WO2013147206A1 - フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びこれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びこれをコードするポリヌクレオチド Download PDF

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WO2013147206A1
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glucose dehydrogenase
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glucose
amino acid
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本田　通済
涼 竹中
高史 宅見
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池田食研株式会社
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    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements

Definitions

  • the present invention relates to a soluble flavin-binding glucose dehydrogenase (GLD) that catalyzes a reaction of dehydrogenating (oxidizing) the hydroxyl group at the 1-position of glucose. More specifically, a novel GLD polypeptide, a polynucleotide encoding the same, a method for producing the GLD, a glucose measuring method using the GLD, a glucose measuring reagent composition, and a glucose measuring method It relates to biosensors.
  • GLD glucose dehydrogenase
  • ⁇ Rapid and accurate measurement of blood glucose concentration is important in diagnosing diabetes.
  • the enzymatic method is superior in terms of specificity and safety.
  • electrochemical biosensors are advantageous from the viewpoints of reducing the amount of specimen, reducing the measurement time, and reducing the size of the apparatus.
  • glucose oxidase using oxygen as an electron acceptor As an enzyme that can be used in such a biosensor, glucose oxidase using oxygen as an electron acceptor is known.
  • glucose oxidase since glucose oxidase has a problem that measurement errors occur due to dissolved oxygen in blood, several glucose dehydrogenases that do not use oxygen as an electron acceptor have been developed.
  • glucose dehydrogenases flavin-binding glucose dehydrogenase does not require the addition of a coenzyme and is not affected by dissolved oxygen, and thus has attracted attention as an enzyme for glucose biosensors (Patent Documents 1 to 7). .
  • Patent Document 5 those having excellent substrate specificity (Patent Document 5), when the activity value at 50 ° C.
  • Patent Document 6 an activity value at 60 ° C. of 70% or more
  • Patent Document 7 a modified enzyme in which the relative activity value at 25 ° C. is improved when it is 100%.
  • an object of the present invention is to provide a flavin-binding glucose dehydrogenase having a small activity fluctuation in a general biosensor measurement temperature range (10 to 40 ° C.), a glucose measurement method using the same, and the like. .
  • the present invention searched for glucose dehydrogenases derived from various microorganisms.
  • the substrate specificity for glucose is high and the activity value at 30 ° C. is 10%.
  • a flavin-binding glucose dehydrogenase having an activity value at 20 to 150 ° C. of 20 to 150% exists, and it was found that glucose concentration can be measured accurately and reproducibly in a wider temperature range, thereby completing the present invention. .
  • Flavin-binding glucose dehydrogenase having the following properties (1) to (3): (1) Action: shows glucose dehydrogenase activity in the presence of an electron acceptor; (2) Substrate specificity: the activity values for maltose, D-galactose, D-fructose, sorbitol, lactose and sucrose when the activity value for D-glucose is 100% are 10% or less; (3) Temperature characteristics: When the activity value at 30 ° C. is 100%, the activity value at 10 to 40 ° C. is 20 to 150%.
  • Glucose dehydrogenase comprising the following protein (a), (b) or (c): (A) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 or 20, (B) 17th to 591th of SEQ ID NO: 2, 16th to 589th of SEQ ID NO: 4, 24 to 592th of SEQ ID NO: 6, 17 to 591st of SEQ ID NO: 8, 18th to 586th of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: A protein having the amino acid sequence shown in Nos.
  • a polynucleotide comprising the following (e), (f), (g) or (h): (E) a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19, (F) 49 to 1773 of SEQ ID NO: 1, 46 to 1767 of SEQ ID NO: 3, 70 to 1776 of SEQ ID NO: 5, 49 to 1773 of SEQ ID NO: 7, 52 to 1758 of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 to 52 to 1758, SEQ ID NO: 13 to 52 to 1758, SEQ ID NO: 15 to 52 to 1758, SEQ ID NO: 17 to 52 to 1758, or SEQ ID NO: 19 to 51 to 1758 nucleotide, (G) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide of (e) or (f) under stringent conditions and encodes a protein having glucose dehydrogenase activity; (H) A polynucleotide encoding the
  • a recombinant vector comprising the polynucleotide according to [8].
  • a transformed cell comprising the polynucleotide according to [8].
  • a method for producing glucose dehydrogenase comprising culturing the cell according to [10] and collecting glucose dehydrogenase from the culture.
  • a flavin-binding glucose dehydrogenase having a small activity fluctuation can be provided in a measurement temperature range (10 to 40 ° C.) of a general biosensor, and if the enzyme is used, the measurement environment is low. Can measure blood glucose accurately and with good reproducibility.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of glucose dehydrogenases (A) to (F) of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing the optimum temperature range of the glucose dehydrogenase (A) to (F) of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of measuring the amount of glucose by the glucose dehydrogenases (A) to (F) of the present invention. It is a figure which shows pH stability of this invention glucose dehydrogenase (F).
  • the glucose dehydrogenase of the present invention is a soluble flavin-binding glucose dehydrogenase, and is an enzyme exhibiting activity in a state in which flavin as a coenzyme is bound.
  • an enzyme classified as EC 1.1.9.10 examples include flavin adenine dinucleotide (FAD) and flavin mononucleotide (FMN).
  • the glucose dehydrogenase of the present invention is characterized by the following properties (1) to (3).
  • Action Shows glucose dehydrogenase activity in the presence of an electron acceptor.
  • Substrate specificity The activity value for maltose, D-galactose, D-fructose, sorbitol, lactose and sucrose is 10% or less when the activity value for D-glucose is 100%.
  • Temperature characteristics When the activity value at 30 ° C. is 100%, the activity value at 10 to 40 ° C. is 20 to 150%.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention (1) exhibits glucose dehydrogenase activity in the presence of an electron acceptor. That is, it catalyzes a reaction in which the hydroxyl group of glucose is oxidized to produce glucono- ⁇ -lactone in the presence of an electron acceptor.
  • coenzyme FAD becomes FADH 2
  • ferricyanide for example, “Fe (CN) 6 ” 3 ⁇
  • FADH 2 is This is converted into a ferrocyanide (in this case, “Fe (CN) 6 ” 4 ⁇ ), and itself returns to FAD.
  • ferrocyanide is applied with an electric potential, it passes electrons to the electrode and returns to the ferricyanide.
  • an electrochemical signal can be detected.
  • the substrate specificity of the glucose dehydrogenase of the present invention is suitable for the measurement of glucose since it has a high specificity for D-glucose.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention is (2) reactivity to maltose, D-galactose, D-fructose, sorbitol, lactose and sucrose when the activity value to D-glucose is 100% with respect to reactivity to D-glucose. Is 10% or less, preferably 8% or less, more preferably 6% or less, and still more preferably 5% or less. More preferably, the activity value for D-fructose, sorbitol, lactose and sucrose when the activity value for D-glucose is 100% is 1% or less, particularly preferably 0.5% or less.
  • the temperature characteristics of the glucose dehydrogenase of the present invention are as follows: (3) When the activity value at 30 ° C. is 100%, the activity value at 10 to 40 ° C. is 20 to 150%, and the activity at 10 ° C. to 40 ° C.
  • the lower limit of the value is preferably 30%, more preferably 40%, and still more preferably 50%.
  • the upper limit of the activity value at 10 to 40 ° C. is preferably 140%, more preferably 130%, still more preferably 120%, and particularly preferably 110%.
  • the preferred range is preferably 30 to 130%, more preferably 40 to 120%, still more preferably 50 to 110% at a substrate concentration of 10 mM; preferably 30 to 140%, more preferably at a substrate concentration of 50 mM. Is 40 to 130%, more preferably 50 to 120%.
  • the activity value at 30 ° C. is 100%
  • the activity value at 10 ° C. is preferably 20% or more
  • the substrate concentration is 10 mM, more preferably 30% or more, still more preferably 40% or more, Particularly preferably 50% or more; when the substrate concentration is 50 mM, it is more preferably 30% or more, still more preferably 40% or more, and particularly preferably 50% or more.
  • the activity value at 20 ° C. is preferably 40% or more, and when the substrate concentration is 10 mM, more preferably 50% or more, still more preferably 60% or more, Particularly preferably 70% or more; when the substrate concentration is 50 mM, it is more preferably 50% or more, still more preferably 60% or more, and particularly preferably 70% or more.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention preferably further has the following properties (4) to (6). That is, (4) the molecular weight of the enzyme protein polypeptide is preferably 60-70 kDa, more preferably 65-70 kDa.
  • the molecular weight of the polypeptide of the enzyme protein is the molecular weight when the molecular weight of the protein part from which the sugar chain has been removed is measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the molecular weight of the entire enzyme as determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis varies depending on the culture conditions, purification conditions, etc., depending on the amount of glycan addition. The amount of added sugar changes and the molecular weight changes.
  • the optimum temperature of the glucose dehydrogenase of the present invention is preferably 30 to 40 ° C. More specifically, the relative activity value is measured at 30 to 40 ° C. when the enzyme is measured at various temperatures by the enzyme activity measurement method described later and the activity value at the temperature at which the enzyme exhibits maximum activity is 100%. Is more preferably 50% or more, still more preferably 60% or more, and most preferably 80 ° C. or more.
  • the (6) Km of the glucose dehydrogenase of the present invention is preferably 1 to 80 mM, and more preferably 5 to 60 mM.
  • glucose dehydrogenase of the present invention include six types as shown in Examples 2 to 7 below.
  • the origin of the glucose dehydrogenase of the present invention is not particularly limited, it is preferably a filamentous fungus, more preferably a filamentous fungus belonging to the class of Dothidemycetes, more preferably Dothideomycetidae or the sub-class of preospora
  • a filamentous fungus belonging to (Pleospomycetidae) more preferably a filamentous fungus belonging to the order of Dothideales, Capnodiales or Pleosporales, and more preferably the family Dothioaceae
  • a fungus belonging to the family Venturiaceae particularly preferred Is a filamentous fungus belonging to any of the genus Aureobasidium, Kabatiella, Cladosporium, or Fusacladium, and most preferably Aureobasidium pullulans, Kabatiella ⁇ Kalibora (Kabatiella caulivora), Kabatiella zeae (Kavatiella zeae),
  • the glucose dehydrogenase of the present invention can be produced, for example, by culturing a glucose dehydrogenase-producing bacterium belonging to a filamentous fungus and collecting it from the culture.
  • a normal culture medium for microbial culture can be used, and if it contains moderate amounts of micronutrients required by the carbon source, nitrogen source, inorganic substance and other microorganisms used, a synthetic medium, Any natural medium can be used.
  • a carbon source glucose, sucrose, dextrin, starch, glycerin, molasses and the like can be used.
  • Nitrogen sources include inorganic salts such as ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate and ammonium phosphate, amino acids such as DL-alanine and L-glutamic acid, nitrogen content such as peptone, meat extract, yeast extract, malt extract and corn steep liquor Natural products can be used.
  • inorganic substances include monosodium phosphate, disodium phosphate, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, and ferric chloride.
  • the culture for obtaining the glucose dehydrogenase of the present invention is usually preferably carried out under aerobic conditions by a method such as shaking culture or aeration stirring, and is carried out in the range of 20 to 50 ° C. and pH 4 to pH 8. preferable.
  • the culture period is preferably in the range of 2 days to 10 days.
  • the microorganism is removed by centrifugation or the like to obtain a culture supernatant, or after culturing the microorganism, the culture solution is centrifuged to obtain the cultured microorganism, and the cultured microorganism is obtained by an appropriate method. Is obtained, and a supernatant is obtained from the crushed liquid by centrifugation or the like.
  • Glucose dehydrogenase contained in these supernatants can be appropriately purified by ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, dialysis, ion exchange chromatography, hydrophobic adsorption chromatography, gel filtration, affinity chromatography, electrophoresis, etc. Can be purified by combining.
  • a solid medium can also be used for the culture for obtaining the glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the culture method is not particularly limited, and may be static culture or can be performed by rotating culture or fluidized bed culture in which the culture is always mixed. Is preferred.
  • a normal protein purification method can be used as a method for obtaining glucose dehydrogenase from the culture. That is, it can be performed by adding an extractant such as water to the culture and stirring, and then removing the solid medium such as bran by a separation method such as centrifugation or filtration to obtain an extract.
  • the glucose dehydrogenase accumulated in the microbial cells is recovered by crushing the culture residue obtained from the above extract together with an abrasive such as sea sand and then adding water to release the glucose released from the microbial cells. It can be performed by a method of extracting dehydrogenase.
  • the whole culture is ground with an abrasive such as sea sand, and then water is added to remove glucose dehydrogenase released from the cells and glucose dehydrogenase secreted into the medium. It can be performed by a method of extracting both at once.
  • Glucose dehydrogenase contained in these supernatants can be appropriately purified by ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, dialysis, ion exchange chromatography, hydrophobic adsorption chromatography, gel filtration, affinity chromatography, electrophoresis, etc. Can be purified by combining.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention may be a synthetic glucose dehydrogenase or a recombinant glucose dehydrogenase obtained by genetic engineering. Those skilled in the art can easily obtain such recombinant glucose dehydrogenase based on the disclosure of the present invention. For example, it can be obtained by a synthesis method based on the amino acid sequence of the glucose dehydrogenase of the present invention and the base sequence of the gene encoding it, and the gene fragment of the glucose dehydrogenase gene can be used as a known expression vector such as a commercially available expression vector.
  • the glucose dehydrogenase is produced industrially by genetic engineering, such as by transforming a host such as Escherichia coli or filamentous fungus using the obtained plasmid and culturing the transformant to obtain the desired glucose dehydrogenase. Is also possible.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention is a glucose dehydrogenase comprising the protein (a), (b), (c) or (d).
  • (C) a protein having an amino acid sequence having at least 90%, preferably at least 95% similarity with the amino acid sequence of (a) or (b) and having glucose dehydrogenase activity. Similarity is based on the value of Similarity calculated by homology analysis between amino acid sequences of GENETYX (manufactured by Software Development Co., Ltd.).
  • the proteins (a) to (d) are preferably flavin-binding glucose dehydrogenases having the above properties (1) to (3), more preferably properties (4) to (6).
  • the signal sequence is the 1st to 16th amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the 1st to 23rd amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and the 1st to 11th amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the recombinant strain-derived mature protein may be a protein consisting of a modified amino acid sequence in which several amino acids are substituted, added, or deleted from the N-terminus of the wild-type enzyme (mature protein) described in the present specification.
  • the mature protein derived from a recombinant strain 1 to 25, 20 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, or 6 or less amino acids are added or substituted at the N-terminus of the wild-type mature protein. Or may have the glucose dehydrogenase activity described above even if 1 to 10, 9, or less, 8 or less, 7 or less, or 6 or less amino acids are deleted.
  • the polynucleotide of the present invention is a polynucleotide comprising (e), (f), (g), (h) or (i). (E) a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19.
  • (G) A polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide of (e) or (f) under a stringent condition and encodes a protein having glucose dehydrogenase activity.
  • H A polynucleotide encoding the protein described in (a) to (d).
  • II at least 60%, preferably at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identity with the polynucleotide of (e) or (f) and glucose A polynucleotide encoding a protein having dehydrogenase activity. The identity is based on the identity value calculated by homology analysis between the base sequences of GENETYX (Software Development Co., Ltd.).
  • any of the polynucleotides (e) to (i) encodes the protein having the glucose dehydrogenase activity described above.
  • the signal sequence is encoded by the 1st to 48th nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, the 1st to 69th nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5, and the 1st to 33rd nucleotide sequences of SEQ ID NO: 11.
  • the percentage identity between amino acid sequences and base sequences is published or commercially available with an algorithm for comparing the reference sequence (in the present invention, the sequence (a), (b), (e) or (f)) as a reference sequence.
  • an algorithm for comparing the reference sequence (in the present invention, the sequence (a), (b), (e) or (f)) as a reference sequence. Can be calculated using software. For example, BLAST, FASTA, GENETYX (manufactured by Software Development Co., Ltd.) or GeneDoc can be used, and these can be used with default parameters.
  • hybridization under stringent conditions include, for example, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM sodium chloride, 15 mM trisodium citrate, 10 mM sodium phosphate. 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, pH 7.2), 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.1% SDS, 10% dextran sulfate and 100 ⁇ g / mL denatured salmon sperm DNA, incubated at 42 ° C., and then filtered with 0.2 X Washing at 42 ° C. in SSC can be exemplified.
  • the signal sequence of the polynucleotide of the present invention is as described above.
  • the signal sequence of the glucose dehydrogenase sequence derived from Aspergillus tereus described in International Publication No. 2006/101239 (in SEQ ID NO: 2 to 1 to 19 in the publication) It can also be estimated by using a signal sequence prediction site (Signal P: http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Even a protein consisting of an amino acid sequence from which the estimated signal sequence has been deleted is considered to have glucose dehydrogenase activity.
  • polynucleotide specifically refers to a polynucleotide obtained by PCR amplification using synthetic DNA, chromosomal DNA, cDNA synthesized from mRNA encoding flavin-binding glucose dehydrogenase or a template thereof as a template.
  • Polypeptide is a compound in which amino acids are linked by peptide bonds, and means a molecule synthesized or artificially synthesized by ribosomes in a cell. Including those chemically modified.
  • the origin of the chromosomal DNA or RNA is not particularly limited, but is preferably a filamentous fungus, more preferably a filamentous fungus that belongs to the genus Kurobotella, more preferably a filamentous fungus that belongs to the subclass of Kurobottake or Pleospora, and more Preferably, it is a filamentous fungus belonging to the order of Cleoptera, Capnodia, or Pleopsora, more preferably a filamentous fungus belonging to the family Dothiola, Davidiera, or Venturiaceae, particularly preferably the genus Aureobasidium, the genus Kabatiera, the genus Cladosporium Or a filamentous fungus belonging to the genus Fusicledium, most preferably Aureobasidium pullulans, Kabatiera caulivora, Kabatiera zeae, Cladosporium sp, Cladosporium cladospolio Death is a Clado
  • Chromosomal DNA or RNA can be extracted from the filamentous fungus to prepare a DNA or cDNA library. Subsequently, a DNA encoding a known flavin-binding glucose dehydrogenase, for example, a DNA encoding a flavin-binding glucose dehydrogenase derived from Aspergillus terreus described in International Publication No. 2006/101239, a flavin derived from Aspergillus oryzae described in Patent Document 3 Based on alignments comparing the identity of DNA encoding bound glucose dehydrogenase and / or SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19 Make a heavy primer.
  • the probe or primer may be prepared by cleaving DNA with an appropriate restriction enzyme.
  • the polynucleotide of the present application can be obtained from the library by a conventional method such as hybridization, PCR, RT-PCR, etc. using the probe or primer.
  • a forward primer and a reverse primer for decoding the internal sequence are prepared from sites with high identity in the alignment, and PCR is performed using the library as a template.
  • the forward primer is preferably a site where the amplification side (downstream side) coincides with at least 2 bases, preferably a site that can be designed to have a sequence length of about 15 to 40 bases, and the 238 to 260 and 394 to 417 positions of SEQ ID NO: 1. Can be exemplified.
  • the reverse primer is preferably a site where the amplification side (upstream side) coincides with at least 2 bases, preferably a site that can be designed to have a sequence length of about 15 to 40 bases, 1600-1625 of SEQ ID NO: 1, 1735-1757th Can be exemplified.
  • the annealing temperature is set low, preferably 40 to 50 ° C, more preferably 40 to 45 ° C.
  • the second stage PCR may be performed using the primer set inside the primer set used in the first stage. The size of the PCR product is predicted from the position of the base used for the primer, and the corresponding PCR product is decoded.
  • the decoded PCR product has at least 50% identity with the corresponding portion of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, More preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%, the internal sequence of the gene of the present application can be obtained.
  • the full length gene of the present invention can be obtained from the decoded internal sequence by a well-known method. That is, a primer is designed to elucidate the vicinity of the start codon and the stop codon of the gene of the present invention, and 5′-RACE method and 3′-RACE method are performed using the primer with the library as a template.
  • the vicinity of the start codon and the stop codon of the gene encoding the glucose dehydrogenase of the present invention can be elucidated.
  • a primer capable of amplifying a full-length gene from the start codon to the stop codon encoding the glucose dehydrogenase of the present invention can be designed, and the polynucleotide of the present invention can be obtained using the primer as a template. .
  • the polynucleotide of the present invention is a homology search such as BLAST (blastp or tblastn) with respect to a public sequence whose function is unknown, using the amino acid sequence of (a) or (b), the identity is at least 55%, Preferably, it is obtained from a gene sequence that encodes an amino acid sequence that is 550-650 amino acid sequence long hit with at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identity. be able to. Primers that can obtain the full length from the public sequence can be designed and amplified by PCR or RT-PCR using the DNA or RNA of the strain derived from the gene sequence as a template.
  • BLAST blastp or tblastn
  • a recombinant protein can be obtained by a conventional method using the polynucleotide obtained by amplification, and the glucose dehydrogenase activity can be confirmed.
  • DNA or RNA can also be obtained from strains of the same or the same genus as the strain from which the gene sequence is derived.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced by modification by a known mutation introduction method, mutation introduction PCR method or the like. Furthermore, it can be obtained from a chromosomal DNA or cDNA library thereof by a probe hybridization method using an oligonucleotide prepared based on nucleotide sequence information. In the hybridization, the above-mentioned polynucleotide can be obtained by variously changing the stringent conditions. Stringent conditions are defined by the salt concentration in the hybridization and washing steps, the concentration of organic solvent (formaldehyde, etc.), temperature conditions, and the like. For example, as disclosed in US Pat. No. 6,100,037, etc. Various conditions well known to those skilled in the art can be employed.
  • the recombinant vector of the present invention is a cloning vector or an expression vector, and an appropriate one is used according to the type of polynucleotide as an insert, its purpose of use, and the like.
  • expression vectors for in vitro transcription prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, filamentous fungi such as yeast and mold, insect cells
  • An expression vector suitable for each eukaryotic cell such as a mammalian cell can also be used.
  • a polynucleotide having the same amino acid sequence corresponding to the host but having optimized codon usage may be introduced.
  • the host can be appropriately selected according to the necessity of the sugar chain, the necessity, and the necessity of other peptide modifications. However, it is preferable to select a host to which a sugar chain can be added to produce an enzyme having a sugar chain. .
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis
  • eukaryotic cells such as yeast, mold, insect cells and mammalian cells
  • the mold is not particularly limited, but is preferably Pezizymycotina, more preferably Dothidemycetes, Eurotium mycetes, Leotiomycetes, or Pseudomonas, Particularly preferably, bacteria belonging to the genus Aspergillus are used.
  • These transformed cells can be prepared by introducing a recombinant vector into cells by a known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method. Specific examples of the recombinant vector and the transformed cell include the recombinant vector shown in the examples below, and transformed Escherichia coli and transformed fungi using this vector.
  • the expression vector When the flavin-binding glucose dehydrogenase of the present invention is produced by expressing DNA in a microorganism such as Escherichia coli, the expression vector has an origin, promoter, ribosome binding site, DNA cloning site, terminator sequence, etc. that can replicate in the microorganism.
  • a large amount of flavin-binding glucose dehydrogenase can be produced in a microorganism by preparing an expression vector in which the above-mentioned polynucleotide is recombined, transforming a host cell with this expression vector, and then culturing the obtained transformant. Can do.
  • a flavin-binding glucose dehydrogenase fragment containing the arbitrary region can also be obtained.
  • productivity is poor because the recombinant protein is transferred to the periplasm. Therefore, when it is desired to efficiently recover the recombinant protein, it is preferable to use a sequence in which the gene sequence encoding the signal sequence is deleted. Alternatively, it can be expressed as a fusion protein with another protein.
  • a glucose dehydrogenase gene that does not contain an intron.
  • a polynucleotide that does not contain an intron and does not contain a sequence encoding a signal sequence such as ( It is preferable to insert a polynucleotide obtained by adding an initiation codon ATG to the polynucleotide described in f).
  • Gram-positive bacteria it may be a polynucleotide containing a sequence encoding a signal sequence, and a start codon ATG is added to a polynucleotide not containing a sequence encoding a signal sequence, for example, the polynucleotide described in (f)
  • a polynucleotide may be used, and a polynucleotide in which a sequence encoding a signal sequence is substituted with a sequence appropriate for a host may be inserted.
  • the expression level of the recombinant protein may be improved by replacing the stop codon with a stop codon optimal for the host.
  • Examples of the expression vector for E. coli include pUC, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system, pCold expression system, and the like.
  • flavin-binding glucose dehydrogenase when expressed in eukaryotic cells for production, the polynucleotide is inserted into an expression vector for eukaryotic cells having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, etc. If a recombinant vector is produced and introduced into a eukaryotic cell, a flavin-binding glucose dehydrogenase can be produced in the eukaryotic cell. It can be maintained in the cell in a state like a plasmid, or it can be maintained in a chromosome.
  • the polynucleotide to be inserted may be a polynucleotide containing a sequence encoding a signal sequence, and a start codon ATG is added to a polynucleotide not including a sequence encoding a signal sequence, for example, the polynucleotide described in (f). It may be a polynucleotide, or a polynucleotide in which a sequence encoding a signal sequence is substituted with a signal sequence suitable for a host, for example.
  • the expression level of the recombinant protein may be improved by replacing the stop codon with a stop codon optimal for the host.
  • expression vectors examples include pKA1, pCDM8, pSVK3, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, and pYE82. Furthermore, if pIND / V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFPC1, etc. are used as an expression vector, a flavin-binding glucose dehydrogenase polypeptide as a fusion protein to which various tags such as His tag, FLAG tag, GFP are added. Can also be expressed.
  • the flavin-binding glucose dehydrogenase of the present invention prepares RNA by in vitro transcription from a vector having the polynucleotide (cDNA or translation region thereof) of the present invention, and performs in vitro translation using this as a template.
  • a flavin-binding glucose dehydrogenase can be produced in vitro.
  • the above-described polynucleotide is inserted into a vector having a promoter to which RNA polymerase can bind, and a recombinant vector is prepared.
  • a flavin-binding glucose dehydrogenase can be produced in vitro.
  • promoters to which RNA polymerase can bind include T3, T7, SP6 and the like.
  • vectors containing these promoters include pKA1, pCDM8, pT3 / T718, pT7 / 319, and pBluescript II.
  • the enzyme In measuring the activity of the enzyme, the enzyme is preferably diluted as appropriate so that the final concentration is 0.15-0.6 unit / mL.
  • the enzyme activity unit (unit) of the enzyme is an enzyme activity that oxidizes 1 ⁇ mol of glucose per minute.
  • the enzyme activity of the glucose dehydrogenase (GLD) of the present invention can be measured by the following method. (Enzyme activity measurement method) Each solution was mixed according to the following procedure, the absorbance was measured, and the GLD activity was examined.
  • the amount of decrease per minute ( ⁇ A600) in absorbance at 600 nm accompanying the progress of the enzyme reaction was measured for 5 minutes from the start of the reaction, and the GLD activity was calculated from the linear portion according to Equation 1. At this time, the GLD activity was defined as 1 U for the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute at 37 ° C. and pH 6.0.
  • 3.0 is the volume of the reaction reagent + enzyme solution (mL)
  • 10.8 is the molar extinction coefficient of DCIP (mM ⁇ 1 cm ⁇ 1 ) at pH 6.0
  • 1.0 is the optical path of the cell Length (cm)
  • 0.05 is the volume of the enzyme solution (mL)
  • ⁇ A600 blank is the decrease in absorbance per minute at 600 nm when the reaction is started by adding the solution used for enzyme dilution instead of the enzyme solution.
  • the amount, df represents the dilution factor.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention is not affected by oxygen, has high specificity for glucose, and maintains high activity even at room temperature, so that it is used as an enzyme for measuring glucose concentration, particularly blood glucose concentration.
  • the glucose in the test sample can be measured by the step of bringing a test sample containing glucose, for example, blood into contact with the glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention can be used as a glucose measuring reagent.
  • the measuring reagent is bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin, sugars (eg, trehalose, etc.) or sugar alcohols that do not act on the enzyme, carboxyl group-containing compounds, alkaline earth metal compounds, ammonium salts, sulfates Or other optional components known to those skilled in the art, such as a heat stabilizer selected from the group consisting of proteins and the like, or a buffer, and the like, to increase the thermal stability and storage stability of the enzyme and reagent components it can.
  • a known substance that suppresses the influence of contaminants that affect the measurement present in the test sample can be included in the measurement reagent.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention can be used for a biosensor.
  • the biosensor of the present invention may be a sensor using the glucose dehydrogenase of the present invention as an enzyme in the reaction layer.
  • the biosensor is manufactured by forming an electrode system on an insulating substrate using a method such as screen printing or vapor deposition, and further including a measurement reagent including an oxidoreductase and an electron acceptor.
  • a sample solution containing a substrate is brought into contact with the measurement reagent of this biosensor, the measurement reagent is dissolved and the enzyme reacts with the substrate, and the electron acceptor is reduced accordingly. After completion of the enzyme reaction, the reduced electron acceptor is oxidized electrochemically.
  • the biosensor can measure the substrate concentration in the sample solution from the obtained oxidation current value.
  • a biosensor that detects color intensity or pH change.
  • various substances can be measured by selecting an enzyme that uses the substance to be measured as a substrate. For example, when the glucose dehydrogenase of the present invention is selected as the enzyme, a glucose sensor that can measure the glucose concentration in the sample solution and is not affected by oxygen can be produced.
  • Electrode acceptor of the biosensor As the electron acceptor of the biosensor, a substance excellent in electron transfer capability can be used.
  • Substances that excel in electron transfer are chemical substances generally called “electron mediators,” “mediators,” or “redox mediators,” and protein-type electron mediators.
  • the electron carriers and redox mediators listed in JP-T-2002-526759 may be used.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention can be used in a biobattery.
  • the biobattery according to the present invention includes an anode electrode that performs an oxidation reaction and a cathode electrode that performs a reduction reaction, and includes an electrolyte layer that separates the anode and the cathode as necessary.
  • An enzyme electrode including the above-mentioned electron mediator and glucose oxidoreductase or the above fusion is used as an anode electrode, and electrons generated by oxidizing the substrate are taken out to the electrode and protons are generated.
  • an enzyme generally used for the cathode electrode may be used on the cathode side.
  • laccase laccase, ascorbate oxidase or bilirubin oxidase is used, and the proton generated on the anode side is reacted with oxygen. Generate water.
  • an electrode an electrode generally used for a bio battery such as carbon, gold, or platinum can be used.
  • glucose dehydrogenase activity was quantified according to the method described above.
  • Example 1 (Acquisition of flavin-binding glucose dehydrogenase (GLD) of the present invention) (1) Confirmation of GLD activity Strains isolated from nature and strains of microorganisms preserved (Independent Administrative Institution, Product Evaluation Technology Infrastructure Organization: 2-5-8 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818) As a result of searching for GLD-producing bacteria from a total of about 3,800 strains, Aureobasidium pullulans S20, Aureobasidium pullulans NBRC4464, Kabatella caulivola NBRC7314, Kabatiella zeae NBRC9664, T799, Cladosporium sp.
  • the crude enzyme solution was adjusted to a 60% saturated ammonium sulfate solution, allowed to stand at 4 ° C. overnight, and then centrifuged to collect the supernatant.
  • the supernatant was passed through a TOYOPEARL Butyl-650C (manufactured by Tosoh Corp.) column pre-equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 60% saturated ammonium sulfate to adsorb the enzyme. After washing the column with the same buffer, the enzyme was eluted by a gradient elution method from the buffer to 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and the active fraction was collected.
  • the collected active fraction is concentrated with an ultrafiltration membrane, desalted, equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and DEAE-Sephacryl (GE Healthcare) pre-equilibrated with the same buffer.
  • the enzyme was adsorbed through a column. The column was washed with the same buffer, and then the enzyme was eluted by a gradient elution method into 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.2 M sodium chloride to collect the active fraction.
  • the recovered active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane, desalted, equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and pre-parallelized with the same buffer, monoQ5 / 5 (GE Healthcare).
  • the enzyme was adsorbed through a column. The column was washed with the same buffer, and then the enzyme was eluted by a gradient elution method into 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 M sodium chloride to collect the active fraction.
  • the collected active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane, desalted, equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and preloaded with HiLoad26 / 60 Superdex 200 pg (previously paralleled with the same buffer). GE Healthcare Co., Ltd.), gel filtration purification was performed using the same buffer, and the active fraction was collected.
  • the collected active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 8,000, and then water-replaced to obtain a wild-type ApsGLD sample.
  • the specific activity of the purified enzyme was 378 U / mg.
  • Example 2 (A. Expression by Eukaryotic Cells of Aureobasidium pullulans S20-derived GLD (ApsGLD)) (1) Cell culture Glucose (manufactured by Nacalai) 1% (W / V), defatted soybean (manufactured by Showa Sangyo Co., Ltd.) 2% (W / V), corn steep liquor (manufactured by Sanei Sugar Chemical Co., Ltd.) 0.5% ( W / V), magnesium sulfate heptahydrate (manufactured by Nacalai Co., Ltd.) 0.1% (W / V) and water were adjusted to pH 6.0, and 150 mL was placed in a 500 mL Sakaguchi flask. Autoclaved at 20 ° C. for 20 minutes. This cooled liquid medium was inoculated with Aureobasidium pullulans strain S20, cultured with shaking at 15 ° C. for 90 hours, and then wet cells were collected
  • cDNA library was prepared from total RNA by a reverse transcription reaction using a reverse transcriptase and an oligo dT primer with an adapter sequence.
  • a reaction reagent “SMARTER RACE cDNA Amplification kit” (manufactured by Takara Bio Inc.) was used, and the reaction conditions were performed according to the protocol described in the instructions.
  • the ApsGLD gene was PCR amplified using the cDNA library obtained in (3) as a template. Primers are analyzed using a degenerate base so that a common sequence is analyzed from a plurality of GLD sequences that have already been clarified by the present inventors, and a GLD sequence having low identity is also amplified based on the common sequence. F1, primer-F2, primer-R1 and primer-R2 were designed. In the first stage, PCR was performed using primer-F1 and primer-R1 using the cDNA library obtained in (2) of Example 2 as a template. In the second stage, PCR was performed using primer-F2 and primer-R2 using the PCR product of the first stage as a template.
  • PCR product was sequenced, and primers for elucidating the vicinity of the start codon and the stop codon of the gene were designed from the decoded internal sequence, and 5′-RACE method and 3′-RACE method were performed. Finally, PCR was carried out using the following primer-ApsF and primer-ApsR primer pairs to obtain a DNA fragment containing the Abasobium pullulans S20-derived ApsGLD gene having a total chain length of 1,776 bp shown in SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence encoded by the gene sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • primer-F1 5'-CGGCACTCAGATYGAYTGGGCRTA-3 ' primer-F2: 5'-AAGTTGGGHAACAACMTCACMTGG-3 ' primer-R1: 5'-ATGCGCTCRGCAGCTCTCTCVGC-3 ' primer-R2: 5'-ACGCCACCGAGHTCCTYSGACATCAT-3 ' primer-ApsF: 5 '-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA) ATGTATCGTTTACTCTCTACATTTG-3' (In parentheses: transcription enhancer) primer-ApsR: 5'-CGCTTCTAGA GCATGC CTACTGGTGGCTAGCCTCGATAAC-3 ' (Underlined part: restriction enzyme site (SphI)) primer-GLD-
  • Plasmid vectors were prepared using an improved promoter of the amylase system.
  • PCR was performed using the above-mentioned primer-ApsR and primer-GLD-F primer pairs using the DNA fragment obtained in (4) as a template to amplify the ApsGLD gene.
  • the amplified ApsGLD gene was ligated downstream of the vector promoter to prepare a plasmid vector capable of expressing the gene. This expression plasmid vector is introduced into E.
  • the transformant obtained in (6) was inoculated into this cooled liquid medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 4 days. After completion of the culture, the supernatant was collected by centrifugation, and the GLD activity of the present invention was confirmed by measuring the GLD activity using a plate reader according to the aforementioned GLD activity measurement method.
  • the culture solution is filtered through a filter cloth, and the collected filtrate is centrifuged to collect the supernatant, and further filtered through a membrane filter (10 ⁇ m, manufactured by Advantech) to collect the culture supernatant, and the molecular weight cut off is 10,000. It concentrated with the ultrafiltration membrane (made by Sartorius). This sample was used as a recombinant ApsGLD sample.
  • Example 3 (Expression by Eukaryotic Cell of BLD Aureobasidium pullulans NBRC4464-derived GLD (ApnGLD)) (1) Cloning of the ApnGLD gene A.A.
  • the ApnGLD gene was PCR amplified using the pullulans NBRC4464 cDNA library as a template.
  • the first-stage and second-stage PCR, and the 5′-RACE method and the 3′-RACE method were performed according to the method described in Example 2 (4).
  • PCR was carried out using the following primer-ApnF and primer-ApnR primer pairs, and an A.R.
  • a DNA fragment containing the AplnGLD gene derived from the pullulans NBRC4464 strain was obtained.
  • the amino acid sequence encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 4.
  • signal sequence prediction by SignalP4.1 was performed on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4, and 15 amino acids from 1 to 15 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 were predicted as signal sequences.
  • primer-ApnF 5 '-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA) ATGTTGGGACTTGCTACCCTCGCCC-3' (In parentheses: transcription enhancer)
  • primer-ApnR 5'-CGCTTCTAGA GCATGC TTAGTGACTGGCCTTGATGATATC-3 ' (Underlined part: restriction enzyme site (SphI))
  • Example 4 (Expression by C. Kabatiella caulivora-derived GLD (KcGLD) by eukaryotic cells) (1) Cloning of the KcGLD gene The K. coli gene prepared by the method described in Example 2 (1) to (3) The KcGLD gene was PCR amplified using the pullulans NBRC4464 cDNA library as a template. The first-stage and second-stage PCR, and the 5′-RACE method and the 3′-RACE method were performed according to the method described in Example 2 (4). Finally, PCR was performed using the following primer-KcF and primer-KcR primer pair, and a K.P.
  • a DNA fragment containing the KcGLD gene sequence derived from caulivora NBRC7314 strain was obtained.
  • the amino acid sequence encoded by the gene sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • signal sequence prediction by SignalP4.1 was performed on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6, and 16 amino acids from the 1st to 16th amino acids were predicted to be signal sequences among the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 6.
  • primer-KcF 5 '-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA) ATGTTGGGACAAGTTGCTGCTCTCG-3' (In parentheses: transcription enhancer) primer-KcR: 5'-CGCTTCTAGA GCATGC TTACAAGTGCTTGGCCTTGATGAG-3 ' (Underlined part: restriction enzyme site (SphI))
  • Plasmid Vector Containing KcGLD Gene PCR was performed using the primer fragment of the above primer-KcR and primer-GLD-F using the DNA fragment obtained in (1) as a template to amplify the KcGLD gene.
  • a plasmid vector capable of expressing the gene was prepared by binding the amplified KcGLD gene downstream of the promoter. Furthermore, according to the method described in Example 2 (5), the plasmid was extracted and the sequence of the insert was analyzed. As a result, the KcGLD gene (SEQ ID NO: 5) was confirmed.
  • the transformed liquid obtained in (3) was inoculated into this cooled liquid medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days to obtain a seed culture solution.
  • 0.01% riboflavin (manufactured by Nacalai Tesque) (w / v), 0.005% chloramphenicol (manufactured by Nacalai Tesque) (w / v) and an antifoaming agent were added to the same medium composition as above.
  • 3.5 L of medium was placed in a 5 L jar fermenter and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes.
  • the seed culture solution was inoculated into this cooled liquid medium and cultured at 30 ° C., 400 rpm, 1 v / v / m for 3 days.
  • the culture solution is filtered through a filter cloth, and the collected filtrate is centrifuged to collect the supernatant, and further filtered through a membrane filter (10 ⁇ m, manufactured by Advantech) to collect the culture supernatant, and the molecular weight cutoff
  • the resultant was concentrated with an 8,000 ultrafiltration membrane (Millipore) to obtain a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution was adjusted to a 50% saturated ammonium sulfate solution (pH 6.0), allowed to stand at 4 ° C. overnight, and then centrifuged to collect the supernatant.
  • the supernatant was passed through a TOYOPEARL Butyl-650C (Tosoh Corp.) column pre-equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 50% saturated ammonium sulfate to adsorb the enzyme. After washing the column with the same buffer, the enzyme was eluted by a gradient elution method from the buffer to 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and the active fraction was collected.
  • the collected active fraction is concentrated with an ultrafiltration membrane, desalted, equilibrated with 1 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and DEAE Cellufine A-500m (equilibrated in advance with the same buffer).
  • the enzyme was adsorbed by passing through a column manufactured by Chisso Corporation. The column was washed with the same buffer, and then the enzyme was eluted by a gradient elution method from the buffer to 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) to collect the active fraction.
  • the collected active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 8,000, and then water-substituted sample was used as a recombinant KcGLD sample.
  • the specific activity of the purified enzyme was 1,200 U / mg.
  • Example 5 (D. Expression by Eukaryotic Cell of GLD from Kabatiella zeae (KzGLD)) (1) Cloning of the KzGLD gene Using the zeae NBRC9664 cDNA library as a template, the KzGLD gene was PCR amplified. The first-stage and second-stage PCR, and the 5′-RACE method and the 3′-RACE method were performed according to the method described in Example 2 (4). Finally, PCR was performed using the following primer-KzF and primer-KzR primer pairs, and a K.P. A DNA fragment containing the zeae NBRC9664 strain-derived KzGLD gene was obtained.
  • the amino acid sequence encoded by the gene sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • signal sequence prediction by SignalP4.1 was performed on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8, and 16 amino acids from 1st to 16th of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 were predicted as the signal sequence.
  • primer-KzF 5 '-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA) ATGTTGGGTCAATTGGCCGCTCTCG-3'
  • primer-KzR 5'-CGCTTCTAGA GCATGC TTACTTGTGGCTAGCCTTGATGAG-3 ' (Underlined part: restriction enzyme site (SphI))
  • plasmid vector containing KzGLD gene PCR was carried out using the primer fragment of the above primer-KzR and primer-GLD-F using the DNA fragment obtained in (1) as a template to amplify the KzGLD gene.
  • a plasmid vector capable of expressing the gene was prepared by linking the amplified KzGLD gene downstream of the promoter. Further, according to the method described in Example 2 (5), the plasmid was extracted and the sequence of the insert was analyzed. As a result, the KzGLD gene (SEQ ID NO: 7) was confirmed.
  • Example 6 (Expression by Eukaryotic Cell of GLD (Cs7GLD) Derived from E. Cladosporium sp. T799) (1) Cloning of Cs7GLD gene The Cs7GLD gene was prepared according to the method described in Example 2 (1) to (3). sp. Cs7GLD gene was PCR amplified using T799 cDNA library as a template. The first-stage and second-stage PCR, and the 5′-RACE method and the 3′-RACE method were performed according to the method described in Example 2 (4). Finally, PCR was performed using the following primer-Cs7F and primer-Cs7R primer pairs, and a C.I. sp.
  • a DNA fragment containing the T799 strain-derived Cs7GLD gene sequence was obtained.
  • the amino acid sequence encoded by the gene sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • signal sequence prediction by SignalP4.1 was performed on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10, and 17 amino acids from 1 to 17 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 were predicted as the signal sequence.
  • primer-Cs7F 5 '-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA) ATGCTGCCACTGCTCGCGACTCTGG-3' (In parentheses: transcription enhancer) primer-Cs7R: 5'-CGCTTCTAGA GCATGC CTAGTTGCACTGCTTAATGCGCTC-3 ' (Underlined part: restriction enzyme site (SphI))
  • plasmid vector containing Cs7GLD gene PCR was carried out using the above primer-Cs7R and primer-GLD-F primer pairs using the DNA fragment obtained in (1) as a template to amplify the Cs7GLD gene.
  • a plasmid vector capable of expressing the gene was prepared by linking the amplified Cs7GLD gene downstream of the promoter. Furthermore, when the plasmid was extracted and the sequence of the insert was analyzed according to the method described in Example 2 (5), the Cs7GLD gene (SEQ ID NO: 9) was confirmed.
  • Example 7 (Expression by Eukaryotic Cell of FLD from F. Fusicadium carpophilum (FcGLD)) (1) Cloning of FcGLD gene
  • the F.GLD gene prepared according to the method described in Example 2 (1) to (3).
  • Carpophilum NBRC9645 cDNA library was used as a template to carry out the following PCR.
  • the first-stage and second-stage PCR, and the 5′-RACE method and the 3′-RACE method were performed according to the method described in Example 2 (4).
  • F.I The Carpophilum NBRC9645 strain-derived FcGLD gene was found to be a base sequence having a total chain length of 1,761 bp shown in SEQ ID NO: 11.
  • amino acid sequence encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 12.
  • signal sequence prediction by SignalP4.1 was performed on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 12, and 17 amino acids from 1 to 17 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 12 were predicted as the signal sequence.
  • primer-FcF 5 '-(CCGCAGCTCGTCAAA) ATGCTCCCGATCCTCGCGTCT-3' (In parentheses: transcription enhancer) primer-FcR1: 5'-GTTCAT (TTA) GTGGCTCTCTTGAATGCG-3 ' (In parentheses: substituted stop codon) primer-FcR2: 5'-GTTACGCTTCTAGA GCATGC GTTCAT (TTA) GTGGCTCTC-3 ' (Underlined part: restriction enzyme site (SphI), in parentheses: substituted stop codon)
  • the transformant obtained in (4) was inoculated, and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days to obtain a seed culture solution.
  • 500 mL of a medium in which 0.01% riboflavin (manufactured by Nacalai Tesque) (w / v) was added to the same medium composition as above was placed in a 2000 mL Sakaguchi flask and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes.
  • 10 mL of the seed culture solution was inoculated, and cultured with shaking at 30 ° C. and 110 rpm for 3 days.
  • the culture solution is filtered through a filter cloth, and the collected filtrate is centrifuged to collect the supernatant, and further filtered through a membrane filter (10 ⁇ m, manufactured by Advantech) to collect the culture supernatant, and the molecular weight cutoff
  • a membrane filter (10 ⁇ m, manufactured by Advantech) to collect the culture supernatant, and the molecular weight cutoff
  • the resultant was concentrated with an 8,000 ultrafiltration membrane (Millipore) to obtain a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution was equilibrated with a 5 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and passed through a DEAE Cellufine A-500m (made by Chisso) column pre-equilibrated with the same buffer to adsorb the enzyme. It was. The column was washed with the same buffer, and then the enzyme was eluted by a gradient elution method from the buffer to 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) to collect the active fraction. A sample obtained by concentrating the collected active fraction with an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 8,000 and then substituting with water was used as a recombinant FcGLD sample. The specific activity of the purified enzyme was 190 U / mg.
  • Example 8 G. Cladosporia sp. T806-derived GLD (Cs8GLD) expression by eukaryotic cells
  • Cs8GLD GLD
  • Cloning of Cs8GLD gene The Cs8GLD gene was prepared according to the method described in Example 2 (1) to (3). sp.
  • the following PCR was carried out using T806 cDNA library as a template.
  • the first-stage and second-stage PCR, and the 5′-RACE method and the 3′-RACE method were performed according to the method described in Example 2 (4).
  • the Cs8GLD gene derived from the T806 strain was found to have a base sequence having a total chain length of 1,761 bp shown in SEQ ID NO: 13.
  • the amino acid sequence encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 14.
  • signal sequence prediction by SignalP3.0 was performed on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, and 17 amino acids from 1 to 17 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 were predicted as the signal sequence.
  • Example 2 (5) the plasmid was extracted and the sequence of the insert was analyzed. As a result, the Cs8GLD gene in which the stop codon described in SEQ ID NO: 13 was replaced with TAA was confirmed.
  • primer-Cs8F 5 '-(CCGCAGCTCGTCAAA) ATGCTCCCAGTGCTCGCGTCT-3' (In parentheses: transcription enhancer) primer-Cs8R1: 5'-GTTCAT (TTA) GTGGCTCTGCTGAATACG-3 ' (In parentheses: substituted stop codon) primer-Cs8R2: 5 '-((GTTACGCTTCTAGA)) GCATGC GTTCAT (TTA) GTGGCTCTG-3' (Underlined part: restriction enzyme site (SphI), in parentheses: substituted stop codon)
  • Example 9 (Expression by Eukaryotic Cell of H. Cladospodium cladosporoides-derived GLD (CcGLD)) (1) Cloning of CcGLD gene C. cerevisiae prepared according to the method described in Example 2 (1) to (3). The following PCR was performed using the cDNA library of cladosporioides NBRC4459 as a template. The first-stage and second-stage PCR, and the 5′-RACE method and the 3′-RACE method were performed according to the method described in Example 2 (4). As a result, C.I.
  • the CcGLD gene derived from cladosporeoides NBRC4459 strain was found to have a base sequence of 1,761 bp in total chain length shown in SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 16.
  • signal sequence prediction by SignalP3.0 was performed on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16, and 17 amino acids from 1 to 17 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16 were predicted as the signal sequence.
  • plasmid vector 1 containing CcGLD gene PCR was carried out using the following primer-CcF and primer-CcR1 primer pair using the cDNA library prepared in (1) as a template, and the stop codon was replaced with TAA. A sequence containing the CcGLD gene 1761 bp was amplified. Next, PCR was performed using the PCR product as a template and the following primer-CcF and primer-CcR2 primer pairs to amplify a fragment for plasmid insertion. Subsequently, according to the method described in Example 2 (5), a plasmid vector capable of expressing the CcGLD gene was prepared by binding the amplified fragment downstream of the promoter.
  • Example 2 (5) the plasmid was extracted and the sequence of the insert was analyzed. As a result, a CcGLD gene in which the stop codon of SEQ ID NO: 15 was substituted with TAA was confirmed. Since this gene is a wild type gene except for the stop codon, it is referred to as a “wild type CcGLD gene”.
  • primer-CcF 5 '-(CCGCAGCTCGTCAAA) ATGCTCCCAATTATCGCGTCT-3' (In parentheses: transcription enhancer) primer-CcR1: 5'-GTTCAT (TTA) GTGGCTCTGCTGAATGCGCTC-3 ' (In parentheses: substituted stop codon) primer-CcR2: 5'-GTTACGCTTCTAGA GCATGC GTTCAT (TTA) GTGGCTCTG-3 ' (Underlined part: restriction enzyme site (SphI), in parentheses: substituted stop codon)
  • Plasmid vector for recombinantly producing CcGLD which is a mature protein, outside the cell body using the signal sequence of Aspergillus oryzae-derived GLD (Ao signal sequence: SEQ ID NO: 64) was prepared. Specifically, a plasmid vector was prepared in which a modified gene in which the expected signal sequence coding region of the CcGLD gene was substituted into the Ao signal sequence coding region described in SEQ ID NO: 63 was inserted.
  • PCR was performed using the following primer-A-CcF and the above primer-CcR1 primer pair using the cDNA library prepared in (1) as a template, and the expected signal sequence coding region of the CcGLD gene was deleted.
  • PCR was performed stepwise to add the Ao signal sequence coding region described in SEQ ID NO: 63, and finally PCR was performed using primer-AF and primer-CcR2 primer pairs.
  • a plasmid insertion fragment in which the 1st to 51st nucleotide sequences of the sequence shown in SEQ ID NO: 15 were replaced with 66 bases shown in SEQ ID NO: 63 and the stop codon was replaced with TAA was amplified.
  • a plasmid vector capable of expressing the modified CcGLD gene was prepared by binding the amplified fragment downstream of the promoter. Further, according to the method described in Example 2 (5), the plasmid was extracted and the sequence of the insert was analyzed. As a result, the 1st to 51st nucleotide sequences of the sequence shown in SEQ ID NO: 15 were replaced with 66 bases described in SEQ ID NO: 63, and the stop codon was replaced with TAA (downstream of 66 bp described in SEQ ID NO: 63).
  • the 1776 bp modified gene described in SEQ ID NO: 24 was confirmed by fusion between the 1st and 5760th positions 1709 bp described in SEQ ID NO: 15 and the last being adenine.
  • This gene is referred to as “modified CcGLD gene”.
  • primer-A-CcF 5'- CCGGCTGGACGGGCC CATTCCACTCCCAGATACGAC-3 ' (Underlined: Ao signal sequence coding region)
  • primer-AF 5 '-(CCGCAGCTCGTCAAA) ATGCTCTTCTCACTGGCATTC- 3' (In parentheses: transcription enhancing factor, underlined: Ao signal sequence coding region)
  • Example 10 (Expression of I. Cladosporium funiculosum-derived GLD (CfGLD) by eukaryotic cells) (1) Cloning of CfGLD gene The CfGLD gene was prepared according to the method described in Example 2 (1) to (3). The following PCR was carried out using a funiculosum NBRC6537 cDNA library as a template. The first-stage and second-stage PCR, and the 5′-RACE method and the 3′-RACE method were performed according to the method described in Example 2 (4). As a result, C.I.
  • the CfGLD gene derived from the funiculosum NBRC6537 strain was found to be a base sequence having a total chain length of 1,761 bp shown in SEQ ID NO: 17.
  • the amino acid sequence encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 18.
  • signal sequence prediction by SignalP3.0 was performed on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18, and 17 amino acids from 1 to 17 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18 were predicted as the signal sequence.
  • plasmid vector containing CfGLD gene A plasmid vector for recombinantly producing CfGLD, which is a mature protein, outside the cell body, using the signal sequence of ALD of Aspergillus oryzae (Ao signal sequence: SEQ ID NO: 64).
  • a plasmid vector was prepared in which a modified gene in which the expected signal sequence coding region of the CfGLD gene was substituted into the Ao signal sequence coding region described in SEQ ID NO: 63 was inserted.
  • PCR was performed using the following primer-A-CfF and primer-CfR1 primer pair using the cDNA library prepared in (1) as a template, and the expected signal sequence coding region of the CfGLD gene was deleted.
  • PCR is performed stepwise to add the Ao signal sequence coding region described in SEQ ID NO: 63, and finally PCR is performed using the primer-AF and primer-CfR2 primer pairs described below. It was.
  • a plasmid insertion fragment in which the 1st to 51st nucleotide sequences of the sequence shown in SEQ ID NO: 17 were replaced with 66 bases shown in SEQ ID NO: 63 and the stop codon was replaced with TAA was amplified.
  • a plasmid vector capable of expressing the modified CfGLD gene was prepared by binding the amplified fragment downstream of the promoter. Further, according to the method described in Example 2 (5), the plasmid was extracted and the sequence of the insert was analyzed. As a result, the 1st to 51st nucleotide sequences of the sequence shown in SEQ ID NO: 17 were replaced with 66 bases described in SEQ ID NO: 63, and the stop codon was replaced with TAA (downstream of 66 bp described in SEQ ID NO: 63). The 1776 bp modified gene described in SEQ ID NO: 26 could be confirmed.
  • primer-A-CfF 5'- CCGGCTGGACGGGCC CATTCCACTCCTAGATATGAC-3 ' (Underlined: Ao signal sequence coding region)
  • primer-CfR1 5'-GTTCAT (TTA) GTGACTGTGCTGAATACG-3 ' (In parentheses: substituted stop codon)
  • primer-CfR2 5'-GTTACGCTTCTAGA GCATGC GTTCAT (TTA) GTGACTGTG-3 ' (Underlined part: restriction enzyme site (SphI), in parentheses: substituted stop codon)
  • Example 11 (Expression of GLD (CoGLD) derived from J. Cladosporium oxysporum by eukaryotic cells) (1) Cloning of CoGLD gene C. cerevisiae prepared according to the method described in Example 2 (1) to (3) The following PCR was carried out using the oxysporum NBRC32511 cDNA library as a template. The first-stage and second-stage PCR, and the 5′-RACE method and the 3′-RACE method were performed according to the method described in Example 2 (4). As a result, C.I. The CoGLD gene derived from oxysporum NBRC32511 strain was found to have a base chain length of 1,761 bp shown in SEQ ID NO: 19.
  • amino acid sequence encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 20.
  • signal sequence prediction by SignalP3.0 was performed on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 20, and 17 amino acids from 1 to 17 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 20 were predicted as the signal sequence.
  • plasmid vector 1 containing CoGLD gene PCR was carried out using the cDNA library prepared in (1) as a template using the following primer-CoF and primer-CoR1 primer pairs, and the stop codon was replaced with TAA. A sequence containing the CoGLD gene 1761 bp was amplified. Next, PCR was performed using the PCR product as a template and the following primer-CoF and primer-CoR2 primer pairs to amplify a fragment for plasmid insertion. Subsequently, according to the method described in Example 2 (5), a plasmid vector capable of expressing the CoGLD gene was prepared by binding the amplified fragment downstream of the promoter.
  • Example 2 (5) the plasmid was extracted and the sequence of the insert was analyzed. As a result, a CoGLD gene in which the stop codon of SEQ ID NO: 19 was substituted with TAA was confirmed. Since this gene is a wild type gene except for the stop codon, it is referred to as a “wild type CoGLD gene”.
  • primer-CoF 5 '-(CCGCAGCTCGTCAAA) ATGCTCCCAGTGCTCGCGTCT-3' (In parentheses: transcription enhancer) primer-CoR1: 5'-GTTCAT (TTA) GTGGCTCTGCTGAATACGCTC-3 ' (In parentheses: substituted stop codon) primer-CoR2: 5'-GTTACGCTTCTAGA GCATGC GTTCAT (TTA) GTGGCTCTG-3 ' (Underlined part: restriction enzyme site (SphI), in parentheses: substituted stop codon)
  • Plasmid vector for recombinant production of CoGLD which is a mature protein, outside the cell using the signal sequence of Aspergillus oryzae-derived GLD (Ao signal sequence: SEQ ID NO: 64) was prepared. Specifically, a plasmid vector was prepared in which the predicted signal sequence coding region of the CoGLD gene was inserted into the Ao signal sequence coding region described in SEQ ID NO: 63 and the modified gene was inserted. First, PCR was performed using the primer library of primer-A-CoF and primer-CoR1 described below using the cDNA library prepared in (1) as a template, and the expected signal sequence coding region of the CoGLD gene was deleted.
  • PCR is performed stepwise to add the Ao signal sequence coding region described in SEQ ID NO: 63, and finally PCR is performed using the primer-AF and primer-CoR2 primer pairs. It was.
  • a plasmid insertion fragment in which the 1st to 51st nucleotide sequences of the sequence shown in SEQ ID NO: 19 were replaced with 66 bases shown in SEQ ID NO: 63 and the stop codon was replaced with TAA was amplified.
  • a plasmid vector capable of expressing the modified CoGLD gene was prepared by binding the amplified fragment downstream of the promoter.
  • the plasmid was extracted and the sequence of the insert was analyzed.
  • the 1st to 51st nucleotide sequences of the sequence shown in SEQ ID NO: 19 were replaced with 66 bases described in SEQ ID NO: 63, and the stop codon was replaced with TAA (downstream of 66 bp described in SEQ ID NO: 63).
  • the 1776 bp modified gene described in SEQ ID NO: 28 was confirmed by fusion of 1709 bp in positions 52 to 1760 described in SEQ ID NO: 19, and the last being adenine. This gene is referred to as “modified CoGLD gene”.
  • primer-A-CoF 5'- CCGGCTGGACGGGCC CATTCTACTCCCAGATACGAC-3 ' (Underlined: Ao signal sequence coding region)
  • Example 12 (N-terminal sequence analysis) (1) ApsGLD N-terminal sequence analysis of purified ApsGLD described in Example 1 was performed. As a result, it was revealed that the N-terminal amino acid of the enzyme, which is a mature protein, is IPNTL. Therefore, among the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence from the 1st to 16th positions is a signal sequence, and the mature protein ApsGLD is an amino acid sequence consisting of 575 amino acids from the 17th to 591st positions described in SEQ ID NO: 2. Seems to have. Further, the base sequence encoding the mature protein is considered to be a base sequence consisting of 1725 bases at positions 49 to 1776 of SEQ ID NO: 1 (not including a stop codon). The signal sequence was consistent with the prediction by SignalP4.1.
  • the base sequence encoding the mature protein was a base sequence consisting of 1707 bases at positions 70 to 1776 of SEQ ID NO: 5 (not including the stop codon).
  • the signal sequence was 7 amino acids longer than predicted by SignalP4.1, that is, the predicted N-terminal was an N-terminal with 7 amino acids added.
  • the base sequence encoding the mature protein was a base sequence consisting of 1725 bases at positions 34 to 1758 of SEQ ID NO: 11 (not including the stop codon).
  • the signal sequence was a sequence that was 6 amino acids shorter than predicted by SignalP4.1, that is, the predicted N-terminus was the N-terminus with 6 amino acids deleted.
  • the amino acid sequence of the mature protein is considered to be an amino acid sequence consisting of 574 amino acids at positions 16 to 589 or 567 amino acids at positions 23 to 589 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. Furthermore, among the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence from the 1st to the 15th or the 1st to 22nd positions is considered to be a signal sequence.
  • the base sequence encoding the mature protein is a base sequence consisting of the 462-1767th 1722 bases of SEQ ID NO: 3 or the 671-1767th 1701 bases of SEQ ID NO: 3 (not including the stop codon). Seem.
  • the amino acid sequence of the mature protein is considered to be an amino acid sequence consisting of 575 amino acids at the 17th to 591th positions or 568 amino acids at the 24th to 591th positions among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8. Furthermore, among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8, the amino acid sequences from the 1st to the 16th or the 1st to 23rd positions are considered to be signal sequences.
  • the base sequence encoding the mature protein is a base sequence consisting of 4925 to 1773 base 1725 of SEQ ID NO: 7 or 70 to 1773 base 1704 base of SEQ ID NO: 7 (not including a stop codon). Seem.
  • the amino acid sequence of the mature protein is considered to be an amino acid sequence consisting of 575 amino acids at positions 12 to 586 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10. Furthermore, among the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, the amino acid sequence from the 1st to 11th positions is considered to be a signal sequence. In addition, the base sequence encoding the mature protein seems to be a base sequence consisting of 1725 bases at positions 34 to 1758 of SEQ ID NO: 9 (not including a stop codon).
  • the amino acid sequence of the mature protein is considered to be an amino acid sequence consisting of 575 amino acids at positions 12 to 586 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14. Furthermore, among the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, the amino acid sequence from the 1st to the 11th amino acid sequence is considered to be a signal sequence.
  • the base sequence encoding the mature protein is considered to be a base sequence consisting of 1725 bases at positions 34 to 1758 of SEQ ID NO: 13 (not including a stop codon).
  • the amino acid sequence of the mature protein is considered to be an amino acid sequence consisting of 575 amino acids at positions 12 to 586 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16. Furthermore, among the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 16, the amino acid sequences from the 1st to the 11th are considered to be signal sequences. In addition, the base sequence encoding the mature protein seems to be a base sequence consisting of 1725 bases at positions 34 to 1758 of SEQ ID NO: 15 (not including the stop codon).
  • the amino acid sequence of the mature protein is considered to be an amino acid sequence consisting of 575 amino acids at positions 12 to 586 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18. Furthermore, among the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, the amino acid sequence from the 1st to 11th positions is considered to be a signal sequence.
  • the base sequence encoding the mature protein is considered to be a base sequence consisting of 1725 bases at positions 34 to 1758 of SEQ ID NO: 17 (not including a stop codon).
  • the amino acid sequence of the mature protein is considered to be an amino acid sequence consisting of 575 amino acids at positions 12 to 586 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20. Furthermore, among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 20, the amino acid sequences from the 1st to 11th positions are considered to be signal sequences.
  • the base sequence encoding the mature protein is considered to be a base sequence consisting of 1725 bases at positions 34 to 1758 of SEQ ID NO: 19 (not including a stop codon).
  • Modified gene-derived GLD From the analysis result of FcGLD in (3), the modified gene-derived GLD obtained in Examples 9, 10 and 11 has 6 amino acids at the N-terminal as compared with the mature protein derived from the wild-type gene (wild-type GLD). Probably a modified GLD deleted.
  • the modified CcGLD gene is designed so that the mature protein obtained from the recombinant is the 569th amino acid at positions 18 to 586 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16, and therefore the amino acid sequence of the mature protein is SEQ ID NO: As shown in 25, the N-terminal amino acid is HSTPR. Since wild-type CcGLD is considered to have an amino acid sequence consisting of 575 amino acids at positions 12 to 586, the modified CcGLD gene-derived GLD is considered to be modified CcGLD in which 6 amino acids at the N-terminal are deleted.
  • the modified CfGLD gene was designed so that the mature protein obtained from the recombinant would be 569 amino acids from 18th to 586th of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18, so the amino acid sequence of the mature protein is the sequence As shown in number 27, the N-terminal amino acid is HSTPR. Since wild-type CfGLD is considered to be an amino acid sequence consisting of 575 amino acids at positions 12 to 586, the modified CfGLD gene-derived GLD is considered to be a modified CfGLD in which 6 amino acids at the N-terminal are deleted.
  • the modified CoGLD gene was designed so that the mature protein obtained from the recombinant would be 569 amino acids at positions 18 to 586 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20. As shown in No. 29, the N-terminal amino acid is HSTPR. Since wild-type CoGLD is considered to have an amino acid sequence consisting of 575th amino acids at positions 12 to 586, the modified CoGLD gene-derived GLD is considered to be a modified CoGLD in which 6 amino acids at the N-terminal are deleted.
  • Example 13 (Examination of enzymatic chemistry of GLD of the present invention) Various properties of each GLD obtained in Examples 2 to 7 were examined.
  • 3.0 is the amount of the reaction reagent + enzyme solution (mL)
  • 10.66 is the molar extinction coefficient (mM-1 cm-1) under the measurement conditions
  • 0.5 is 1 mol of hydrogen peroxide
  • 1.0 is the optical path length of the cell (cm)
  • 0.05 is the amount of the enzyme solution (mL)
  • ⁇ A500 blank is the solution used for enzyme dilution instead of the enzyme solution
  • the amount of increase in absorbance per minute at 500 nm when the reaction is started by adding to, and df represents the dilution factor.
  • the molecular weight before and after the sugar chain cleavage of each GLD was determined by the following method. 5 ⁇ L of each GLD solution (prepared to 1.0 mg / mg each) and 5 ⁇ L of 0.4 M potassium phosphate buffer solution (pH 6.0) containing 1% SDS and 2% ⁇ -mercaptoethanol are mixed at 100 ° C. for 3 minutes. Heat treatment was performed. As the sugar chain cleavage treatment, 10 ⁇ L (50 mU) of endoglycosidase H (Roche) was added to the heat-treated sample and reacted at 37 ° C. for 18 hours.
  • FIG. 1 molecular weight marker (BioDynamics Laboratory, DynaMarker Protein Recombinant (10-150 kDa), 150 kDa, 100 kDa, 80 kDa, 60 kDa, 40 kDa from the top)
  • Lane 2 Before ApsGLD sugar chain cleavage
  • Lane 3 After ApsGLD sugar chain cleavage
  • Lane 1 molecular weight marker (BioDynamics Laboratory, DynaMarker Protein Recombinant (10-150 kDa), 150 kDa, 100 kDa, 80 kDa, 60 kDa, 40 kDa from the top)
  • Lane 2 Before ApnGLD sugar chain cleavage
  • Lane 3 After ApnGLD sugar chain cleavage
  • Lane 1 molecular weight marker (BioDynamics Laboratory, DynaMarker Protein Recombinant (10-150 kDa), 150 kDa, 100 kDa, 80 kDa, 60 kDa, 40 kDa from the top)
  • Lane 2 before KcGLD sugar chain cleavage
  • Lane 3 after KcGLD sugar chain cleavage
  • Lane 1 molecular weight marker (BioDynamics Laboratory, DynaMarker Protein Recombinant (10-150 kDa), 150 kDa, 100 kDa, 80 kDa, 60 kDa, 40 kDa from the top)
  • Lane 2 before KzGLD sugar chain cleavage
  • Lane 3 after KzGLD sugar chain cleavage
  • Lane 1 molecular weight marker (BioDynamics Laboratory, DynaMarker Protein Recombinant (10-150 kDa), 150 kDa, 100 kDa, 80 kDa, 60 kDa, 40 kDa from the top)
  • Lane 2 before Cs7GLD sugar chain cleavage
  • Lane 3 after Cs7GLD sugar chain cleavage
  • Lane 1 molecular weight marker (BioDynamics Laboratory, DynaMarker Protein Recombinant (10-150 kDa), 150 kDa, 100 kDa, 80 kDa, 60 kDa, 40 kDa from the top)
  • Lane 2 before FcGLD sugar chain cleavage
  • Lane 3 after FcGLD sugar chain cleavage
  • the molecular weight of ApsGLD is 100 to 115 kDa
  • the molecular weight of ApnGLD is 95 to 120 kDa
  • the molecular weight of KcGLD is 85 to 115 kDa
  • the molecular weight of KzGLD is 95 to 115 kDa
  • the molecular weight of Cs7GLD is 90.
  • the molecular weight of ⁇ 105 kDa and FcGLD was 85 to 110 kDa
  • the molecular weight after sugar chain cleavage was 60 to 70 kDa.
  • each of D-glucose, maltose, D-galactose, D-fructose, sorbitol, lactose, sucrose, D-xylose, D-mannose and trehalose is used as the substrate.
  • the activity of each GLD against the substrate was measured.
  • Table 1 shows the results of calculating the relative activity of each substrate, assuming that the activity for D-glucose is 100%.
  • the GLD of the present invention has a reactivity with respect to maltose, D-galactose, D-fructose, sorbitol, lactose and sucrose of 10% or less, and further D-fructose, sorbitol, The activity against lactose and sucrose was 1% or less.
  • FIG. 2A is ApsGLD
  • FIG. 2B is ApnGLD
  • FIG. 2C is KcGLD
  • FIG. 2D is KzGLD
  • FIG. 2E is Cs7GLD
  • FIG. F shows FcGLD
  • the final concentration of the substrate is 10 mM, 1.00 mL of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), 0.03 mL of 1M D-glucose solution, 1.58 mL of ultrapure water, 0.14 mL of 3 mM DCIP and When 0.20 mL of 3 mM 1-m-PMS is mixed and the final concentration of the substrate is 50 mM, 1.00 mL of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), 0.15 mL of 1M D-glucose solution, ultrapure water 1.
  • the optimal temperature of the GLD of the present invention is 30 ° C. at a substrate concentration of 10 mM, 30 or 40 ° C. at a substrate concentration of 50 mM, and a relative activity value of 80 at a substrate concentration of 50 mM. % Or more.
  • ApsGLD is 53.0 to 111% for ApsGLD, 62.1 to 106% for ApnGLD at a substrate concentration of 10 mM, KcGLD is 52.0-100%, KzGLD is 58.4-100%, Cs7GLD is 55.1-100%, FcGLD is 51.6-112%, and at a substrate concentration of 50 mM, ApsGLD is 50.9-136%. ApnGLD was 55.9 to 119%, KcGLD was 50.4 to 100%, KzGLD was 56.7 to 100%, Cs7GLD was 55.2 to 100%, and FcGLD was 51.5 to 117%. From the above, when the activity value at 30 ° C.
  • the GLD of the present invention has an activity value range of 20 to 150% at 10 to 40 ° C. and an activity value at 30 ° C. of 100%. Further, it was found that the activity value at 10 ° C. was 20% or more and the activity value at 20 ° C. was 40% or more. Therefore, any of the GLDs of the present invention is an enzyme with little activity fluctuation over a wide temperature range.
  • pH stability FcGLD was prepared at 6 U / mL, and the final concentration was 100 mM sodium acetate buffer solution (plotted with diamonds in the figure), 100 mM sodium citrate buffer solution (plotted with squares in the figure), 100 mM phosphate Sodium buffer (plotted with black circles in the figure), 100 mM potassium phosphate buffer (plotted with triangles in the figure), 100 mM Tris-HCl buffer (plotted with white circles in the figure), or 100 mM glycine-NaOH buffer (figure in the figure) Each buffer solution was added so as to be plotted in the middle x), treated at 30 ° C. for 1 hour, and then enzyme activity was measured by the enzyme activity measurement method.
  • the residual rate of enzyme activity was calculated and shown in FIG. 4 as a stable pH.
  • the activity of the enzyme treated with the buffer solution having the most stable FcGLD is 100%, it is 80% or more at pH 5.0 to 7.5, and 60% or more at pH 4.0 to 8.0.
  • the remaining activity was 80% or more at pH 5.0 to 7.5, and 60% or more at pH 4.0 to 8.0.
  • the remaining activity was 80% or more at pH 5.0 to 7.5, and 60% or more at pH 4.0 to 8.0.
  • potassium phosphate buffer solution tends to be less stable than other buffer solutions of the same pH at pH around 7 or on the alkali side. It was seen.
  • Km Value for Glucose the activity of each GLD was measured by changing the concentration of D-glucose as a substrate.
  • Km value Michaelis constant
  • ApsGLD was 8.78 mM
  • ApnGLD was 11.5 mM
  • KcGLD was 21.6 mM
  • KzGLD was 37.3 mM
  • Cs7GLD was 13.0 mM
  • FcGLD was 16.8 mM.
  • ApsGLD is about 5 to 20 mM
  • ApnGLD is about 5 to 20 mM
  • KcGLD is about 10 to 50 mM
  • KzGLD is about 10 to 60 mM
  • Cs7GLD is about About 5-30 mM
  • FcGLD is considered about 5-30 mM.
  • Example 14 (Measurement of glucose by GLD of the present invention) Using the GLD of the present invention, the change in absorbance was measured by changing the concentration of D-glucose in the activity measurement method in the range of 0.3 mM (5.5 mg / dL) to 50 mM (900 mg / dL). The results are shown in FIG. 3 (FIG. 3A is ApsGLD, FIG. 3B is ApnGLD, FIG. 3C is KcGLD, FIG. 3D is KzGLD, FIG. 3E is Cs7GLD, FIG. F) shows FcGLD). As a result, in any GLD of the present invention, D-glucose up to 900 mg / dL could be measured. From this, it was shown that D-glucose can be quantified using the GLD of the present invention.
  • Example 15 The amino acid sequences of the respective GLDs of the present invention (SEQ ID NOs: 2: ApsGLD, 4: ApnGLD, 6: KcGLD, 8: KzGLD, 10: Cs7GLD, 12: FsGLD, 14: Cs8GLD, 16: CcGLD, 18: CfGLD and 20: CoGLD) was compared by GENETYX homology search, and the numerical values of Similarity% were summarized in Table 3 as% similarity, and numerical values of identity% were summarized in Table 4 as% identity.
  • the base sequences of the respective GLDs of the present invention (SEQ ID NOs: 1: ApsGLD, 3: ApnGLD, 5: KcGLD, 7: KzGLD, 9: Cs7GLD, 11: FcGLD, 13: Cs8GLD, 15: CcGLD, 17: CfGLD and 19: CoGLD) were compared by GENETYX homology search, and the values of identity% were summarized in Table 5 as% identity.
  • the amino acid sequence is at least 60% identical to the sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20, and glucose dehydrogenase activity. It was confirmed that a protein having a protein and a polynucleotide encoding the protein could be obtained.
  • the nucleotide sequence has at least 60% identity with the sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19 and glucose dehydrogenase activity. It was confirmed that the polynucleotide encoding the protein having

Abstract

　本発明の目的は、一般的なバイオセンサの測定温度域（１０～４０℃）において、活性の変動が小さいフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びそれを用いるグルコースの測定法を提供すること。　本発明は、下記の性質（１）～（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼなどに関する： （１）作用：電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す； （２）基質特異性：Ｄ－グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である； （３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０～４０℃における活性値の範囲が２０～１５０％。

Description

フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びこれをコードするポリヌクレオチド
　本発明は、グルコースの１位の水酸基を脱水素（酸化）する反応を触媒する、可溶性のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）等に関する。より具体的には、新規なＧＬＤポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、該ＧＬＤの製造方法、該ＧＬＤを使用することを特徴とするグルコースの測定方法、グルコース測定試薬組成物及びグルコース測定用のバイオセンサ等に関する。
　血液中のグルコース濃度の迅速且つ正確な測定は、糖尿病を診断するうえで重要である。グルコースの測定法としては、化学法と酵素法があるが、酵素法が特異性、安全性の点で優れている。当該酵素法の中でも、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点から、電気化学的バイオセンサが有利である。
　そのようなバイオセンサに使用可能な酵素として、酸素を電子受容体とするグルコースオキシダーゼが知られている。しかし、グルコースオキシダーゼは、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があるため、酸素を電子受容体としない、いくつかのグルコースデヒドロゲナーゼが開発されてきた。グルコースデヒドロゲナーゼのうち、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼは、補酵素の添加を必要としないこと及び溶存酸素の影響を受けないことから、グルコースバイオセンサ用の酵素として注目されている（特許文献１～７）。これらのフラビン結合型デヒドロゲナーゼの中には、基質特異性に優れるもの（特許文献５）、５０℃における活性値を１００％とする場合に、１０℃における活性値が１５％以上、２０℃における活性値が３０％以上、６０℃における活性値が７０％以上であるもの（特許文献６）、アスペルギルス・オリゼ由来のフラビン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの組換え大腸菌の細胞破砕液で、３７℃における活性値を１００％とする場合に２５℃における相対的な活性値が改善された改変型酵素（特許文献７）等がある。
特開２００７－２８９１４８号公報 国際公開２００７／１３９０１３号パンフレット 国際公開２００８／００１９０３号パンフレット 国際公開２００４／０５８９５８号パンフレット 国際公開２０１０／１４０４３１号パンフレット 特開２０１０－０５７４２７号公報 国際公開２０１１／０３４１０８号パンフレット
　しかしながら、これら従来のグルコースデヒドロゲナーゼの活性は、高温側では反応性が強いが低温側で反応性が低下するものなど、温度帯によって活性の変動が大きかった。そのため、バイオセンサ自体に温度補正機能が付加されているものの、糖尿病患者が血糖値を測定する際に、環境温度によって得られる値が変動する可能性があったため、広い温度帯でより活性の変動が小さい酵素が求められていた。
　従って、本発明の課題は、一般的なバイオセンサの測定温度域（１０～４０℃）において、活性の変動が小さいフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びそれを用いるグルコースの測定法等を提供することにある。
　そこで本発明は、種々の微生物由来のグルコースデヒドロゲナーゼを探索したところ、糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼの中に、グルコースに対する基質特異性が高く、且つ３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０～４０℃における活性値が２０～１５０％であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼが存在し、これを用いればより広い温度域で正確且つ再現性良く、グルコース濃度が測定できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［１４］の態様に関する。
［１］下記の性質（１）～（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
（１）作用：電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す；
（２）基質特異性：Ｄ－グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である；
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０～４０℃における活性値が２０～１５０％である。
［２］酵素タンパクのポリペプチドの分子量が６０～７０ｋＤａである［１］記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［３］至適温度が３０～４０℃である［１］又は［２］に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［４］糸状菌由来である［１］～［３］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［５］クロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する糸状菌由来である［１］～［４］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［６］糸状菌に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする［１］～［５］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
［７］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなるグルコースデヒドロゲナーゼ：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号２の１７～５９１番目、配列番号４の１６～５８９番目、配列番号６の２４～５９２番目、配列番号８の１７～５９１番目、配列番号１０の１８～５８６番目、配列番号１２の１８～５８６番目、配列番号１４の１８～５８６番目、配列番号１６の１８～５８６番目、配列番号１８の１８～５８６番目又は配列番号２０の１８～５８６番目に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
［８］以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）からなるポリヌクレオチド：
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１の４９～１７７３番目、配列番号３の４６～１７６７番目、配列番号５の７０～１７７６番目又は配列番号７の４９～１７７３番目、配列番号９の５２～１７５８番目、配列番号１１の５２～１７５８番目、配列番号１３の５２～１７５８番目、配列番号１５の５２～１７５８番目、配列番号１７の５２～１７５８番目又は配列番号１９の５２～１７５８番目に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｈ）（ａ）～（ｃ）に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［９］［８］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［１０］［８］に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞。
［１１］［１０］に記載の細胞を培養し、培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
［１２］［１］～［５］若しくは［７］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は［６］若しくは［１１］に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを使用するグルコースの測定方法。
［１３］［１］～［５］若しくは［７］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は［６］若しくは［１１］に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを含有するグルコース測定試薬。
［１４］［１］～［５］若しくは［７］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は［６］若しくは［１１］に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを使用するグルコース測定用バイオセンサ。
　本発明によって一般的なバイオセンサの測定温度域（１０～４０℃）において、活性の変動が小さいフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを提供することが出来、該酵素を用いれば、測定環境が低温であっても正確且つ再現性良く、血中グルコースを測定することができる。
本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）～（Ｆ）のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。 本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）～（Ｆ）の至適温度の範囲を示す図である。 本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）～（Ｆ）によるグルコース量測定結果を示す図である。 本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｆ）のｐＨ安定性を示す図である。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、可溶性のフラビン結合型のグルコースデヒドロゲナーゼであり、補酵素としてのフラビンが結合した状態で活性を示す酵素である。例えば、ＥＣ１．１．９９．１０に分類される酵素である。ここでフラビンとしては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）が挙げられる。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、下記の性質（１）～（３）を有する点に特徴がある。
（１）作用：電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す。
（２）基質特異性：Ｄ－グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である。
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０～４０℃における活性値が２０～１５０％である。
　まず、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、（１）電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す。すなわち、電子受容体の存在下で、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する。フラビン結合型のグルコースデヒドロゲナーゼがグルコースに作用すると、補酵素ＦＡＤはＦＡＤＨ２となるが、電子受容体としてフェリシアン化物（例えば、「Ｆｅ（ＣＮ）６」３－）を存在させると、ＦＡＤＨ２はこれをフェロシアン化物（この場合、「Ｆｅ（ＣＮ）６」４－）へと変換し、自らはＦＡＤへと戻る。フェロシアン化物は電位を与えると、電子を電極に渡してフェリシアン化物へと戻るので、こうした電子伝達物質を電子受容体とすることにより、電気化学的なシグナル検出が可能になる。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性は、Ｄ－グルコースに対する特異性が高いため、グルコースの測定に適している。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、（２）Ｄ－グルコースに対する反応性に対してＤ－グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する反応性が低く、１０％以下であり、好ましくは８％以下、より好ましくは６％以下、更に好ましくは５％以下である。更に好ましくはＤ－グルコースに対する活性値を１００％とした場合のＤ－フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値は１％以下であって、特に好ましくは０．５％以下である。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの温度特性は、（３）３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０～４０℃における活性値は２０～１５０％であって、当該１０℃～４０℃における活性値の下限値は３０％であるのが好ましく、４０％であるのがより好ましく、５０％であるのが更に好ましい。更に、当該１０～４０℃における活性値の上限値は１４０％であるのが好ましく、１３０％であるのがより好ましく、１２０％であるのが更に好ましく、１１０％であるのが特に好ましい。
　即ち、好適範囲は、基質濃度１０ｍＭの場合、好ましくは３０～１３０％、より好ましくは４０～１２０％、更に好ましくは５０～１１０％；基質濃度５０ｍＭの場合、好ましくは３０～１４０％、より好ましくは４０～１３０％、更に好ましくは５０～１２０％である。
　又は、３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０℃における活性値が２０％以上であるのが好ましく、基質濃度１０ｍＭの場合、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上；基質濃度５０ｍＭの場合、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上である。
　又は、３０℃における活性値を１００％とした場合に、２０℃における活性値が４０％以上であるのが好ましく、基質濃度１０ｍＭの場合、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上；基質濃度５０ｍＭの場合、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上である。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、更に以下の（４）～（６）の性質を有していることが好ましい。即ち、（４）酵素タンパクのポリペプチドの分子量が６０～７０ｋＤａであるのが好ましく、６５～７０ｋＤａであるのがより好ましい。酵素タンパクのポリペプチドの分子量とは、糖鎖を除去したタンパク質部分をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定した場合の分子量のことである。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による酵素全体の分子量については、培養条件や精製条件等により、糖鎖付加量が変われば分子量は異なり、組換え酵素においてはその宿主等によっても糖鎖の有無や糖付加量が変わり、分子量は異なってくる。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの（５）至適温度は、３０～４０℃であるのが好ましい。より詳細には、該酵素を、各種温度で、後述の酵素活性測定法により測定し、該酵素が最大活性を示す温度における活性値を１００％とした場合に、３０～４０℃で相対活性値が５０％以上であるのがより好ましく、６０％以上であるのが更に好ましく、８０℃以上であるのが最も好ましい。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの（６）Ｋｍは、１～８０ｍＭであるのが好ましく、５～６０ｍＭであるのがより好ましい。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの具体例としては、後記実施例２～７に示すような６種を挙げられる。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの由来は特に制限されないが、糸状菌であるのが好ましく、より好ましくはクロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する糸状菌であり、より好ましくはクロイボタケ亜綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ）又はプレオスポラ菌亜綱（Ｐｌｅｏｓｐｏｒｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ）に属する糸状菌であり、より好ましくはクロイボタケ目（Ｄｏｔｈｉｄｅａｌｅｓ）、カプノディウム目（Ｃａｐｎｏｄｉａｌｅｓ）又はプレオスポラ目（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ）に属する糸状菌であり、更に好ましくはドチオラ科（Ｄｏｔｈｉｏｒａｃｅａｅ）、ダビディエラ科（Ｄａｖｉｄｉｅｌｌａｃｅａｅ）又はベンツリア科（Ｖｅｎｔｕｒｉａｃｅａｅ）に属する糸状菌であり、特に好ましくはアウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、カバティエラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属又はフシクラディウム属の何れかに属する糸状菌であり、最も好ましくはアウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、カバティエラ・カウリボラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ　ｃａｕｌｉｖｏｒａ）、カバティエラ・ゼアエ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ　ｚｅａｅ）、クラドスポリウム・エスピー（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｐ．）クラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、クラドスポリウム・フニクロサム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｆｕｎｉｃｌｏｓｕｍ）、クラドスポリウム・オキシスポラム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、クラドスポリウム・デリカツラム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｄｅｌｉｃａｔｕｌｕｍ）、クラドスポリウム・ゴッシピーコラ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｇｏｓｓｙｐｉｉｃｏｌａ）、クラドスポリウム・テヌイッシマム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｔｅｎｕｉｓｓｉｍｕｍ）又はフシクラディウム・カルポフィラム（Ｆｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ　ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ）から選ばれる糸状菌である。具体的には、本明細書の実施例１～１１に記載された１０種類の菌株を挙げることができる。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、例えば、糸状菌に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物から採取することにより製造することができる。
　本発明で使用される微生物の培養には、通常の微生物培養用培地が使用でき、炭素源、窒素源、無機物その他使用微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜などが使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機塩類、ＤＬ－アラニン、Ｌ－グルタミン酸などのアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカーなどの窒素含有天然物が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを得るための培養は、通常、振盪培養や通気攪拌などの方法による好気的条件下で行うのがよく、２０℃から５０℃、且つｐＨ４からｐＨ８の範囲で行うのが好ましい。培養期間は２日から１０日の範囲が好ましい。この様な方法で培養することにより、培養物中、特に培養液中にグルコースデヒドロゲナーゼを生成蓄積することができる。又は該培養方法により、培養微生物内にもグルコースデヒドロゲナーゼを生成蓄積することができる。ついで、培養物中からグルコースデヒドロゲナーゼを得る方法は、通常のタンパク質の精製方法が使用できる。この方法は、例えば、微生物を培養後、遠心分離などにより微生物を除き培養上清を得る方法、又は微生物を培養後、培養液を遠心分離して培養微生物を得、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離などによって上清液を得る方法である。これらの上清液中に含まれるグルコースデヒドロゲナーゼは、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。
　更に、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを得るための培養は、固体培地も使用できる。培養方法には特に制限はなく、静置培養によってもよく、培養物を常時混合するような回転培養や流動層培養などによっても行うことができるが、設備投資の少ない培養装置としては静置培養が好ましい。次いで、培養物中からグルコースデヒドロゲナーゼを得る方法は、通常のタンパク質の精製方法が使用できる。すなわち、培養物に水などの抽出剤を加えて攪拌したのち、ふすまなどの培地固形分を遠心分離、ろ過などの分離法により除去して抽出液を得ることにより行うことができる。一方、菌体内に蓄積されたグルコースデヒドロゲナーゼの回収は、上記の抽出液を得た培養物残渣を海砂などの研磨剤とともに磨砕したのち、水などを加えて、菌体から遊離されたグルコースデヒドロゲナーゼを抽出する方法などで行うことができる。又は、全グルコースデヒドロゲナーゼを得るには、培養物全体を海砂などの研磨剤とともに磨砕したのち、水などを加えて、菌体から遊離されたグルコースデヒドロゲナーゼと培地中に分泌されたグルコースデヒドロゲナーゼの両方を一挙に抽出する方法などで行うことができる。これらの上清液中に含まれるグルコースデヒドロゲナーゼは、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、合成によるグルコースデヒドロゲナーゼや遺伝子工学によって得られた組換え型のグルコースデヒドロゲナーゼであってもよい。当業者は本発明の開示に基づいて容易にこのような組換え型のグルコースデヒドロゲナーゼを得ることができる。例えば、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列をもとに合成法によって得ることができるし、該グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子断片を市販の発現ベクターなど公知の発現ベクターに挿入し、得られたプラスミドを使用して大腸菌や糸状菌などの宿主を形質転換し、形質転換体を培養して目的のグルコースデヒドロゲナーゼを得るといった遺伝子工学によって該グルコースデヒドロゲナーゼを工業的に製造することも可能である。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質からなるグルコースデヒドロゲナーゼである。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２の１７～５９１、配列番号４の１６～５８９、配列番号６の１７～５９２、配列番号８の１７～５９１、配列番号１０の１２～５８６、配列番号１２の１２～５８６、配列番号１４の１２～５８６、配列番号１６の１２～５８６、配列番号１８の１２～５８６、配列番号２０の１２～５８６、配列番号２の２４～５９１、配列番号４の２３～５８９、配列番号６の２４～５９２、配列番号８の２４～５９１、配列番号１０の１８～５８６、配列番号１２の１８～５８６、配列番号１４の１８～５８６、配列番号１６の１８～５８６、配列番号１８の１８～５８６又は配列番号２０の１８～５８６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
　類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）のアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたＳｉｍｉｌａｒｉｔｙの値に基づく。
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
　同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）のアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。
　（ａ）～（ｄ）のタンパク質は何れも好ましくは上記の性質（１）～（３）を有するフラビン結合型のグルコースデヒドロゲナーゼであり、更に好ましくは性質（４）～（６）を有する。
　各アミノ酸配列の内、シグナル配列は、配列番号２の１～１６番目、配列番号６の１～２３番目及び配列番号１２の１～１１番目のアミノ酸配列である。配列番号２、６又は１２のシグナル配列から、配列番号４の１～１５番目、１～２２番目、配列番号８の１～１６番目、１～２３番目、又は配列番号１０、１４、１６、１８若しくは２０の１～１１番目のアミノ酸配列が、シグナル配列と予測される。
　尚、組換え株由来成熟タンパクは本明細書に記載の野生株由来酵素（成熟タンパク）のＮ末端から、数アミノ酸が置換、付加若しくは欠失した改変アミノ酸配列からなるタンパク質でも良い。即ち、組換え株由来成熟タンパクは、野生株由来成熟タンパクのＮ末端に於いて、１～２５、２０以下、１０以下、９以下、８以下、７以下若しくは６以下のアミノ酸が付加又は置換されていてもよく、又は１～１０、９以下、８以下、７以下若しくは６以下のアミノ酸が欠失していても上記のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し得る。
　本発明のポリヌクレオチドは、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）を含むポリヌクレオチドである。
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号１の４９～１７７３番目、配列番号３の４６～１７６７番目、配列番号５の４９～１７７６番目、配列番号７の４９～１７７３番目、配列番号９の３４～１７５８番目、配列番号１１の３４～１７５８番目、配列番号１３の３４～１７５８番目、配列番号１５の３４～１７５８番目、配列番号１７の３４～１７５８番目、配列番号１９の３４～１７５８番目、配列番号１の７０～１７７３番目、配列番号３の６７～１７６７番目、配列番号５の７０～１７７６番目、配列番号７の７０～１７７３番目、配列番号９の５２～１７５８番目、配列番号１１の５２～１７５８番目、配列番号１３の５２～１７５８番目、配列番号１５の５２～１７５８番目、配列番号１７の５２～１７５８番目又は配列番号１９の５２～１７５８番目に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｈ）（ａ）～（ｄ）に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｉ）（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を有し、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）の塩基配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。
　（ｅ）～（ｉ）のポリヌクレオチドは何れも上記のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする。
　尚、各ポリヌクレオチドの内、シグナル配列をコードするのは、配列番号１の１～４８番目、配列番号５の１～６９番目、配列番号１１の１～３３番目の塩基配列である。配列番号１、５又は１１のシグナル配列をコードする塩基配列から、配列番号３の１～４５番目、１～６６番目、配列番号７の１～４８番目、１～６９番目、又は配列番号９、１３、１５、１７若しくは１９の１～３３番目に示される塩基配列と予測される。
　更に、上記のような野生株由来酵素（成熟タンパク）のＮ末端から、数アミノ酸が置換、付加若しくは欠失した改変アミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドも利用できる。
　アミノ酸配列及び塩基配列の同一性パーセンテージは、基準配列（本発明では（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）の配列）を照会配列として、比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウェアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）若しくはＧｅｎｅＤｏｃなどを用いることができ、これらはデフォルトパラメーターで使用することができる。
　本発明において、ハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」の具体的な条件とは、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム、１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’s）溶液、０．１％　ＳＤＳ、１０％　デキストラン硫酸及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡで４２℃インキュベーションした後、フィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄することを例示することができる。
　本発明のポリヌクレオチドのシグナル配列は、前記に記載の通りだが、例えば国際公開２００６／１０１２３９に記載のアスペルギルス・テレウス由来グルコース脱水素酵素配列のシグナル配列（該公報の配列番号２の１～１９に示されるアミノ酸配列）と比較することや、シグナル配列予測サイト（Ｓｉｇｎａｌ　Ｐ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いても推定できる。推定されたシグナル配列を削除したアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有すると考えられる。
　尚、本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、具体的にはフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする合成ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ又はそれらを鋳型としてＰＣＲ増幅して得たポリヌクレオチドを含む。「ポリペプチド」とは、アミノ酸がペプチド結合によって連なった化合物で、細胞中のリボソームで合成又は人工的に合成された分子を意味し、更には、これらに糖鎖が付加したものや、人工的に化学的修飾がなされたもの等も含む。
　染色体ＤＮＡ又はＲＮＡの由来は特に制限されないが、糸状菌であるのが好ましく、より好ましくはクロイボタケ綱に属する糸状菌であり、より好ましくはクロイボタケ亜綱又はプレオスポラ亜綱に属する糸状菌であり、より好ましくはクロイボタケ目、カプノディウム目又はプレオスポラ目に属する糸状菌であり、更に好ましくはドチオラ科、ダビディエラ科又はベンツリア科に属する糸状菌であり、特に好ましくはアウレオバシジウム属、カバティエラ属、クラドスポリウム属又はフシクラディウム属に属する糸状菌であり、最も好ましくはアウレオバシジウム・プルランス、カバティエラ・カウリボラ、カバティエラ・ゼアエ、クラドスポリウム・エスピー（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｐ）、クラドスポリウム・クラドスポリオイデス、クラドスポリウム・フニクロサム、クラドスポリウム・オキシスポラム、クラドスポリウム・デリカツラム、クラドスポリウム・ゴッシピーコラ、クラドスポリウム・テヌイッシマム又はフシクラディウム・カルポフィラムである。前記糸状菌から染色体ＤＮＡ又はＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。続いて、公知のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、例えば国際公開２００６／１０１２３９に記載のアスペルギルス・テレウス由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、特許文献３記載のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ及び／又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９の同一性を比較したアライメントに基づいて、複数のオリゴヌクレオチドプローブ又は縮重プライマーを作製する。又は、ＤＮＡを適当な制限酵素で切断してプローブ又はプライマーを作製してもよい。前記のプローブ又はプライマーを用いてハイブリダイズ、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ等、常法によって上記ライブラリーから、本願のポリヌクレオチドを取得することができる。
　具体的には、前記アライメントの内、同一性の高い部位から内部配列解読用のフォワードプライマー及びリバースプライマーを作製し、上記ライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行う。フォワードプライマーは、好ましくは増幅側（下流側）が少なくとも2塩基一致する部位で、好ましくは15～40塩基程度の配列長に設計できる部位で、配列番号１の238～260番目及び394～417番目の部位が例示できる。リバースプライマーは、好ましくは増幅側（上流側）が少なくとも2塩基一致する部位で、好ましくは15～40塩基程度の配列長に設計できる部位で、配列番号１の1600～1625番目、1735～1757番目の部位が例示できる。この部位から設計したプライマーを用いてＰＣＲを行う際、アニーリング温度は低く設定し、４０～５０℃が好ましく、４０～４５℃がより好ましい。1段階目で使用したプライマーセットの内側のプライマーセットを用いて2段階目のＰＣＲを行っても良い。プライマーに利用した塩基の位置からＰＣＲ産物のサイズを予想し、該当するＰＣＲ産物を解読する。解読したＰＣＲ産物が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９の該当箇所と少なくとも50％の同一性、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％の同一性があれば、本願遺伝子の内部配列を取得できている。次に解読した内部配列から、周知の方法で本発明の遺伝子全長を取得できる。つまり、本発明の遺伝子の開始コドン周辺及び終止コドン周辺を解明するためにプライマーを設計し、該プライマーを用いて、上記ライブラリーを鋳型として５’－ＲＡＣＥ法及び３’－ＲＡＣＥ法を行う。その結果、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の開始コドン周辺及び終止コドン周辺が解明できる。続いて本発明のグルコースデヒドロゲナーゼをコードする開始コドンから終止コドンまでの全長遺伝子を増幅できるプライマーを設計し、該プライマーを用いて、上記ライブラリーを鋳型として本発明のポリヌクレオチドを取得することができる。
　本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を用いて、機能未知の公開配列に対して例えばＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ）等のホモロジー検索を行い、同一性が少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性でヒットした５５０～６５０アミノ酸配列長であるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列から取得することができる。公開配列から全長を取得できるプライマーをデザインし、該遺伝子配列の由来株のＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ又はＲＴ－ＰＣＲにより増幅して得ることができる。更に増幅して得た該ポリヌクレオチドを用いて常法により組換えタンパク質を得て、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を確認することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡは、該遺伝子配列の由来株と同種又は同属の株からも得ることができる。
　本発明のポリヌクレオチドは、公知のミューテーション導入法や変異導入ＰＣＲ法等によって改変して作製することができる。更に、染色体ＤＮＡやそのｃＤＮＡライブラリーから、ヌクレオチド配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドを用いるプローブハイブリダイゼーション法によって取得することができる。ハイブリダイゼーションに際して、ストリンジェント条件を様々に変化させることによって、上記ポリヌクレオチドを取得することができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーション及び洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアルデヒド等）の濃度、温度条件等によって規定され、例えば、米国特許No.6,100,037号明細書等に開示されているような、当業者らに周知の様々な条件を採用することができる。
　文献（例えばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．　Ｑｕａｎｔ．　Ｂｉｏｌ．　４７：４１１－４１８；Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１０５：６６１；　Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　２５：３４４０－３４４４；　Ｆｒｅｎｋｅｌ(１９９５)Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．　１９：３７３－３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：７８８６－７８９６；　Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　６８：１０９；　Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．　Ｌｅｔｔ．　２２：１８５９；　米国特許第４，４５８，０６６号）に記載されているような周知の化学合成技術により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて本発明のポリヌクレオチドを合成することができる。
　本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、インサートとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、ｃＤＮＡ又はそのＯＲＦ領域をインサートとしてフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを生産する場合には、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、カビなどの糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することもできる。宿主に対応して、同一アミノ酸配列であるが、コドンユーセージを最適化したポリヌクレオチドを導入しても良い。更に糖鎖の要、不要、その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができるが、糖鎖付加可能な宿主を選択し、糖鎖を有する酵素を製造することが好ましい。
　本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。カビは特に限定されないが、好ましくはチャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、より好ましくはクロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ユーロチウム菌綱（Ｅｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ズキンタケ綱（Ｌｅｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）又はフンタマカビ綱（Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、更に好ましくはユーロチウム目、特に好ましくはアスペルギルス属に属する菌を使用する。これらの形質転換細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。組換えベクター及び形質転換細胞の具体例として、下記実施例に示した組換えベクターと、このベクターによる形質転換大腸菌及び形質転換カビが挙げられる。
　本発明のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター配列等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作製し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを微生物で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと終止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含むフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ断片を得ることもできる。特に、分泌シグナル配列をコードする遺伝子配列を含む外来遺伝子を用いて、大腸菌などのグラム陰性菌で組換えタンパクを発現させる場合は、組換えタンパクがペリプラズムに移行されるため、生産性が悪い。そのため、組換えタンパクを効率よく回収したい場合は、シグナル配列をコードする遺伝子配列を削除した配列を用いるのが良い。又は、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。原核細胞で発現させて生産させる場合は、イントロンを含まないグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を挿入する必要があり、特にグラム陰性菌の場合、イントロンを含まずシグナル配列をコードする配列を含まないポリヌクレオチド、例えば（ｆ）に記載のポリヌクレオチドに開始コドンＡＴＧを付加したポリヌクレオチドを挿入することが好ましい。グラム陽性菌の場合、シグナル配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドであっても良く、シグナル配列をコードする配列を含まないポリヌクレオチド、例えば（ｆ）に記載のポリヌクレオチドに開始コドンＡＴＧを付加したポリヌクレオチドであってもよく、シグナル配列をコードする配列を宿主に適切な配列に置換したポリヌクレオチドを挿入しても良い。終止コドンを宿主に最適な終止コドンに置換することで組換えタンパクの発現量を向上させても良い。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システムなどが例示できる。
　一方、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを真核細胞で発現させて生産させる場合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを真核細胞で生産することができる。プラスミドのような状態で細胞内に維持することもできるし、染色体中に組みこませて維持することもできる。挿入するポリヌクレオチドは、シグナル配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドであっても良く、シグナル配列をコードする配列を含まないポリヌクレオチド、例えば（ｆ）に記載のポリヌクレオチドに開始コドンＡＴＧを付加したポリヌクレオチドであってもよく、シグナル配列をコードする配列を例えば宿主に適切なシグナル配列に置換したポリヌクレオチドでも良い。終止コドンを宿主に最適な終止コドンに置換することで組換えタンパクの発現量を向上させても良い。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ-ＣＭＶ、ｐＢＫ-ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ８２などが例示できる。更に、ｐＩＮＤ／Ｖ５-Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ-ＣＭＶ-２、ｐＥＧＦＰ-Ｎ１、ｐＥＧＦＰＣ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質としてフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼポリペプチドを発現させることもできる。
　既に述べたように、本発明のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼは、本発明のポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ又はその翻訳領域）を有するベクターからｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳を行うことによりｉｎ　ｖｉｔｒｏでフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを作製することができる。
　本発明のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現させて生産させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系に添加すれば、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをｉｎ　ｖｉｔｒｏで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターとしては、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６などが例示できる。これらのプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどが例示できる。
　本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．１５－０．６ｕｎｉｔ／ｍＬになるように適宜希釈して用いる。尚、該酵素の酵素活性単位（ｕｎｉｔ）は１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）の酵素活性は、次の方法で測定できる。
（酵素活性測定法）
　以下の手順に従って各溶液を混合し、吸光度を測定し、ＧＬＤ活性を調べた。
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ Ｄ－グルコース溶液１．００ｍＬ、超純水０．６１ｍＬ、３ｍＭ ２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰという）０．１４ｍＬ及び３ｍＭ １－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェイト（以下１－ｍ－ＰＭＳという）０．２０ｍＬを混合し、３７℃で１０分間保温後、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、直線部分から式１に従いＧＬＤ活性を算出した。この際、ＧＬＤ活性は、３７℃、ｐＨ６．０で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．８はｐＨ６．０におけるＤＣＩＰのモル吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍率を表す。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、前述のように酸素の影響を受けず、グルコースに対する特異性が高く、且つ室温でも高い活性を維持しているため、グルコース濃度、特に血中グルコース濃度の測定用酵素として有用である。グルコースを含む被検試料、例えば血液と本発明のグルコースデヒドロゲナーゼとを接触させる工程により、被検試料中のグルコースが測定できる。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、グルコース測定試薬に用いることができる。該測定試薬は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類（例えば、トレハロースなど）若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等から成る群より選ばれる熱安定化剤、又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めることができる。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を、該測定試薬に含ませることができる。
　本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、バイオセンサに用いることができる。
　本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを反応層に使用したセンサであればよい。例えば、該バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷や蒸着などの方法を利用して電極系を形成し、更に酸化還元酵素と電子受容体とを含む測定試薬を備えることによって作製される。このバイオセンサの測定試薬に基質を含む試料液を接触させると、測定試薬が溶解して酵素と基質が反応し、これにともなって電子受容体が還元される。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させ、このとき、このバイオセンサは得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を測定することが可能である。この他に、発色強度又はｐＨ変化などを検知する方式のバイオセンサも構築可能である。これらのバイオセンサにより、測定対象物質を基質とする酵素を選択することによって、様々な物質の測定が可能である。例えば、酵素に本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを選択すると、試料液中のグルコース濃度を測定できる、酸素の影響を受けないグルコースセンサを作製することができる。
　バイオセンサの電子受容体としては、電子の授受能に優れた物質を用いることができる。電子の授受能に優れた物質とは、一般的に「電子伝達体」、「メディエータ」あるいは「酸化還元媒介剤」と呼ばれる化学物質やタンパク質性の電子メディエータであり、これらに該当する化学物質として、例えば、特表２００２－５２６７５９に挙げられた電子伝達体や酸化還元媒介剤などを利用してもよい。
　更に本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及びグルコース酸化還元酵素又は上記の融合体を含む酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例によって限定されるものではない。以下の実施例におけるグルコースデヒドロゲナーゼ活性の定量は前記の方法に従って行った。
［実施例１］
（本発明のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）の取得）
（１）ＧＬＤ活性の確認
　自然界から分離した菌株及び微生物保存機関（独立行政法人　製品評価技術基盤機構：〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）から購入した菌株、計約３，８００株からＧＬＤ生産菌の探索を行った結果、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　Ｓ２０、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　ＮＢＲＣ４４６４、Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ　ｃａｕｌｉｖｏｒａ　ＮＢＲＣ７３１４、Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ　ｚｅａｅ　ＮＢＲＣ９６６４、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｐ．Ｔ７９９、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｐ．Ｔ８０６、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ　ＮＢＲＣ４４５９、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｆｕｎｉｃｌｏｓｕｍ　ＮＢＲＣ６５３７、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ＮＢＲＣ３２５１１、及びＦｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ　ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ　ＮＢＲＣ９６４５の培養上清にＧＬＤ活性が確認できた。
（２）Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　Ｓ２０由来ＧＬＤの精製
　グルコース１％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、大豆粉２％（昭和産業社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、ヒドロキノン０．１７ｇ/Ｌ（ナカライテスク社製）、キシリジン０．０００６％（和光純薬社製）（ｗ／ｖ）、ＥＤＴＡ０．１５ｍＭ（和光純薬社製）、ビオチン２ｎｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、（＋）－パントテン酸カルシウム０．４μｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、イノシトール２μｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、ニコチン酸０．４μｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、チアミン塩酸塩０．４μｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、ｐ－アミノベンゾニックアシッド０．２μｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、ビタミンＢ２ ０．２μｇ／ｍＬ（ナカライテスク社製）、葉酸１０ｎｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、及び水からなる液体培地５００ｍＬを２０００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　Ｓ２０株を植菌し、１５℃で１４日間振とう培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して培養上清を回収し、分画分子量８，０００の限外ろ過膜（ミリポア社製）で濃縮して粗酵素液とした。
　前記粗酵素液を、６０％飽和硫酸アンモニウム溶液に調整し、４℃で一晩放置後、遠心分離して上清を回収した。
　該上清を、６０％飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｃ（東ソー社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（ＧＥヘルスケア社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平行化したｍｏｎｏＱ５／５（ＧＥヘルスケア社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平行化したＨｉＬｏａｄ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に通液し、その後同緩衝液を用いて、ゲル濾過精製を実施し、活性画分を回収した。回収した活性画分を分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換して野生株由来ＡｐｓＧＬＤサンプルとした。該精製酵素の比活性は３７８Ｕ／ｍｇだった。
［実施例２］
（Ａ．Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　Ｓ２０由来ＧＬＤ（ＡｐｓＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）菌体培養
　グルコース（ナカライ社製）１％（Ｗ／Ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）２％（Ｗ／Ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライ社製）０．１％（Ｗ／Ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　Ｓ２０株を接種し、１５℃で９０時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。
（２）全ＲＮＡの単離
　（１）で取得した湿菌体２００ｍｇを－８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いて１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。
（３）ｃＤＮＡライブラリーの調製
　全ＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、「ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ」（タカラバイオ株式会社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。
（４）ＡｐｓＧＬＤ遺伝子のクローニング
　（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＡｐｓＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマーは、本発明者らによって既に解明されていた複数のＧＬＤ配列から共通配列を解析し、その共通配列を基に同一性の低いＧＬＤ配列でも増幅するように、縮重塩基を用いてprimer-F1、primer-F2、primer-R1及びprimer-R2を設計した。第１段階目に、実施例２の（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、primer-F1及びprimer-R1を用いてＰＣＲを行った。第2段階目に、第1段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer-F2及びprimer-R2を用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ産物を配列解析し、解読した内部配列から、遺伝子の開始コドン周辺及び終止コドン周辺を解明するためのプライマーを設計して、５’－ＲＡＣＥ法及び３’－ＲＡＣＥ法を行った。最終的に下記のprimer-ApsF及びprimer-ApsRのプライマー対を用いてＰＣＲを行って、配列番号１に示す全鎖長１，７７６ｂｐのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　Ｓ２０株由来ＡｐｓＧＬＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。当該遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２に示した。
　尚、配列番号２記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１～１６番目までの１６アミノ酸がシグナル配列と予測された。
primer-F1：5’-CGGCACTCAGATYGAYTGGGCRTA-3’
primer-F2：5’-AAGTTGGGHAACAACMTCACMTGG-3’
primer-R1：5’-ATGCGCTCRGCAGCTCTCTCVGC-3’
primer-R2：5’-ACGCCACCGAGHTCCTYSGACATCAT-3’
primer-ApsF：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGTATCGTTTACTCTCTACATTTG-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-ApsR：5’-CGCTTCTAGAGCATGCCTACTGGTGGCTAGCCTCGATAAC-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
primer-GLD-F：5’-CTCCAAGTTAGTCGAC(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳａｌＩ）、括弧内：転写増強因子）
（５）ＡｐｓＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
　公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１－８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最初に、（４）で得られたＤＮＡ断片を鋳型として上記のprimer-ApsR及びprimer-GLD-Fのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＡｐｓＧＬＤ遺伝子を増幅した。次にベクターのプロモーターの下流に、増幅したＡｐｓＧＬＤ遺伝子を結合させることで、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。この発現用プラスミドベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養して、集菌した菌体から、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ｐｌａｓｍｉｄ－ｐｒｅｐ ＭＩＮＩ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミド中のインサートの配列解析を行ったところ、ＡｐｓＧＬＤ遺伝子（配列番号１）が確認できた。
（６）形質転換体の取得
　（５）で抽出したプラスミドを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７－１３６９，１９９７）及び公知文献３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４－５０２、２０００）に記載の方法に準じて、ＡｐｓＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、公知文献２にあるように、１９９７年（平成９年）に醸造試験所で育種され、転写因子の解析、各種酵素の高生産株の育種などに利用され、現在は、独立行政法人酒類総合研究所（〒739-0046日本国広島県東広島市鏡山３－７－１）分譲されているものが入手可能である。
（７）組換えカビ由来ＡｐｓＧＬＤの確認
　パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１０ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、（６）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で４日間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のＧＬＤ活性測定法に準じ、プレートリーダーを用いてＧＬＤ活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して培養上清を回収し、分画分子量１０，０００の限外ろ過膜（ザルトリウス社製）で濃縮した。本サンプルを組換えＡｐｓＧＬＤサンプルとした。
［実施例３］
（Ｂ．Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　ＮＢＲＣ４４６４株由来ＧＬＤ（ＡｐｎＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＡｐｎＧＬＤ遺伝子のクローニング
　実施例２（１）～（３）に記載の方法に従って調製したＡ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　ＮＢＲＣ４４６４のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＡｐｎＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
　第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’－ＲＡＣＥ法及び３’－ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。最終的に下記のprimer-ApnF及びprimer-ApnRのプライマー対を用いてＰＣＲを行って、配列番号３に示す全鎖長１，７７０ｂｐのＡ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　ＮＢＲＣ４４６４株由来ＡｐｎＧＬＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号４に示した。
　尚、配列番号４記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号４記載のアミノ酸配列のうち、１～１５番目までの１５アミノ酸がシグナル配列と予測された。
primer-ApnF：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGTTGGGACTTGCTACCCTCGCCC-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-ApnR：5’-CGCTTCTAGAGCATGCTTAGTGACTGGCCTTGATGATATC-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
（２）ＡｐｎＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
　（１）で得られたＤＮＡ断片を鋳型として上記のprimer-ApnR及びprimer-GLD-Fのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＡｐｎＧＬＤ遺伝子を増幅した。実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅したＡｐｎＧＬＤ遺伝子を結合させることで、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、ＡｐｎＧＬＤ遺伝子（配列番号３）が確認できた。
（３）形質転換体の取得
　（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、ＡｐｎＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。
（４）組換えカビ由来ＡｐｎＧＬＤの確認
　実施例２の（７）に記載の方法に従い、ＡｐｎＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。実施例２の（７）に記載の方法に従い、培養液を限外ろ過で濃縮したサンプルを、組換えＡｐｎＧＬＤサンプルとした。
［実施例４］
（Ｃ．Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ　ｃａｕｌｉｖｏｒａ由来ＧＬＤ（ＫｃＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＫｃＧＬＤ遺伝子のクローニング
　実施例２（１）～（３）に記載の方法に従って調製したＫ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　ＮＢＲＣ４４６４のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＫｃＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
　第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’－ＲＡＣＥ法及び３’－ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。最終的に下記のprimer-KcF及びprimer-KcRのプライマー対を用いてＰＣＲを行って、配列番号５に示す全鎖長１，７７９ｂｐのＫ．ｃａｕｌｉｖｏｒａ　ＮＢＲＣ７３１４株由来ＫｃＧＬＤ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得した。当該遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を配列番号６に示した。
　尚、配列番号６記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号６記載のアミノ酸配列のうち、１～１６番目までの１６アミノ酸がシグナル配列と予測された。
primer-KcF：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGTTGGGACAAGTTGCTGCTCTCG-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-KcR：5’-CGCTTCTAGAGCATGCTTACAAGTGCTTGGCCTTGATGAG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
（２）ＫｃＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
　（１）で得られたＤＮＡ断片を鋳型として上記のprimer-KcR及びprimer-GLD-Fのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＫｃＧＬＤ遺伝子を増幅した。実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅したＫｃＧＬＤ遺伝子を結合させることで、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、ＫｃＧＬＤ遺伝子（配列番号５）が確認できた。
（３）形質転換体の取得
　（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、ＫｃＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。
（４）組換えカビ由来ＫｃＧＬＤの確認
　実施例２の（７）に記載の方法に従い、ＫｃＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。
（５）ＫｃＧＬＤの精製
　パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、（３）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で３日間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成に０．０１％リボフラビン（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、０．００５％クロラムフェニコール（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、消泡剤を添加した培地３．５Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、種培養液を５０ｍＬ植菌し、３０℃、４００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで３日間培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して培養上清を回収し、分画分子量８，０００の限外ろ過膜（ミリポア社製）で濃縮して粗酵素液とした。
　前記粗酵素液を、５０％飽和硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ６．０）になるように調整し、４℃で一晩放置後、遠心分離して上清を回収した。
　該上清を、５０％飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｃ（東ソー社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、１ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ－５００ｍ（チッソ社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換したサンプルを、組換えＫｃＧＬＤサンプルとした。該精製酵素の比活性は１，２００Ｕ／ｍｇだった。
［実施例５］
（Ｄ．Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ　ｚｅａｅ由来ＧＬＤ（ＫｚＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＫｚＧＬＤ遺伝子のクローニング
　実施例２（１）～（３）に記載の方法に従って調製したＫ．ｚｅａｅ　ＮＢＲＣ９６６４のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＫｚＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
　第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’－ＲＡＣＥ法及び３’－ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。最終的に下記のprimer-KzF及びprimer-KzRのプライマー対を用いてＰＣＲを行って、配列番号７に示す全鎖長１，７７６ｂｐのＫ．ｚｅａｅ　ＮＢＲＣ９６６４株由来ＫｚＧＬＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。当該遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を配列番号８に示した。
　尚、配列番号８記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号８記載のアミノ酸配列のうち、１～１６番目までの１６アミノ酸がシグナル配列と予測された。
primer-KzF：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGTTGGGTCAATTGGCCGCTCTCG-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-KzR：5’-CGCTTCTAGAGCATGCTTACTTGTGGCTAGCCTTGATGAG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
（２）ＫｚＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
　（１）で得られたＤＮＡ断片を鋳型として上記のprimer-KzR及びprimer-GLD-Fのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＫｚＧＬＤ遺伝子を増幅した。実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅したＫｚＧＬＤ遺伝子を結合させることで、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、ＫｚＧＬＤ遺伝子（配列番号７）が確認できた。
（３）形質転換体の取得
　（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、ＫｚＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。
（４）組換えカビ由来ＫｚＧＬＤの確認
　実施例２の（７）に記載の方法に従い、ＫｚＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。実施例２の（７）に記載の方法に従い、培養液を限外ろ過で濃縮したサンプルを、組換えＫｚＧＬＤサンプルとした。
［実施例６］
（Ｅ．Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｐ．Ｔ７９９株由来ＧＬＤ（Ｃｓ７ＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子のクローニング
　実施例２（１）～（３）に記載の方法に従って調製したＣ．ｓｐ．Ｔ７９９のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
　第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’－ＲＡＣＥ法及び３’－ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。最終的に下記のprimer-Cs7F及びprimer-Cs7Rのプライマー対を用いてＰＣＲを行って、配列番号９に示す全鎖長１，７６１ｂｐのＣ．ｓｐ．Ｔ７９９株由来Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得した。当該遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１０に示した。
　尚、配列番号１０記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号１０記載のアミノ酸配列のうち、１～１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。
primer-Cs7F：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGCTGCCACTGCTCGCGACTCTGG-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-Cs7R：5’-CGCTTCTAGAGCATGCCTAGTTGCACTGCTTAATGCGCTC-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
（２）Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
　（１）で得られたＤＮＡ断片を鋳型として上記のprimer-Cs7R及びprimer-GLD-Fのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子を増幅した。実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅したＣｓ７ＧＬＤ遺伝子を結合させることで、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子（配列番号９）が確認できた。
（３）形質転換体の取得
　（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、Ｃｓ７ＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。
（４）組換えカビ由来Ｃｓ７ＧＬＤの確認
　実施例２の（７）に記載の方法に従い、Ｃｓ７ＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。実施例２の（７）に記載の方法に従い、培養液を限外ろ過で濃縮したサンプルを、組換えＣｓ７ＧＬＤサンプルとした。
［実施例７］
（Ｆ．Ｆｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ　ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ由来ＧＬＤ（ＦｃＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＦｃＧＬＤ遺伝子のクローニング
　実施例２（１）～（３）に記載の方法に従って調製したＦ．ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ　ＮＢＲＣ９６４５のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、以下のＰＣＲを行った。
　第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’－ＲＡＣＥ法及び３’－ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。その結果、Ｆ．ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ　ＮＢＲＣ９６４５株由来ＦｃＧＬＤ遺伝子は、配列番号１１に示す全鎖長１，７６１ｂｐの塩基配列であることが分かった。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１２に示した。
　尚、配列番号１２記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号１２記載のアミノ酸配列のうち、１～１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。
（２）ＦｃＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
　（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-FcF及びprimer-FcR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、終止コドンをTAAに置換したＦｃＧＬＤ遺伝子を増幅した。次に前記ＰＣＲ産物を鋳型として下記のprimer-FcF及びprimer-FcR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プラスミド挿入用の断片を増幅した。続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、ＦｃＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、配列番号１１に記載の終止コドンをTAAに置換したＦｃＧＬＤ遺伝子が確認できた。
primer-FcF：5’-(CCGCAGCTCGTCAAA）ATGCTCCCGATCCTCGCGTCT-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-FcR1：5’-GTTCAT(TTA)GTGGCTCTCTTGAATGCG-3’
（括弧内：置換した終止コドン）
primer-FcR2：5’-GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCAT(TTA)GTGGCTCTC-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、括弧内：置換した終止コドン）
（３）形質転換体の取得
　（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、ＦｃＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。
（４）組換えカビ由来ＦｃＧＬＤの確認
　実施例２の（７）に記載の方法に従い、ＦｃＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。
（５）ＦｃＧＬＤの精製
　パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地１０ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、（４）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で３日間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成に０．０１％リボフラビン（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）を添加した培地５００ｍＬを２０００ｍＬ容坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、種培養液を１０ｍＬ植菌し、３０℃、１１０ｒｐｍで３日間振盪培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して培養上清を回収し、分画分子量８，０００の限外ろ過膜（ミリポア社製）で濃縮して粗酵素液とした。
　前記粗酵素液を５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ－５００ｍ（チッソ社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換したサンプルを、組換えＦｃＧＬＤサンプルとした。該精製酵素の比活性は１９０Ｕ／ｍｇだった。
［実施例８］
（Ｇ．Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｐ．Ｔ８０６由来ＧＬＤ（Ｃｓ８ＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）Ｃｓ８ＧＬＤ遺伝子のクローニング
　実施例２（１）～（３）に記載の方法に従って調製したＣ．ｓｐ．Ｔ８０６のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、以下のＰＣＲを行った。
　第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’－ＲＡＣＥ法及び３’－ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。その結果、Ｃ．ｓｐ．Ｔ８０６株由来Ｃｓ８ＧＬＤ遺伝子は、配列番号１３に示す全鎖長１，７６１ｂｐの塩基配列であることが分かった。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１４に示した。
　尚、配列番号１４記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ３．０によるシグナル配列予測を行い、配列番号１４記載のアミノ酸配列のうち、１～１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。
（２）Ｃｓ８ＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
　（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-Cs8F及びprimer-Cs8R1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、終止コドンをTAAに置換したＣｓ８ＧＬＤ遺伝子を増幅した。次に前記ＰＣＲ産物を鋳型として下記のprimer-Cs8F及びprimer-Cs8R2のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プラスミド挿入用の断片を増幅した。続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、Ｃｓ８ＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、配列番号１３に記載の終止コドンをTAAに置換したＣｓ８ＧＬＤ遺伝子が確認できた。
primer-Cs8F：5’-(CCGCAGCTCGTCAAA）ATGCTCCCAGTGCTCGCGTCT-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-Cs8R1：5’-GTTCAT(TTA)GTGGCTCTGCTGAATACG-3’
（括弧内：置換した終止コドン）
primer-Cs8R2：5’-((GTTACGCTTCTAGA))GCATGCGTTCAT(TTA)GTGGCTCTG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、括弧内：置換した終止コドン）
（３）形質転換体の取得
　（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、Ｃｓ８ＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。
（４）組換えカビ由来Ｃｓ８ＧＬＤの確認
　実施例２の（７）に記載の方法に従い、Ｃｓ８ＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。
［実施例９］
（Ｈ．Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ由来ＧＬＤ（ＣｃＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＣｃＧＬＤ遺伝子のクローニング
　実施例２（１）～（３）に記載の方法に従って調製したＣ．ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ　ＮＢＲＣ４４５９のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、以下のＰＣＲを行った。
　第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’－ＲＡＣＥ法及び３’－ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。その結果、Ｃ．ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ　ＮＢＲＣ４４５９株由来ＣｃＧＬＤ遺伝子は、配列番号１５に示す全鎖長１，７６１ｂｐの塩基配列であることが分かった。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１６に示した。
　尚、配列番号１６記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ３．０によるシグナル配列予測を行い、配列番号１６記載のアミノ酸配列のうち、１～１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。
（２）ＣｃＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクター１の調製
　（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-CcF及びprimer-CcR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、終止コドンをTAAに置換したＣｃＧＬＤ遺伝子１７６１ｂｐを含む配列を増幅した。次に前記ＰＣＲ産物を鋳型として下記のprimer-CcF及びprimer-CcR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プラスミド挿入用の断片を増幅した。続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、ＣｃＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、配列番号１５の終止コドンをTAAに置換したＣｃＧＬＤ遺伝子が確認できた。該遺伝子は終止コドン以外は野生型遺伝子のため、「野生型ＣｃＧＬＤ遺伝子」と呼ぶ。
primer-CcF：5’-(CCGCAGCTCGTCAAA）ATGCTCCCAATTATCGCGTCT-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-CcR1：5’-GTTCAT(TTA)GTGGCTCTGCTGAATGCGCTC-3’
（括弧内：置換した終止コドン）
primer-CcR2：5’-GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCAT(TTA)GTGGCTCTG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、括弧内：置換した終止コドン）
（３）ＣｃＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクター２の調製
　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来ＧＬＤのシグナル配列（Ａｏシグナル配列：配列番号６４）を用いて、成熟タンパクであるＣｃＧＬＤを菌体外に組換え生産するためのプラスミドベクターを調製した。詳細には、ＣｃＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域に、置換した改変遺伝子を挿入したプラスミドベクターを調製した。
　最初に、（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-A-CcF及び上記primer-CcR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＣｃＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を削除した。次に、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域を付加するために段階的にＰＣＲを行い、最終的に、primer-A-F及びprimer-CcR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。その結果、配列番号１５に記載の配列の内、１～５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した、プラスミド挿入用の断片を増幅した。
　続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、改変ＣｃＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行った。その結果、配列番号１５に記載の配列の内、１～５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した（配列番号６３記載の６６ｂｐの下流に、配列番号１５記載の５２～１７６０番目の１７０９ｂｐが融合し、最後がアデニンである）配列番号２４に記載の１７７６ｂｐの改変遺伝子が確認できた。該遺伝子を「改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子」と呼ぶ。
primer-A-CcF：5’-CCGGCTGGACGGGCCCATTCCACTCCCAGATACGAC-3’
（下線部：Ａｏシグナル配列コード領域）
primer-A-F：5’-(CCGCAGCTCGTCAAA)ATGCTCTTCTCACTGGCATTC-3’
（括弧内：転写増強因子、下線部：Ａｏシグナル配列コード領域）
（４）形質転換体の取得
　野生型ＣｃＧＬＤ遺伝子が挿入された（２）又は改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子が挿入された（３）のプラスミドをそれぞれ用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、野生型ＣｃＧＬＤ遺伝子又は改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子を含む組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）をそれぞれ作製した。得られたそれぞれの組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。
（５）組換えカビ由来ＣｃＧＬＤの確認
　実施例２の（７）に記載の方法に従い、それぞれの組換えカビ由来のＣｃＧＬＤの活性を測定したところ、野生型遺伝子由来ＣｃＧＬＤも改変型遺伝子由来ＣｃＧＬＤも、何れも本発明のＧＬＤ活性が確認でき、何れの組換えカビも同等の生産性であり、何れのＣｃＧＬＤも比活性は同等だった。
［実施例１０］
（Ｉ．Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｆｕｎｉｃｌｏｓｕｍ由来ＧＬＤ（ＣｆＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＣｆＧＬＤ遺伝子のクローニング
　実施例２（１）～（３）に記載の方法に従って調製したＣ．ｆｕｎｉｃｌｏｓｕｍ　ＮＢＲＣ６５３７のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、以下のＰＣＲを行った。
　第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’－ＲＡＣＥ法及び３’－ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。その結果、Ｃ．ｆｕｎｉｃｌｏｓｕｍ　ＮＢＲＣ６５３７株由来ＣｆＧＬＤ遺伝子は、配列番号１７に示す全鎖長１，７６１ｂｐの塩基配列であることが分かった。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１８に示した。
　尚、配列番号１８記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ３．０によるシグナル配列予測を行い、配列番号１８記載のアミノ酸配列のうち、１～１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。
（２）ＣｆＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来ＧＬＤのシグナル配列（Ａｏシグナル配列：配列番号６４）を用いて、成熟タンパクであるＣｆＧＬＤを菌体外に組換え生産するためのプラスミドベクターを調製した。詳細には、ＣｆＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域に、置換した改変遺伝子を挿入したプラスミドベクターを調製した。
　最初に、（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-A-CfF及びprimer-CfR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＣｆＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を削除した。次に、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域を付加するために段階的にＰＣＲを行い、最終的に、前記のprimer-A-F及び下記のprimer-CfR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。その結果、配列番号１７に記載の配列の内、１～５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した、プラスミド挿入用の断片を増幅した。
　続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、改変ＣｆＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行った。その結果、配列番号１７に記載の配列の内、１～５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した（配列番号６３記載の６６ｂｐの下流に、配列番号１７記載の５２～１７６０番目の１７０９ｂｐが融合し、最後がアデニンである）配列番号２６に記載の１７７６ｂｐの改変遺伝子が確認できた。該遺伝子を「改変型ＣｆＧＬＤ遺伝子」と呼ぶ。
primer-A-CfF：5’-CCGGCTGGACGGGCCCATTCCACTCCTAGATATGAC-3’
（下線部：Ａｏシグナル配列コード領域）
primer-CfR1：5’-GTTCAT(TTA)GTGACTGTGCTGAATACG-3’
（括弧内：置換した終止コドン）
primer-CfR2：5’-GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCAT(TTA)GTGACTGTG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、括弧内：置換した終止コドン）
（３）形質転換体の取得
　改変型ＣｆＧＬＤ遺伝子が挿入された（２）のプラスミドをそれぞれ用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、改変型ＣｆＧＬＤ遺伝子を含む組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。
（４）組換えカビ由来ＣｆＧＬＤの確認
　実施例２の（７）に記載の方法に従い、改変型遺伝子由来ＣｆＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認でき、該ＣｆＧＬＤは実施例９記載の野生型遺伝子由来ＣｃＧＬＤと同等の比活性だった。
［実施例１１］
（Ｊ．Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来ＧＬＤ（ＣｏＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＣｏＧＬＤ遺伝子のクローニング
　実施例２（１）～（３）に記載の方法に従って調製したＣ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ＮＢＲＣ３２５１１のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、以下のＰＣＲを行った。
　第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’－ＲＡＣＥ法及び３’－ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。その結果、Ｃ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ＮＢＲＣ３２５１１株由来ＣｏＧＬＤ遺伝子は、配列番号１９に示す全鎖長１，７６１ｂｐの塩基配列であることが分かった。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号２０に示した。
　尚、配列番号２０記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ３．０によるシグナル配列予測を行い、配列番号２０記載のアミノ酸配列のうち、１～１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。
（２）ＣｏＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクター１の調製
　（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-CoF及びprimer-CoR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、終止コドンをTAAに置換したＣｏＧＬＤ遺伝子１７６１ｂｐを含む配列を増幅した。次に前記ＰＣＲ産物を鋳型として下記のprimer-CoF及びprimer-CoR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プラスミド挿入用の断片を増幅した。続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、ＣｏＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、配列番号１９の終止コドンをTAAに置換したＣｏＧＬＤ遺伝子が確認できた。該遺伝子は終止コドン以外は野生型遺伝子のため、「野生型ＣｏＧＬＤ遺伝子」と呼ぶ。
primer-CoF：5’-(CCGCAGCTCGTCAAA）ATGCTCCCAGTGCTCGCGTCT-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-CoR1：5’-GTTCAT(TTA)GTGGCTCTGCTGAATACGCTC-3’
（括弧内：置換した終止コドン）
primer-CoR2：5’-GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCAT(TTA)GTGGCTCTG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、括弧内：置換した終止コドン）
（３）ＣｏＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクター２の調製
　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来ＧＬＤのシグナル配列（Ａｏシグナル配列：配列番号６４）を用いて、成熟タンパクであるＣｏＧＬＤを菌体外に組換え生産するためのプラスミドベクターを調製した。詳細には、ＣｏＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域に、置換した改変遺伝子を挿入したプラスミドベクターを調製した。
　最初に、（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-A-CoF及び上記primer-CoR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＣｏＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を削除した。次に、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域を付加するために段階的にＰＣＲを行い、最終的に、前記のprimer-A-F及び上記のprimer-CoR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。その結果、配列番号１９に記載の配列の内、１～５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した、プラスミド挿入用の断片を増幅した。
　続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、改変ＣｏＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行った。その結果、配列番号１９に記載の配列の内、１～５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した（配列番号６３記載の６６ｂｐの下流に、配列番号１９記載の５２～１７６０番目の１７０９ｂｐが融合し、最後がアデニンである）配列番号２８に記載の１７７６ｂｐの改変遺伝子が確認できた。該遺伝子を「改変型ＣｏＧＬＤ遺伝子」と呼ぶ。
primer-A-CoF：5’-CCGGCTGGACGGGCCCATTCTACTCCCAGATACGAC-3’
（下線部：Ａｏシグナル配列コード領域）
（４）形質転換体の取得
　野生型ＣｏＧＬＤ遺伝子が挿入された（２）又は改変型ＣｏＧＬＤ遺伝子が挿入された（３）のプラスミドをそれぞれ用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、野生型ＣｏＧＬＤ遺伝子又は改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子を含む組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）をそれぞれ作製した。得られたそれぞれの組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。
（５）組換えカビ由来ＣｏＧＬＤの確認
　実施例２の（７）に記載の方法に従い、それぞれの組換えカビ由来のＣｏＧＬＤの活性を測定したところ、野生型遺伝子由来ＣｏＧＬＤも改変型遺伝子由来ＣｏＧＬＤも、何れも本発明のＧＬＤ活性が確認でき、何れの組換えカビも同等の生産性であり、何れのＣｏＧＬＤも比活性は同等だった。
［実施例１２］
（Ｎ末端配列解析）
（１）ＡｐｓＧＬＤ
　実施例１に記載の精製ＡｐｓＧＬＤのＮ末端配列解析を実施した。その結果、成熟タンパクである該酵素のＮ末端のアミノ酸はＩＰＮＴＬであることが明らかになった。このことから、配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１～１６番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であり、成熟タンパクであるＡｐｓＧＬＤは配列番号２記載の１７～５９１番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有していると思われる。更に、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１の４９～１７７６番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。
　尚、該シグナル配列は、ＳｉｇｎａｌＰ４．１による予測と一致していた。
（２）ＫｃＧＬＤ
　実施例４に記載の精製ＫｃＧＬＤのＮ末端配列解析を実施した。その結果、成熟タンパクである該酵素のＮ末端のアミノ酸はＳＴＰＳＲであることが明らかになった。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号６記載のアミノ酸配列のうち、２４～５９２番目の５６９アミノ酸からなるアミノ酸配列であることが分かった。更に、配列番号６記載のアミノ酸配列のうち、１～２３番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であり、該シグナル配列は成熟タンパクとなる過程で切断されていることが分かった。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号５の７０～１７７６番目の１７０７塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であることが分かった。
　尚、該シグナル配列は、ＳｉｇｎａｌＰ４．１による予測より７アミノ酸長い配列であり、つまり予測のＮ末端は７アミノ酸が付加したＮ末端だった。
（３）ＦｃＧＬＤ
　実施例７に記載の精製ＦｃＧＬＤのＮ末端配列解析を実施した。その結果、成熟タンパクである該酵素のＮ末端のアミノ酸はＡＰＴＶＬであることが明らかになった。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号１２記載のアミノ酸配列のうち、１２～５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であることが分かった。更に、配列番号１２記載のアミノ酸配列のうち、１～１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であり、該シグナル配列は成熟タンパクとなる過程で切断されていることが分かった。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１１の３４～１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であることが分かった。
　尚、該シグナル配列は、ＳｉｇｎａｌＰ４．１による予測より６アミノ酸短い配列であり、つまり予測のＮ末端は６アミノ酸が欠失したＮ末端だった。
（４）ＡｐｎＧＬＤ
　（１）のＡｐｓＧＬＤ又は（２）のＫｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＡｐｎＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＡＰＮＴＬ又はＳＴＰＲＹと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号４記載のアミノ酸配列のうち、１６～５８９番目の５７４アミノ酸又は２３～５８９番目の５６７アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号４記載のアミノ酸配列のうち、１～１５番目又は１～２２番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号３の４６～１７６７番目の１７２２塩基又は配列番号３の６７～１７６７番目の１７０１塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。
（５）ＫｚＧＬＤ
　（１）のＡｐｓＧＬＤ又は（２）のＫｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＫｚＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＩＰＳＴＬ又はＨＩＡＲＹと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号８記載のアミノ酸配列のうち、１７～５９１番目の５７５アミノ酸又は２４～５９１番目の５６８アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号８記載のアミノ酸配列のうち、１～１６番目又は１～２３番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号７の４９～１７７３番目の１７２５塩基又は配列番号７の７０～１７７３番目の１７０４塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。
（６）Ｃｓ７ＧＬＤ
　（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＣｓ７ＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＶＰＡＳＬと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号１０記載のアミノ酸配列のうち、１２～５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号１０記載のアミノ酸配列のうち、１～１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号９の３４～１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。
（７）Ｃｓ８ＧＬＤ
　（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＣｓ８ＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＡＰＴＴＬと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号１４記載のアミノ酸配列のうち、１２～５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号１４記載のアミノ酸配列のうち、１～１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１３の３４～１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。
（８）ＣｃＧＬＤ
　（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＣｃＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＡＰＴＡＬと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号１６記載のアミノ酸配列のうち、１２～５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号１６記載のアミノ酸配列のうち、１～１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１５の３４～１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。
（９）ＣｆＧＬＤ
　（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＣｆＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＡＰＴＡＬと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号１８記載のアミノ酸配列のうち、１２～５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号１８記載のアミノ酸配列のうち、１～１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１７の３４～１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。
（１０）ＣｏＧＬＤ
　（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＣｏＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＡＰＴＡＬと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号２０記載のアミノ酸配列のうち、１２～５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号２０記載のアミノ酸配列のうち、１～１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１９の３４～１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。
（１１）改変型遺伝子由来ＧＬＤ
　（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、実施例９、１０及び１１で得られた改変型遺伝子由来ＧＬＤは、野生型遺伝子由来の成熟タンパク（野生型ＧＬＤ）と比べて、Ｎ末端の６アミノ酸が欠失した改変型ＧＬＤであると思われる。
　つまり、改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子は、組換え体から得られる成熟タンパクが、配列番号１６記載のアミノ酸配列のうち、１８～５８６番目の５６９アミノ酸になるように設計したため、成熟タンパクのアミノ酸配列は配列番号２５に示すとおりであって、Ｎ末端のアミノ酸はＨＳＴＰＲである。野生型ＣｃＧＬＤは１２～５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われるため、改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子由来ＧＬＤは、Ｎ末端の６アミノ酸が欠失した改変型ＣｃＧＬＤであると思われる。
　同様に、改変型ＣｆＧＬＤ遺伝子は、組換え体から得られる成熟タンパクが、配列番号１８記載のアミノ酸配列のうち、１８～５８６番目の５６９アミノ酸になるように設計したため、成熟タンパクのアミノ酸配列は配列番号２７に示すとおりであって、Ｎ末端のアミノ酸はＨＳＴＰＲである。野生型ＣｆＧＬＤは１２～５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われるため、改変型ＣｆＧＬＤ遺伝子由来ＧＬＤは、Ｎ末端の６アミノ酸が欠失した改変型ＣｆＧＬＤであると思われる。
　同様に、改変型ＣｏＧＬＤ遺伝子は、組換え体から得られる成熟タンパクが、配列番号２０記載のアミノ酸配列のうち、１８～５８６番目の５６９アミノ酸になるように設計したため、成熟タンパクのアミノ酸配列は配列番号２９に示すとおりであって、Ｎ末端のアミノ酸はＨＳＴＰＲである。野生型ＣｏＧＬＤは１２～５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われるため、改変型ＣｏＧＬＤ遺伝子由来ＧＬＤは、Ｎ末端の６アミノ酸が欠失した改変型ＣｏＧＬＤであると思われる。
　Ｎ末端が欠失した改変型ＧＬＤであっても、実施例９（５）、１０（４）及び１１（５）に示すように、野生型ＧＬＤと同じ活性を有し、組換えカビの生産性も同等であり、比活性も野生型ＧＬＤと同等だった。
［実施例１３］
（本発明のＧＬＤの酵素化学的性質の検討）
　実施例２～７で得られた各ＧＬＤの諸性質を調べた。
（１）吸収スペクトルの測定
　各ＧＬＤについて、Ｄ－グルコース添加前後の２００－７００ｎｍにおける吸収スペクトルをプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＰＬＵＳ ３８４、モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した結果、何れのＧＬＤについても、波長３６０－３８０ｎｍ付近及び波長４５０－４６０ｎｍ付近に認められた吸収極大が、Ｄ－グルコース添加により消失したことから、本発明のＧＬＤは何れもフラビン結合型タンパク質であることが明らかになった。
（２）グルコース酸化酵素（ＧＯＤ）活性の測定
　各ＧＬＤのＧＯＤ活性を調べた結果、何れのＧＬＤについてもＧＯＤ活性は見られなかった。よって、本発明のＧＬＤは酸素を電子受容体として利用しないため、Ｄ－グルコースを定量する際に反応系の溶存酸素の影響を受けにくいことが示された。ＧＯＤ活性は、以下の方法で測定した。１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．００ｍＬ、２５ｍＭ ４－アミノアンチピリン０．１０ｍＬ、４２０ｍＭフェノール０．１０ｍＬ、ペルオキシダーゼ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）０．１０ｍＬ、超純水０．６５ｍＬ、Ｄ－グルコース１．００ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から酵素反応の進行に伴う５００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量（ΔＡ５００）を測定し、式２に従いＧＯＤ活性を算出した。この際ＧＯＤ活性は、３７℃、ｐＨ７．０で、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
  
　尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．６６は本測定条件におけるモル吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）、０．５は１モルの過酸化水素の生成量に対するキノン型色素の生成量、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ５００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の５００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量、ｄｆは希釈倍率を表す。
（３）分子量
　各ＧＬＤの糖鎖切断前後の分子量を以下の方法で求めた。各ＧＬＤ溶液（各１．０ｍｇ／ｍｇに調製）５μＬと１％ＳＤＳ及び２％β―メルカプトエタノールを含む０．４Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５μＬを混合し、１００℃で３分間熱処理を行った。糖鎖切断処理として、熱処理後のサンプルにエンドグリコシダーゼＨ（ロシュ製）を１０μＬ（５０ｍＵ）添加し、３７℃で１８時間反応させた。糖鎖切断処理前後のサンプルをｅ－パジェル７．５％（アトー社製）を用いたＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動に供し、分子量マーカーより分子量を求めた。結果を図１に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
図１（Ａ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０－１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＡｐｓＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＡｐｓＧＬＤ糖鎖切断後
図１（Ｂ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０－１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＡｐｎＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＡｐｎＧＬＤ糖鎖切断後
図１（Ｃ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０－１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＫｃＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＫｃＧＬＤ糖鎖切断後
図１（Ｄ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０－１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＫｚＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＫｚＧＬＤ糖鎖切断後
図１（Ｅ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０－１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：Ｃｓ７ＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：Ｃｓ７ＧＬＤ糖鎖切断後
図１（Ｆ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０－１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＦｃＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＦｃＧＬＤ糖鎖切断後
　図１より、糖鎖切断前の各ＧＬＤについて、ＡｐｓＧＬＤの分子量は１００～１１５ｋＤａ、ＡｐｎＧＬＤの分子量は９５～１２０ｋＤａ、ＫｃＧＬＤの分子量は８５～１１５ｋＤａ、ＫｚＧＬＤの分子量は９５～１１５ｋＤａ、Ｃｓ７ＧＬＤの分子量は９０～１０５ｋＤａ、ＦｃＧＬＤの分子量は８５～１１０ｋＤａであり、糖鎖切断後の分子量は、何れも６０～７０ｋＤａだった。
（４）基質特異性
　前記活性測定法に準じ、基質にＤ－グルコース、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－フルクトース、ソルビトール、ラクトース、スクロース、Ｄ－キシロース、Ｄ－マンノース及びトレハロースをそれぞれ用いて、各基質に対する各ＧＬＤの活性を測定した。Ｄ－グルコースに対する活性を１００％として、各基質の相対活性を算出した結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明のＧＬＤは、Ｄ－グルコースに対する活性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する反応性が１０％以下で、更にＤ－フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性は１％以下であった。
（５）至適温度の範囲
　前記活性測定法に準じ、種々の温度にて各ＧＬＤの活性を測定した。基質の終濃度は１０ｍＭ及び５０ｍＭとした。結果を図２に示す（図２（Ａ）はＡｐｓＧＬＤ、図２（Ｂ）はＡｐｎＧＬＤ、図２（Ｃ）はＫｃＧＬＤ、図２（Ｄ）はＫｚＧＬＤ、図２（Ｅ）はＣｓ７ＧＬＤ、図２（Ｆ）はＦｃＧＬＤを示す）。具体的には、基質の終濃度が１０ｍＭの場合、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ Ｄ－グルコース溶液０．０３ｍＬ、超純水１．５８ｍＬ、３ｍＭ ＤＣＩＰ０．１４ｍＬ及び３ｍＭ １－ｍ－ＰＭＳ０．２０ｍＬを混合し、基質の終濃度が５０ｍＭの場合、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ Ｄ－グルコース溶液０．１５ｍＬ、超純水１．４６ｍＬ、３ｍＭ ＤＣＩＰ０．１４ｍＬ及び３ｍＭ １－ｍ－ＰＭＳ０．２０ｍＬを混合し、何れの基質の終濃度の場合も３７℃で保温する代わりに各温度で１０分間保温し、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、各温度にて反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を測定し、直線部分から前記式１に従いＧＬＤ活性を算出した。その結果、各ＧＬＤが最大活性を示す温度における活性値を１００％とした場合に、基質濃度１０ｍＭでは、ＡｐｓＧＬＤは３０～４０℃で８０％以上、ＡｐｎＧＬＤは３０～４０℃で８０％以上、ＫｃＧＬＤは３０℃で８０％以上、ＫｚＧＬＤは２０～３０℃で８０％以上、Ｃｓ７ＧＬＤは３０℃で８０％以上、ＦｃＧＬＤは３０～４０℃で８０％以上の相対活性で、基質濃度５０ｍＭでは、ＡｐｓＧＬＤは４０℃で８０％以上、ＡｐｎＧＬＤは３０～４０℃で８０％以上、ＫｃＧＬＤは３０～４０℃で８０％以上、ＫｚＧＬＤは３０℃で８０％以上、Ｃｓ７ＧＬＤは３０～４０℃で８０％以上、ＦｃＧＬＤは３０～４０℃で８０％以上の相対活性で、何れの基質濃度においても、ＡｐｓＧＬＤは４０℃で８０％以上、ＡｐｎＧＬＤは３０～４０℃で８０％以上、ＫｃＧＬＤは３０℃で８０％以上、ＫｚＧＬＤは３０℃で８０％以上、Ｃｓ７ＧＬＤは３０℃で８０％以上、ＦｃＧＬＤは３０～４０℃で８０％以上の相対活性であった。以上から、本発明のＧＬＤの至適温度は、最大活性を示す温度における活性値を１００％とした場合に、基質濃度１０ｍＭでは３０℃、基質濃度５０ｍＭでは３０又は４０℃で相対活性値が８０％以上であった。
（６）温度特性
　前記活性測定法に準じ、各温度にて各ＧＬＤの活性を測定した。基質の終濃度は１０ｍＭ及び５０ｍＭとした。３０℃を１００％とした時の各温度の相対活性を表２に示した。その結果、３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０～４０℃における活性値の範囲は、基質濃度１０ｍＭでは、ＡｐｓＧＬＤは５３．０～１１１％、ＡｐｎＧＬＤは６２．１～１０６％、ＫｃＧＬＤは５２．０～１００％、ＫｚＧＬＤは５８．４～１００％、Ｃｓ７ＧＬＤは５５．１～１００％、ＦｃＧＬＤは５１．６～１１２％で、基質濃度５０ｍＭでは、ＡｐｓＧＬＤは５０．９～１３６％、ＡｐｎＧＬＤは５５．９～１１９％、ＫｃＧＬＤは５０．４～１００％、ＫｚＧＬＤは５６．７～１００％、Ｃｓ７ＧＬＤは５５．２～１００％、ＦｃＧＬＤは５１．５～１１７％であった。
　以上から、本発明のＧＬＤは、３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０～４０℃における活性値の範囲が２０～１５０％であり、３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０℃における活性値が２０％以上、２０℃における活性値が４０％以上であることがわかった。よって、本発明のＧＬＤは何れも広い温度範囲で活性の変動が少ない酵素である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（８）ｐＨ安定性
　ＦｃＧＬＤを６Ｕ／ｍＬに調製し、終濃度が１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（図中ひし形印でプロット）、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（図中四角印でプロット）、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（図中黒丸印でプロット）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（図中三角印でプロット）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（図中白丸印でプロット）又は１００ｍＭグリシン－ＮａＯＨ緩衝液（図中×でプロット）になるように各緩衝液を添加し、３０℃で１時間処理した後、前記酵素活性測定方法で酵素活性を測定した。酵素活性の残存率を算出し、安定ｐＨとして図４に示した。
　その結果、ＦｃＧＬＤが最も安定だったｐＨの緩衝液で処理した酵素の活性を１００％とした場合に、ｐＨ５．０～７．５で８０％以上、ｐＨ４．０～８．０で６０％以上の残存活性だった。尚、同じｐＨであっても緩衝液の種類によって残存活性は異なり、リン酸カリウム緩衝液は、ｐＨが７付近又はアルカリ側で、同じｐＨの他の緩衝液に比べ、安定性が低い傾向がみられた。
（９）グルコースに対するＫｍ値
　前記活性測定法に準じ、基質であるＤ－グルコース濃度を変化させて、各ＧＬＤの活性を測定した。５、１５、２５及び５０ｍＭの各グルコース濃度における活性測定値からＨａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆプロットによりミカエリス定数（Ｋｍ値）を求めた結果、ＡｐｓＧＬＤは８．７８ｍＭ、ＡｐｎＧＬＤは１１．５ｍＭ、ＫｃＧＬＤは２１．６ｍＭ、ＫｚＧＬＤは３７．３ｍＭ、Ｃｓ７ＧＬＤは１３．０ｍＭ、ＦｃＧＬＤは１６．８ｍＭだった。尚、Ｋｍ値は、測定方法や算出するプロットによって値が変動し易いため、ＡｐｓＧＬＤは約５～２０ｍＭ、ＡｐｎＧＬＤは約５～２０ｍＭ、ＫｃＧＬＤは約１０～５０ｍＭ、ＫｚＧＬＤは約１０～６０ｍＭ、Ｃｓ７ＧＬＤは約５～３０ｍＭ、ＦｃＧＬＤは約５～３０ｍＭと考えられる。
［実施例１４］
（本発明のＧＬＤによるグルコースの測定）
　本発明のＧＬＤを用いて、前記活性測定法におけるＤ－グルコースの濃度を０．３ｍＭ（５．５ｍｇ／ｄＬ）～５０ｍＭ（９００ｍｇ／ｄＬ）の範囲に変化させて、吸光度変化を測定した。結果を図３に示す（図３（Ａ）はＡｐｓＧＬＤ、図３（Ｂ）はＡｐｎＧＬＤ、図３（Ｃ）はＫｃＧＬＤ、図３（Ｄ）はＫｚＧＬＤ、図３（Ｅ）はＣｓ７ＧＬＤ、図３（Ｆ）はＦｃＧＬＤを示す）。その結果、何れの本発明のＧＬＤにおいても、９００ｍｇ／ｄLまでのＤ－グルコースを測定できた。これより、本発明のＧＬＤを用いたＤ－グルコースの定量が可能であることが示された。
［実施例１５］
　本発明の各ＧＬＤのアミノ酸配列同士（配列番号２：ＡｐｓＧＬＤ、４：ＡｐｎＧＬＤ、６：ＫｃＧＬＤ、８：ＫｚＧＬＤ、１０：Ｃｓ７ＧＬＤ、１２：ＦｃＧＬＤ、１４：Ｃｓ８ＧＬＤ、１６：ＣｃＧＬＤ、１８：ＣｆＧＬＤ及び２０：ＣｏＧＬＤ）をＧＥＮＥＴＹＸのホモロジー検索により比較して、Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ％の数値を類似性％として表３にまとめ、ｉｄｅｎｔｉｔｙ％の数値を同一性％として表４にまとめた。
　更に、本発明の各ＧＬＤの塩基配列同士（配列番号１：ＡｐｓＧＬＤ、３：ＡｐｎＧＬＤ、５：ＫｃＧＬＤ、７：ＫｚＧＬＤ、９：Ｃｓ７ＧＬＤ、１１：ＦｃＧＬＤ、１３：Ｃｓ８ＧＬＤ、１５：ＣｃＧＬＤ、１７：ＣｆＧＬＤ及び１９：ＣｏＧＬＤ）をＧＥＮＥＴＹＸのホモロジー検索により比較して、ｉｄｅｎｔｉｔｙ％の数値を同一性％として表５にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表３の結果より、本願では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０の配列と、類似性がそれぞれ少なくとも９０％のアミノ酸配列であり且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得できたことが確認できた。
　表４の結果より、本願では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０の配列と、同一性がそれぞれ少なくとも６０％のアミノ酸配列であり且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得できたことが確認できた。
　表５の結果より、本願では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９の配列と、同一性がそれぞれ少なくとも６０％の塩基配列であり且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得できたことが確認できた。

Claims (14)

  1. 　下記の性質（１）～（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    （１）作用：電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す；
    （２）基質特異性：Ｄ－グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である；
    （３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０～４０℃における活性値の範囲が２０～１５０％である。
  2. 　酵素タンパクのポリペプチドの分子量が６０～７０ｋＤａである請求項１記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
  3. 　至適温度が３０～４０℃である請求項１又は２記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
  4. 　糸状菌由来である請求項１～３の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
  5. 　クロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する糸状菌由来である請求項１～４の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
  6. 　糸状菌に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする請求項１～５の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
  7. 　グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなるグルコースデヒドロゲナーゼ：
    （ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
    （ｂ）配列番号２の１７～５９１番目、配列番号４の１６～５８９番目、配列番号６の２４～５９２番目、配列番号８の１７～５９１番目、配列番号１０の１８～５８６番目、配列番号１２の１８～５８６番目、配列番号１４の１８～５８６番目、配列番号１６の１８～５８６番目、配列番号１８の１８～５８６番目又は配列番号２０の１８～５８６番目に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
    （ｃ）（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  8. 以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）からなるポリヌクレオチド：
    （ｅ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
    （ｆ）配列番号１の４９～１７７３番目、配列番号３の４６～１７６７番目、配列番号５の７０～１７７６番目、配列番号７の４９～１７７３番目、配列番号９の位置５２～１７５８番目、配列番号１１の５２～１７５８番目、配列番号１３の５２～１７５８番目、配列番号１５の５２～１７５８番目、配列番号１７の５２～１７５８番目又は配列番号１９の５２～１７５８番目に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
    （ｇ）（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    （ｈ）（ａ）～（ｃ）に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  9. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  10. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞。
  11. 請求項１０に記載の細胞を培養し、培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
  12. 被検試料と請求項１～５若しくは請求項７の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は請求項６若しくは請求項１１に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを使用するグルコースの測定方法。
  13. 　請求項１～５若しくは請求項７の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は請求項６若しくは請求項１１に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを含有するグルコース測定試薬。
  14. 請求項１～５若しくは請求項７の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は請求項６若しくは請求項１１に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを使用するグルコース測定用バイオセンサ。
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