CN101160397A - 辅酶结合型葡萄糖脱氢酶及编码该酶的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

[课题]提供一种用于大量生产对葡萄糖的基质识别性优异、且对麦芽糖的活性低的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的方法。[解决方法]一种编码可溶性的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的多核苷酸，所述辅酶结合型葡萄糖脱氢酶在电子受体存在下催化葡萄糖氧化反应，对麦芽糖的活性为5％以下；一种由所述多核苷酸的碱基序列编码的多肽；具有所述多核苷酸的重组载体；使用所述重组载体形成的转化细胞；一种多肽的制备方法，其特征在于培养所述转化细胞，从所得培养物中收集与FAD结合具有葡萄糖脱氢作用的多肽；一种使用所述多肽的葡萄糖测定方法；葡萄糖测定试剂组合物；生物传感器。

Description

辅酶结合型葡萄糖脱氢酶及编码该酶的多核苷酸

技术领域

本发明涉及新型的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(以下有时记为“GLD”)、编码该酶的多核苷酸、其获取方法、该GLD的制备方法、及此GLD的应用。

背景技术

血中葡萄糖量是糖尿病的重要标志。糖尿病的检查，除在医院检查室等中进行的临床检查之外，还可以进行由诊断人员等进行的简易检查或由患者自己进行的自检查等简易测定(Point-of-Care Testing：POCT)。

此简易测定可以通过葡萄糖诊断试剂盒或生物传感器等测定装置(POCT装置)进行，目前，上述POCT装置中开始使用葡萄糖氧化酶。但是，葡萄糖氧化酶受溶存氧浓度的影响，使测量值产生误差，因此，推荐使用不受氧影响的葡萄糖脱氢酶。

葡萄糖脱氢酶包括以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)为辅酶的NAD辅酶非结合型葡萄糖脱氢酶、和以吡咯喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等为辅酶的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，辅酶结合型葡萄糖脱氢酶与NAD辅酶非结合型葡萄糖脱氢酶相比，不易受杂质的影响，测定感度高，并且从原理上看具有可以廉价地制备POCT装置的优点。

但是，现有的吡咯喹啉醌(PQQ)型葡萄糖脱氢酶具有稳定性低、并且也与麦芽糖或半乳糖反应的缺点。麦芽糖是用于输液的糖，如果PQQ葡萄糖脱氢酶与麦芽糖反应，则血糖POCT装置显示比实际高的血糖值。因此，导致患者进行了不必要的胰岛素注射，结果发生陷入意识障碍或昏睡状态等低血糖事故，造成严重问题。

特别指出的是，现在的血糖POCT装置的应用主要是简单地测定血糖，进而由于作为患者自我管理及治疗的一种方法的重要性提高，因此使用的自我监测血糖装置(Self-Monitoring of Blood Glucose：SMBG)向家庭中的普及迅速扩大，所以对测定精度的要求非常高。

目前，2005年2月日本卫生劳动部发出通知，要求对正注射麦芽糖输液的患者使用利用了以PQQ作为辅酶的酶的血糖测定器时，加以注意(2005年2月7日；药食安发第0207005号等)。

另一方面，作为催化葡萄糖脱氢反应、以FAD为辅酶的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，已报道有来自根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(J.Biol.Chem.(1967)242：3665-3672)、来自海黄噬纤维菌(Cytophaga marinoflava)(Appl.Biochem.Biotechnol.(1996)56：301-310)、来自盐单胞菌α-15(Halomonas sp.)(EnzymeMicrob.Technol.(1998)22：269-274)、来自双孢蘑菇(Agaricusbisporus)(Arch.Microbiol.(1997)167：119-125、Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)51：58-64)及来自大环柄菇(Macrolepiotarhacodes)(Arch.Microbiol.(2001)176：178-186)的酶，但是，上述酶氧化葡萄糖的2位及/或3位的羟基，对麦芽糖的活性都很高，对葡萄糖的选择性低。另外，也已知同样对麦芽糖活性高、来自洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhorderia cepacia)的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，该酶的天然型酶是由α、β、γ3种亚基构成的杂寡聚物酶，为膜结合性酶。所以存在以下问题：为了得到酶，必须进行可溶化处理，或者为了在克隆中呈现充分的活性必须同时克隆必要的亚基等。

并且，根据日本生物工学会大会(2002年10月28日-30日)的报告，基质特异性(对葡萄糖活性为100％时，对麦芽糖的活性、对半乳糖的活性)为SM4株40％、105％、JCM5506株43％、132％、JCM550株57％、123％、JCM2800株83％、108％、JCM2801株74％、117％、IFO14595株38％、104％、IFO15124株74％、148％，据报告者所述，由于对麦芽糖的活性高，用于自我血糖监测器时存在问题，期望今后能改变序列，改良基质特异性。

针对上述问题，本发明人等发明了一种以FAD为辅酶的、非膜结合型的新型可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，并申请了专利(专利文献1)。此专利文献1的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶具有迄今为止没有的优异特性，即氧化葡萄糖的1位羟基，对葡萄糖的基质识别性优异，不受溶存酶的影响，并且对麦芽糖的活性低(对葡萄糖活性为100％时，对麦芽糖活性为5％以下、对半乳糖活性也为5％以下)。

但是，此专利文献1的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶从野生的微生物(例如曲霉属微生物等)的液体培养物中分离、萃取而获得，其生产量有限。另外，酶生产量为极微量，且糖大量地与酶结合，被与通常的与酶结合的N型或O型糖链种类不同的糖被覆，形成称为“糖包埋型酶”的状态，由此难于检出其活性(酶活性低)，不能通过酶或化学方法除去糖链，结果在电泳中，常用的蛋白质染色方法(使用考马斯亮兰(Coomassie Brilliant Blue)G-250等)几乎不能将其染色，也难以由常用的精制酶解读为基因获取所必要的信息的酶的氨基末端或内部的氨基酸序列，目前为止尚无成功进行酶基因克隆、确认该酶活性表达的事例。

关于来自米曲霉的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，在1967年已提示过该酶的存在(非专利文献1)，但只阐明了其部分酶学性质，虽然提示该酶具有不作用于麦芽糖的特性，但之后关于来自米曲霉的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的详细报告，当然也包括关于来自其他微生物的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的报告，未见对于氧化葡萄糖1位羟基的酶的继续报道，关于辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列或基因也完全没有报道。

另外，已知在葡萄糖测定中使用葡萄糖脱氢酶EC 1.1.99.10的设想(参见专利文献15)，但辅酶结合型葡萄糖脱氢酶不能按照实用的水平生产，实际上尚未达到用于传感器而实用化的水平。推测其原因在于，该酶在菌体内的活性微弱，即使分泌到菌体外其量也极其微小，并且被大量的糖所被覆，活性弱，连检测都很困难，所以未能克隆出基因。

另外，在使用葡萄糖氧化酶的传感器中，葡萄糖测定时受到酶的糖链的影响，难以将来自霉菌的多糖链酶应用于葡萄糖传感器(非专利文献2)，但通常已知与液体培养相比固体培养时糖链较多，在曲霉属微生物的固体培养中产生的酶的糖含量与液体培养时相比增加(非专利文献3)等。因此，即使探讨培养条件等，减少来自霉菌的葡萄糖脱氢酶的糖链，也难以用于葡萄糖传感器，推测上述情况也是迄今为止辅酶结合型葡萄糖脱氢酶不能实用化的原因。

目前，本申请人等也精制了来自土曲霉菌的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，但该酶被大量的糖被覆，成为“阿拉伯半乳糖胶包埋型酶”的形态，由此在将其涂布在电极上、使其干燥制成固定化酶电极时，除产生干燥性差的问题之外，还存在糖导致作为葡萄糖传感器的反应性降低的问题。

为了大量地生产酶等蛋白质，已知有使用编码蛋白质的基因材料的基因工程学方法，已知有关于葡萄糖脱氢酶的基因工程学制备的专利文献2～14的现有技术。上述现有技术，主要涉及PQQ葡萄糖脱氢酶的改变，提供了用于改良基质特异性低或稳定性低的现有PQQ葡萄糖脱氢酶缺点的修饰型PQQ葡萄糖脱氢酶和用于采用基因工程学方法制备该酶的修饰型基因材料。

专利文献1：WO2004/058958号说明书

专利文献2：特开2000-312588号公报

专利文献3：特开2000-350588号公报

专利文献4：特开2000-354495号公报

专利文献5：特开2001-197888号公报

专利文献6：特开2001-346587号公报

专利文献7：特开2001-37483号公报

专利文献8：特开2004-173538号公报

专利文献9：特开2004-313172号公报

专利文献10：特开2004-313180号公报

专利文献11：特开2004-344145号公报

专利文献12：特开平10-243786号公报

专利文献13：特表2004-512047号公报

专利文献14：WO2002/072839号说明书

专利文献15：特开昭59-25700号公报

非专利文献1：Biochem.Biophys.Acta.，139，277-293，1967

非专利文献2：Appl Environ Microbiol.，64(4)，1405-1411，1998

非专利文献3：Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(10)，1938-1946，1998

发明内容

但是，目前的实际情况是使用修饰型基因材料制作的修饰型PQQ葡萄糖脱氢酶对葡萄糖的活性为100％时，对麦芽糖的活性依然较高，大约为10％以上，或使对麦芽糖的反应性降低，结果导致原来的对葡萄糖的反应性(比活性)也降低，如果在基质为充分量的条件下采用电化学测定方法观察活性，则作为葡萄糖传感器的功能不充分，不能达到用于POCT装置等的程度。

另外，也存在下述问题，即PQQ葡萄糖脱氢酶的活性表达所必需的辅酶PQQ，不能用通常广泛用作重组宿主的大肠杆菌制作，必须限定于生产PQQ的宿主微生物(假单胞菌(Pseudomonas)等)制作重组体。

本发明是鉴于上述现有技术中的问题而完成的，其目的在于提供一种可解决附加在酶上的大量糖的问题，并且具有对葡萄糖的反应性、热稳定性、基质识别性优异且对麦芽糖的活性低的优异特性的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶及大量且简单地制备该酶的方法、编码该酶的多核苷酸及其获取方法、使用该酶的葡萄糖测定方法、葡萄糖测定试剂组合物、葡萄糖测定用生物传感器。

本发明人等认为，为了产业上广泛地利用辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，除将附加在酶上的大量糖链减少至能够用于葡萄糖测定的水平之外，还必须可按实用成本通过基因克隆大量生产不作用于麦芽糖的葡萄糖脱氢酶。另外，本发明人认为，为了进行基因克隆，解读酶的氨基末端及内部的氨基酸序列、获得基因获取所必须的信息是必不可少的，因此，将目前为止妨碍基因克隆获得成功的、与通常N型、O型糖链不同的、包埋酶的大量糖除去，改善蛋白质染色性，同时可以通过HPLC进行分析是十分必要的，本发明人等全力以赴地研究一种精制酶的获取，从该精制酶上除去了导致难以进行蛋白质染色及HPLC分析的、包埋酶的糖。结果发现，可以通过进行固体培养，减少包埋目标酶的糖，使其氨基酸序列明确，获取基因。

作为解决上述问题的方法，本发明提供了一种编码可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GLD)的多核苷酸(以下，有时记为“GLD多核苷酸”)，该辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的特征在于，在电子受体存在下催化葡萄糖脱氢反应，相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，优选为3％以下，较优选为2％以下。

更具体而言，此多核苷酸为

(A)一种GLD多核苷酸，其特征在于，所述GLD具有下述1)至4)的性质。

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶，

2)亚基结构为同二聚体(homodimer)，

3)不以氧为电子受体，及

4)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，优选为3％以下，更优选为2％以下。

(B)一种GLD多核苷酸，其特征在于，所述GLD具有下述1)至3)的性质。

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶，

2)不以氧为电子受体，及

3)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，优选为3％以下，更优选为2％以下。

(C)一种GLD多核苷酸，其特征在于，所述GLD具有下述1)至4)的性质。

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶，

2)不以氧为电子受体，

3)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，优选为3％以下，更优选为2％以下，

4)相对于每1μg蛋白质，所含糖(半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖)的含量总和为80μg以下，

(D)一种GLD多核苷酸，其特征在于，所述GLD具有下述1)至4)的性质。

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶，

2)不以氧为电子受体，

3)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，优选为3％以下，更优选为2％以下，

4)每1单位(unit)酶活性，所含糖(半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖)的含量总和为40μg以下。

(E)一种多核苷酸，所述多核苷酸具有选自序列号5～7记载的、编码辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的碱基序列的共有序列中的1种或2种以上的部分碱基序列，且编码具有下述a～d性质的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，

a亚基分子量：约63kDa，

b辅酶：FAD，

c催化将葡萄糖的1位羟基氧化、将葡萄糖变为葡糖酸-δ-内酯的反应，

d相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下。

其中，性质a的亚基分子量是指，将来自原核细胞的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)时测得的亚基分子量，为58kDa～63kDa，其中，所述原核细胞插入了含有或不含信号肽的GLD多核苷酸。另外，与上述相同，用来自真核细胞的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶测定时，亚基分子量为58kDa～150kDa。

(F)一种编码辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的多核苷酸，所述辅酶结合型葡萄糖脱氢酶具有选自序列号8～12记载的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶共有序列中的1种或2种以上的部分氨基酸序列，且具有下述a～d性质，

a亚基分子量：约63kDa，

b辅酶：FAD，

c催化将葡萄糖的1位羟基氧化，将葡萄糖变为葡糖酸-δ-内酯的反应，

d相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，

其中，性质a的亚基分子量，是指将来自原核细胞的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)时测得的亚基分子量，为58kDa～63kDa，其中，所述原核细胞插入了含有或不含信号肽的GLD多核苷酸。另外，与上述相同，在用来自真核细胞的酶结合型葡萄糖脱氢酶测定时，亚基分子量为58kDa～150kDa。

由该GLD多核苷酸编码的GLD，是具有下述物理化学性质的酶，即以黄素化合物(黄素腺嘌呤二核苷酸)为辅酶，在电子受体存在下催化葡萄糖1位羟基氧化反应。另外，此GLD对麦芽糖的活性为5％以下，优选为3％以下，更优选为2％以下，用终浓度5mM的1，10-菲咯啉可阻断50％以上，优选用2mM的1，10-菲咯啉阻断50％以上，更优选用1mM的1，10-菲咯啉阻断50％以上。亚基结构为同二聚体，有时单聚体也为活性型。

另外，由该GLD多核苷酸编码的GLD所含的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖的总含量，与野生型不同，相对于每1μg蛋白质总计为80μg以下，优选为10μg以下，较优选为2μg以下，更优选为0.5μg以下。

并且，由该GLD多核苷酸编码的GLD所含的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖的总含量，与野生型不同，相对于每1单位酶活性总计为40μg以下，优选为10μg以下，较优选为2μg以下，更优选为0.5μg以下。

另外，由该GLD多核苷酸编码的GLD的亚基分子量约为63kDa，辅酶为黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，催化葡萄糖1位羟基氧化、使葡萄糖变为葡糖酸-δ-内酯的反应，相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下。

具体而言，该GLD多核苷酸是从丝状菌、或担子菌，例如曲霉菌属(Aspergillus)、青霉菌属(Penicillium)、或灵芝属(Ganoderma)微生物中，特别是从土曲霉菌(A.terreus)中分离获得的多核苷酸。

本发明的GLD多核苷酸的具体方案是提供一种多核苷酸，所述多核苷酸由序列号1的碱基序列构成、或由序列号1所示碱基序列中缺失、取代或附加1个或数个碱基形成的碱基序列构成，且编码与辅酶、特别是与FAD结合具有使葡萄糖脱氢的作用的GLD。

另外，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸由与由序列号1所示碱基序列构成的多核苷酸具有60％以上同源性的碱基序列构成，并且编码与辅酶、特别是与FAD结合具有使葡萄糖脱氢的作用的GLD。

需要说明的是，“与由序列号1所示碱基序列构成的多核苷酸具有60％以上同源性的碱基序列”，是指在序列号1的碱基序列全长内，相对于序列号1的碱基序列显示至少60％的同一性、优选为70％以上、较优选为80％以上、更优选为90％以上、特别优选为95％以上的同一性的碱基序列。上述碱基序列的同一性百分率，可以使用公开或市售的软件进行计算，所述软件中具有以基准序列(本发明中的序列号1)为对照序列进行比较的计算法。作为例子，可以使用BLAST、FASTA、或GENETYX(软件开发株式会社制)等，可以按默认参数(defaultparameter)使用上述软件。

本发明还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸和由下述碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交，并且编码与辅酶、特别是与FAD结合具有使葡萄糖脱氢的作用的GLD，上述碱基序列与由序列号1所示碱基序列构成的多核苷酸互补。

此核苷酸序列编码的GLD中，从开始的Met到第19个氨基酸Leu为止是信号肽，编码此部分的多核苷酸可以根据生物体或所用宿主载体系统分别取代为适当的序列或被删除。

另外，本发明提供一种编码GLD的多核苷酸的获取方法，该多核苷酸的获取方法将具有GLD生产能力的微生物进行固体培养，以所得酶的信息作为基础克隆基因。所用微生物为属于曲霉菌属的一个以上菌株，特别优选为土曲霉菌(A.terreus)。

并且，本发明提供由上述任一种多核苷酸碱基序列编码的GLD。本发明的GLD的更具体方案为提供一种可溶性GLD，所述可溶性GLD在电子受体存在下能催化葡萄糖脱氢反应，相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下。

另外，具有下述1)至4)的性质。

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸作为辅酶，

2)亚基结构为同二聚体，

3)不以氧为电子受体，

4)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，优选为3％以下，更优选为2％以下。

或者，具有下述1)至3)的性质。

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸作为辅酶，

2)不以氧为电子受体，

3)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，优选为3％以下，更优选为2％以下

或者，具有下述1)至4)的性质。

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶，

2)不以氧为电子受体，

3)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，及

4)相对于每1μg蛋白质，所含半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖的含量总和为80μg以下。

或者，具有下述1)至4)的性质。

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶，

2)不以氧为电子受体，

3)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，及

4)相对于每1单位酶活性，所含半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖的含量总和为40μg以下。

或者，具有下述性质。

a亚基分子量：约63kDa，

b辅酶：FAD，

c催化氧化葡萄糖1位羟基、将葡萄糖变为葡糖酸-δ-内酯的反应，

d相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下。

上述GLD是从丝状菌，优选从属于曲霉菌属的1个以上菌株，特别优选从土曲霉菌中分离得到的酶。

本发明的GLD的更具体的方案是一种GLD，该GLD由序列号2所示氨基酸序列构成，且与辅酶、特别是与FAD结合使葡萄糖脱氢。另外，提供一种GLD，该GLD由序列号2所示氨基酸序列中缺失、取代或附加1个或数个氨基酸形成的氨基酸序列构成，且与辅酶、特别是与FAD结合显示使葡萄糖脱氢的作用。

另外，本发明提供一种GLD，该GLD由相对于序列号2所示氨基酸序列具有至少60％以上序列同源性的氨基酸序列构成，且与辅酶、特别是与FAD结合显示使葡萄糖脱氢的作用。目前，果蝇的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶是公知的(Proc.Natl.Acad.Sci.1983 October；80：6286-6288.“Biphasic expression and function of glucosedehydrogenase in Drosophila melanogaster.”)，与序列号2所示氨基酸序列具有45～47％的同源性。另外，来自该昆虫的酶在昆虫细胞之外难于表达，生产率极差，因此，难于在产业上应用。由相对于序列号2所示氨基酸序列具有至少60％序列同源性的氨基酸序列构成的本发明的酶，可以在大肠杆菌等中表达，因此能够容易地作为产业用酶使用。

另外，本发明提供一种编码由序列号2所示氨基酸序列构成的GLD的多核苷酸。

需要说明的是，“相对于序列号2所示氨基酸序列具有至少60％序列同源性的氨基酸序列”是指在序列号2的氨基酸序列全长内，相对于序列号2的氨基酸序列具有至少60％的同一性，优选为70％以上、较优选为80％以上、更优选为90％以上、特别优选为95％以上的同一性的氨基酸序列。上述氨基酸序列的同一性百分率可以使用公开或市售的软件进行计算，所述软件中具有以基准序列(本发明中的序列号2)为对照序列进行比较的计算法。作为例子，可以使用BLAST、FASTA、或GENETYX(软件开发株式会社制)等软件，可以按默认参数使用。

另外，本发明提供上述GLD的制备方法及通过该方法制备的GLD，所述制备方法的特征在于，使产生上述任一种GLD的微生物存在于使用小麦麸或麦片等为培养基成分的固体培养物中，由此可以使该培养物中产生GLD，进而得到GLD。

本发明还提供一种具有如上所述由本发明提供的多核苷酸中的任一种多核苷酸的重组载体以及使用重组载体制成的转化细胞，特征为培养转化细胞，从培养物中提取具有葡萄糖脱氢作用的GLD的该GLD的制备方法，及通过该方法得到的GLD。

通过该方法得到的GLD不结合糖链，或即使结合，也为常用的N型、O型糖链，其结合量与野生型的糖结合量相比少，糖链也容易除去，且显示较高活性。

另外，本发明提供一种GLD，该GLD具有序列号2的第20-592氨基酸序列、或与此氨基酸序列具有60％以上同源性的氨基酸序列，具有与上述GLD同等的功能，且可通过肽合成法或基因重组法获得。

本发明还分别提供了特征在于使用由本发明如上所述地提供的GLD的葡萄糖测定方法；特征在于含有由本发明提供的GLD的葡萄糖测定试剂组合物；及特征在于使用由本发明提供的GLD的葡萄糖测定用生物传感器。上述发明使用时优选以终浓度为2mM-500mM使用电子受体，特别是铁氰化物。

需要说明的是，本发明中，“多核苷酸”是指键合100个以上嘌呤或嘧啶与糖以β-N-糖苷键连接的核苷的磷酸酯(ATP(三磷酸腺苷)、GTP(三磷酸鸟苷)、CTP(三磷酸胞苷)、UTP(三磷酸尿苷)、或dATP(三磷酸脱氧腺苷)、dGTP(三磷酸脱氧鸟苷)、dCTP(三磷酸脱氧胞苷)、dTTP(三磷酸脱氧胸苷))形成的分子，具体而言，包括由编码GLD的基因组DNA、由基因组DNA转录所得的mRNA、由mRNA合成的cDNA及以其为模板进行PCR扩增得到的多核苷酸。“寡核苷酸”是指2～99个核苷酸连接形成的分子。另外，“多肽”是指由通过酰胺键(肽键)或非天然残基的连接相互键合得到的30个以上的氨基酸残基构成的分子，并且，也包括其上附加有糖链的分子、或进行人工化学修饰所得的分子等。

本申请的各项发明中其它的用语或概念，在发明的实施方案的说明或实施例中详细地解释。另外，为了实施此发明而使用的各种技术，除了特别标注其出处的技术之外，只要为本技术领域人员，即可基于公知的文献等容易且确实地实施。例如，基因工程学及分子生物学技术可以根据以下方法实施，即Sambrook and Maniatis，in MolecularCloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989；Ausubel，F.M.et a1.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995等记载的方法、或其中引用的文献记载的方法、或与其实质上相同的方法或变形。并且，此发明中的用语基本上依据IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature，或依据该领域中惯用的用语的含义。

本发明的酶是辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GLD)，该酶能够将天然型酶中的大量的糖减少至可用于葡萄糖传感器的水平，对葡萄糖的基质识别性优异，并且具有对麦芽糖的活性低的优异特性。另外，如果使用本发明的酶的制备方法，则能够均质且大量地生产该酶。

另外，如上所述人工生产的GLD可以根据目的控制在与FAD结合使葡萄糖脱氢的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶中产生问题的糖的量，因此，通过调制减少了糖含量的酶，也可以在血糖测定等中改变对试样中糖(葡萄糖等)的活性。

本发明的GLD在血糖测定中实质上不作用于麦芽糖，因此能够用于精度更高的SMBG装置中，十分有助于糖尿病患者的自我管理·治疗。

附图说明

[图1]表示将酶的糖链切断，用于SDS-PAGE，进行糖链染色。

[图2]表示将酶的糖链切断，用于SDS-PAGE，进行CBB染色。

[图3]表示将酶的糖链切断，进行Native-PAGE电泳、活性染色。

[图4]表示使用锇配位化合物作为电子受体，测定酶的传感特性(双分子反应速度常数)的结果。

[图5]表示使用醌化合物作为电子受体，测定酶的传感特性(双分子反应速度常数)的结果。

[图6]表示使用酶固定化电极，定量D-葡萄糖的结果。

具体实施方式

本发明的GLD多核苷酸(基因)是编码可溶性GLD的多核苷酸，所述GLD的特征在于，在电子受体存在下，可催化葡萄糖氧化反应，相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，优选为3％以下，更优选为2％以下。更具体而言，此多核苷酸是GLD多核苷酸，其中GLD的特征在于具有上述(A)～(F)中的任一种性质。

本发明的GLD多核苷酸的最具体的方案为含有序列号1的核苷酸序列的多核苷酸。此多核苷酸是来自丝状菌，例如曲霉属，特别是土曲霉(FERM BP-08578)的GLD多核苷酸，编码具有序列号2的氨基酸序列的GLD。

此GLD多核苷酸可以如下获取，即制备来自例如土曲霉(FERMBP-08578)的cDNA文库，通过Edman法等确定该GLD的N末端及内部序列的氨基酸，使用基于此氨基酸序列制作的多个寡核苷酸探针筛选cDNA文库，获取该GLD多核苷酸。

需要说明的是，在含有小麦麸、麦片等的固体培养物中，添加可以产生本发明GLD的微生物，例如属于曲霉属的土曲霉、日本曲霉(A.japonicus)、米曲霉(A.oryzae)等1个以上的菌株，从该培养物中提取GLD的方法，由于与GLD结合的糖链的量少，易于除去糖链，精制GLD，因此，在确定GLD的N末端及内部序列时，优选使用固体培养得到的GLD。

使用小麦麸时，例如将含有40～70质量％小麦麸的液体进行灭菌后，添加0.5～2质量％种培养液，在约室温下进行培养，从所得的培养菌体中萃取GLD粗酶即可。另外，使用麦片时，例如将含有40～70质量％麦片的液体进行灭菌后，添加0.5～2质量％种培养液，在约室温下进行培养，从所得的培养菌体中萃取GLD粗酶即可。

另外，探针标记可以采用放射性同位素(RI)法或非RI法进行，但优选使用非RI法。作为非RI法，可以举出荧光标记法、生物素标记法、化学发光法等，优选使用荧光识别法。作为荧光物质，可以适当地选择使用能够与寡核苷酸的碱基部分结合的荧光物，可以使用花青苷色素(例如Cy Dye^TM系列的Cy3、Cy5等)、若丹明6G试剂、N-乙酰氧基-N²-乙酰氨基芴(AAF)、AAIF(AAF的碘衍生物)等。

或者，可以通过以下方法获得目的GLD基因，即将土曲霉(FERMBP-08578)的cDNA文库作为模板，使用上述制成的寡核苷酸引物(探针)组的PCR方法，或者以从土曲霉(FERM BP-08578)中萃取的全部RNA或mRNA为模板的RT-PCR方法。另外，也可以通过使用序列号1的5′端1引物的5′RACE法对cDNA的上游进行PCR扩增，通过使用序列号1的3′端1引物的3′RACE法对cDNA的下游部分进行PCR扩增。需要说明的是，设计探针时，要考虑到使引物的大小(碱基数)满足与模板DNA之间的特异性退火，为15-40个碱基，优选为15-30个碱基。但是，进行LA(long and accurate)PCR时，至少30个碱基是有效率的。避免两引物间的互补序列，使由有意义链(5′末端侧)和反义链(3′末端侧)构成的一组或一对(2条)引物相互间不发生退火。并且，为了确保与模板DNA之间的稳定的键合，使GC含量约为50％，防止富含GC或富含AT在引物内不均衡分布。由于退火温度依赖于Tm(解链温度，melting temperature)，所以为了获得特异性高的PCR产物，选择Tm值在55-65℃相互近似的引物。另外，必须注意的是，需调整PCR中所用引物的最终浓度，使其约为0.1至1μM等。另外，也可以使用探针设计用的市售软件，例如Oligo TM[National Bioscience Inc.(美国)制]、GENETYX(软件开发株式会社制)等。

此外，上述寡核苷酸探针或寡核苷酸引物组(primer set)，例如也可以通过用适当的限制酶切断上述GLD cDNA而制成，或者按照文献(例如Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)Nucleic Acid Res.25：3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)Biochemistry 33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利第4,458,066号)记载的周知的化学合成技术，在体外合成。

本发明的多核苷酸由与序列号1具有60％以上同源性的碱基序列构成，可以编码与上述辅酶特别是与FAD结合具有使葡萄糖脱氢的作用GLD。

本发明的多核苷酸由缺失、取代或附加序列号1中的1个或多个碱基得到的碱基序列构成，可以编码与上述辅酶特别是与FAD结合具有使葡萄糖脱氢的作用的GLD。

本发明的多核苷酸在严格条件下杂交与序列号1所示碱基序列互补的DNA、具有与序列号1所示碱基序列互补的碱基序列的DNA，且可以编码与上述辅酶特别是与FAD结合具有使葡萄糖脱氢的作用的GLD。

本发明的多核苷酸具有选自序列号5～7所示的、编码辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的碱基序列的共有序列中的1种或2种以上的部分碱基序列。另外，本发明的多核苷酸可以编码具有选自序列号8～12所示的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶共有序列中的1种或2种以上的部分氨基酸序列的酶。所述具有共有序列(氨基酸序列)的酶，多具有本发明GLD的活性，推断所述部分构成本发明酶的活性中心。

需要说明的是，序列号8的3个Xaa中，最左端的Xaa表示Ala或Gly，左侧第2个Xaa表示Ala或Val，最右端的Xaa表示Ile或Val。另外，序列号9的4个Xaa中，最左端的Xaa表示Ala或Val，左例第2个Xaa表示Ile或Leu，左侧第3个Xaa表示Ala或Ser，最右端的Xaa表示Glu或Gln。另外，序列号10的3个Xaa中，最左端的Xaa表示Ala或Leu，左侧第2个Xaa表示Ile或Leu，最右端的Xaa表示Ile或Val。另外，序列号12的3个Xaa中，最左端的Xaa表示Ala或Ser，左侧第2个Xaa表示Asn或Ser，最右端的Xaa表示Ile或Val。

编码上述GLD类似酶的多核苷酸，例如可以通过公知的突变导入法或变异导入PCR法等改变上述来自土曲霉的GLD cDNA进行制备。或者通过使用多核苷酸的探针杂交法获取，所述多核苷酸基于序列号1的核苷酸序列信息，由土曲霉之外的微生物等的基因组DNA或其cDNA文库制备得到。进行杂交时，通过多种方式改变严格条件，可以获取如上所述的编码GLD类似酶的多核苷酸。通过杂交及清洗工序中的盐浓度、有机溶剂(甲醛等)的浓度、温度条件等限定严格条件，可以采用本领域技术人员周知的各种条件，例如美国专利No.6,100,037等公开的条件等。

作为更具体的杂交条件，例如可以列举在50％甲酰胺，5×SSC(150mM氯化钠、15mM柠檬酸三钠、10mM磷酸钠、1mM乙二胺四乙酸、pH7.2)、5×Denhardt(Denhardt’s)溶液、0.1％SDS、10％硫酸葡聚糖及100μg/mL的变性鲑鱼精子DNA中于42℃下孵育后，在0.2×SSC中于42℃下清洗过滤器等。

作为用于获取编码GLD类似酶的多核苷酸的微生物等，对微生物的种或属没有限定，可以为野生株或变异株的任意微生物。例如，可以列举专利文献1公开的微生物等。

本发明的重组载体是克隆载体或表达载体，可以根据作为插入片断的多核苷酸的种类或其使用目的等使用适当的载体。例如，使用cDNA或其ORF区域作为插入片断生产GLD或其类似酶时，可以使用体外转录用的表达载体、或分别适于大肠杆菌、枯草菌等原核细胞、酵母、霉菌等丝状菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等真核细胞的表达载体。

本发明的转化细胞，例如在大量制备GLD或其类似酶时，可以使用大肠杆菌、枯草菌等原核细胞、或酵母、霉菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等真核细胞等。上述转化细胞可以通过采用电穿孔法、磷酸钙法、核糖体法、DEAE葡聚糖法等公知的方法将重组载体导入细胞进行制备。作为重组载体及转化细胞的具体例，可以举出下述实施例中给出的重组载体pCGLD和由此载体得到的转化大肠杆菌Escherichiacoli JM109/pCGLD(FERM ABP-10243)。

本发明的GLD是具有由上述GLD多核苷酸的碱基序列编码的氨基酸序列的多肽。具体而言，是在电子受体存在下催化葡萄糖脱氢反应，相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下的可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，并且，优选具有上述(A)～(F)中的任一种性质。

本发明的GLD的更具体方案为，相对于每1μg蛋白质，所含的糖(半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖)的含量总和为80μg以下，或者相对于每1单位酶活性，所含的糖(半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖)的含量总和为40μg以下。上述糖通过缩聚形成多糖类，被覆酶的周围。所以，只要上述糖类的含量为相对于每1μg蛋白质总计为80μg以下，或相对于每1单位酶活性总计为40μg以下，即可获得高活性的酶，故而优选。

另外，本发明的GLD的更具体方案为由序列号2所示的氨基酸序列构成。并且，本发明的GLD可以是由与序列号2具有60％以上同源性的氨基酸序列构成的、且与辅酶特别是与FAD结合具有葡萄糖脱氢作用的GLD类似酶。进而，本发明的GLD可以是由序列号2中缺失、取代或附加1个或数个氨基酸残基的氨基酸序列构成的、且与辅酶特别是与FAD结合具有葡萄糖脱氢作用的GLD类似酶。并且，本发明的GLD是具有序列号2的第20-592个氨基酸序列，或与此氨基酸序列具有60％以上同源性，具有与上述多肽同等的功能，并且可通过肽合成法或基因重组法合成的多肽。

上述GLD例如可以基于序列号2的氨基酸序列或其类似序列，通过公知的肽合成法(Merrifield，R.B.J.Solid phase peptide synthesisI.The synthesis of tetrapeptide.J.Amer.Chem.Soc.85，2149-2154，1963；Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis.A PracticalApproach.Chan，W.C.and White，P.D.，Oxford University Press，2000)进行制备。另外，上述肽可以由天然的酰胺键之外的残基连接构成。天然的酰胺键之外的残基连接，例如可以列举戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、2官能团马来酰亚胺、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、或N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)等化学键或偶联方法。另外，可以代替肽键的连接基团例如包含酮亚甲基(ketomethylene)(例如，用-C(＝O)-CH₂-代替-C(＝O)-NH-)、氨基亚甲基(CH₂-NH)、亚乙基、烯烃(CH＝CH)、醚(CH₂-O)、硫醚(CH₂-S)、四唑(CN₄-)、噻唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺、或酯(参见例如Spatola(1983)in Chemistryand Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，Vol.7，pp267-357，″Peptide Backbone Modifications，”Marcell Dekker，NY)。

另外，GLD可以通过使用上述GLD多核苷酸(cDNA或其翻译区域)的重组DNA技术获得。例如，通过体外转录，由具有上述多核苷酸的载体制备RNA，将其作为模板进行体外翻译，由此可以在体外制备GLD。另外，只要通过公知的方法将多核苷酸重组到适当的表达载体上，即可使多核苷酸编码的GLD在大肠杆菌、枯草菌等原核细胞或酵母、霉菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等真核细胞中大量地表达。可以根据是否需要糖链、其他肽修饰的必要性，选择适当的宿主。

使GLD在体外表达进行生产时，将上述多核苷酸插入到具有能够键合RNA聚合酶的启动子的载体中，制成重组载体，只要将此载体添加到体外翻译体系，即含有与启动子相对应的RNA聚合酶的兔网状红细胞溶解物或小麦胚芽萃取物等，即可在体外生产GLD。作为RNA聚合酶能够键合的启动子，可以列举T3、T7、SP6等。作为含有上述启动子的载体，可以举出pKA1、pCDM8、pT3/T718、pT7/319、pBluescriptII等。

在大肠杆菌等微生物中使DNA表达生产GLD时，在具有可以在微生物中复制的起始点、启动子、核糖体结合部位、DNA克隆部位、终止子序列等的表达载体中重组上述多核苷酸，制作表达载体，培养用此表达载体转化宿主细胞得到的转化体，即可在微生物内大量生产GLD。此时，如果在任意的翻译区域前后插入起始密码子和终止密码子使其表达，也可得到含有任意区域的GLD片断。或者，也可以作为与其他蛋白质的融合蛋白表达。通过用适当的蛋白酶切断此融合蛋白质，可以得到目的GLD。作为大肠杆菌用表达载体，可以举出pUC类、pBluescript II、pET表达体系、pGEX表达体系、pCold表达体系等。

在真核细胞中表达生产GLD时，只要将上述多核苷酸插入具有启动子、剪接区域、多(A)附加部位等的真核细胞用表达载体中，制作重组载体，导入真核细胞内，即可在真核细胞内生产GLD。在细胞内能够以质粒之类的状态保持，也能够使其整合到染色体中保持。作为表达载体，可以列举出pKA1、pCDM8、pSVK3、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV载体、pRS、pYE82等。另外，使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等作为表达载体时，也可以使FAD-GLD多肽表达为附加了His标记、FLAG标记、GFP等各种标记的融合蛋白。作为真核细胞，通常可以使用猴肾脏细胞COS-7、中国苍鼠(chinese hamster)卵巢细胞CHO等哺乳动物培养细胞、芽殖酵母、分裂酵母、霉菌、蚕细胞、非洲爪蟾卵细胞等，只要为能够表达GLD的细胞即可，可以为任意真核细胞。为了将表达载体导入真核细胞内，可以使用电穿孔法、磷酸钙法、核糖体法、DEAE葡聚糖法等公知的方法。

使GLD在原核细胞或真核细胞中表达后，为了从培养物(含有菌体或分泌到菌体外的酶的培养液、培养基组合物等)中分离精制目的蛋白质，可以组合公知的分离操作进行分离。例如可以举出用尿素等变性剂或表面活性剂进行的处理、热处理、pH处理、超声波处理、酶消化、盐析或溶剂沉淀法、透析、离心、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点电泳、离子交换色谱法、疏水性色谱法、反相色谱法、亲和色谱法(包括利用标记序列的方法及使用UKC1特异性多克隆抗体、单克隆抗体的方法)等。

通过上述方法制作的本发明的GLD具有以下特性。

(1)作用：按照国际生化学联合(IUB)的分类，本发明的GLD是分属于EC 1.1.99.10的酶，在电子受体存在下可以催化葡萄糖1位羟基氧化、生成葡糖酸-δ-内酯的反应(葡萄糖+电子受体→葡糖酸-δ-内酯+还原型电子受体)。

需要说明的是，作为电子受体，例如可以举出利用吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate)、1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸甲酯盐(1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate)、2，6-二氯酚靛酚、铁氰化物、锇化合物、醌化合物等。

(2)基质特异性：对D-葡萄糖作用强，对D-甘露糖、1，5-脱水-D-葡萄糖醇、D-纤维二糖、D-海藻糖、麦芽糖、D-半乳糖、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖作用弱。另外，对L-阿拉伯糖、乳糖、D-山梨糖醇、葡糖酸、蔗糖、D-甘露醇、L-山梨糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖-1-磷酸、D-棉子糖、乙醇、甘油几乎无作用。

(3)阻断剂：被1，10-菲咯啉阻断60％以上。

(4)辅酶：黄素腺嘌呤二核苷酸

(5)最适pH：7.0～9.0

(6)稳定pH：4.5～8.5

(7)最适温度：55℃左右

(8)温度稳定性：在约50℃以下稳定

需要说明的是，关于上述分子量，由于原来糖链附加在该酶上，所以如果糖链的附加方法根据培养条件或精制条件而改变，则分子量变化，在重组体中，糖链或附加的氨基酸也根据其宿主、载体系的种类等而变化，分子量变化。

确认等电点也以与上述相同的方式发生变化。

如上所述的本发明的GLD是在电子受体存在下催化葡萄糖脱氢反应的酶，因此，只要是可以利用由此反应导致的变化的应用即可，没有特殊的限制。例如，可以用于含有活体物质的试样中的葡萄糖的测定及测定用试剂、清除用试剂等医疗领域、临床领域，也可以在使用辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的物质生产中使用。

本发明的生物传感器用于含有本发明GLD作为酶的反应层中，是测定试样液中葡萄糖浓度的生物传感器。例如，可以通过如下方法制作，即利用丝网印刷等方法在绝缘性基板上形成由工作电极、其对电极及参比电极构成的电极体系，与此电子体系相连接形成含有亲水性高分子和氧化还原酶和电子受体的酶反应层，由此制得生物传感器。在此生物传感器的酶反应层上滴下含有基质的试样液时，酶反应层溶解，酶和基质反应，随之电子受体被还原。酶反应结束后，使被还原的电子受体以电化学方式被氧化，此时，此生物传感器可以根据所得氧化电流值测定试样液中的基质浓度。除此之外，也可以构筑具有检测发色强度或pH变化等方式的生物传感器。

作为生物传感器的电子受体，可以使用电子授受能力优异的化学物质。所谓电子授受能力优异的化学物质，是指通常称为“电子转运体”、“中介体”或“氧化还原介质”的化学物质，作为与其相当的化学物质，例如可以利用特表2002-526759中举出的电子转运体、氧化还原介质等。具体而言可以举出锇化合物、醌化合物、铁氰化合物等。

生物传感器通常使用廉价的铁氰化钾(六氰合铁(III)酸钾)作为电子受体，一般在终浓度为1mM以下使用。但是本发明的GLD在以高浓度2-500mM、较优选30-100mM使用铁氰化钾时，能够感度更好地测定D-葡萄糖。本发明的测定方法、测定试剂、测定化合物、生物传感器等的优选方案为在其涉及的测定反应体系中以终浓度2-500mM使用铁氰化钾。

在该酶的活性测定中，适当地稀释使用该酶，优选终浓度为0.1～1.0unit/ml。需要说明的是，该酶的酶活性单位(unit)是1分钟内氧化1μmol的葡萄糖的酶活性。本发明的辅酶结合型葡萄脱氢酶的酶活性可以采用以下方法进行测定。

(i)酶活性测定方法-1

在3ml石英槽(光路长1cm)中添加0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)1.0ml、1.0M D-葡萄糖1.0ml、3mM 2，6-二氯酚靛酚(以下称为DCIP)0.1ml、3mM 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸甲酯盐0.2ml、水0.65ml，安放在带有恒温槽支架的分光光度计上，在37℃下培育5分钟后，添加0.05ml酶溶液，之后测定DCIP在600nm处的吸光度变化(ΔABS/min)。DCIP在pH7.0下的摩尔吸光系数为16.3×10³cm^-1M^-1，1分钟内还原1μmol的DCIP的酶活性实质上与1单位该酶活性等价，因此可以根据下式由吸光度变化求出该酶活性。

(ii)酶活性测定方法-2

将1.0M磷酸钾缓冲液(pH7.0)3.4μl、1.0M D-葡萄糖0.1ml、20mMDCIP86.6μl在37℃下培育5分钟后，加入0.01ml酶溶液搅拌，反应5分钟后在100℃下培育3分钟，停止反应。再加入100mM甘氨酸·钠缓冲液(pH13.0)0.19ml、2.0N氢氧化钾0.01ml，在37℃下培育10分钟，溶液中的D-葡糖酸变为D-葡糖酸-δ-内酯后，加入100mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)0.39ml、1.0N盐酸0.01ml，使pH为中性。用D-葡糖酸/D-葡糖酸-δ-内酯定量试剂盒(Roche·Diagnostics社制)定量溶液中的D-葡糖酸。由于1分钟内生成1μmol D-葡糖酸-δ-内酯的酶活性实质上与1单位该酶活性等价，所以由D-葡糖酸-δ-内酯的生成量鉴定该酶活性。

该酶的蛋白质浓度的测定中，适当地稀释使用该酶，优选终浓度为0.2～0.9mg/ml。本发明的蛋白质浓度可以使用从日本Bio Rad(株)购入的蛋白质浓度测定试剂盒Bio-Rad Protein Assay，按照操作说明书，根据以牛血清白蛋白(BSA，和光纯药工业(株)制，生化学用)作为标准物质制作的标准曲线进行换算而求出。

以下给出实施例，更加详细且具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下例子。

实施例1

1-1(种培养)

将由1％(W/V)葡萄糖(和光纯药工业社制)、2％(W/V)脱脂大豆(日本食贩社制)、0.5％(W/V)玉米浸渍液(SAN-EI糖化社制)、0.1％(W/V)硫酸镁七水合物(NACALAI TESQUE社制)及水构成的液体培养基调至pH6.0，将100mL装入500mL容量的坂口烧瓶(sakaguchi flask)中，加上棉塞，在121℃下高压灭菌20分钟。在冷却后的液体培养基中接种土曲霉(Aspergillus terreus)FERMBP-08578株，在28℃下振荡培养48小时，将所得培养液作为种培养液。

1-2(通过液体培养获取粗酶溶液)

将4L由1％(W/V)葡萄糖(和光纯药工业社制)、2％(W/V)脱脂大豆(日本食贩社制)、0.5％(W/V)玉米浸渍液(SAN-EI糖化社制)、0.1％(W/V)硫酸镁七水合物(NACALAI TESQUE社制)、消泡剂、水构成的液体培养基调整至pH6.0，加入5L容量的发酵缸(jar fermenter)中，在121℃下高压灭菌20分钟。在冷却后的该液体培养基中接种40mL上述1-1(种培养)所述的培养液，在通气搅拌的条件下培养菌体41小时。过滤培养液，将所得培养液上清液作为粗酶溶液1。

1-3(通过固体培养(麦麸培养)获取粗酶溶液)

将300g小麦麸(阳和制粉株式会社制)和240g自来水放入5L容量的三角烧瓶中，充分搅拌混合后，加上棉塞，在121℃下灭菌25分钟。

接种5mL上述1-1(种培养)所述的种培养液，在26℃下静置培养。边不时地搅拌且使其通气，边培养2周，用5L的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)萃取麦麸中生长的培养菌体，过滤，将所得的上清液作为粗酶溶液2。

1-4(通过固体培养(麦片培养)获取粗酶溶液)

将300g麦片(雪印乳业制)和240g自来水加入5L容量的三角烧瓶中，充分搅拌混合后，加上棉塞，在121℃下灭菌25分钟。

接种5mL上述1-1(种培养)中制备的种培养液，在25℃下边不时地搅拌使其通气，边静置培养4天，用5L的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)萃取麦片中生长的培养菌体，过滤，将所得上清液作为粗酶溶液3。

1-5(酶的精制)

通过以下步骤(1)～(5)对上述粗酶溶液1至3进行酶精制，分离精制辅酶结合型葡萄糖脱氢酶。

(1)浓缩·脱盐

用截留分子量为10000的超滤膜“Pellicon2Modules”(MILLIPORE社制)浓缩粗酶溶液，换为20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，得到粗酶浓缩液。

(2)通过Butyl-TOYOPEARL650M(东曹社制)进行精制(第1次)

将上述粗酶浓缩液配制成65％硫酸铵饱和液(pH7.5)后，离心，得到上清液。使此粗酶液通过预先用含有65％饱和硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)平衡化的Butyl-TOYOPEARL650M柱，使酶吸附。用相同的缓冲液清洗此柱后，用含有30％饱和硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)使酶溶出，收集活性成分。进而，采用从该缓冲液至20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)的梯度洗脱法洗脱酶，与上述活性成分合并。

(3)通过DEAE-Cellulofine A-500(生化学工业社制)进行精制

用截留分子量为10000的超滤膜“Pellicon2 Modules”浓缩上述活性成分，脱盐后用15mM Tris·盐酸缓冲液(pH8.5)平衡化。使该成分通过用该缓冲液平衡化的DEAE-CellulofineA-500柱，收集活性成分。

(4)通过Butyl-TOYOPEARL650M(东曹社制)进行精制(第2次)

将上述活性成分配制成65％硫酸铵饱和液(pH7.5)后，离心，得到上清液。使该上清液通过用含有65％饱和硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)预先平衡化的Butyl-TOYOPEARL650M柱，使酶吸附。该柱用相同缓冲液清洗后，用含有30％饱和硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)使酶洗脱，收集活性成分。

(5)通过TSKgel G3000SW(东曹社制)精制

用截留分子量13000的笔型膜浓缩组件(pencil-type membraneconcentration module)“ACP-0013”(旭化成工业社制)浓缩上述活性成分，脱盐后使其与含有0.2M氯化钠的50mM磷酸钾缓冲液(pH5.5)平衡。将此成分通过用上述缓冲液平衡化的TSKgelG3000SW(直径2.15cm×高60cm)，用相同缓冲液使酶洗脱，分取活性成分。用Centriplus10(Amicon社制)浓缩活性成分，脱盐后换为50mM柠檬酸·磷酸钠缓冲液(pH5.5)。从粗酶溶液1得到的精制酶(以下称为精制酶1)的比活性为约1,800units/mg，从粗酶溶液2得到的精制酶(以下称为精制酶2)的比活性为约1,010units/mg。从粗酶溶液3得到的酶(以下称为精制酶3)的比活性与上述精制酶等同，所有酶的精制倍率相对于粗酶溶液均为100倍以上。

实施例2

(制备含有插入DNA的载体)

(1)分离全RNA

将2g根据实施例1的1-1(种培养)所述方法培养的湿菌体用液体氮冻结后，使用EASYPrep RNA(TaKaRa Bio社制)萃取得到1.5mg全RNA。

(2)制备cDNA文库

通过使用逆转录酶及附有衔接序列的寡dT引物的逆转录反应，由全RNA制备cDNA文库。反应试剂使用“3’-Full RACE Core Set”(TaKaRa Bio株式会社制)，反应条件依据说明书中记载的方案。

(3)GLD基因的克隆

以cDNA文库为模板，对GLD基因进行PCR扩增。引物可以根据实施例1的1-5(酶的精制)记载的方法，精制上述实施例1的1-3(通过固体培养(麦麸培养)获取粗酶溶液)所述的来自麦麸培养的粗酶溶液2而获得，通过Edman法确定不含有包埋糖的精制酶2的N末端及内部序列的氨基酸，以此氨基酸序列为基础合成多个寡核苷酸。最后使用KpnF(序列号3)、PstR(序列号4)以下的引物组，获取目的GLD基因。

需要说明的是，PCR使用DNA聚合酶、Pyrobest(TaKaRa Bio株式会社)，反应条件为[94℃/30秒→55℃/1分→72℃/2分]×25循环。

然后，使用限制酶PstI和KpnI使pColdIII载体(TaKaRa Bio株式会社)裂开，将该限制酶处理后的PCR扩增断片与载体连接，导入大肠杆菌DH5α株中进行转化。所得转化体中用6个克隆制备质粒DNA，在用PstI和KpnI处理时在全部克隆中可确认目的大小的片断。制备4个克隆的质粒，确定其插入片段的序列，此时可确认在所有质粒中有目的基因。

实施例3

(宿主的转化和酶的精制)

使用实施例2制作的重组载体(pCGLD)转化宿主大肠杆菌JM109株，在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上选择转化体。然后将转化体植菌到含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃下振荡培养。在培养液的OD600为约0.4～0.5时将培养液冷却至15℃，放置30分钟后，添加1mM IPTG，再于15℃下振荡培养24小时。培养结束后，通过离心收集菌体，悬浊在10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中。使用超声波破碎装置破碎菌体后，离心，制备无细胞萃取液。在SDS-PAGE及活性测定中确认目的表达时，可以确认有予测的分子量的酶表达。另外，确认每培养液中酶活性为0.09U/mL。

并且，通过以下步骤(1)～(5)，分离精制辅酶结合型葡萄糖脱氢酶。

(1)浓缩

用截留分子量10000的超滤膜“Pellicon2 Modules”(MILLIPORE社制)浓缩上述无细胞萃取液，置换成20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，得到粗酶液。

(2)采用Butyl-TOYOPEARL650M(东曹社制)进行精制(第1次)

调整上述粗酶液成为65％饱和硫酸铵液(pH7.5)后，离心得到上清液。将此粗酶液通过预先用含有65％硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)平衡化的Butyl-TOYOPEARL650M柱，使酶吸附。用相同缓冲液清洗此柱后，用含有30％硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)使酶洗脱，收集活性成分。进而，采用从该缓冲液至20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)的梯度洗脱法洗脱酶，与上述活性成分合并。

(3)通过DEAE-CellulofineA-500(生化学工业社制)进行精制

用截留分子量10000的超滤膜“Pellicon2 Modules”浓缩上述活性成分，脱盐后使其与15mM Tris·盐酸缓冲液(pH8.5)平衡。使该成分通过用相同缓冲液平衡化的DEAE-Cellulofine A-500柱，收集洗脱液。

(4)采用Butyl-TOYOPEARL650M(东曹社制)进行精制(第2次)

调整上述洗脱液成为65％饱和硫酸铵液(pH7.5)后，离心，得到上清。将此上清液通过预先用含有65％硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)平衡化的Butyl-TOYOPEARL650M柱，使酶吸附。用相同缓冲液清洗该柱后，用含有30％硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)使酶洗脱，收集活性成分。

(5)通过TSKgel G3000SW(东曹社制)进行精制

用截留分子量13000的笔型膜浓缩组件“ACP-0013”(旭化成工业社制)浓缩上述活性成分，脱盐后用含有0.2M氯化钠的50mM磷酸钾缓冲液(pH5.5)使其平衡化。使此成分通过用上述缓冲液平衡化的TSKgel G3000SW(直径2.15cm×高60cm)，用相同缓冲液使酶洗脱，分取活性成分。用Centriplus10(Amicon社制)浓缩活性成分，脱盐后置换成50mM柠檬酸·磷酸钠缓冲液(pH5.5)。所得酶(以下，称为精制酶4)的比活性为约2,450units/mg，其精制度约为粗酶液的50倍。

实施例4

(霉菌的转化和酶的精制)

作为所用的宿主，使用米曲霉(A.oryzae)NS4株。如公知文献1(Biosci.Biotech.Biochem.，61(8)，1367-1369，1997)所述，该菌株于1997年(平成9年)在酿造试验所育种，用于转录因子的解析、各种酶的高生产株的育种等，可以购入被分成小块的菌株。

在该菌株中，使用公知文献2(曲霉属的异种基因表达体系，峰时俊贵，化学和生物，38、12、P831-838、2000)所述的来自米曲霉(A.oryzae)的淀粉酶类的改良启动子，制备可以表达GLD基因的载体。

基本上按照公知文献2及公知文献3(清酒用麴菌的基因操作技术，五味胜也，酿协，P494-502，2000)中记载的方法实施转化。通过反复实施转化·活性株的选择，可以获取具有GLD生产能力的米曲霉(Aspergillus oryzae)。

将该菌株在含有蛋白胨1％、蔗糖2％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸镁0.05％的培养液中于30℃下振荡培养5天，由此可以获取具有GLD活性的培养液。

精制方法按照实施例3中记载的方法实施，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳得到几乎单一的酶标准品。将其作为精制酶5。

实施例5

(酵母的转化和酶的精制)

作为所用宿主，使用采用公知文献4(Laboratory Manual for GeneExpression，Production of useful protein in high expression system，石田功·安东民卫编，Kodansya Scientific Ltd、P100-129、1994)的方法，将作为高蛋白质生产酵母已知的Candida boidiniiS2 AOU-1株改良成异种基因导入用而得到的菌株。需要说明的是，S2 AOU-1株被命名为博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)SAM1958，于1992年2月25日保藏于工业技术院生命工学技术研究所，保藏号为FERM BP-3766。

对于改良的菌株，使用公知文献5(采用甲醇同化性(assimilating)酵母的异种基因表达体系，由里本博也·阪井康能，化学和生物，38、8、P533-540、2000)中记载的来自S2 AOU-1株的甲醇衍生性启动子，制备可以表达GLD基因的载体，按照公知文献4、5的方法进行转化·菌株的选定，由此得到具有GLD生产能力的博伊丁假丝酵母。

将该菌株在含有蛋白胨2％、酵母提取物1％、甘油2％、甲醇1％的培养液中于28℃下振荡培养2天，由此得到具有GLD活性的培养液。

精制方法按照实施例3中记载的方法实施，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳得到几乎单一的酶标准品。将其作为精制酶6。

实施例6

(酶分解)

从上述实施例1的1-2(通过液体培养获取粗酶溶液)中制备的粗酶溶液1中取出一部分，添加0.1％(v/v)SUMIZYME PX、SUMIZYME ARS，在40℃下使其反应2小时。反应结束后，用于SDS-PAGE，使用糖链染色试剂盒(Gelcode Glycoprotein Staining Kit(PIERCE社制))，按照规定的方法进行糖链染色，可确认无糖链分解。

(使用高碘酸进行氧化、还原、酸水解)

在用铝箔被覆的1.5mL容量的Eppendorf管中，加入以蛋白质量计为20μg的粗酶溶液1，加入8分之1量的0.8N偏高碘酸钠(NaIO₄)水溶液(最终浓度：0.1N)，在25℃下进行24小时的氧化反应。然后，加入为此溶液的10分之1量的0.4N NaBH₄水溶液，在室温下使其还原反应10小时。进而，加入为此溶液的10分之1量的1N硫酸水溶液，在25℃下水解24小时。与上述(酶分解)试验的确认试验相同，将该试样供于SDS-PAGE，使用糖链染色试剂盒进行糖链染色，经确认无糖链分解。

(电泳(糖链染色、考马斯亮蓝(CBB)染色、活性染色))

向实施例1至5所得的各酶溶液(精制酶1、2、4、5及6)中以每0.1mg蛋白质1单位糖肽酶(glycopeptidase)F(和光纯药社制)的量加入糖肽酶F，在37℃下使其反应15小时，进行糖链切断处理后，用于SDS-PAGE，通过将此凝胶进行糖链染色，可以确认糖链的量及糖链是否被切断。糖链染色使用糖链染色试剂盒(GelcodeGlycoprotein Staining Kit(PIERCE社制))按照规定的方法实施(图1)。结果确认作为从液体培养上清液中精制得到的酶的精制酶1中有大量的糖，糖链切断处理前后无差别，推断糖肽酶F无作用。另一方面，作为由固体培养精制得到的酶的精制酶2、5及6在糖链切断处理后分子量变小，通过糖肽酶F，一部分糖链被切断。

另外，相同地进行SDS-PAGE、考马斯亮蓝(CBB)染色时，精制酶1难于被CBB染色，精制酶2、4、5及6被CBB良好地染色(图2)。从以上结果可知，与通过液体培养得到的精制酶相比，通过固体培养或基因重组法得到的精制酶键合的糖含量减少，也易被CBB染色。

另外，使用Native-PAGE用的电泳凝胶NPU-7.5L(ATTO株式会社制)，通过Native-PAGE进行电泳分析，进行活性染色。结果如图3所示。需要说明的是，带7是进行液体培养、将酶活性调整为20mU时得到的。另外，带8是进行麦麸培养、将酶活性调整为20mU时得到的，带9是进行麦片培养、将酶活性调整为20mU得到的。带7表示精制酶1，带8表示精制酶2，带9表示精制酶3。

与从液体培养上清液中精制得到的精制酶1相比，作为由固体培养精制得到的酶的精制酶2及精制酶3的泳动位置均出现在较下方的位置。从以上结果可知，通过从液体培养变为固体培养，所得的酶的糖含量减少，易被CBB染色。

根据上述实施例的结果，可以推断精制酶1和其他精制酶是糖含量及组成不同的酶，进行酶的糖分析。

实施例7

(通过ABME标记-HPLC分析进行糖组成的分析)

首先，在试验管中称取35mg对氨基苯甲酸甲酯(ABME)和3.5mg氰基硼氢化钠，加入350μl甲醇和41μl乙酸，搅拌，进行调制。

将上述实施例1至5所得的各精制酶溶液调至蛋白质浓度为1.0mg/mL浓度后，称取100μL放入螺口试验管，在氮气氛围中干固后，加入0.2mL的4N TFA(三氟乙酸)溶液，在100℃下使其反应4小时。反应后，将在管式蒸发器(tube evaporator)中减压干固、再加入200μL离子交换水、减压干固的操作重复3次，完全除去TFA。在通风橱内，加入200μL甲醇和20μL吡啶及20μL乙酸酐，在室温下放置2小时以上，进行N-乙酰化反应。在氮气流中干固反应溶液，溶解于1mL离子交换水中，装入预先已清洗的PRE-SEP C18卡套柱(cartridge column)(日本Waters株式会社制)中，用15mL离子交换水洗脱。将洗脱液在旋转蒸发仪(rotary evaporator)中减压浓缩，再移至螺口试验管，于管式蒸发器中减压干固。使残渣溶解于20μL离子交换水中，加入80μLABME试剂，在80℃下使其反应45分钟。将反应结束后的溶液在氮气流中干固后，加入2mL离子交换水和2mL二乙基醚，搅拌。将其离心，除去含有未反应ABME的醚层。将此醚萃取重复5次，所得的水层在管式蒸发器中减压干固，得到ABME衍生化糖。将其溶解于2mL的高纯水中，进行HPLC分析。

作为HPLC的分析柱，使用Wakosil 5C18-200(4.0×250mm；和光纯药工业株式会社制)，柱温度40℃，流速0.5mL/min，溶剂使用5％乙腈/0.1M乙酸溶液(溶剂A)、15％乙腈/0.1M乙酸溶液(溶剂B)。以线性浓度梯度进行洗脱，具体为从样品注入后开始以A∶B＝100∶0洗脱20分钟，之后经80分钟变化至A∶B＝0∶100。在UV304nm下进行检测。

结果在来自液体培养的精制酶1中检测到半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、N-乙酰葡糖胺，未检测到葡萄糖。另一方面，在来自麦麸培养的精制酶2中检测到甘露糖和N-乙酰葡糖胺，未检测到葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖。除此之外，各精制酶的糖含量如表1所示。

[表1]

	半乳糖	葡萄糖	甘露糖	阿拉伯糖	木糖	鼠李糖	N-乙酰葡糖胺
								精制酶1(来自野生株的液体培养)	11.9	ND	1.72	29.0	ND	1.72	0.434
精制酶2(来自野生株的麦麸培养)	ND	ND	0.269	ND	ND	ND	0.045
								精制酶5(来自重组霉菌)	0.046	ND	0.072	ND	ND	ND	0.015
精制酶6(来自重组酵母)	ND	0.273	0.644	ND	ND	ND	0.023

实施例8

(辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的性质试验)

调查通过上述实施例1至5分离得到的精制酶1至6的活性、基质特异性、阻断剂及辅酶。需要说明的是，根据WO2004/058958说明书36页及37页的酶活性测定法-1、酶活性测定法-2的记载，测定酶活性。

1)活性

在8.66mM DCIP存在下，使各精制酶与500mM D-葡萄糖反应，用D-葡糖酸/D-葡糖酸-δ-内酯定量试剂盒(Roche·Diagnostics社制)定量反应产物。结果确认所有精制酶均生成D-葡糖酸，由此可知，本发明的精制酶2至6是与精制酶1相同地催化D-葡萄糖1位羟基氧化反应的酶。

2)最适pH：

将酶活性测定法-2的缓冲液分别适当地置换成磷酸钾缓冲液(pH6.0～7.0)、Tris·盐酸缓冲液(pH7.4～8.0)或甘氨酸·氢氧化钠缓冲液(pH8.6～9.1)(各缓冲液的终浓度均为17mM)，采用与酶活性测定法-2相同的方法，测定在各pH区域中该精制酶的酶活性。结果，精制酶4、5及6的最适pH为7.0～9.0。

3)稳定pH

将该精制酶分别溶解于50mM浓度的缓冲液、即乙酸·乙酸钠缓冲液(pH3.6～5.3)、磷酸钾缓冲液(pH6.0～6.8)、Tris·盐酸缓冲液(pH7.7)及甘氨酸·氢氧化钠缓冲液(pH8.6～10.0)，在40℃下保持60分钟后，采用活性测定方法-1测定酶活性，分析酶活性的残存率。精制酶5的稳定pH为4.5～8.5。

4)最适温度

将辅酶结合型葡萄糖脱氢酶溶解于50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，根据上述活性测定方法-1在30℃～62℃的范围内测定酶活性。结果，精制酶5的最适温度为55℃左右。

5)温度稳定性

将辅酶结合型葡萄糖脱氢酶溶解于50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，在从0℃至55℃的几个温度下保持15分钟后，采用活性测定方法1测定酶活性，分析酶活性的残存率。此处，以在0℃下保持15分钟时的酶活性值为100％，计算酶活性的残存率。结果，精制酶5即使在50℃下仍保持89％的酶活性，在约50℃以下稳定。

6)亚基分子量：

使用1 2.5％聚丙烯酰胺凝胶，根据Laemmli等的方法(Nature(1970)227：680-685)，将该精制酶用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳后进行考马斯亮蓝(CBB)染色，将移动度与分子量标记(LMW Marker；Amersham Pharmacia biotech公司制)的移动度相比较，结果各酶的亚基分子量为：精制酶2约71kDa、精制酶4约58kDa、精制酶5约81kDa、精制酶6约128kDa。

7)基质特异性

活性测定方法-1中的活性测定用反应液的基质，使用D-葡萄糖及其他各基质(终浓度均为333mM，D-纤维二糖为193mM、D-海藻糖及D-棉子糖为121mM)，按照酶活性测定法-1测定精制酶1至6的酶活性。以对D-葡萄糖的活性值为100％，以相对于该值的相对值作为对各基质的活性值。

另外，与上述相同，将D-葡萄糖及麦芽糖的终浓度分别设定为550mM及100mM2种，测定相对反应性(酶活性)。结果是以D-葡萄糖的值为基准换算成相对值。

由此可知，本发明的精制酶2至6与精制酶1相同，对D-葡萄糖作用强，对D-甘露糖、1，5-脱水-D-葡萄糖醇、D-纤维二糖、D-海藻糖、麦芽糖、D-半乳糖、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖作用微弱。另外，对L-阿拉伯糖、乳糖、D-山梨糖醇、葡糖酸、蔗糖、D-甘露糖醇、L-山梨糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖-1-磷酸、D-棉子糖、乙醇、甘油几乎无作用。

8)阻断剂

在活性测定方法-1的反应体系中，分别加入溶解于甲醇的1，10-菲咯啉，且使其终浓度分别为1mM、5mM、10mM、25mM及50mM，按照活性测定方法-1测定精制酶1至6的活性。需要说明的是，相对于反应体系的甲醇终浓度均为10％(v/v)。按照活性测定方法-1，对照区添加甲醇，使终浓度为10％(v/v)进行测定。结果，添加1，10-菲咯啉的最终浓度为1mM以上时，阻断率均较高，为60％以上。

9)辅酶

向精制酶1至6中添加D-葡萄糖，进行吸光分析时，所有在385nm及465nm可确认的极大吸收均通过添加D-葡萄糖而消失，由此表明辅酶为FAD。需要说明的是，上述极大吸收为FAD特有，构筑唯独未加FAD的对照反应体系时，不能观测到。

实施例9

(传感器特性的比较)

使用实施例1的1-2所得的精制酶1、及实施例3至5所得的精制酶4至6，用电化学分析器CHI611A(BAS社制)求出各双分子反应速度常数。需要说明的是，辅助电极使用铂，工作电极使用碳、参比电极使用银/氯化银。在pH7.0的Mops缓冲液中加入终浓度为142mM的葡萄糖及0.45μM精制酶4、0.76μM精制酶5、1.9μM精制酶6、或1.1μM精制酶1，顺次添加锇配位体[Os(4-Methyl-imidazole)₂(4-dimethyl-bipyridine)₂](PF₆)₂，使终浓度为0mM至0.57mM，在各浓度(参见图4)下测定循环伏安(cyclic voltammogram)，结果，精制酶4的双分子反应速度常数为8.15×10⁴s^-1M^-1、精制酶5的双分子反应速度常数为7.36×10⁴s^-1M^-1，精制酶6的双分子反应速度常数为9.3 8×10⁴s^-1M^-1。精制酶1电流较低，未见稳定电流值，不能计算双分子反应速度常数(图4)。

另外，与上述相同，在pH7.0的Mops缓冲液中加入终浓度为142mM葡萄糖及0.45μM精制酶4、0.76μM精制酶5、0.55μM精制酶6、或1.1μM精制酶1，顺次添加醌化合物2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌，使终浓度为0mM至0.22mM，测定各浓度(参见图5)下的循环伏安，结果，精制酶4的双分子反应速度常数为1.14×10⁸s^-1M^-1、精制酶5的双分子反应速度常数为5.29×10⁷s^-1M^-1、精制酶6的双分子反应速度常数为2.49×10⁷s^-1M^-1。精制酶1的双分子反应速度常数较低，为5.69×10⁴s^-1M^-1。

从上述结果可知，从重组基因的细胞中得到的酶，与从野生株获得的酶相比反应性提高(图5)。

使用实施例1的1-2及1-3所得的精制酶1及2，用电化学分析器CHI611A(BAS社制)求出各双分子反应速度常数。需要说明的是，辅助电极使用铂，工作电极使用碳，参比电极使用银/氯化银。在pH7.0的Mops缓冲液中添加终浓度142mM的葡萄糖及0.94μM精制酶1或3.3μM精制酶2，顺次添加铁氰化钾，使终浓度为0mM至0.671mM，在各铁氰化钾浓度(0、0.019、0.048、0.095、0.142、0.188、0.234、0.280、0.325、0.370、0.414、0.458、0.501、0.544、0.587、0.629、0.671mM)下测定循环伏安，结果，精制酶2的双分子反应速度常数为2.84×10³s^-1M^-1。精制酶1的电流较低，未见稳定电流值，不能计算双分子反应速度常数。精制酶1由于为糖包埋型酶所以反应性弱，精制酶2无包埋的糖，是具有通常的糖链的酶，因此，反应性得到改善。

实施例10

(使用酶固定化电极测定葡萄糖)

使用精制酶1、2、4、5及6，使用酶固定化电极测定D-葡萄糖。使用固定1.0U各酶的玻璃碳(GC)电极，测定相对于葡萄糖浓度的应答电流值。向电解槽中加入50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)1.8ml及1M六氰合铁(III)酸钾(铁氰化钾)水溶液0.2ml。将GC电极与恒电位仪BAS100B/W(BAS制)连接，在40℃下搅拌溶液，对银/氯化银参比电极施加+500mV。在上述体系中添加1M D-葡萄糖溶液20μl，测定稳定状态的电流值。进而，将添加同量1M D-葡萄糖溶液、测定电流值的操作各重复3次。相对于已知的葡萄糖浓度(约10、20、30、40mM)测绘此电流值，制作标准曲线(图6)。由此，通过使用本发明GLD的酶固定化电极，可以定量葡萄糖。

实施例11

由序列号1合成多个寡核苷酸，最后使用序列号13及序列号14的引物组，将作为以FAD为辅酶的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶生产株的日本曲霉菌(Aspergillus japonicus)IFO4408、蓝青霉菌(Penicilliumcyaneum)IFO5337及灵芝(Ganoderma applanatum)IFO6498的DNA作为模板，进行PCR。此外，在实施例1记载的条件下培养各株，用液体氮冷冻所得湿菌体后，粉碎，用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)(NIPPON GENE社制)萃取DNA。使用TaKaRa LA Taq(TaKaRaBio社制)，用热循环仪(thermal cycler)(Stratagene社制)，在[94℃/30秒→42℃/30秒→72℃/1.5分]×35循环的反应条件下进行PCR。解析约1.6kbp的各扩增产物的序列，将除去了内含子的cDNA序列和序列号1、或公知的葡萄糖氧化酶及山梨糖脱氢酶的序列进行比较时，可明确以FAD为辅酶的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶所特有的碱基序列(序列号5-7)及、氨基酸序列(序列号8-12)。特别指出的是，序列号8的氨基酸序列是FAD的结合位点，是活性中心的一部分。

产业上的可利用性

本发明可以用于糖尿病检查领域。

序列表

<110>池田食研株式会社

<120>辅酶结合型葡萄糖脱氢酶和编码该酶的多核苷酸

<130>PC-10067

<160>4

<170>Patentln version 3.1

<210>1

<211>1779

<212>DNA

<213>土曲霉

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1779)

<223>

<400>1

atgttgggaa agctctcctt cctcagtgcc ctgtccctgg cagtggcggc acctttgtcc   60

aactccacgt ccgccaaata tgattatatc gttattggag gcggtactag cggtttggcc  120

gtcgcaaacc gtctatcgga ggatccaaac gtgaacgtac tcattctgga ggccggtggc  180

tcggtctgga acaatcccaa tgtcacaaac gtggatggct acgggcttgc ttttgggtct  240

gacattgact ggcaatacca gtccgtcaac cagccatatg gaggcaacct tagtcaagtg  300

cttcgtgccg gcaaggccct tggtggtact agtactatca atggcatggc ctatacgcgc  360

gccgaggatg tccagatcga cgcctgggaa accattggca acacaggatg gacgtggaag  420

aatctgttcc cttactatcg gaagagcgag aactttactg tccctaccaa atcgcagacc  480

tctcttggag cgtcgtatga agctggagcc cacggccacg agggtcccct tgacgttgcc  540

ttcactcaga tcgagtcgaa caacctgacc acttacctca accgtacctt ccagggcatg  600

ggactcccat ggacggagga cgtcaatggc ggaaagatgc gcggctttaa cttatacccc  660

tccaccgtga atcttgagga gtatgtgcgc gaagacgccg ctcgtgcata ctactggccc  720

tacaagtccc gtcccaactt gcatgtcctg ctcaacactt ttgccaaccg gattgtgtgg  780

gacggcgaag cccatgacgg ccacatcact gccagtggtg tcgagatcac ttccaggaac  840

ggcactgttc gtgttatcaa tgcggagaag gaagtcattg tctctgccgg tgccttgaag  900

tccccggcta tccttgaact ttctggaatt ggcaacccta gcgttcttga caagcacaac  960

atccccgtca aggtcaacct cccgactgtc ggcgagaacc ttcaggacca agtgaacagc 1020

cacatggatg catcgggcaa cacttccatc tctggaacca aggcagtctc ctaccccgat 1080

gtctatgacg tcttcggtga cgaagccgag tcggtcgcca aacagatccg tgccaacctg 1140

aagcaatacg ccgccgacac cgccaaggcc aacggaaaca ttatgaaggc cgccgatctg 1200

gagcgtctct tcgaggtcca gtatgacctt attttcaagg gcagagttcc aatcgctgaa 1260

gtcctgaact atccgggcag cgcgacgtcc gtgtttgcag aattctgggc cctccttccc 1320

ttcgctcgtg gaagtgttca catcggttct tcaaacccgg ccgagttccc tgtcatcaac 1380

cccaactatt tcatgctcga ctgggacgcg aagagctacg ttgccgttgc gaagtatatc 1440

cgccgttcgt tcgagagcta ccctctcagc agtatcgtga aggagtctac ccctggctat 1500

gatgttatcc cccggaacgc ttctgagcag agctggaaag aatgggtctt tgataagaac 1560

tatcgttcta acttccatcc cgtcggcacg gctgccatga tgcctcgtga gattggtggt 1620

gtcgtggacg agcgtctgaa tgtctatggc actacgaatg tcagagttgt agatgcttcg 1680

gtccttccat tccaggtctg cggccatttg gtgagcacac tatacgctgt ggccgaacgg 1740

gcggcggatc tcatcaaggc cgatgctggt cgtcgttag                        1779

<210>2

<211>592

<212>PRT

<213>土曲霉

<400>2

Met Leu Gly Lys Leu Ser Phe Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ala Val Ala

  1               5                      10              15

Ala Pro Leu Ser Asn Ser Thr Ser Ala Lys Tyr Asp Tyr Ile Val Ile

             20                  25                  30

Gly Gly Gly Thr Ser Gly Leu Ala Val Ala Asn Arg Leu Ser Glu Asp

         35                 40                  45

Pro Asn Val Asn Val Leu Ile Leu Glu Ala Gly Gly Ser Val Trp Asn

     50                  55                 60

Asn Pro Ash Val Thr Asn Val Asp Gly Tyr Gly Leu Ala Phe Gly Ser

 65                  70                 75                   80

Asp Ile Asp Trp Gln Tyr Gln Ser Val Asn Gln Pro Tyr Gly Gly Asn

                 85                  90                  95

Leu Ser Gln Val Leu Arg Ala Gly Lys Ala Leu Gly Gly Thr Ser Thr

            100                 105                 110

Ile Asn Gly Met Ala Tyr Thr Arg Ala Glu Asp Val Gln Ile Asp Ala

        115                 120                 125

Trp Glu Thr Ile Gly Asn Thr Gly Trp Thr Trp Lys Asn Leu Phe Pro

    130                 135                 140

Tyr Tyr Arg Lys Ser Glu Asn Phe Thr Val Pro Thr Lys Ser Gln Thr

145                 150                 155                 160

Ser Leu Gly Ala Ser Tyr Glu Ala Gly Ala His Gly His Glu Gly Pro

                165                 170                 175

Leu Asp Val Ala Phe Thr Gln Ile Glu Ser Asn Asn Leu Thr Thr Tyr

                                              (1)

            180                 185                 190

Leu Asn Arg Thr Phe Gln Gly Met Gly Leu Pro Trp Thr Glu Asp Val

        195                 200                 205

Asn Gly Gly Lys Met Arg Gly Phe Asn Leu Tyr Pro Ser Thr Val Asn

    210                 215                 220

Leu Glu Glu Tyr Val Arg Glu Asp Ala Ala Arg Ala Tyr Tyr Trp Pro

225                 230                 235                 240

Tyr Lys Ser Arg Pro Asn Leu His Val Leu Leu Asn Thr Phe Ala Asn

                245                 250                 255

Arg Ile Val Trp Asp Gly Glu Ala His Asp Gly His Ile Thr Ala Ser

            260                 265                 270

Gly Val Glu Ile Thr Ser Arg Asn Gly Thr Val Arg Val Ile Asn Ala

        275                 280                 285

Glu Lys Glu Val Ile Val Ser Ala Gly Ala Leu Lys Ser Pro Ala Ile

    290                 295                 300

Leu Glu Leu Ser Gly Ile Gly Asn Pro Ser Val Leu Asp Lys His Asn

305                 310                 315                 320

Ile Pro Val Lys Val Asn Leu Pro Thr Val Gly Glu Asn Leu Gln Asp

                325                 330                 335

Gln Val Asn Ser His Met Asp Ala Ser Gly Asn Thr Ser Ile Ser Gly

            340                 345                 350

Thr Lys Ala Val Ser Tyr Pro Asp Val Tyr Asp Val Phe Gly Asp Glu

        355                 360                 365

Ala Glu Ser Val Ala Lys Gln Ile Arg Ala Asn Leu Lys Gln Tyr Ala

    370                 375                 380

Ala Asp Thr Ala Lys Ala Asn Gly Asn Ile Met Lys Ala Ala Asp Leu

385                 390                 395                 400

Glu Arg Leu Phe Glu Val Gln Tyr Asp Leu Ile Phe Lys Gly Arg Val

                405                 410                 415

Pro lle Ala Glu Val Leu Asn Tyr Pro Gly Ser Ala Thr Ser Val Phe

            420                 425                 430

Ala Glu Phe Trp Ala Leu Leu Pro Phe Ala Arg Gly Ser Val His Ile

        435                 440                 445

Gly Ser Ser Asn Pro Ala Glu Phe Pro Val Ile Asn Pro Asn Tyr Phe

    450                 455                 460

Met Leu Asp Trp Asp Ala Lys Ser Tyr Val Ala Val Ala Lys Tyr Ile

465                 470                 475                 480

Arg Arg Ser Phe Glu Ser Tyr Pro Leu Ser Ser Ile Val Lys Glu Ser

                485                 490                 495

Thr Pro Gly Tyr Asp Val Ile Pro Arg Asn Ala Ser Glu Gln Ser Trp

            500                 505                 510

Lys Glu Trp Val Phe Asp Lys Asn Tyr Arg Ser Asn Phe His Pro Val

        515                 520                 525

Gly Thr Ala Ala Met Met Pro Arg Glu Ile Gly Gly Val Val Asp Glu

    530                 535                 540

Arg Leu Asn Val Tyr Gly Thr Thr Asn Val Arg Val Val Asp Ala Ser

545                 550                 555                 560

Val Leu Pro Phc Gln Val Cys Gly His Leu Val Ser Thr Leu Tyr Ala

                565                 570                 575

Val Ala Glu Arg Ala Ala Asp Leu Ile Lys Ala Asp Ala Gly Arg Arg

            580                 585                 590

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工序列的说明：合成寡核苷酸

<400>3

cgtcatggta cctccaactc cacgtccgcc aa    32

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工序列的说明：合成寡核苷酸

<400>4

agtgtactgc agctaacgac gaccagcatc gg    32

<210>5

<211>214

<212>DNA

<213>土曲霉

<220>

<221>CDS

                                                      (2)

<400>5

tbgargcmgg hgvntcngbn ydsaacaayy ysraygtvwc naaysyndhb ggytayrgvh  60

yngcnttygg vwcbsmbrty gaytggsmvt aymarwcbrw baaccarmvv taygsaggmr 120

rymwdmvbca rrybhtncgw gcbgghaarg yymtbggwgg nacbagyacn atcaatggma 180

tgkcmtayac bcgvgcmsar gaygtbcara tyga                             214

<210>6

<211>77

<212>DNA

<213>土曲霉

<220>

<221>CDS

<400>6

tyctygarctk tchgghrtkg gmaacccdds svtyytbram raghacaaya tmhcmsymvd 60

dgtyraymtn mcvacygtyg gvgaraa                                      87

<210>7

<211>209

<212>DNA

<213>土曲霉

<220>

<221>CDS

<400>7

atcaayccha actaytwyat gytygrnyrr gayrbbrmrd shyavryyrs bryhgcsmar  60

twyatymgsh vbdybytbsr baaykmnccw ytbwvcdvwh tyrtkrvvdm kkmdryyhmb 120

ssykrhbwbd hyrhvvyhys drmyrvtkch dmsvrbdvsd vdwrrdhhdr dkksbtyrad 180

rmdrmytayc gwwchaactw ccayccmgt                                   209

<210>8

<211>15

<212>PRT

<213>土曲霉

<400>8

Gly Xaa Gly Thr Ser Gly Leu Xaa Xaa Ala Asn Arg Leu Ser Glu

  1               5                  10                  15

<210>9

<211>26

<212>PRT

<213>土曲霉

<400>9

Arg Ala Gly Lys Xaa Xaa Gly Gly Thr Ser Thr Ile Asn Gly Met Xaa

  1               5                  10                  15

Tyr Thr Arg Ala Xaa Asp Val Gln Ile Asp

            20                  25

<210>10

<211>12

<212>PRT

<213>土曲霉

<400>10

Ser Pro Xaa Xaa Leu Glu Leu Ser Gly Xaa Gly Asn Pro

  1               5                  10

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>土曲霉

<400>11

Thr Val Gly Glu Asn Leu Gln

  1               5

<210>12

<211>11

<212>PRT

<213>土曲霉

<400>12

Leu Leu Pro Phe Xaa Arg Gly Xaa Xaa His Ile

  1               5                  10

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>土曲霉

<220>

<221>CDS                                             (3)

<400>13

ttggwggygg wacyagtgg                                19

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>土曲霉

<220>

<221>CDS

<400>14

gtkcckacgg gatggaagtt                               20

Claims (33)

1.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码可溶性的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，所述辅酶结合型葡萄糖脱氢酶在电子受体存在下催化葡萄糖脱氢反应，相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有下述1)至4)性质的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶，

2)亚基结构为同二聚体，

3)不以氧为电子受体，及

4)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有下述1)至3)性质的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶，

2)不以氧为电子受体，及

3)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下。

4、如权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有下述1)至4)性质的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶，

2)不以氧为电子受体，

3)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，及

4)相对于每1μg蛋白质，所含糖的含量总和为80μg以下。

4.如权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有下述1)至4)性质的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，

1)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶，

2)不以氧为电子受体，

3)相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下，及

4)相对于每1单位酶活性，所含糖的含量总和为40μg以下。

5.一种多核苷酸，所述多核苷酸具有选自序列号5～7记载的、编码辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的碱基序列的共有序列中的1种或2种以上的部分碱基序列，且编码具有下述a～d性质的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，

a亚基分子量：约63kDa，

b辅酶：FAD，

c催化将葡萄糖的1位羟基氧化、将葡萄糖变为葡糖酸-δ-内酯的反应，

d相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下。

6.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，所述辅酶结合型葡萄糖脱氢酶具有选自序列号8～12记载的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶共有序列中的1种或2种以上的部分氨基酸序列，且具有下述a～d性质，

a亚基分子量：约63kDa，

b辅酶：FAD，

c催化将葡萄糖的1位羟基氧化、将葡萄糖变为葡糖酸-δ-内酯的反应，

d相对于对葡萄糖的活性，对麦芽糖的活性为5％以下。

7.如权利要求1～7中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸是从丝状菌或担子菌分离获得的。

8.如权利要求1～8中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸是从曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、或灵芝属(Ganoderma)微生物中分离获得的。

9.如权利要求1～9中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸是从土曲霉菌(A.terreus)中分离获得的。

10.如权利要求1～10中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸是由序列号1所示的碱基序列构成的。

11.一种多核苷酸，所述多核苷酸由在序列号1所示碱基序列中缺失、取代或附加1个或数个碱基得到的碱基序列构成，且编码具有葡萄糖脱氢作用的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶。

12.一种多核苷酸，所述多核苷酸由与由序列号1所示碱基序列构成的多核苷酸的同源性为60％以上的碱基序列构成，且编码具有葡萄糖脱氢作用的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶。

13.一种多核苷酸，所述多核苷酸和由与由序列号1所示碱基序列构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有葡萄糖脱氢作用的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶。

14.一种编码辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的多核苷酸的获取方法，其特征在于，固体培养具有辅酶结合型葡萄糖脱氢酶生产能力的微生物，以所得酶的信息为基础克隆基因。

15.如权利要求15所述的编码辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的多核苷酸的获取方法，其中，所述微生物为属于曲霉属(Aspergillus)的1个以上菌株。

16.如权利要求15或16所述的编码辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的基因的获取方法，其中，所述微生物为选自土曲霉(A.terreus)、日本曲霉(A.japonicus)、米曲霉(A.oryzae)中的1个以上菌株。

17.一种辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，所述辅酶结合型葡萄糖脱氢酶具有由权利要求1～14中任一项所述的多核苷酸的碱基序列编码的氨基酸序列。

18.如权利要求18所述的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，所述辅酶结合型葡萄糖脱氢酶由序列号2所示的氨基酸序列构成。

19.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码由序列号2所示氨基酸序列构成的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶。

20.一种辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，所述辅酶结合型葡萄糖脱氢酶由在序列号2所示氨基酸序列中缺失、取代或附加1个或数个氨基酸形成的氨基酸序列构成，且具有葡萄糖脱氢作用。

21.一种辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，所述辅酶结合型葡萄糖脱氢酶由与序列号2所示氨基酸序列具有至少60％序列同源性的氨基酸序列构成，且具有葡萄糖脱氢作用。

22.一种重组载体，所述重组载体载有权利要求1～14或20中任一项所述的多核苷酸。

23.一种转化细胞，所述转化细胞通过使用权利要求23所述的重组载体而制成。

24.一种辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于，培养权利要求24所述的转化细胞，从所得培养物中收集具有葡萄糖脱氢作用的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶。

25.一种辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于，使产生权利要求18、19、21、22中任一项所述的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的微生物存在于固体培养物中，由此使该培养物中生成该辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，进行收集。

26.一种辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，由权利要求25或26所述的方法制备。

27.一种辅酶结合型葡萄糖脱氢酶，具有序列号2的第20-592氨基酸序列，或与此氨基酸序列有60％以上同源性的氨基酸序列，具有与权利要求18、19、21、22或27中任一项所述的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶相同的功能，且可以通过肽合成法或基因重组法合成。

28.一种葡萄糖的测定方法，其特征在于，使用权利要求18、19、21、22或27、28中任一项所述的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶。

29.如权利要求29所述的葡萄糖的测定方法，其特征在于，使用时在终浓度2mM至500mM的范围内使用铁氰化物。

30.一种葡萄糖测定试剂组合物，其特征在于，含有权利要求18、19、21、22或27、28中任一项所述的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶。

31.如权利要求31所述的葡萄糖测定试剂组合物，其特征在于，使用时在终浓度2mM至500mM的范围内使用铁氰化物。

32.一种葡萄糖测定用生物传感器，其特征在于，使用权利要求18、19、21、22或27、28中任一项所述的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶。

33.如权利要求33所述的生物传感器，其特征在于，使用时在终浓度2mM至500mM的范围内使用铁氰化物。

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