CN103981157A - 黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，该酶(1)具有催化在电子受体存在下氧化葡萄糖的羟基而生成葡萄糖酸-δ-内酯的反应的作用，(2)通过SDS-聚丙烯酰胺电泳测得的分子量为约100kDa，通过凝胶过滤色谱法测得的分子量为约400kDa，(3)对麦芽糖、D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖的反应性低。而且，还提供了生产该酶的米曲霉。而且，还提供了采用该酶的葡萄糖测定法、葡萄糖测定用试剂和葡萄糖测定用试剂盒。

Description

黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶
本申请为专利申请200780019640.5（申请日：2007年5月25日，发明创造名称：黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶）的分案申请。
技术领域
本发明涉及辅酶结合型葡萄糖脱氢酶及其用途。本发明具体涉及以黄素腺嘌呤双核苷酸作为辅酶的葡萄糖脱氢酶，以及该酶的生产菌、该酶的制造方法、使用该酶的葡萄糖测定法等。
背景技术
近年来，广泛应用的是采用电化学生物传感器的简易型自我血糖测定器。生物传感器是在绝缘性的基板上形成电极、酶反应层而形成的。作为其中可以使用的酶，可以例举葡萄糖脱氢酶(GDH)、葡萄糖氧化酶(GO)等。现已指出使用GO的方法容易受到测定试样中所溶解氧的影响，溶解氧对测定结果产生影响这样的问题。
另一方面，作为不受溶解氧影响且在不存在NAD(P)下作用于葡萄糖的酶，已知有以吡咯喹啉醌(PQQ)作为辅酶的GDH(PQQ-GDH)(例如，参照专利文献1-3)。但是，PQQ-GDH中却存在着如下问题：(1)PQQ容易被酶解离，(2)对葡萄糖选择性低，以及(3)由于一般存在于膜馏分中因此其提取·分离操作有困难等。
可是，近年来报道了，在医院使用简易血糖自我测定器的患者中发生低血糖等的病例。随后的调查分析的结果是，PQQ-GDH与作为输液成分而含有的麦芽糖反应，显示出比实际血糖值更高的值，从而清楚了其是这种发病例的原因(医药品·医药用具等安全性情报206号(Pharmaceuticals and Medical Devices Safety Information No.206)，平成16年(2004年)10月，厚生劳动省医药食品局)。由于有这样的事情，而迫切希望开发特异性作用于葡萄糖，尤其是与麦芽糖的作用性低的血糖测定用酶。
而且，除了PQQ-GDH之外，作为不受溶存氧的影响且在不存在NAD(P)下与葡萄糖作用的酶，已知有以黄素腺嘌呤双核苷酸作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(本说明书中也称为“FAD-GDH”)。迄今为止分别从米曲霉(Aspergillus oryzae)(非专利文献1～4)和土曲霉(Aspergillusterreus)(专利文献4)中获得了FAD-GDH。
专利文献1：特开2000-350588号公报
专利文献2：特开2001-197888号公报
专利文献3：特开2001-346587号公报
专利文献4：国际公开第2004/058958号小册子
非专利文献1：Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.I.Induction of its synthesis by p-benzoquinone andhydroquinone,T.C.Bak,andR.Sato,Biochim.Biophys.Acta,139,265-276(1967).
非专利文献2：Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.II.Purification and physical and chemical properties,T.C.Bak,Biochim.Biophys.Acta,139,277-293(1967).
非专利文献3：Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.III.General enzymatic properties,T.C.Bak,Biochim.Biophys.Acta,146,317-327(1967).
非专利文献4：Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.IV.Histidyl residue as an active site,T.C.Bak,andR.Sato,Biochim.Biophys.Acta,146,328-335(1967).
发明内容
本发明是在上述背景下以提供可以更正确地测定葡萄糖量的新酶及其生产菌以及其用途作为课题。
本发明人为了解决上述课题，首先关注于以黄素腺嘌呤双核苷酸作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)。而且，以广泛微生物作为对象进行筛选的结果是，发现了在FAD-GDH的生产性上优异的菌株。鉴定的结果判明为米曲霉（Aspergillus oryzae）。而且，还成功纯化出该菌株生产的FAD-GDH，确定其各种性状。根据所确定的各种性状，判断该FAD-GDH是一种新酶。而且，还表明该FAD-GDH对葡萄糖的选择性优异，而且难以受到存在于反应系中的溶解氧的影响，可以更正确地测定试样中的葡萄糖量。另一方面，确认了其它菌株(米曲霉)生产与该FAD-GDH同等的酶。
进一步研究的结果是，成功确定了上述菌株所具有的FAD-GDH的氨基酸序列以及编码它的基因的序列。
本发明基于上述认识及成果，提供如下所示的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶等。
[1]具备以下性状的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，
(1)作用：催化在电子受体存在下氧化葡萄糖的羟基而生成葡萄糖酸-δ-内酯的反应，
(2)分子量：通过SDS-聚丙烯酰胺电泳测得的分子量为约100kDa，通过凝胶过滤色谱法测得的分子量为约400kDa，
(3)底物特异性：对麦芽糖、D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖的反应性低。
[2]根据[1]中记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时对麦芽糖的反应性为5%以下。
[3]根据[1]或[2]中记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时对D-半乳糖的反应性为5%以下。
[4]根据[1]～[3]中任一项记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时对D-果糖和D-甘露糖的反应性均为5%以下。
[5]根据[1]～[4]中任一项记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其还具备以下性状：
(4)最适pH:7附近，
(5)最适温度:60℃附近，
(6)pH稳定性:在pH3.0～7.0的范围内稳定，
(7)温度稳定性:在40℃以下稳定。
[6]根据[1]～[5]中任一项记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其还具备以下性状：
(8)Km值：对于D-葡萄糖的Km值为约8mM。
[7]根据[1]～[6]中任一项记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其是来源于米曲霉的酶。
[8]根据[1]～[7]中任一项记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其特征在于，具有序列号20所示的氨基酸序列，或与该氨基酸序列同源的氨基酸序列。
[9]具有生产黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶能力的保藏编号为NITE BP-236的米曲霉BB-56。
[10]黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶基因，其由选自以下的(A)～(C)中任意一个DNA构成：
(A)编码序列号20所示的氨基酸序列的DNA；
(B)由序列号19所示的碱基序列构成的DNA；
(C)具有与序列号19所示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。
[11]含有[10]中记载的基因的载体。
[12]导入了[10]中记载的基因的转化体。
[13]黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的制造方法，其包括以下的步骤(1)和(2)、或步骤(i)和(ii):
(1)培养具有生产[7]中记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶能力的米曲霉的步骤；
(2)由培养后的培养液和/或菌体回收黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的步骤；
(i)在产生前述基因编码的蛋白质的条件下培养[12]中记载的转化体的步骤；
(ii)回收产生的前述蛋白质的步骤。
[14]葡萄糖测定法，其特征在于，使用[1]～[8]中任一项记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶测定试样中的葡萄糖。
[15]葡萄糖测定用试剂，其特征在于，含有[1]～[8]中任一项记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶。
[16]葡萄糖测定用试剂盒，其含有[15]中记载的葡萄糖测定用试剂。
附图说明
图1：米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的SDS-PAGE。两端的泳道，为分子量标记，自上依次为磷酸化酶b(97kDa)、白蛋白(66kDa)、卵白蛋白(45kDa)、碳酸酐酶(30kDa)、胰蛋白酶抑制剂(20.1kDa)、α-乳清蛋白(14.4kDa)。
图2：米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的经HPLC进行的分子量测定。(A)分子量标记。谷氨酸脱氢酶(290kDa,11.508min)，乳酸脱氢酶(142kDa,13.012min)，烯醇酶(67kDa,14.643min)，肌激酶(32kDa,15.321min)，细胞色素C(12.4kDa,20.303min)(B)纯化FAD-GDH。
图3：米曲霉来源的FAD-GDH的分子量的比较。(A)分子量标记。按洗脱由快至慢顺序为谷氨酸脱氢酶(GLDH,290kDa)、乳酸脱氢酶(LDH,142kDa)，肌激酶(32kDa)。(B)、(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、(H)分别以米曲霉BB-56、IAM2603、IAM2628、IAM2683、IAM2736、IAM2706和NBRC30113来源的培养滤液作为试样。
图4：米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH在400－800nm处的吸收光谱。
图5：米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的最适pH。
图6：米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的最适温度。
图7：米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的pH稳定性。
图8：米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的温度稳定性。
图9：通过甘油密度梯度等电点电泳进行的米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的等电点的测定。
图10：米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH对于葡萄糖的双倒数作图法。
图11：米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的糖含量的测定。
图12：通过米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH进行的葡萄糖浓度的测定。
具体实施方式
(术语)
本发明中所谓“编码蛋白质的DNA”是指使之表达时可以获得该蛋白质的DNA，即具有对应于该蛋白质的氨基酸序列的碱基序列的DNA。因此也考虑密码子的简并。
本说明书中的术语“分离的”可以与“纯化的”交换使用。与本发明的酶(FAD-GDH)相关使用时的所谓“分离的”是指本发明的酶来源于天然材料时，该天然材料中基本不含该酶以外的成分(尤其是基本不含杂质蛋白质)的状态。具体而言，例如，在本发明的分离的酶中，杂质蛋白质的含量按重量换算，小于总重量的约20%，优选小于约10%，更优选小于约5%，更为优选小于约1%。另一方面，本发明的酶为用基因工程方法制备时的术语“分离的”是指基本不含来源于所使用的宿主细胞的其它成分或培养液等的状态。具体而言，例如，在本发明的分离的酶中，杂质成分的含量按重量换算，小于总重量的约20%，优选小于约10%，更优选小于约5%，更为优选小于约1%。而且，除非清楚表示与其不同的含义，本说明书中单独记载“黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶”时是指“分离状态的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶”。代替黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶而使用的术语“FAD-GDH”和“酶”也是同样的。
使用DNA时的“分离的”，在原本天然存在的DNA的情况中，典型的是指，与在天然状态中共存的其它核酸分离的状态。但是，在天然状态中可以含有邻接的核酸序列(例如启动子区域的序列和终止子序列等)等部分其它核酸成分。例如，在基因组DNA时的“分离的”状态中，优选基本不含天然状态中共存的其它的DNA成分。另一方面，cDNA分子等通过基因工程方法制备的DNA情况中的“分离的”状态中，优选基本不含细胞成分、培养液等。同样，通过化学合成制备DNA的情况中的“分离的”状态中，优选基本不含dNTP等前体(原材料)和合成过程中使用的化学物质等。而且，除非清楚表示与其不同的含义，本说明书中单独记载“DNA”时是指分离状态的DNA。
(FAD-GDH及其生产菌)
本发明的第1个方面提供以黄素腺嘌呤双核苷酸作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)及其生产菌。本发明的FAD-GDH(以下也称为“该酶”)的特征在于具备以下性状。首先，该酶催化以下反应，即在电子受体存在下氧化葡萄糖的羟基而生成葡萄糖酸-δ-内酯的反应。而且，通过SDS-聚丙烯酰胺电泳测得的该酶的分子量为约100kDa，通过凝胶过滤色谱法测得的该酶的分子量为约400kDa。而且，本发明的FAD-GDH由4聚体构成。
另一方面，该酶底物特异性优异，对D-葡萄糖选择性作用。详细而言，本发明的FAD-GDH对麦芽糖的反应性极低，对D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖等的反应性也非常低。具体而言，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时，对这些底物的反应性均在5%以下。本发明的优选方式中对麦芽糖的反应性在1%以下或基本没有发现反应性。在更为优选的方式中，对D-果糖的反应性和D-半乳糖的反应性均为1%以下或基本没有发现反应性。具有以上优异的底物特异性的该酶，优选作为用于正确测定试样中的葡萄糖量的酶。即，如果用该酶，即使在试样中存在麦芽糖或半乳糖等杂质时也可以更为正确地测定目的葡萄糖量。因此，该酶可以说适于预料或担心试样中存在这种杂质的用途（典型的是血液中的葡萄糖量的测定），而且也适于包括该用途的各种用途，即，也可以说通用性高。而且，该酶的反应性和底物特异性可以用后述的实施例中所示方法((1-2)栏，(7-1)栏，(7-2-2)栏)来测定、评价。
该酶优选为米曲霉来源的FAD-GDH。这其中所谓“米曲霉来源的FAD-GDH”是指被分类为米曲霉的微生物(可以是野生株，也可以是变异株)所生产的FAD-GDH或利用米曲霉(可以是野生株，也可以是变异株)的FAD-GDH基因通过基因工程方法获得的FAD-GDH。因此，由导入了从米曲霉中获得的FAD-GDH基因(或改变了该基因的基因)的宿主微生物所生产的重组体也相当于“米曲霉来源的FAD-GDH”。
该酶所来源的米曲霉，从说明的方便考虑，称为该酶的生产菌。作为该酶的生产菌的例子，可以列举后述的实施例所示的米曲霉BB-56、米曲霉IAM2603、米曲霉IAM2628、米曲霉IAM2683、米曲霉IAM2736、米曲霉IAM2706和米曲霉NBRC30113。在这些菌株中BB-56株对FAD-GDH生产性优异，是特别优选的生产菌。BB-56株保藏于如下规定的保藏机构中，可以容易地获得。
保藏机构：NITE生物技术本部专利微生物保藏中心(〒292-0818日本千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8)
保藏日(接受日)：2006年5月17日
保藏编号：NITE BP-236
而且，米曲霉IAM2603，米曲霉IAM2628，米曲霉IAM2683，米曲霉IAM2736和米曲霉IAM2706是保管于IAM培养物保藏中心(culture collection)(东京大学分子细胞生物学研究所细胞功能信息研究中心)的菌株，可以经过规定手续接受其发放。同样，米曲霉NBRC30113是保管于NBRC(独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术本部生物遗传资源部门)的菌株，可以通过规定手续接受其发放。
本发明人，如后述实施例所示，由米曲霉BB-56成功制备出具备以上性状(作用，分子量，底物特异性)的FAD-GDH。对获得的FAD-GDH进行详细研究的结果是，清楚了其还具备以下性状。
(4)最适pH：7附近，
(5)最适温度：60℃附近，
(6)pH稳定性：在pH3.0～7.0的范围内稳定，
(7)温度稳定性：在40℃以下稳定，
(8)Km值：就D-葡萄糖而言的Km值为约8mM，
(9)等电点：6.4附近。
这其中，就最适pH而言，如后述实施例所示，例如是在Mcllvaine缓冲液中测定的值，就最适温度而言，同样是例如PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)中测定的值。而且，在特定pH条件下，37℃处理30分钟时维持80%以上的活性时，可以称为在该pH条件下“稳定”。同样，在特定温度条件下，在适当的缓冲液中(例如，PIPES-NaOH缓冲液，pH6.5)中处理20分钟后发现活性基本没有降低(即维持约100%的活性)时，可以称为在该温度条件下“稳定”。Km值和等电点可以用后述的实施例中所示的方法(8栏，6栏)测定、评价。
如上所示，清楚了成功获得的该酶性状的详细内容。其结果是，判明了该酶对葡萄糖有选择性且亲合性高，而且稳定性优异，适于葡萄糖传感器等中的应用、实用化。
另一方面，清楚了该酶性状的详细内容的结果是，确认了其是与过去报道的辅酶结合型酶完全不同的酶。
而且，还确认了就以上例示的其它菌株而言，即米曲霉IAM2603、米曲霉IAM2628、米曲霉IAM2683、米曲霉IAM2736、米曲霉IAM2706和米曲霉NBRC30113，也生产具备与米曲霉BB-56所生产的FAD-GDH同等性状的FAD-GDH。
本发明人进一步研究的结果是，确定了米曲霉BB-56所带有的FAD-GDH的氨基酸序列。因此，由具有序列号20的氨基酸序列的蛋白质构成的这一特征可以进一步表征该酶。其中，一般而言，在对某种蛋白质的氨基酸序列的一部分实施改变时，存在改变后的蛋白质具有与改变前的蛋白质同等的功能的情况。即，存在氨基酸序列的改变对蛋白质的功能没有实质影响，蛋白质的功能在改变前后得以维持的情况。因此，本发明，作为其它形态，提供具有与序列号20所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列且具有FAD-GDH活性的蛋白质(以下也称为“同源蛋白质”)。其中所谓“同源的氨基酸序列”是指与序列号20所示的氨基酸序列部分不同，但这种差异对蛋白质的功能(在此为FAD-GDH活性)基本没有影响的氨基酸序列。
所谓“氨基酸序列部分不同”，典型是指由于构成氨基酸序列的1-数个氨基酸缺失、取代或1-数个氨基酸添加、插入或它们的组合而发生氨基酸序列变异(变化)。这里的氨基酸序列的不同只要FAD-GDH活性得以保持就是允许的(也可以存在活性稍微变化)。只要满足该条件，氨基酸序列不同的位置没有特别限定，而且可以在多个位置产生差异。这里的所谓多个是相当于例如小于所有氨基酸的约30%的数目，优选相当于小于约20%的数目，更优选是相当于小于约10%的数目，更优选是相当于小于约5%的数目，最优选是相当于小于约1%的数目。即，同源蛋白质与序列号20的氨基酸序列具有例如约70%以上，优选约80%以上，更优选约90%以上，更优选约95%以上，最优选约99%以上的同一性。
优选为，通过使在FAD-GDH活性所非必需的氨基酸残基中发生保守的氨基酸取代而获得同源蛋白质。其中所谓“保守的氨基酸取代”是指将某个氨基酸残基取代为具有相同性质侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链可以分类为像碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组胺酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，非电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组胺酸)这样的几个家族。保守的氨基酸取代优选为同一个家族内的氨基酸残基间的取代。
但是，两个氨基酸序列或两个核酸(以下，使用“两个序列”作为包括它们的用语)的同一性(%)可以通过例如以下程序确定。首先，按可以进行最合适的比较的方式排列两个序列(例如，可以在第一个序列中导入缺口（gap）使得与第二序列的比对最适化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列中对应位置的分子相同时，可以说该位置的分子同一。两个序列的同一性是这两个序列中共同的同一位置数的函数(也就是说，同一性(%)=同一位置数/位置的总数×100)，优选也考虑比对最适化所需要的缺口数和大小。
两个序列的比较和同一性的确定可以使用数学算法实现。作为序列的比较中可以利用的数学算法的具体例子，有记载于Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68中的，在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77中改变的算法，但不限于此。这种算法，整合到记载于Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10中的NBLAST程序和XBLAST程序(版本2.0)中。为了获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列，可以例如用NBLAST程序，以score＝100，wordlength＝12，进行BLAST核苷酸检索。为了获得与本发明的多肽分子同源的氨基酸序列，可以例如用XBLAST程序，以score＝50，wordlength＝3，进行BLAST多肽检索。为了获得用于比较的缺口比对，可以使用记载于Altschul等人(1997)Amino Acids Research25(17):3389-3402中记载的GappedBLAST。在使用BLAST和Gapped BLAST时可以使用对应的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。详细请参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov。作为可以在序列比较中使用的其它数学算法的例子，有记载于Myers和Miller(1988)Comput Appl Biosci.4:11-17中的算法。这种算法整合到例如在GENESTREAM网络服务器(IGHMontpellier，法国)或ISREC服务器上可以利用的ALIGN程序中。氨基酸序列的比较中使用ALIGN程序时，可以使用例如PAM120残基质量表，设为缺口长度罚分（penalty）=12，缺口罚分＝4。
用GCG软件包的GAP程序，用Blossom62matrix或PAM250matrix，以缺口权重＝12、10、8、6或4，缺口长度权重=2、3或4来确定两个氨基酸序列的同一性。并且，可以使用GCG软件包(在http://www.gcg.com上可以使用)的GAP程序，以缺口权重＝50，缺口长度权重=3确定两个核酸序列的同源度。
具有上述氨基酸序列的该酶可以通过基因工程方法容易地制备。例如，可以通过用编码该酶的DNA转化适当的宿主细胞(例如，大肠杆菌)，回收转化体内表达的蛋白质来制备。回收的蛋白质根据目的适当纯化。作为这样的重组蛋白质，如果要获得该酶，可以进行各种修饰。例如，在相同载体中插入编码该酶的DNA和其它适当的DNA，若用该载体进行重组蛋白质的生产，则可以获得由连结了任意的肽或者蛋白质的重组蛋白质构成的该酶。而且，还可以实施糖链和/或脂质的添加或发生N末端或C末端的加工这样的修饰。通过以上的这种修饰，可以进行重组蛋白质的提取，可以使得纯化简便，或者可以增加生物学功能。
(编码FAD-GDH的DNA)
本发明的第2方面在于提供编码该酶的基因，即新的FAD-GDH基因。在一个方式中，本发明的基因由编码序列号20的氨基酸序列的DNA构成。该方式的具体例子为由序列号19所示的碱基序列构成的DNA。
结果是，一般而言，对编码某蛋白质的DNA的一部分实施改变时，也存在改变后的DNA编码的蛋白质具有与改变前的DNA所编码的蛋白质相同的功能的情况。也就是说，存在DNA序列的改变对编码的蛋白质的功能没有实质影响，编码的蛋白质的功能在改变前后被维持的情况。因此，本发明的其它方式为，提供具有与序列号19所示的碱基序列同源的碱基序列且编码具有FAD-GDH活性的蛋白质的DNA(以下，也称为“同源DNA”)。其中所谓“同源的碱基序列”是指一部分与序列号19所示的核酸不同，而这种不同对其所编码的蛋白质的功能(这里是FAD-GDH活性)没有实质影响的碱基序列。
同源DNA的具体例子是与序列号19所示的碱基序列互补的碱基序列在严紧条件下杂交的DNA。其中所谓的“严紧条件”是指形成所谓特异的杂交，不形成非特异的杂交的条件。这种严紧的条件可以参照本领域技术人员公知的例如《分子克隆》(第3版，冷泉港实验室出版社，纽约)和Current protocols in molecular biology(由FrederickM.Ausubel等人编辑，1987)进行设定。作为严紧条件，可以例举例如用杂交液(50％甲酰胺，10×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠，pH7.0)，5×Denhardt溶液，1%SDS，10%右旋糖酐硫酸酯，10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA，50mM磷酸缓冲液(pH7.5))，在约42℃～约50℃下温育，然后用0.1×SSC、0.1％SDS，在约65℃～约70℃下清洗的条件。作为更为优选的严紧条件，可以例举例如采用作为杂交液的50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠，pH7.0)、1×Denhardt溶液、1%SDS、10%右旋糖酐硫酸酯、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5)的条件。
作为同源DNA的其它具体例子，可以例举由以序列号19所示的碱基序列作为基准含有1个或多个碱基的取代、缺失、插入、添加或倒位的碱基序列构成的、编码具有FAD-GDH活性的蛋白质的DNA。碱基的取代或缺失等可以在多个部位发生。其中所谓“多个”根据该DNA编码的蛋白质的立体结构中氨基酸残基的位置、种类而不同，例如为2-40个碱基，优选2-20个碱基，更优选2-10个碱基。可以利用例如限制性内切酶处理，通过核酸外切酶、DNA连接酶等进行的处理，通过定点突变导入法(《分子克隆》，第3版，第13章，冷泉港实验室出版社，纽约)、随机突变诱导法(《分子克隆》，第3版，第13章，冷泉港实验室出版社，纽约)进行的变异的导入等，通过将具有序列号19所示的碱基序列的DNA改变成含有碱基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位，从而可以获得以上这种同源DNA。而且，通过紫外线照射等其它方法也可以获得同源DNA。
作为同源DNA的其它例子，可以例举由于以SNP(单核苷酸多态性)为代表的多态性而出现如上文所述的碱基差异的DNA。
本发明的基因可以参照本说明书或所附的序列表所公开的序列信息，通过使用标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生物化学方法等制备成分离的状态。具体而言，从适当的丝状菌类、酵母菌类的基因组DNA文库或cDNA文库，或丝状菌类、酵母菌类的菌体内提取液中，适当利用可以与本发明的基因特异性杂交的寡核苷酸探针、引物来进行制备。寡核苷酸探针、引物可以使用市售的自动化DNA合成装置等容易地合成。而且，在用于制备本发明的基因中使用的文库的制备方法，可以参照例如《分子克隆》，第3版，冷泉港实验室出版社，纽约。
例如，如果是具有序列号19所示的碱基序列的基因，可以利用以该碱基序列或其互补序列的全部或一部分作为探针的杂交法进行分离。而且，可以利用采用被设计成与该碱基序列的一部分特异性杂交的合成寡核苷酸引物的核酸扩增反应(例如PCR)进行扩增和分离。
(载体)
本发明的另一个方面涉及含有本发明的基因的载体。本说明书中的术语“载体”是指可以将插入于其中的核酸分子向细胞等目标内输送的核酸性分子，其种类和形态并没有特别的限定。因此，本发明的载体可以获得质粒载体、柯斯质粒载体、噬菌体载体、病毒载体(腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒、疱疹病毒等)的形态。
根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，并考虑宿主细胞的种类可选择适当的载体。若要举载体具体的例子，有以大肠杆菌作为宿主的载体(M13噬菌体或其变异体、λ噬菌体或其变异体、pBR322或其变异体(pB325、pAT153、pUC8等)等)，以酵母作为宿主的载体(pYepSecl、pMFa、pYES2等)，以昆虫细胞作为宿主的载体(pAc、pVL等)，以哺乳类细胞作为宿主的载体(pCDM8、pMT2PC等)等。
本发明的载体优选为表达载体。所谓“表达载体”是指可以将插入于其中的核酸导入于目的细胞(宿主细胞)内，而且可以在该细胞内表达的载体。表达载体通常含有插入的核酸的表达所必需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。还可以使用含有选择标记的表达载体。在使用这种表达载体时，可以利用选择标记确认表达载体是否导入(及其程度)。
本发明的基因向载体的插入、选择标记基因的插入(必要时)、启动子的插入(必要时)等，可以使用标准的重组DNA技术(例如，可参照《分子克隆》，第3版，1.84，冷泉港实验室出版社，纽约，使用限制性酶和DNA连接酶的公知方法)进行。
(转化体)
本发明还涉及导入了本发明的基因的转化体。本发明的转化体中，本发明的基因作为外来性分子而存在。本发明的转化体优选通过使用上述本发明的载体的转染或转化来制备。转染、转化可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Potter,H et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,7161-7165(1984))、lipofection(Felgner,P.L.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,7413-7417(1984))、微注射(Graessmann,M.&Graessmann,A.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73,366-370(1976))、Hanahan的方法(Hanahan,D.,J.Mol.Biol.166,557-580(1983))、醋酸锂法(Schiestl,R.H.etal，Curr.Genet.16，339-346(1989))、原生质体-聚乙二醇法(Yelton,M.M.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.81,1470-1474(1984))等实施。
作为宿主细胞，可以例示大肠杆菌等细菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、毕氏酵母(pichia pastoris)、丝状真菌细胞(例如米曲霉、黑曲霉)等。
(FAD-GDH的制造方法)
本发明的另一个方面在于提供FAD-GDH的制备方法。在本发明的制造方法的一个方式中，进行培养具有该酶(FAD-GDH)的生产能力的微生物的步骤(步骤(1))和从培养后的培养液和/或菌体中回收黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的步骤(步骤(2))。
作为步骤(1)中使用的微生物，可以使用例如上述的米曲霉BB-56等。培养法和培养条件，只要是生产目的酶的条件，则没有特别的限定。即，作为生产该酶的条件，可以适当设定适于所使用的微生物的培养的方法、培养条件。以下，作为培养条件，例示培养基、培养温度和培养时间。
作为培养基，如果是所使用的微生物可以生长的培养基，则可以是任意一种。例如，可以使用添加了葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源，以及硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、醋酸铵或蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麸子、肉提取物等氮源，以及钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。在培养基中还可以添加用于促进所使用的微生物生长的维生素、氨基酸等。将培养基的pH调整到例如约3～8，优选约5～7左右，在培养温度通常为约10～50℃，优选约25～35℃左右，在好氧条件下培养1～15天，优选3～7天左右。作为培养方法，可以使用例如振荡培养法、通过发酵罐进行的好氧深度培养法。
在以上的条件下培养后，由培养液或菌体回收FAD-GDH(步骤(2))。从培养液回收时，可以通过例如过滤、离心处理等从培养上清中除去不溶物后，适当组合通过超滤膜进行的浓缩，硫酸铵沉淀等盐析、透析、各种色谱法等进行分离、纯化，来获得该酶。
另一方面，由菌体回收时，可以通过例如用加压处理、超声波处理等破碎菌体后，与上述同样方式进行分离、纯化而获得该酶。而且，可以在通过过滤、离心处理等从培养液中预先回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、纯化)。
而且，在各纯化工序中作为原则以FAD-GDH活性作为指标进行分离，继续进行以下步骤。但是，在通过预备试验等已经可以设定合适的条件时，没有这种限制。
本发明的其它方式中，用上述转化体制造FAD-GDH。这种方式的制造方法首先在导入其中的基因所编码的蛋白质能产生的条件下培养上述转化体(步骤(i))。对于各种载体宿主系统而言的转化体的培养条件是公知的，只要是本领域技术人员就可以容易地设定合适的培养条件。培养步骤后，继续回收所产生的蛋白质(即FAD-GDH)(步骤(ii))。可以与上述方式的情况一样进行回收和之后的纯化。
该酶的纯化程度没有特别限定，例如，可以纯化到比活性为50～160(U/mg)，优选比活性为100～160(U/mg)的状态。而且，最终的形态可以是液状，也可以是固状(包括粉状)。
(FAD-GDH的用途)
本发明的另一个方面涉及该酶的用途。该方面中，首先提供采用该酶的葡萄糖测定法。本发明的葡萄糖测定法中，利用通过该酶的氧化还原反应来测定试样中的葡萄糖量。本发明可以在例如血糖值的测定、食品(调味品、饮料等)中的葡萄糖浓度的测定等中利用。而且，在发酵食品(例如食用醋)或发酵饮料(例如啤酒、酒)的制造工序中可以利用本发明来检测发酵度。该酶，由于辅酶FAD总是与GDH结合，因此在测定时不需要添加辅酶，因此可以构建简便的测定系统。
本发明还提供了一种含有该酶的葡萄糖测定用试剂。该试剂在上述本发明的葡萄糖测定法中使用。
本发明还提供一种用于实施本发明的葡萄糖测定法的试剂盒(葡萄糖测定用试剂盒)。本发明的试剂盒除了包含该酶的葡萄糖测定用试剂之外，还含有作为任意要素的反应用试剂、缓冲液、葡萄糖标准液等。而且，本发明的葡萄糖测定试剂盒中通常附带使用说明书。
实施例
1.FAD-GDH生产菌的筛选
(1-1)米曲霉的培养
用以下的方法培养米曲霉的7个菌株(BB-56、IAM2603、IAM2628、IAM2683、IAM2736、IAM2706、NBRC30113)。
(1-1-1)前培养
在容积为300mL的三角烧瓶中分注由0.2%(w/v)酵母提取物(Becton,Dichinson公司)、1.0％(w/v)大豆蛋白胨(DMV公司)、2.0%(w/v)葡萄糖(和光纯药工业株式会社)、0.1%(w/v)KH2PO4(和光纯药工业株式会社)和0.05%(w/v)MgSO4·7H2O(pH5.7)(SIGMA-ALDRICH Japan公司)组成的50mL培养基，于121℃、0.12MPa条件下杀菌20分钟。冷却后，用5×5mm方形斜面接种米曲霉各菌株，于30℃、200rpm进行3天前培养。
(1-1-2)正式培养
在容积为300mL的三角烧瓶中分注由15.0%(w/v)葡萄糖、3.0％(w/v)Meast P1G(ASAHI FOOD＆HEALTHCARE公司)、6.0％(w/v)大豆蛋白胨、0.3%(w/v)KH2PO4、0.2%(w/v)K2HPO4(和光纯药工业株式会社)和4mM对苯二酚(pH6.0)(和光纯药工业株式会社)组成的50mL培养基，于121℃，0.12MPa条件下杀菌20分钟。冷却后，接种1mL上述前培养的培养液，于30℃，200rpm培养4天。培养终止后，用No.2号滤纸(Advantech公司)过滤培养液，确认各菌株的培养滤液有无FAD-GDH活性。
(1-2)FAD-GDH活性的检测
FAD-GDH催化在电子受体存在下氧化葡萄糖的羟基而生成葡萄糖酸-δ-内酯的反应。FAD-GDH活性的检测在下述反应系统中进行。
(1)D-葡萄糖＋PMS→D-葡萄糖酸-δ-内酯+还原型PMS
(2)2还原型PMS+NTB→2PMS+二甲腊（Diformazan）
而且，式中的PMS表示吩嗪硫酸甲酯（Phenazine methosulfate），NTB表示硝基四氮唑蓝(Nitrotetrazolium blue)。
反应(1)中，伴随葡萄糖的氧化生成还原型PMS，再在570nm的波长下测定反应(2)中通过由还原型PMS进行的NTB的还原而生成的二甲腊。
酶活性(单位)用以下计算式计算。
而且，式中的Vt表示总液量，Vs表示试样量，20.1表示二甲腊的每0.5μmol的吸光系数(cm2/0.5μmol)，1.0表示光路长(cm)，df表示稀释倍数。
混合2.55mL含有0.22%(w/v)TritonX-100的50mM PIPES-NaOH缓冲液pH6.5、0.09mL1M D-葡萄糖溶液、0.2mL的3mM PMS溶液和0.1mL6.6mM NTB溶液，于37℃保温5分钟后，添加0.1mL上述培养滤液，开始反应。在进行酶反应的同时生成在570nm有吸收的二甲腊。通过测定每1分钟的570nm的吸光度的增加，测定FAD-GDH活性。
其结果是，米曲霉BB-56、IAM2603、IAM2628、IAM2683、IAM2736、IAM2706、NBRC30113来源的培养滤液中检测出FAD-GDH活性(表1)。尤其是，米曲霉BB-56和NBRC30113的生产性优异。
[表1]
表1.FAD-GDH生产菌的筛选
2.FAD-GDH的生产和酶的纯化
(2-1)菌株的培养
培养米曲霉BB-56使FAD-GDH生产。制备由0.2%(w/v)酵母提取物、0.5％(w/v)大豆蛋白胨、2.0%(w/v)葡萄糖、0.1%(w/v)KH2PO4、0.05%(w/v)MgSO4·7H2O(pH5.7)组成的前培养培养基。将50mL液体培养基分注于300mL三角烧瓶中，于121℃、0.12MPa条件下杀菌20分钟后，接种米曲霉BB-56，于30℃、200rpm条件下培养3天。
FAD-GDH的生产在由以下成分组成的正式培养的培养基中进行：10.0%(w/v)葡萄糖、2.0％(w/v)Meast P1G、4.0％(w/v)大豆蛋白胨、0.3%(w/v)KH2PO4、0.2%(w/v)K2HPO4和4mM对苯二酚(pH6.0)。在30L发酵罐中于121℃、0.12MPa，以200rpm对正式培养的20L培养基杀菌20分钟后，冷却到30℃。将上述前培养的200mL培养液接种到正式培养的培养基中，于30℃、350rpm、0.05MPa、0.75vvm的通气量培养4天，从而进行FAD-GDH的生产。
(2-2)FAD-GDH的纯化
通过采用二氧化硅＃600S(Chuo Silika公司)的硅藻土过滤如上述方式获得的30L发酵罐的15.0L培养液，除去培养液中的菌体及其它固体成分。用超滤膜(ACP-3013,13000穿过，旭化成株式会社，以下相同)将通过该操作获得的16.4L澄清液脱盐、浓缩成3.0L。用90%的饱和硫酸铵对该浓缩液进行盐析处理，通过超滤膜对离心上清进行脱盐(10mmol/L Mcllvaine缓冲液pH5.5)、浓缩，调整成pH5.5、导电率1.10mS/cm。将该脱盐浓缩液加到用10mmol/L Mcllvaine缓冲液pH5.5平衡化的CM-Sepharose Fast Flow(柱容积1000mL，AmershamBiosciences)上，使FAD-GDH吸附于柱上。用10mmol/L Mcllvaine缓冲液pH5.5清洗柱后，用含有0.1mol/L NaCl的10mmol/L Mcllvaine缓冲液pH5.5使FAD-GDH洗脱，回收FAD-GDH活性成分。用超滤膜浓缩回收的活性成分，将该浓缩液加到用含有2.5mol/L硫酸铵的10mmol/L K2HPO4-NaOH缓冲液pH6.5平衡化的Octyl-Sepharose(柱容积200mL)，使FAD－GDH吸附于柱上。用含有2.5mol/L硫酸铵的10mmol/L K2HPO4-NaOH缓冲液pH6.5清洗柱后，通过将相同缓冲液中的硫酸铵的浓度阶段性改变到2.0、1.5、1.0、0.5mol/L，使FAD-GDH洗脱。回收FAD-GDH的活性成分，用超滤膜脱盐(20mmol/LK2HPO4-NaOH缓冲液pH6.5)、浓缩。将该脱盐浓缩液加到用20mmol/LKH2PO4-NaOH pH6.5缓冲液平衡化的DEAE-Sepharose CL-6B(柱容积50mL，Amersham Biosciences)，通过20mmol/L KH2PO4-NaOHpH6.5缓冲液使FAD-GDH洗脱。通过用超滤膜对该成分脱盐(10mmol/LKH2PO4-NaOH pH6.5)、浓缩，获得了FAD-GDH的纯化酶标准品。如表2所示，纯化酶的收率是硅藻土滤液的14%的收率，比活性上升至约41000倍。
[表2]
表2FAD-GDH纯化的总结
3.分子量的测定
(3-1)通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行的FAD-GDH分子量测定
通过SDS-PAGE测定米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的分子量。凝胶采用Homogeneous12.5(GE Healthcare Bio-Sciences)，分子量标记使用蛋白质分子标记14.4-97kDa(GE Healthcare Bio-Sciences)，通过PhastSystem(GE Healthcare Bio-Sciences)进行。用PhastGel BlueR(考马斯R350染色)染色凝胶上的蛋白质条带，检测出蛋白质。其结果是，在分子量100kDa附近检测出单一条带(图1)。
(3-2)通过凝胶过滤色谱法进行的FAD-GDH分子量的测定
通过用HPLC(LC-10AD VP，株式会社岛津制作所)进行的凝胶过滤色谱法测定米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的分子量。将25μL纯化的FAD-GDH溶液加到用含有0.3M NaCl的50mM磷酸缓冲液pH6.9平衡化的TSK-gel G3000SW(7.5mmI.D.×30cm，TOSOH公司)，在柱温度25℃，流速0.7mL/min下用相同缓冲液洗脱，测定280nm的吸光度。用分子量标记(MW-标记蛋白，Oriental Yeast公司制)制成校正曲线，其结果显示纯化FAD-GDH的分子量为约400000的蛋白(图2)。
比较米曲霉BB-56、IAM2603、IAM2628、IAM2683、IAM2736、IAM2706、NBRC30113各菌株生产的FAD-GDH的分子量。将3mL的米曲霉BB-56、IAM2603、IAM2628、IAM2683、IAM2736、IAM2706、NBRC30113的培养滤液加到用0.1M KH2PO4-NaOH缓冲液pH6.5平衡化的Sephadex G-100(直径2.2cm×高度105cm，柱容积360mL，GEHealthcare Bio-Sciences)上，使FAD-GDH填充到柱上。用上述缓冲液洗脱填充的FAD-GDH，回收洗脱成分，用上述1.的方法测定各成分的FAD-GDH活性。通过分子量标记制作校正曲线，结果，每一种培养滤液都在分子量为约400000的位置检测到FAD-GDH活性(图3)。由此表明米曲霉BB-56、IAM2603、IAM2628、IAM2683、IAM2736、IAM2706、NBRC30113来源的FAD-GDH均为分子量为400000的蛋白质。
4.吸收光谱
用10mM磷酸缓冲液pH6.5稀释米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH，用吸光度计(株式会社岛津制作所)扫描400-800nm处的吸收光谱。其结果表明，黄素酶中在特有的460nm附近有极大吸收，由此确认该酶是黄素结合蛋白质(图4)。
5.FAD-GDH的最适pH·温度和pH·温度稳定性
(5-1)最适pH的研究
混合2.55mL含有0.22%(w/v)TritonX-100的100mM Mcllvaine缓冲液(调整到pH4.5、pH5.0、pH6.0、pH7.0或pH8.0)，0.1mL1M D-葡萄糖溶液，0.2mL3mM PMS溶液和0.1mL6.6mM NTB溶液，于37℃保温5分钟后，添加0.1mL米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH溶液，开始反应。通过在570nm的吸光度测定由酶反应生成的二甲腊，测定每1分钟二甲腊的生成量来测定酶活性。米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的最适pH为7.0(图5)。
(5-2)最适温度的研究
混合2.55mL含有0.22%(w/v)TritonX-100的50mM PIPES-NaOH缓冲液pH6.5、0.1mL1M D-葡萄糖溶液、0.2mL3mM PMS溶液和0.1mL6.6mM NTB溶液，于30、37、45、55、60或65℃保温5分钟后，添加0.1mL米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH溶液，于30、37、45、50、55、60或65℃开始反应。通过在570nm的吸光度测定由酶反应生成的二甲腊，通过测定每1分钟二甲腊的生成量来测定酶活性。米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH的最适温度为约60℃(图6)。
(5-3)pH稳定性的研究
用0.1M醋酸缓冲液(pH3、pH4)、0.1M Mcllvaine缓冲液(pH4.5、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0)或0.1M Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH9.5)稀释纯化FAD-GDH溶液(50U/mL)，各pH下于37℃处理30分钟。用0.2M KH2PO4-NaOH缓冲液pH6.5适当稀释各处理液，用上述1.的方法测定FAD-GDH活性。作为对照，测定用0.1M KH2PO4-NaOH缓冲液pH6.5稀释的冰冻保存的纯化FAD-GDH的活性。其结果是，FAD-GDH至少在pH3.0-7.0的范围内维持80%以上的活性，表明在pH3.0-7.0的范围内稳定(图7)。
(5-4)温度稳定性的研究
用含有1mM氯化钙、0.1%(w/v)TritonX-100和0.1%(w/v)牛血清白蛋白的50mM PIPES-NaOH缓冲液pH6.5将纯化FAD-GDH稀释到1U/mL，于各指定温度(5、30、40、50或60℃)下处理20分钟。在冰中冷却后，用含有1mM氯化钙、0.1%(w/v)TritonX-100，0.1%(w/v)牛血清白蛋白的50mM PIPES-NaOH缓冲液pH6.5稀释各处理液，用上述1.记载的方法测定FAD-GDH活性。作为对照，也测定未经热处理的酶的FAD-GDH。其结果是FAD-GDH在40℃以下维持约100%的活性，因而表明在40℃以下稳定(图8)。
6.等电点的测定
将3mL米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH溶液加入到透析膜36(和光纯药工业株式会社)，浸渍于纯化水中，于4℃进行透析一晚。将该透析试样提供给甘油密度梯度电泳。使用柱容量为110mL、两性载体(IEF用PharmalyteTM3-10(Amersham Biosciences AB),平均终浓度1%)，于5℃400V的定电压下通电48小时。通电后，以约2mL/分的流速回收试样(1个部分为1.5mL)。测定各部分的pH和FAD-GDH活性，结果是，米曲霉BB-56来源的FAD-GDH的pI为6.4(图9)。
7.底物特异性
(7-1)底物特异性的研究1(纯化FAD-GDH的底物特异性)
混合2.55mL含有0.22%(w/v)TritonX-100的50mM PIPES-NaOH缓冲液pH6.5、0.09mL1M底物(D-葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、木糖、麦芽三糖、麦芽六糖或麦芽五糖)溶液、0.2mL3mM PMS溶液和0.1mL6.6mM NTB溶液，于37℃保温5分钟后，添加0.1mL纯化FAD-GDH溶液，开始反应。通过570nm的吸光度测定由酶反应生成的二甲腊，通过测定每1分钟二甲腊的生成量来测定酶活性。以对D-葡萄糖的反应速度作为100%计算对各底物的相对活性(表3)。
[表3]
表3纯化FAD-GDH对各底物的相对活性
(7-2)底物特异性的研究2(各菌株产生的FAD-GDH的底物特异性的比较)
(7-2-1)酶试样的制备
将米曲霉BB-56、IAM2603、IAM2628、IAM2683、IAM2736、IAM2706或NBRC30113来源的各培养滤液10mL装入透析膜36，在10mMKH2PO4-NaOH中，于4℃进行透析一晚。
(7-2-2)相对活性的测定
混合2.5mL含有2mM氯化钙的20mM MOPS缓冲液pH7.0、0.3mL0.4M底物溶液(D-葡萄糖、2-去氧葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖或麦芽糖)，于25℃保温5分钟后，添加0.05mL20mM PMS溶液、0.05mL4mMDCIP(2,6-二氯靛酚)溶液，各透析试样0.1mL，然后开始酶反应。通过在600nm的吸光度测定该还原反应产生的DCIP减少，测定FAD-GDH活性。将以D-葡萄糖作为底物时的活性设为100%，计算对于各底物的相对活性(表4)。根据该结果，表明米曲霉BB-56、IAM2603、IAM2628、IAM2683、IAM2736、IAM2706或NBRC30113来源的FAD-GDH的底物特异性相同。
[表4]
表4对各底物的相对活性的比较
8.米氏（Michaelis-Menten，Km)常数的测定
混合2.55mL含有0.22%(w/v)TritonX-100的50mM PIPES-NaOH缓冲液pH6.5、0.1mL6.1-610mM D-葡萄糖溶液、0.2mL的3mM PMS溶液和0.1mL6.6mM NTB溶液，于37℃保温5分钟后，添加0.1mL纯化FAD-GDH溶液，开始反应。通过570nm的吸光度测定由酶反应生成的二甲腊，通过测定每1分钟的二甲腊的生成量，测定酶反应速度。通过双倒数作图法计算Km值(图10)，结果是纯化FAD-GDH对D-葡萄糖的Km值为8.2mM。
9.糖含量
用苯酚硫酸法测定每种酶蛋白的糖含量。混合1.0mL的纯化FAD-GDH溶液、1.0mL的5%(w/v)苯酚溶液、5.0mL的98%硫酸，于室温下放置20分钟。用流水冷却后，测定490nm的吸光度。用0-0.03mg/mL的D-葡萄糖标准液制成校正曲线(图11)，计算每1mg酶的糖含量。其结果是，FAD-GDH的糖含量为每1mg酶为0.43mg(43％)。
10.与葡萄糖氧化酶(GO)的比较
(10-1)FAD-GDH活性的测定
混合2.55mL含有0.22%(w/v)TritonX-100的50mM PIPES-NaOH缓冲液pH6.5、0.1mL的1M D-葡萄糖溶液、0.2mL的3mM PMS溶液和0.1mL6.6mM NTB溶液，于37℃保温5分钟后，添加0.1mL适当稀释的酶溶液(米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH或GO(天野酶株式会社))，于37℃开始反应。通过570nm的吸光度测定由酶反应生成的二甲腊，通过测定每1分钟的二甲腊的生成量，测定酶活性。
(10-2)GO活性的测定
葡萄糖氧化酶活性按以下的反应原理测定。
反应1：D-葡萄糖＋O2→D-葡萄糖酸-δ-内酯＋H2O2
反应2：H2O2＋4-氨基安替比林＋苯酚→醌亚胺染料＋4H2O
反应1中由GO生成的H2O2被用于反应2中由过氧化物酶所产生的醌亚胺染料的生成反应中。通过在500nm的吸光度测定醌亚胺染料，测定GO活性。GO活性1个单位定义为在37℃的这种反应条件下，1分钟内氧化1μmole的D-葡萄糖的酶量。以下所示为实际的测定方法。
混合2.0mL苯酚溶液(含有0.152％的苯酚和0.152％的TritonX-100的0.1M磷酸缓冲液pH7.0)、0.5mL的0.555mol/L D-葡萄糖溶液，0.5mL的25U/mL过氧化物酶(天野酶株式会社)溶液和0.1mL的4mg/mL4-氨基安替比林溶液，于37℃保温5分钟后，添加0.1mL适当稀释的酶溶液(米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH或GO)，于37℃开始反应。在反应开始2分钟后和5分钟后测定500nm的吸光度。而且，作为酶空白，添加0.1M磷酸缓冲液pH7.0代替酶溶液，同样测定吸光度。用以下计算式计算GO活性。
上式中的“3”表示反应时间，“12.88”表示醌亚胺染料的分子吸光常数(mM)，“1/2”表示基于由2mole的H2O2生成1mole的醌亚胺染料的系数，“3.2”表示反应液的最终液量，“0.1”表示试样量(mL)，“Dm”表示稀释倍数。
该结果表明，米曲霉BB-56来源的纯化FAD-GDH独有GDH活性，基本没有GO活性。另一方面，判明了GO主要具有GO活性，但也同时具有GDH活性(表5)。即，表明米曲霉BB-56来源的FAD-GDH用电子传递系统的物质测定D-葡萄糖时，与GO相比，难以受到反应系统的溶解氧的影响。
[表5]
表5FAD-GDH与GO的比较
11.葡萄糖浓度的测定
本申请发明涉及的米曲霉来源的FAD-GDH的利用例如下所示。混合2.55mL含有0.22%TritonX-100的50mM PIPES-NaOH缓冲液pH6.5，0.10mL D-葡萄糖溶液(0、100、200、400、600、800、1000mg/dL)、0.20mL的3mM PMS溶液和0.10mL的6.6mM NTB溶液，于37℃放置5分钟后，添加0.10mL米曲霉BB-56来源的FAD-GDH酶溶液(0.3U/mL)，开始反应。通过在570nm的吸光度测定由酶反应生成的二甲腊，每3分钟的570nm处的吸光度的增加与葡萄糖浓度的关系示于图12。表明米曲霉来源的FAD-GDH如果为800mg/dL以下的葡萄糖浓度，则可以高精度地测定试样检测对象中的葡萄糖浓度。
12.抑制试验
用以下方法测定对照组和试验组(1,10-邻二氮杂菲添加组)的酶活性，然后对二者进行比较，从而研究1,10-邻二氮杂菲对纯化FAD-GDH的抑制效果。
(对照组的酶活性的测定(参照表6))
[表6]
表6对照组的测定法
*1)稀释缓冲液:0.1MKH2PO4-NaOHpH7.0
首先，将1.0mL0.1M的磷酸钾缓冲液(pH7.0)、1.0mL1M的D-葡萄糖溶液、0.1mL3mM的DCIP(2，6-二氯苯酚靛酚)、0.2mL3mM的1-甲氧基PMS(5-甲基吩嗪硫酸甲酯)溶液、0.65mL纯化水装入石英池中，于37℃保温5分钟。接着，添加0.05mL的酶溶液，测定DCIP在600nm的吸光度变化(△ABS/min)，用下式计算酶活性。
(试验组酶活性的测定(参照表7))
[表7]
表7.试验组(抑制剂添加组)的测定法
求出在上述的测定方法中，加入1,10-邻二氮杂菲使得终浓度分别为1mM、5mM、10mM、25mM和50mM时的酶活性。
(试验结果)
如表8所示，1,10-邻二氮杂菲对纯化FAD-GDH的抑制效果低，只是在1mM的1,10-邻二氮杂菲中发现了2%左右的抑制效果。
[表8]
表8.
13.米曲霉BB-56株的鉴定
(1)方法
(1-1)菌株
米曲霉BB-56
(1-2)培养基组成
参考Klich,M.A.(2002). Identification of Common Aspergillusspecies.Utrecht:Centraalbureau voor Schimmelcultures,116pp.的报告，调制出以下培养基。
CYA培养基：1gK2HPO4，10mL Czapek 浓缩物，5g酵母提取物(Difco)，30g蔗糖，15g琼脂(和光)，1000mL纯化水
CZ培养基：1gK2HPO4，10mL Czapek 浓缩物，30g蔗糖，17.5g琼脂(和光)，1000mL纯化水
CY20S培养基：1gK2HPO4，10mL Czapek 浓缩物，5g酵母提取物(Difco)，200g蔗糖，15g琼脂(和光)，1000mL纯化水
MEA培养基：20g麦芽提取物(Difco)，20g葡萄糖，1g细菌蛋白胨(Difco)，15g琼脂(和光)，1000mL纯化水
PDA培养基：使用马铃薯右旋糖琼脂(荣研)。
Czapek浓缩物：30gNaNO3，5gKCl，5gMgSO4·7H2O，0.1gFeSO4·7H2O，0.1gZnSO4·7H2O，0.05gCuSO4·5H2O，100mL纯化水
(1-3)表现性状
生长程度，于25℃或37℃培养7天，测定菌落的直径。
在CYA培养基、CZ培养基、CY20S培养基、MEA培养基中观察生长状态(25℃，7天)。
形态观察在CYA培养基、于25℃培养下进行(培养6～21天)。
用扫描型电子显微镜进行分生孢子表面的观察，在CYA培养基中25℃培养15天，通过锇酸蒸汽固定进行处理，观察。
菌落的色调按照日本园芸植物标准色卡(财团法人日本色彩研究所发行)。
(2)结果
(2-1)生长程度(菌落的直径)
各种培养基中的生长程度(培养7天)如下表所示。
[表9]
表9.各培养基中的生长程度(培养7天)
(2-2)生长状态
各种培养基中的生长状态(25℃，培养7天)如下表所示。而且，颜色按照日本园芸植物标准色卡(财团法人日本色彩研究所发行)(括号内的数字为色卡编号)。
[表10]
表10各培养基中的生长状态(25℃，培养7天)
(2-3)形态
参考Raper,K.B.&Fennell,D.I.(1965).The genus Aspergillus.Williams&Wilkins Co.,Baltimore,686pp、Kozakiewicz,Z.(1989).Aspergillus species on stored products.Mycological Papers.No.161:1-188、Klich,M.A.(2002).Identification of Common Aspergillusspecies.Utrecht:Centraalbureau voor Schimmelcultures,116pp.、Samson,R.A.Hoekstra,E.S.Frisvad,J.C&Filtenborg,O.(2002).
Introduction to food-and airborne fungi,6th edn,pp.64-97.Utrecht:Centraalbureau voor Schimmelcultures,389pp.，则米曲霉BB-56其菌落颜色是浓绿黄色或暗绿黄色(表7)，生长程度在CYA培养基(25℃，培养7天)中为59-62mm，在MEA培养基(25℃，培养7天)中为52-64mm(表6)，分生孢子头呈放射状这样的缓柱状，分生孢子柄由顶囊向下没有中间变细，单列和2列的曲霉混合存在，顶囊呈亚球形或瓶状，其直径为10～42μm，分生孢子为亚球形或球形，其大小为5.6～8.8×5.2～8.8μm，表面为光滑表面或略微粗糙的表面(表8)，由此确认其为米曲霉。
[表11]
表11.在CYA培养基中的形态
14.米曲霉BB-56来源FAD-GDH的鉴定
(1)氨基酸序列的分析
培养米曲霉(Aspergillus oryzae)BB-56，用6.所示的方法对获得的纯化酶进行等电点分离。将获得的纯化酶提供给采用凝胶PAG MiniDAIICHI7.5(第一化学药品株式会社)的SDS-PAGE。使用转印缓冲液1(0.3M Tris(pH10.4),20％甲醇)，转印缓冲液2(30mM Tris(pH10.4),20％甲醇)，转印缓冲液3(40mM6-氨基已酸(pH7.6),20％甲醇)作为转印缓冲液，将电泳后的凝胶转印到PVDF膜上。转印操作，在阳极侧使用转印缓冲液1，在含有膜的中央部位使用转印缓冲液2，在阴极侧使用转印缓冲液3，用半干转印装置，在定电流0.8mA/PVDF膜cm2，90min的条件下进行。转印后进行CBB(考马斯亮蓝R-250)染色、切出该酶相应的条带，作为N末端氨基酸序列分析用试样。同样，对电泳后的凝胶进行CBB染色，切出该酶相应的条带，照原样作为内部氨基酸序列分析用试样。分析的结果清楚了N末端氨基酸序列和内部氨基酸序列。
(2)通过N末端氨基酸序列进行的同源性检索
从特开2005-176602的申请人获得特开2005-176602公开的米曲霉RIB40的基因信息中的全CDS序列，用数据库软件Kiroku ver.3(WorldFusion公司)，实施依据已经清楚的N末端氨基酸序列的同源性检索。其结果确认葡萄糖氧化酶前体与具有同源性的某种氨基酸序列(特开2005-176602的序列表中的序列号20494)之间有高同源性。同序列中还存在与通过内部氨基酸序列分析已经清楚的氨基酸序列一致的区域。根据这些事实，清楚了同序列(序列号1)对应于该酶的氨基酸序列。
(3)由米曲霉BB-56提取基因组
用装入了100mlYPD培养基(1%酵母提取物,2%蛋白胨，2%葡萄糖)的广口瓶将米曲霉BB-56于30℃培养一夜后，用布氏漏斗和Nutsche吸滤瓶过滤培养液，获得菌体。于-80℃冷冻后，通过冷冻干燥获得的重量约0.3g的菌体与1药匙的海砂一起用乳钵、乳棒破碎，然后悬浮于12ml提取缓冲液(1％十六烷基三甲基铵，0.7M NaCl,50mMTris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，1％巯基乙醇)中。在室温下连续旋转搅拌30分钟后，加入等量的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)溶液进行搅拌，进行离心分离(1500g，5分钟，室温)获得了上清。在获得的上清中加入等量的氯仿：异戊醇(24:1)溶液进行搅拌，然后进行离心分离(1500g，5分钟，室温)。在所获得的上清中缓缓加入等量的异丙醇。用70%乙醇对通过该处理析出的染色体DNA进行离心分离(20000g，10分钟，4℃)而获得的沉淀进行清洗，然而进行真空干燥。将这样获得的染色体DNA再次溶解到4mlTE中，加入200μl10mg/ml RNaseA(Sigma-Aldrich Japan公司)后，于37℃温育30分钟。然后，加入40μl的20mg/ml蛋白酶K,重组，PCR Grade(Roche diagnostics公司)溶液，于37℃温育30分钟后，加入等量的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)溶液。搅拌后，进行离心分离(1500g，5分钟，室温)，从而获得了上清。重复进行2次这种清洗操作后，在获得的上清中加入等量的氯仿：异戊醇(24:1)溶液进行搅拌，然后进行离心分离(1500g，5分钟，室温)。通过在所获得的上清中加入其1/10容量的3M NaOAc(pH4.8)和2倍容量的乙醇，于-80℃冷却使染色体DNA析出。通过离心分离(20000g，20分钟，4℃)析出的染色体DNA进行回收。用70%乙醇清洗回收的染色体DNA后，真空干燥，最后溶解于400μl的TE溶液，获得了浓度为约1mg/ml的染色体DNA溶液。
(4)合成引物的设计
合成相当于编码序列号1的氨基酸序列(特开2005-176602的序列表中的序列号20494所示的序列)的总链长为3226bp的RIB40株来源的基因序列(序列号2)的5’、3’两末端序列的合成引物FG-F、FG-R(序列号3、4)。
(5)通过PCR法进行的FAD-GDH基因的扩增
以(3)中调制的染色体DNA作为模板来实施PCR反应。反应使用TAKARA LA-TaqTM(takarabio公司)，反应液组成按照所附的常规方法。加入引物(FG-F、FG-R)，使之终浓度分别为0.4μM，加入模板基因组使之终浓度达到10ng/μl，然后实施PCR。反应循环如下。即，重复进行35个由94℃反应2分钟后，94℃反应30秒，60℃反应30秒，72℃反应10分钟构成的循环，最后在72℃反应10分钟。反应结束后，于4℃保存试样。
（6）FAD-GDH基因的碱基序列分析
将PCR反应液提供给琼脂糖电泳，分离扩增片段和引物，用GENECLEANTM III(BIO101公司)从琼脂糖凝胶中提取。将提取的扩增片段亚克隆到载体pUC19(Takarabio公司)的SmaI位点。然后，对亚克隆的质粒pFG2的相当于该酶基因的区域实施碱基序列分析。测序反应用BigDyeTM Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied biosystemjapan公司)，按照制品的使用说明书进行测序反应。分析中使用ABIPRISM310测序仪(Applied biosystem japan公司)。为了实施该酶基因的碱基序列分析，合成了合成引物FG-1(序列号5)、FG-2(序列号6)、FG-3(序列号7)、FG-4(序列号8)、FG-5(序列号9)、FG-6(序列号10)、FG-7(序列号11)、FG-8(序列号12)、FG-9(序列号13)、FG-10(序列号14)、FG-11(序列号15)、FG-12(序列号16)、M13-M5(序列号17)、M13-RV2(序列号18)。碱基序列分析的结果是，清楚了序列号19所示的总链长为3241bp的米曲霉BB-56来源的该酶基因序列。根据该酶基因序列预测的该酶基因的氨基酸序列示于序列号20。
产业上利用的可能性
本发明的FAD-GDH底物特异性优异，可以更为正确地测定葡萄糖量。因此，本发明的FAD-GDH可以说适于血糖值的测定、食品(调味料、饮料等)中的葡萄糖浓度的测定等中。
本发明不限于上述发明的实施方式和实施例说明。在不脱离专利请求的范围的记载，而本领域技术人员可以容易想到的范围内的各种变化形态都包含于本发明中。
本说明书中援引公开的论文、公开特许公报和特许公报等内容的全部。

Claims (16)

1.具备以下性状的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶：
(1)作用：催化在电子受体存在下氧化葡萄糖的羟基而生成葡萄糖酸-δ-内酯的反应，
(2)分子量：通过SDS-聚丙烯酰胺电泳测得的分子量为约100kDa，通过凝胶过滤色谱法测得的分子量为约400kDa，
(3)底物特异性：对麦芽糖、D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖的反应性低。
2.根据权利要求1所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时对麦芽糖的反应性为5%以下。
3.根据权利要求1或2所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时对D-半乳糖的反应性为5%以下。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时对D-果糖和D-甘露糖的反应性均为5%以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其还具备以下性状：
(4)最适pH:7附近，
(5)最适温度:60℃附近，
(6)pH稳定性:在pH3.0～7.0的范围内稳定，
(7)温度稳定性:在40℃以下稳定。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其还具备以下性状：
(8)Km值：对于D-葡萄糖的Km值为约8mM。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其是来源于米曲霉的酶。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其特征在于，具有序列号20所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列同源的氨基酸序列。
9.具有生产黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶能力的保藏编号为NITE BP-236的米曲霉BB-56。
10.黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶基因，其由选自以下的(A)～(C)中任意一个DNA构成：
(A)编码序列号20所示的氨基酸序列的DNA；
(B)由序列号19所示的碱基序列构成的DNA；
(C)具有与序列号19所示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。
11.含有权利要求10所述的基因的载体。
12.导入了权利要求10所述的基因的转化体。
13.黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的制造方法，其包括以下的步骤(1)和(2)、或步骤(i)和(ii):
(1)培养具有生产权利要求7所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶能力的米曲霉的步骤；
(2)由培养后的培养液和/或菌体回收黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的步骤；
(i)在产生所述基因编码的蛋白质的条件下培养权利要求12所述的转化体的步骤；
(ii)回收产生的所述蛋白质的步骤。
14.葡萄糖测定法，其特征在于，使用权利要求1～8中任一项所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶测定试样中的葡萄糖。
15.葡萄糖测定用试剂，其特征在于，含有权利要求1～8中任一项所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶。
16.葡萄糖测定用试剂盒，其含有权利要求15所述的葡萄糖测定用试剂。
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