった。すなわち、Ｓｃ－Ｍｐ株で発現させたＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの「Ｄ－グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））」および「Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））」は、それぞれ０．８７％および１．６４％であることがわかった。
　Ｓｃ－Ｍｐ株で発現させたＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））および（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））は、本来の由来微生物であるＭｕｃｏｒ属において生産されたＦＡＤ－ＧＤＨを精製して同様の測定を行ったものと、ほぼ同等であった。すなわち、Ｓｃ－Ｍｐ株で発現させたＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨは、公知の各種ＦＡＤ－ＧＤＨと比較しても既に十分に優れたＤ－グルコースへの基質特異性を有していることが確認され、改変によりさらなる基質特異性向上を目指す取り組みにおいてこの酵素が好ましい出発物といえることがわかった。
（Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおける基質結合部位近傍に位置するアミノ酸の予測と変異導入による改良型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの作製、および基質特異性向上効果の検証）
（１）Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおける基質結合部位周辺のアミノ酸残基の予測
　出願人が特許文献第４６４８９９３号公報で開示したＭｕｃｏｒ属由来のケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨの一種であるＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨは、そのアミノ酸配列において、それまでに知られた各種公知のタンパク質の中で高い相同性を有するものがみつかっていない。従って、相同性の高い公知のタンパク質が存在する場合のように、酵素が類似すると予測される公知のタンパク質の立体構造を基に、Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの立体構造や活性部位近傍に位置するアミノ酸を予測することは容易ではないと考えられた。
　実際に、ＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ）にてｂｌａｓｔ検索を行い、より低い同一性の領域まで検索の範囲を拡げて検索を行った結果、２６個のアミノ酸配列がヒットした。具体的には、同一性が上位のものから順に、１ＧＰＥ（同一性３２％、グルコース酸化酵素）、１ＣＦ３（同一性３１％、グルコース酸化酵素）、１ＧＡＬ（同一性３１％、グルコース酸化酵素）、３ＱＶＰ（同一性３１％、グルコース酸化酵素）、３ＱＶＲ（同一性３１％、グルコース酸化酵素）、３ＦＩＭ（同一性２６％、アリルアルコール酸化酵素）、３Ｑ９Ｔ（同一性２２％、ギ酸酸化酵素）等がヒットした。ヒットした２６個のタンパク質のうち、５つはグルコース酸化酵素であり、残りは、機能的に、より異なるタンパク質であった。
　ＰＤＢ上のｂｌａｓｔ検索でヒットした中で、最も同一性が高かったものは、Penicilliumamagasakiense（P. amagasakiense）由来のグルコース酸化酵素（ＰＤＢ　ＩＤ：１ＧＰＥ）であったが、同一性はわずか３２％という低い数値であった。P. amagasakienseのグルコース酸化酵素のアミノ酸配列を配列番号５に示す。当業者にとって、この程度まで同一性が低いタンパク質間において、両者が同様な機能を有するであろうと予測することは通常的でない。さらに、当業者にとって、このように同一性が低いことがわかっているアミノ酸配列間での比較により、一方の配列におけるアミノ酸の位置に対応して他方の配列における同じ位置のアミノ酸が同様の機能効果を奏し得ることを期待することは、通常的ではない。実際にこの程度の同一性でヒットした公知のタンパク質が同じ酵素であるとは言い難いことは、上述の通りである。
　上述のように、同一性の低いタンパク質の立体構造を基にして解析を行うことは通常的ではないことを承知の上、タンパク質構造データバンク（http://www.pdb.org/pdb/home/home.do）より、P. amagasakiense由来グルコース酸化酵素の立体構造（ＰＤＢ　ＩＤ：１ＧＰＥ）を入手し、以下のようにしてＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの基質結合部位近傍に位置するアミノ酸を推測することにした。
　一般的に、フラビンを補酵素とする酸化還元酵素の活性中心は、イソアロキサジン環のｒｅ面周辺に位置することが知られている。そこで、ウェブサイト上から入手可能な立体構造解析ソフトＰｙＭＯＬ　０．９９ｒｃ６上で、P. amagasakiense由来のグルコース酸化酵素の立体構造を表示しＦＡＤのイソアロキサジン環のｒｅ面を囲むように位置するアミノ酸を、P. amagasakiense由来のグルコース酸化酵素の基質結合部位近傍に位置するアミノ酸として想定することとした。その結果、P. amagasakiense由来グルコース酸化酵素における基質結合部位の近傍に位置する可能性を有するアミノ酸の候補として、配列番号５のアミノ酸配列における７３位のチロシン、１１２位のグリシン、５１６位のアルギニン、５６３位のヒスチジンが予測された。
　次に、ＷＥＢ上のマルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）を利用して、配列番号１のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨと配列番号５のP. amagasakiense由来のグルコース酸化酵素のアミノ酸配列の比較を行った。アミノ酸配列の比較結果を図１に示す。図１より、P. amagasakiense由来グルコース酸化酵素の７３位のチロシン、１１２位のグリシン、５１６位のアルギニン、５６３位のヒスチジンは、Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおいて、配列番号１の７９位のチロシン、１２０位のグリシン、５６６位のアルギニン、６１３位のヒスチジンに相当することが予想され、これらのアミノ酸がＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおいて基質結合部位近傍に位置することが予想された。
　発明者らは、上述の検討によって、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを作出するための基本的な方針を立案した。しかし、Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨとP. amagasakiense由来グルコース酸化酵素の同一性の低さ、および、P. amagasakiense由来グルコース酸化酵素における基質結合部位が間接的な推測に基づいて決められたに過ぎないことを考慮すれば、実際の酵素の立体構造が上記の予測通りの結果となる見込みは高いとはいえなかった。また、仮に、Ｍｕｃｏｒ属由来のＦＡＤ－ＧＤＨにおけるいくつかの位置のアミノ酸が実際に対応する位置で同じ残基となっていた場合でも、そのことがP. amagasakiense由来グルコース酸化酵素の立体的特徴やその効果と必ずしも関連しているとは言い難いということが当業者の通常的な認識である。従って、本発明の知見は当業者の通常的な認識や予測を超えたことであったし、実際に、この方針で探索を行った場合でも、本発明の知見を得るに至るには、相当量の試行錯誤を必要とした。
（２）Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおける予測基質結合部位近傍への部位特異的変異の導入
　上記のような間接的な推測により、Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおいて基質結合部位近傍に位置する可能性が予測された位置、すなわち、配列番号１における７９位のチロシン、１２０位のグリシン、５６６位のアルギニン、６１３位のヒスチジンに対して、これらを各種アミノ酸へと置換する部位特異的変異を導入することとした。
　組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを鋳型として、配列番号６、７の合成ヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
　すなわち、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５５℃、３０秒」－「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。
　反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約８ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、ベクターに連結して、大腸菌ＪＭ１０９株（ニッポンジーン社製）を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に塗布した。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ液体培地に接種して振とう培養し、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ｓｉｇｍａ社製）を用いて添付のプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のＦＡＤ－ＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、配列番号２記載のアミノ酸配列の７９位のチロシンがアラニンに置換された改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする組換え体プラスミド（ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ａ）を得た。
　同様にして、表１に示した配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせをそれぞれ用いて、ＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号２に記載のアミノ酸配列の７９位のチロシンがアラニンに、７９位のチロシンがバリンに、７９位のチロシンがプロリンに、７９位のチロシンがシステインに、７９位のチロシンがアスパラギンに、７９位のチロシンがグルタミンに、７９位のチロシンがセリンに、７９位のチロシンがスレオニンに、７９位のチロシンがヒスチジンに、７９位のチロシンがフェニルアラニンに、７９位のチロシンがトリプトファンに、７９位のチロシンがリジンに、１２０位のグリシンがヒスチジンに、１２０位のグリシンがシステインに、１２０位のグリシンがグルタミン酸に、１２０位のグリシンがリジンに、１２０位のグリシンがトリプトファンに、１２０位のグリシンがメチオニンに、５６６位のアルギニンがヒスチジンに、５６６位のアルギニンがメチオニンに、５６６位のアルギニンがチロシンに、５６６位のアルギニンがグルタミンに、５６６位のアルギニンがグルタミン酸に、５６６位のアルギニンがリジンに、６１３位のヒスチジンがリジンに、６１３位のヒスチジンがアルギニンに、６１３位のヒスチジンがアスパラギンに、６１３位のヒスチジンがアスパラギン酸に置換された組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｐ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｗ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｗ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｈ６１３Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｈ６１３Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｈ６１３Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｈ６１３Ｄをそれぞれ取得した。
(３)部位特異的変異を導入した各種改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性評価
　部位特異的変異を導入した上述の改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｐ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｗ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｙ７９Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｗ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ１２０Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｒ５６６Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｈ６１３Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｈ６１３Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｈ６１３Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｈ６１３Ｄを用いて、上述と同様にしてＩｎｖ－Ｓｃ株を形質転換し、形質転換株の培養を行って、培養上清中のＦＡＤ－ＧＤＨ活性を測定した。
　続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨ変異体の培養上清を用いて、前述の活性測定方法に基づく反応条件下で、Ｄ－グルコースへの反応性に対する同モル濃度のＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））および／またはＤ－グルコースへの反応性に対する同モル濃度のマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。
　各種変異体におけるＸｙｌ／Ｇｌｃ（％）、Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％）、および、部位特異的変異導入前のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおけるＸｙｌ／Ｇｌｃ（％）、Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％）の値を１００％とした時に部位特異的変異導入後の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨが示す相対的な基質特異性を表す「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）」および「Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）」を表１に示す。「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）」または「Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）」が１００を超える改変型ＦＡＤ－ＧＤＨにおいては、部位特異的変異導入前のＦＡＤ－ＧＤＨと比較して、Ｄ－キシロースまたはマルトースへの反応性が高まってしまっており、基質特異性が低下していることを示す。逆に、「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）」または「Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）」が１００を下回る改変型ＦＡＤ－ＧＤＨにおいては、部位特異的変異導入前のＦＡＤ－ＧＤＨと比較して、Ｄ－キシロースまたはマルトースへの反応性が低下し、基質特異性が高まっていることを示し、その度合は、数値が小さくなるほど大きい。なお、測定値が「－」である変異体は、ＧＤＨ活性が著しく低下した、もしくはＧＤＨ活性が消失したことを表す。表１で示す結果はすべて同一の測定条件で測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示す通り、作製した多くの改変型タンパク質は、ＦＡＤ－ＧＤＨとしての十分な活性を有さなかった。また、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を示したものであっても、Ｄ－キシロースまたはマルトースへの反応性が高まっており、基質特異性が悪化しているものがみられた。その中で、配列番号１の７９位のチロシンを、アラニン、アスパラギン、セリン、フェニルアラニンにそれぞれ置換することにより、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）およびＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）が低減することがわかった。特に、アスパラギンまたはフェニルアラニンに置換したものではＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）が２０％以上低減し、基質特異性の向上度合が顕著であった。また、配列番号１の７９位のチロシンをアスパラギンに置換したものでは、あわせてＭａｌ／Ｇｌｃ（％）およびＭａｌ／Ｇｌｃ比率（％）も若干低減し、Ｄ－キシロースだけでなくマルトースに対しての反応性も、部位特異的変異導入前と同等以上に良好であることがわかった。
　すなわち、上述の（１）の方針により間接的に推測した複数箇所のアミノ酸をそれぞれ変異させることにより、所望の効果を奏する改変体を容易に取得することはできなかったが、探索を行う中で、７９位の位置のアミノ酸を変異させ、ある種のアミノ酸残基へと置換を行った場合において、好ましい効果を奏する改変体を取得することができた。
（間接的に予測した基質結合部位の周辺へ部位特異的変異を導入した改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの作製とその基質特異性評価）
（１）予測基質結合部位周辺への部位特異的変異導入
　実施例２に示すように、作製した一部の改変体において、所望の性質を有する改変体を取得することができたため、次いで、実施例２で変異させた７９位のチロシン、１２０位のグリシン、５６６位のアルギニン、６１３位のヒスチジンのそれぞれの近傍に位置するアミノ酸に対しても、部位特異的変異を導入することを試みた。
　具体的には、各種合成ヌクレオチドの組み合わせをプライマーとして用いることにより、実施例２に準じ、組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを鋳型として、目的とする部位特異的変異を導入した改変型ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドを作製した。作成した改変体の代表例を表２に示す。これらの改変体は、具体的には、配列番号１の７７位のグリシンがアラニンに、７８位のメチオニンがシステインに、７８位のメチオニンがアスパラギン酸に、７８位のメチオニンがアスパラギンに、７８位のメチオニンがグルタミン酸に、７８位のメチオニンがグルタミンに、８１位のグルタミンがロイシンに、８１位のグルタミンがフェニルアラニンに、８１位のグルタミンがアスパラギンに、１２１位のロイシンがシステインに、１２１位のロイシンがメチオニンに、１２２位のバリンがスレオニンに、１２２位のバリンがイソロイシンに、１２２位のバリンがアラニンに、１２２位のバリンがメチオニンに、１２２位のバリンがシステインに、１２３位のトリプトファンがシステインに、１２３位のトリプトファンがフェニルアラニンに、１２３位のトリプトファンがヒスチジンに、１２３位のトリプトファンがバリンに、１２３位のトリプトファンがセリンに、５６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに、５６８位のアスパラギン酸がグルタミン酸に、５６９位のトリプトファンがフェニルアラニンに、５６９位のトリプトファンがチロシンに、６１２位のセリンがアラニンに、６１２位のセリンがシステインに、６１２位のセリンがスレオニンに置換された変異体であり、それぞれをコードする遺伝子を包含する組換え体プラスミドをｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ７７Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｍ７８Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｍ７８Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｍ７８Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｍ７８Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｍ７８Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ８１Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ８１Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ８１Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ１２１Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ１２２Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ１２２Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ１２２Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ１２２Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ１２２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｄ５６８Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｄ５６８Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ５６９Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ５６９Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ６１２Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ６１２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ６１２Ｔと称した。
（２）部位特異的変異を導入した各種改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性評価
　上述の部位特異的変異を導入した改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ７７Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｍ７８Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｍ７８Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｍ７８Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｍ７８Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｍ７８Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ８１Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ８１Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ８１Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ１２１Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ１２２Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ１２２Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ１２２Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ１２２Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ１２２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｄ５６８Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｄ５６８Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ５６９Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ５６９Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ６１２Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ６１２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ６１２Ｔを用いて、実施例２と同様にしてＩｎｖ－Ｓｃ株を形質転換し、各形質転換株の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を確認した。
　続いて、実施例２と同様に、（Ｍａｌ／Ｇｌｃ）（％）、（Ｍａｌ／Ｇｌｃ）比率（％）、（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ）（％）、（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ）比率（％）を測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表２より、配列番号１の７８位のメチオニンをグルタミン酸に、７８位のメチオニンをグルタミンに、８１位のグルタミンをロイシンに、８１位のグルタミンをフェニルアラニンに、８１位のグルタミンをアスパラギンに、１２１位のロイシンをメチオニンに、１２２位のバリンをスレオニンに、１２２位のバリンをイソロイシンに、１２２位のバリンをアラニンに、１２２位のバリンをシステインに、１２３位のトリプトファンをシステインに、１２３位のトリプトファンをフェニルアラニンに、１２３位のトリプトファンをヒスチジンに、１２３位のトリプトファンをバリンに、１２３位のトリプトファンをセリンに、５６９位のトリプトファンをフェニルアラニンに、５６９位のトリプトファンをチロシンに、６１２位のセリンをシステインに、６１２位のセリンをスレオニンに置換することにより、Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％）およびＭａｌ／Ｇｌｃ比率（％）が低減することがわかった。
　特に、配列番号１の７８位のメチオニンをグルタミン酸に、７８位のメチオニンをグルタミンに、８１位のグルタミンをロイシンに、８１位のグルタミンをフェニルアラニンに、８１位のグルタミンをアスパラギンに、１２１位のロイシンをメチオニンに、１２２位のバリンをスレオニンに、１２２位のバリンをアラニンに、１２２位のバリンをシステインに、１２３位のトリプトファンをシステインに、１２３位のトリプトファンをフェニルアラニンに、１２３位のトリプトファンをヒスチジンに、１２３位のトリプトファンをバリンに、１２３位のトリプトファンをセリンに、５６９位のトリプトファンをフェニルアラニンに、５６９位のトリプトファンをチロシンに、６１２位のセリンをシステインに、６１２位のセリンをスレオニンに置換したものでは、Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）が２０％以上低減し、基質特異性の向上度合が顕著であった。
　また、配列場号１の７８位のメチオニンをシステインに、７８位のメチオニンをアスパラギン酸に、７８位のメチオニンをアスパラギンに、７８位のメチオニンをグルタミン酸に、７８位のメチオニンをグルタミンに、８１位のグルタミンをロイシンに、８１位のグルタミンをアスパラギンに、１２１位のロイシンをシステインに、１２１位のロイシンをメチオニンに、１２３位のトリプトファンをシステインに、１２３位のトリプトファンをフェニルアラニンに、１２３位のトリプトファンをヒスチジンに、１２３位のトリプトファンをバリンに、１２３位のトリプトファンをセリンに、５６９位のトリプトファンをフェニルアラニンに、５６９位のトリプトファンをチロシンに、６１２位のセリンをシステインに、６１２位のセリンをスレオニンに置換することにより、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）およびＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）が低減することがわかった。
　特に、配列場号１の７８位のメチオニンをシステインに、７８位のメチオニンをアスパラギンに、７８位のメチオニンをグルタミン酸に、７８位のメチオニンをグルタミンに、８１位のグルタミンをアスパラギンに、１２１位のロイシンをシステインに、１２１位のロイシンをメチオニンに、１２３位のトリプトファンをシステインに、１２３位のトリプトファンをフェニルアラニンに、１２３位のトリプトファンをヒスチジンに、１２３位のトリプトファンをバリンに、１２３位のトリプトファンをセリンに、５６９位のトリプトファンをフェニルアラニンに、５６９位のトリプトファンをチロシンに、６１２位のセリンをシステインに、６１２位のセリンをスレオニンに置換したものでは、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）が２０％以上低減し、基質特異性の向上度合が顕著であった。
　さらに、７８位のメチオニンをグルタミン酸に、７８位のメチオニンをグルタミンに、８１位のグルタミンをアスパラギンに、１２１位のロイシンをメチオニンに、１２３位のトリプトファンをシステインに、１２３位のトリプトファンをフェニルアラニンに、１２３位のトリプトファンをヒスチジンに、１２３位のトリプトファンをバリンに、１２３位のトリプトファンをセリンに、５６９位のトリプトファンをフェニルアラニンに、５６９位のトリプトファンをチロシンに、６１２位のセリンをシステインに、６１２位のセリンをスレオニンに置換した改変型ＦＡＤ－ＧＤＨにおいては、Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）およびＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）がいずれも２０％以上、より顕著なものでは４０％以上、５０％以上、非常に顕著なものでは６０％以上低減し、極めて高い基質特異性を有することがわかった。
（改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨ多重変異体の基質特異性評価）
（１）Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨへの基質特異性向上型変異の多重導入
　実施例２および実施例３の知見をもとに、実施例２および実施例３の方法に準じ、組み換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ５６９Ｙを鋳型として、各種合成ヌクレオチドの組み合わせにより、目的とする部位特異的変異を多重に導入した多様な変異体を取得した。作製した改変体の代表例を表３に示す。これらの改変体は、具体的には、配列番号１の５６９位のトリプトファンがチロシンに置換され、さらに配列番号１の７８位のメチオニンがシステインに、７８位のメチオニンがアスパラギンに、７８位のメチオニンがグルタミン酸に、７８位のメチオニンがグルタミンに、７９位のチロシンがフェニルアラニンに、７９位のチロシンがアスパラギンに、８１位のグルタミンがアスパラギンに、１２１位のロイシンがメチオニンに、１２２位のバリンがシステインに、１２３位のトリプトファンがフェニルアラニンに、１２３位のトリプトファンがバリンに、６１２位のセリンがシステインに、６１２位のセリンがスレオニンに置換された変異体であり、それぞれをコードする遺伝子を包含する組換え体プラスミドをｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｍ７８Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｍ７８Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｍ７８Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｍ７８Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｙ７９Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｙ７９Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｑ８１Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｖ１２２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｗ１２３Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｗ１２３Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｓ６１２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｓ６１２Ｔと称した。
　また、上記と同様にして、組み換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｓ６１２Ｃを鋳型とし、表３に示す合成ヌクレオチドの組み合わせにより、目的とする部位特異的変異を多重に導入した変異体を取得した。作製した改変体の代表例を表３に示す。これらの改変体は、具体的には、配列番号１の５６９位のトリプトファンがチロシンに置換され、さらに配列番号１の６１２位のセリンがシステインに置換され、かつ７８位のメチオニンがアスパラギンに置換された変異体であり、それぞれをコードする遺伝子を包含する組換え体プラスミドをｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹＣ－Ｍ７８Ｎと称した。
　さらに、上記と同様にして、組み換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｆを鋳型とし、表３に示す合成ヌクレオチドの組み合わせにより、目的とする部位特異的変異を多重に導入した変異体を取得した。作製した改変体の代表例を表３に示す。これらの改変体は、具体的には、配列番号１の１２３位のトリプトファンがフェニルアラニンに置換され、さらに配列番号１の１２１位のロイシンがメチオニンに、６１２位のセリンがスレオニンに置換された変異体であり、それぞれをコードする遺伝子を包含する組換え体プラスミドをｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＦ－Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＦ－Ｓ６１２Ｔと称した。
　さらに、上記と同様にして、組み換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｖを鋳型とし、表３に示す合成ヌクレオチドの組み合わせにより、目的とする部位特異的変異を多重に導入した変異体を取得した。作製した改変体の代表例を表３に示す。これらの改変体は、具体的には、配列番号１の１２３位のトリプトファンがバリンに置換され、さらに配列番号１の１２１位のロイシンがメチオニンに、６１２位のセリンがスレオニンに置換された変異体であり、それぞれをコードする遺伝子を包含する組換え体プラスミドをｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＶ－Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＶ－Ｓ６１２Ｔと称した。
（２）部位特異的変異を多重に導入した各種改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性評価
　部位特異的変異を多重に導入した改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｍ７８Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｍ７８Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｍ７８Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｍ７８Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｙ７９Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｙ７９Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｑ８１Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｖ１２２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｗ１２３Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｗ１２３Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｓ６１２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｓ６１２Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹＣ－Ｍ７８Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＦ－Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＦ－Ｓ６１２Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＶ－Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＶ－Ｓ６１２Ｔを用いて、上述と同様にしてＩｎｖ－Ｓｃ株を形質転換し、各形質転換株の培養を行って、培養上清中のＧＤＨ活性を確認した。
　続いて、実施例２と同様に、（Ｍａｌ／Ｇｌｃ）（％）、（Ｍａｌ／Ｇｌｃ）比率（％）、（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ）（％）、（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ）比率（％）を測定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３に示す通り、配列番号１の５６９位のトリプトファンをチロシンに置換した単独変異体と比較して、配列番号１の５６９位のトリプトファンをチロシンに置換し、さらに１２２位のバリンをシステインに置換した二重変異体において、Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％）およびＭａｌ／Ｇｌｃ比率（％）が、より低減することがわかった。
　また、配列番号１の５６９位のトリプトファンをチロシンに置換した単独変異体と比較して、配列番号１の５６９位のトリプトファンをチロシンに置換し、さらに７８位のメチオニンをアスパラギンに、もしくは１２３位のトリプトファンをフェニルアラニンに、もしくは６１２位のセリンをスレオニンに置換した二重変異体において、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）およびＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）が、より低減することがわかった。
　さらに、配列番号１の５６９位のトリプトファンをチロシンに置換した単独変異体と比較して、配列番号１の５６９位のトリプトファンをチロシンに置換し、さらに７８位のメチオニンをグルタミン酸に、もしくは１２１位のロイシンをメチオニンに、もしくは１２３位のトリプトファンをバリンに、もしくは６１２位のセリンをシステインに置換した二重変異体において、Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％）、Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）およびＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）のいずれもが、より低減することがわかった。すなわち、作製したいくつかの二重変異体が、単独変異体を比較して、さらに基質特異性が向上していることがわかった。
　また、表３に示すとおり、配列番号１の５６９位のトリプトファンをチロシンに置換し、かつ、６１２位のセリンをシステインに置換した二重変異体と比較して、配列番号１の５６９位のトリプトファンをチロシンに置換し、かつ６１２位のセリンをシステインに置換し、さらに７９位のメチオニンをアスパラギンに置換した三重変異体において、Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％）、Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）およびＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）のいずれもが、より低減することがわかった。この多重変異体においては、各変異点の効果が加わって、より優れた基質特異性が発揮されているといえる。
　また、表３に示すとおり、配列番号１の１２３位のトリプトファンをフェニルアラニンに置換した単独変異体と比較して、配列番号１の１２３位のトリプトファンをフェニルアラニンに置換し、さらに６１２位のセリンをスレオニンに置換した二重変異体において、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）およびＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）が、より低減することがわかった。
　また、１２３位のトリプトファンをフェニルアラニンに置換した単独変異体と比較して、配列番号１の１２３位のトリプトファンをフェニルアラニンに置換し、さらに１２１位のロイシンをメチオニンに置換した二重変異体において、Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％）、Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）およびＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）のいずれもが、より低減することがわかった。この多重変異体においては、各変異点の効果が加わって、より優れた基質特異性が発揮されているといえる。
　さらに、表３に示すとおり、配列番号１の１２３位のトリプトファンをバリンに単独で置換した単独変異体と比較して、配列番号１の１２３位のトリプトファンをバリンに置換し、さらに１２１位のロイシンをメチオニンに置換した二重変異体において、Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％）、Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）およびＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）のいずれもが、より低減することがわかった。この多重変異体においては、各変異点の効果が加わって、より優れた基質特異性が発揮されているといえる。
（実施例５　酵素電極測定によるＭｕｃｏｒ属由来各種改変型ＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性評価）
（１）各種改変型Ｍｕｃｏｒ由来ＦＡＤ－ＧＤＨの粗酵素液の濃縮
　取得した上述の組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ５６９Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｖ１２２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｗ１２３Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹ－Ｓ６１２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－ＭｐＹＣ－Ｍ７８Ｎを用いて、それぞれＩｎｖ－Ｓｃ株を形質転換し、各種形質転換株を前培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース（ＢＤ）、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物（ｓｉｇｍａ社製）、２．０％（ｗ／ｖ）ラフィノース]１００ｍＬ中で３０℃にて２４時間培養した。その後、前培養液全量を１Ｌの本培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、２．５％（ｗ／ｖ）Ｄ－ガラクトース、０．７５％（ｗ／ｖ）ラフィノース]に加えて、３０℃で１６時間培養した。
　培養液を遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃、３０分）により菌体と培養上清に分離し、培養上清を回収した。その後、回収した培養上清を限外濾過膜ＡＩＰ－１０１３（旭化成ケミカルズ社製）により限外濾過処理し、続いてＡＭＩＣＯＮ　Ｕｌｔｒａ－１５　１０Ｋ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて酵素液の活性が１０００Ｕ／ｍＬ以上となるまで濃縮した。
（２）酵素電極測定による各種改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性評価
　上記で取得した、各種改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの濃縮粗酵素液を用いて、酵素電極測定による基質特異性評価を行った。具体的には、カーボンの作用電極、銀塩化銀の参照電極が印刷されてなる、ＤＥＰ　Ｃｈｉｐ電極（丸形・カーボン・ダムリング付き；バイオデバイステクノロジー社製）上に、終濃度３６４ｍＭのフェリシアン化カリウム、終濃度約１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び１０００Ｕ／ｍＬの各種粗酵素濃縮液を２μＬに溶解した液を載せ、３５℃で２０分間静置することにより、酵素の電極上への固定化（２Ｕ／ｓｒｔｉｐ）を行った。その後、ＤＥＰ　Ｃｈｉｐ専用コネクターを用いて、オートマチック ポラリゼーションシステム ＨＳＶ－１００（北斗電工社製）に接続した。そして、３００ｍＶの電圧を印加して、所定濃度のＤ－グルコース及びマルトース及びＤ－キシロース溶液２０μＬをそれぞれ電極上に載せて反応を行い、２０秒後の電流値を測定した。反応させた各基質濃度における電流応答値をプロットした結果を図２～図６に示す。また、それぞれの基質濃度２０ｍＭにおいて、Ｄ－グルコースへの反応性を１００％としたときのマルトースへの反応性（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））、およびＤ－グルコースへの反応性を１００％としたときのＤ－キシロースへの反応性（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図２から図６より、いずれのＭｕｃｏｒ属由来改変型ＦＡＤ－ＧＤＨにおいても、Ｄ－グルコース濃度と電流応答値が良好な相関関係を示しており、このことから、いずれのＭｕｃｏｒ由来改変型ＦＡＤ－ＧＤＨもＤ－グルコースの定量性に優れていることがわかった。
　しかし、Ｗ５６９Ｙのみの単独変異を有する改変型ＦＡＤ－ＧＤＨのＸｙｌ／Ｇｌｃ（％）が４％であるのに対し、Ｗ５６９Ｙ／Ｖ１２２Ｃの変異を有する改変型ＦＡＤ－ＧＤＨでは、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）が１９％となり、マルトースへの反応性はほとんど示されなかったが、Ｄ－キシロースへの反応性が顕著であることがわかった。
　一方、表４に示す通り、Ｗ５６９Ｙ、Ｗ５６９Ｙ／Ｗ１２３Ｖ、Ｗ５６９Ｙ／Ｓ６１２Ｃ、Ｗ５６９Ｙ／Ｓ６１２Ｃ／Ｍ７８Ｎの変異を有するＭｕｃｏｒ由来改変型ＦＡＤ－ＧＤＨでは、酵素電極測定による評価においても、マルトースやＤ－キシロースへほとんど反応性を示さないことがわかった。
　なお、実施例４の吸光度による測定系では、Ｗ５６９Ｙのみの変異を有する改変型ＦＡＤ－ＧＤＨにおいては、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）が０．５１２％であり、これに対し、Ｗ５６９Ｙ／Ｖ１２２Ｃの変異を有する改変型ＦＡＤ－ＧＤＨにおけるＸｙｌ／Ｇｌｃ（％）が０．９０１％であった。すなわち、実施例１から４での吸光度による測定系におけるＸｙｌ／Ｇｌｃ（％）の差がわずか０．５％程度の差である場合でも、酵素電極測定系における測定系で比較を行った場合には、その基質特異性の差異がより顕著に現れることがわかる。このことからも、本発明で見出された各種の基質特異性向上変異体が、特に、より低いＸｙｌ／Ｇｌｃ（％）および／またはＭａｌ／Ｇｌｃ（％）が求められ、その影響が大きく表れることが想定されるグルコースセンサー等への応用において、非常に有用であることが、強く示唆される。
（Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおける基質結合部位近傍に位置するアミノ酸の予測と変異導入による改良型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの作製、および基質特異性向上効果の検証２）
　実施例２に従って、P. amagasakiense由来のグルコース酸化酵素の立体構造を表示し、ＦＡＤのイソアロキサジン環のｒｅ面を囲むように位置するアミノ酸の候補として、さらに４２８位のアスパラギン酸を予想した。図１より、P. amagasakiense由来グルコース酸化酵素の４２８位のアスパラギン酸は、Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおいて、配列番号１の４７１位のアスパラギン酸に相当することが予想され、このアミノ酸がＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおいて基質結合部位近傍に位置することが予想された。そこで、配列番号１に４７１位のアスパラギン酸及びその周辺のアミノ酸に対して、各種アミノ酸へと置換する部位特異的変異を導入することとした。
　具体的には、表５に示した各種合成ヌクレオチドの組み合わせをプライマーとして用いることにより、実施例２に準じ、組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを鋳型として、目的とする部位特異的変異を導入した改変型ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドを作製した。作成した改変体の代表例を表５に示す。これらの改変体は、具体的には、配列番号１の４６５位のグルタミン酸がアスパラギン酸に、４６５位のグルタミン酸がグリシンに、４６５位のグルタミン酸がイソロイシンに、４６５位のグルタミン酸がアルギニンに、４６５位のグルタミン酸がロイシンに、４６５位のグルタミン酸がセリンに、４６５位のグルタミン酸がスレオニンに、４６５位のグルタミン酸がバリンに、４６５位のグルタミン酸がトリプトファンに、４６９位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４６９位のアスパラギンがグルタミンに、４６９位のアスパラギンがグルタミン酸に、４７１位のアスパラギン酸がアスパラギンに、４７１位のアスパラギン酸がグルタミン酸に、４７１位のアスパラギン酸がグルタミンに、４７３位のグルタミンがグルタミン酸に、４７３位のグルタミンがアスパラギンに、４７３位のグルタミンがアスパラギン酸に、４７４位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４７４位のアスパラギンがグルタミンに、４７４位のアスパラギンがグルタミン酸に、４７５位のアスパラギンがアスパラギン酸に、４７５位のアスパラギンがグルタミンに、４７５位のアスパラギンがグルタミン酸に置換された変異体であり、それぞれをコードする遺伝子を包含する組換え体プラスミドをｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６Ｗ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４６９Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４６９Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４６９Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｄ４７１Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｄ４７１Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｄ４７１Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ４７３Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ４７３Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ４７３Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７４Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７４Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７４Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７５Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７５Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７５Ｅと称した。
　上述の部位特異的変異を導入した改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６５Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｅ４６Ｗ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４６９Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４６９Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４６９Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｄ４７１Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｄ４７１Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｄ４７１Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ４７３Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ４７３Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ４７３Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７４Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７４Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７４Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７５Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７５Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ４７５Ｅを用いて、実施例２と同様にしてＩｎｖ－Ｓｃ株を形質転換し、各形質転換株の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を確認した。
　続いて、実施例２と同様に、（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ）比率（％）を測定した。結果を表５に示す。なお、測定値が「－」である変異体は、ＧＤＨ活性が著しく低下した、もしくはＧＤＨ活性が消失したことを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表５より、配列番号１の４６５位のグルタミン酸をアスパラギン酸に、４６５位のグルタミン酸をイソロイシンに、４６５位のグルタミン酸をアルギニンに置換することによりＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）が低減することがわかった。
　特に、配列番号１のグルタミン酸をアスパラギン酸に、４６５位のグルタミン酸をアルギニンに置換したものでは、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）が２０％以上低減し、基質特異性の向上度合が顕著であった。
　さらに、配列番号１のグルタミン酸をアスパラギン酸に、４６５位のグルタミン酸をアルギニンに置換した改変型ＦＡＤ－ＧＤＨにおいては、Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）がそれぞれ、７９％、７２％であり、Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）およびＸｙｌ／Ｇｌｃ比率（％）がいずれも２０％以上低減し、極めて高い基質特異性を有することがわかった。
（耐熱性向上型変異及び基質特異性向上型変異を導入したＦＡＤ－ＧＤＨ発現酵母株の取得及び性能評価）
　これまでに発明者らは、配列番号１の２３２位のバリンがグルタミン酸に、３８７位のスレオニンがアラニンに、５４５位のイソロイシンがスレオニンに置換された改変型ＦＡＤ－ＧＤＨが優れた耐熱性を有することを見出した。そこで、これら３つの耐熱性向上型変異を蓄積させた３重変異体に、さらに各種基質特異性向上型変異を蓄積させることで、耐熱性及び基質特異性に優れた改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを作製することにした。
　具体的には、配列番号１０６、１０７及び配列番号１０８、１０９及び配列番号１１０、１１１の合成ヌクレオチドの組み合わせをプライマーとして用いることにより、実施例２に準じ、組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを鋳型として部位特異的変異を順次導入し、配列番号１の２３２位のバリンがグルタミン酸に、３８７位のスレオニンがアラニンに、５４５位のイソロイシンがスレオニンに置換された改変型ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔを作製した。
　次に、組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔを鋳型として、表６に示した各種合成ヌクレオチドの組み合わせをプライマーとして用いることにより、目的とする部位特異的変異を導入した改変型ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドを作製した。作成した改変体を表６に示す。これらの改変体は、具体的には、配列番号１の２３２位のバリンがグルタミン酸に、３８７位のスレオニンがアラニンに、５４５位のイソロイシンがスレオニンに置換され、且つ１２１位のロイシンがメチオニンに、あるいは、且つ５６９位のトリプトファンがチロシンに、あるいは、且つ６１２位のセリンがシステインに、あるいは、且つ６１２位のセリンがスレオニンに置換された変異体であり、それぞれをコードする遺伝子を包含する組換え体プラスミドをｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｓ６１２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｓ６１２Ｔと称した。
　さらに、組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙを鋳型として、配列番号７７、７８の合成ヌクレオチドの組み合わせをプライマーとして用いることにより、配列番号１の２３２位のバリンがグルタミン酸に、３８７位のスレオニンがアラニンに、４６５位のグルタミン酸がアスパラギン酸に、５４５位のイソロイシンがスレオニンに、５６９位のトリプトファンがチロシンに置換された改変型ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｅ４６５Ｄ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙを作製した。
　上述の部位特異的変異を導入した改変型Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｓ６１２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｓ６１２Ｔ、ＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｅ４６５Ｄ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙを用いて、実施例２と同様にしてＩｎｖ－Ｓｃ株を形質転換し、各形質転換株の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を確認した後、実施例２と同様に、（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ）（％）、（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ）比率（％）を測定した。結果を表６に示す。
　続いて、同じ培養上清を用いて改変型ＦＡＤ－ＧＤＨの耐熱性評価を行った。具体的には、評価対象のＦＡＤ－ＧＤＨを約０．５Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（１０ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））にて希釈した。この酵素溶液（０．２ｍｌ）を２本用意し、そのうち１本は４℃で保存し、もう１本には、６０℃、１５分間の加温処理を施した。加温処理後、各サンプルのＦＡＤ－ＧＤＨ活性を測定し、４℃で保存したものの酵素活性を１００としたときの、６０℃、１５分間処理後の活性値を「残存活性（％）」として算出した。この残存活性（％）を、各種改変型ＦＡＤ－ＧＤＨの耐熱性評価の指標とした。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表６に示すとおり、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔに、Ｗ５６９Ｙ、Ｓ６１２Ｃ、Ｓ６１２Ｔを導入することにより、導入前と比べて基質特異性が向上した。また、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙに、Ｅ４６５Ｄを導入することにより、導入前に比べてさらに基質特異性が向上した。さらに、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５ＴにＷ５６９Ｙを導入した改変型ＦＡＤ－ＧＤＨでは、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔに比べて耐熱性も向上していることがわかった。
　続いて、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙ、及びＶ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｅ４６５Ｄ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙにおいて、Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率（％）を調べた。Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５ＴのＭａｌ／Ｇｌｃ比率（％）を１００％としたとき、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９ＹのＭａｌ／Ｇｌｃ比率（％）が３４％、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｅ４６５Ｄ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９ＹのＭａｌ／Ｇｌｃ比率（％）が４０％であり、マルトースへの反応性も低減していることがわかった。
　これらの結果から、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙ、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｓ６１２Ｃ、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｓ６１２Ｔ、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｅ４６５Ｄ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙは耐熱性及び基質特異性に優れていることがわかった。特に、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙ及びＶ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｅ４６５Ｄ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙは、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔと比べて、マルトース及びキシロースへの反応性が２０％以上低減していることに加え、さらに耐熱性も向上していることから非常に優れた変異体であることがわかった。
　以上のように、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、Ｄ－グルコースへの基質特異性が十分に高く、かつ、Ｄ－キシロースおよびマルトース等の、Ｄ－グルコース以外の糖化合物への反応性が十分に低いため、Ｄ－グルコース以外の糖化合物を多量に含有する条件下で試料中のＤ－グルコースを測定する場合や、酵素濃度の濃い条件下においても、Ｄ－グルコース濃度を正確に測定ができ、例えば、グルコースセンサーへの応用等において、従来のＦＡＤ－ＧＤＨを用いた場合に比べて、より高精度かつ高感度な測定が可能になることが期待される。

Claims (13)

  1. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列において、以下の（ａ）～（ｉ）：
    （ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列における７８位のメチオニンに対応する位置、
    （ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列における７９位のチロシンに対応する位置、
    （ｃ）配列番号１記載のアミノ酸配列における８１位のグルタミンに対応する位置、
    （ｄ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２１位のロイシンに対応する位置、
    （ｅ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２２位のバリンに対応する位置、
    （ｆ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置、
    （ｇ）配列番号１記載のアミノ酸配列における４６５位のグルタミン酸に対応する位置、
    （ｈ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置、及び
    （ｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列における６１２位のセリンに対応する位置
    よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））、および／またはＤ－グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））が低減していることを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  2. 　以下（ｊ）～（ｒ）：
    （ｊ）配列番号１記載のアミノ酸配列における７８位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、グルタミン、システイン又はアスパラギンのいずれかである、
    （ｋ）配列番号１記載のアミノ酸配列における７９位のチロシンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニン又はアスパラギンのいずれかである、
    （ｌ）配列番号１記載のアミノ酸配列における８１位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、フェニルアラニン又はアスパラギンのいずれかである、
    （ｍ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がシステイン又はメチオニンのいずれかである、
    （ｎ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アラニン又はシステインのいずれかである、
    （ｏ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がシステイン、ファニルアラニン、ヒスチジン、バリン又はセリンのいずれかである、
    （ｐ）配列番号１記載のアミノ酸配列における４６５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン酸又はイソロイシンのいずれかである、
    （ｑ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がファニルアラニン又はチロシンのいずれかである、及び
    （ｒ）配列番号１記載のアミノ酸配列における６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がシステイン又はスレオニンのいずれかである
    よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  3. 　配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファン残基に対応する位置のアミノ酸がチロシンに置換されたことを特徴とする、請求項１に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  4. 　配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファン残基に対応する位置のアミノ酸がファニルアラニン又はバリンに置換されたことを特徴とする、請求項１に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  5. 　以下（ｗ）～（ａｉ）：
    （ｗ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、７８位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギンのいずれかである、
    （ｘ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、１２１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
    （ｙ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、１２２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がシステインである、
    （ｚ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニン又はバリンのいずれかである、
    （ａａ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がシステイン又はスレオニンのいずれかである、
    （ａｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列における５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、７８位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がシステインである、
    （ａｃ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンであり、かつ、１２１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
    （ａｄ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
    （ａｅ）配列番号１記載のアミノ酸配列における１２３位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がバリンであり、かつ、１２１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
    （ａｆ）配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
    （ａｇ）配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がシステインである、
    （ａｈ）配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、６１２位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、又は
    （ａｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、３８７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、４６５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、５４５位のイソロイシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、５６９位のトリプトファンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
    のアミノ酸置換を有する、請求項１に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  6. 　Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））および／またはＤ－グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））が、前記の置換を導入する前と比較して２０％以上低減していることを特徴とする、請求項１～５記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
  8. 　請求項７記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、組換えベクター。
  9. 　請求項８記載の組換え体ベクターを含む、宿主細胞。
  10. 　以下の工程：
    （ａｊ）請求項９に記載の宿主細胞を培養する工程、
    （ａｋ）前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程、及び
    （ａｌ）前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを単離する工程
    を含むフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法。
  11. 　請求項１～６に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とする、グルコース測定方法。
  12. 　請求項１～６に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースアッセイキット。
  13. 　請求項１～６に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサー。
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