JPWO2015141761A1 - フラビン結合型グルコース脱水素酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]以下の(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素:
(a)配列番号2、3、5、6、8又は9に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2、3、5、6、8又は9に示されるアミノ酸配列において1又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号2もしくは3に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性、配列番号5もしくは6に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性又は配列番号8もしくは9に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列。
[2]以下の性質を有する、[1]に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素:
(1)作用:電子受容体存在下で、グルコースの1位の水酸基を酸化する;
(2)可溶性である;
(3)グルコースに対する作用性を100%とした場合に、マルトースに対する作用性が多くとも1.5%である;
(4)酵素のポリペプチドの分子量が60〜70kDaである;及び
(5)pH3.8で安定である。
[3](6)ペニシリウム属に属する微生物由来である、[1]又は[2]記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
[4]以下の(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)からなるポリヌクレオチド:
(i)[1]記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(ii)配列番号1、4又は7に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド;
(iii)配列番号1、4又は7に示される塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(iv)配列番号1、4又は7に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(v)配列番号1、4又は7に示される塩基配列と少なくとも80%の同一性を有する塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[5]ペニシリウム属に属する微生物由来である、[4]に記載のポリヌクレオチド。
[6][4]又は[5]に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
[7][6]に記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
[8][7]に記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
[9][8]の製造方法によって得られたフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
[10][1]〜[3]及び[9]の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用するグルコースの測定方法。
[11][1]〜[3]及び[9]の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物。
[12][1]〜[3]及び[9]の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ。
(a)配列番号2、3、5、6、8又は9に示されるアミノ酸配列。
(b)配列番号2、3、5、6、8又は9に示されるアミノ酸配列において1又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。変異数は、好ましくは多くとも60個、55個、50個、40個、30個、20個、15個、10個、5個、3個又は2個である。
(c)配列番号2、3、5、6、8又は9に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、90%、92%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列。
該酵素は、好ましくは(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。
(1)作用:電子受容体存在下で、グルコースの1位の水酸基を酸化する酵素である。
(2)可溶性である。
(i)前記(a)、(b)及び(c)に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。(ii)配列番号1、4又は7に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
(iii)配列番号1、4又は7に示される塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。変異数は、好ましくは多くとも10個、8個、5個、3個又は2個である。
(iv)配列番号1、4又は7に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(v)配列番号1、4又は7に示される塩基配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)1.00mL、1M D−グルコース溶液1.00mL、3mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(以下DCIPという)0.14mL及び3mM 1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェイト0.20mL及び超純水0.61mLを混合し、37℃で10分間保温後、酵素溶液0.05mLを添加し、反応を開始した。反応開始時から5分間、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)を測定し、直線部分から次式に従い酵素活性を算出した。この際、酵素活性は、37℃、pH6.0で1分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を1Uと定義した。
尚、式中の3.0は反応試薬+酵素溶液の液量(mL)、10.8はpH6.0におけるDCIPのモル吸光係数、1.0はセルの光路長(cm)、0.05は酵素溶液の液量(mL)、ΔA600blankは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量を表す。
(フラビン結合型グルコース脱水素酵素(GLD)の取得)
自然界から分離した菌株からGLD生産菌の探索を行った結果、3菌株の培養上清にGLD活性が確認できた。該菌株を同定した結果、ペニシリウム・スクレロチオルム、ペニシリウム・パネウム及びペニシリウム・ジャンチネルムだった。これらのGLD生産菌由来の各酵素のクローニングを行った。
パインデックス2%(松谷化学工業社製)(w/v)、トリプトン1%(BD社製)(w/v)、リン酸二水素カリウム0.5%(ナカライテスク社製)(w/v)、硫酸マグネシウム七水和物0.05%(w/v)(ナカライテスク社製)及び水からなる液体培地150mLを500mL容の坂口フラスコ3本に各々入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した各液体培地に、前記GLD生産菌を各々接種し、25℃で72時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を各々回収した。
(1)で取得した各湿菌体200mgを−80℃で凍結した後、ISOGENII(ニッポンジーン社製)を用いて各100μgの全RNAを抽出した。
(2)で取得した各RNAから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴdTプライマーを用いた逆転写反応により各cDNAライブラリーを調製した。反応試薬は、「SMARTer RACE cDNA Amplification kit」(タカラバイオ社製)を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。
(3)で取得した各cDNAライブラリーを鋳型とし、GLD遺伝子取得用プライマー対を用いてPCRを行った。その結果、何れもGLD遺伝子の内部配列と思われるPCR産物が確認された。尚、前記プライマー対は、本発明者らによって既に解明されていた複数のGLD配列を基に、種々のGLD遺伝子取得用に設計したプライマーである。前記PCR産物を各々精製し、DNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いて、T−vector PMD20(タカラバイオ社製)にライゲーションした。
公知文献1(Aspergillus属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、38、12、831−838、2000)に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最初に、(3)で取得した各cDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行い、各GLD遺伝子を含むPCR産物を取得した。PsGLD遺伝子の増幅には、ペニシリウム・スクレロチオルム由来のcDNAを鋳型として下記のS158-Ori(配列番号10)及びS158-R-1st(配列番号11)のプライマー対を使用した。PpGLD遺伝子の増幅には、ペニシリウム・パネウム由来のcDNAを鋳型として下記のS1268-A.o(配列番号13)及びS1268-R-1st(配列番号14)のプライマー対を使用した。PjGLD遺伝子の増幅には、ペニシリウム・ジャンチネルム由来のcDNAを鋳型として下記のT475-Ori(配列番号16)及びT475-R-1st(配列番号17)のプライマー対を使用した。次に、前記各PCR産物を鋳型としてPCRを行い、ベクター挿入用の各GLD遺伝子を調製した。PsGLD遺伝子の調製には、PsGLD遺伝子を含むPCR産物を鋳型としてS158-Ori(配列番号10)及びS158-R-2nd(配列番号12)のプライマー対を使用した。PpGLD遺伝子の調製には、PpGLD遺伝子を含むPCR産物を鋳型としてS1268-A.o(配列番号13)及びS1268-R-2nd(配列番号15)のプライマー対を使用した。PjGLD遺伝子の調製には、PjGLD遺伝子を含むPCR産物を鋳型としてT475-Ori(配列番号16)及びT475-R-2nd(配列番号18)のプライマー対を使用した。
(括弧内:転写増強因子)
S158-R-1st(配列番号11):5’− ((GTTCATTTA))GATCTTTCCCTTGATAATGTC−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列)
S158-R-2nd(配列番号12):5’− ((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))GATCTTTCCC−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列、下線部:制限酵素部位(SphI))
S1268-A.o(配列番号13):5’−CCGGCTGGACGGGCCGTTCCCCATGCCTCACACAAG−3’
S1268-R-1st(配列番号14):5’−((GTTCATTTA))GTAGCACGCCTTGATGATAT−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列)
S1268-R-2nd(配列番号15):5’−((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))GTAGCACGC−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列、下線部:制限酵素部位(SphI))
T475-Ori(配列番号16):5’−(CCGCAGCTCGTCAAA)ATGCTGGTCCCCAAGACTC−3’
(括弧内:転写増強因子)
T475-R-1st(配列番号17):5’−((GTTCATTTA))AACGCTTCCAGCCTTGATC−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列)
T475-R-2nd(配列番号18):5’−((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))AACGCTTCCA−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列、下線部:制限酵素部位(SphI))
(5)で抽出した各プラスミドベクターを用いて、公知文献2(Biosci. Biotech. Biochem.,61(8),1367−1369,1997)及び公知文献3(清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、494−502、2000)に記載の方法に準じて、各GLDを生産する各組換えカビ(アスペルギルス・オリゼ)を作製した。得られた各組換え株をCzapek−Dox固体培地で純化した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼNS4株を使用した。本菌株は、公知文献2にあるように、1997年(平成9年)に醸造試験所で育種され、現在は、独立行政法人酒類総合研究所で分譲されているものが入手可能である。
パインデックス2%(松谷化学工業社製)(w/v)、トリプトン1%(BD社製)(w/v)、リン酸二水素カリウム0.5%(ナカライテスク社製)(w/v)、硫酸マグネシウム七水和物0.05%(w/v)(ナカライテスク社製)及び水からなる液体培地10mLを太試験管(22mm×200mm)3本に各々入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した各液体培地に、(6)で取得した各形質転換体を各々植菌し、30℃で4日間振とう培養した。培養終了後、遠心して各上清を回収し、前述のGLD活性測定法に準じ、プレートリーダーを用いてGLD活性を測定したところ、何れも本発明のGLD活性が確認できた。
(8−1)粗酵素液の取得
(7)に記載の液体培地150mLを500mL容の坂口フラスコ3本に入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した各液体培地に、(6)で取得した各形質転換体を各々植菌し、30℃で3日間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成に0.005%クロラムフェニコール(ナカライテスク社製)(w/v)、消泡剤を添加した培地3.5Lを5L容ジャーファーメンター3基に入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した各液体培地に、前記種培養液を各50mL植菌し、30℃、400rpm、1v/v/mで4日間培養した。培養終了後、各培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター(10μm、アドバンテック社製)でろ過して各培養上清を回収した。回収した各培養上清を、分画分子量10,000の限外ろ過膜(ミリポア社製)で濃縮して、PsGLD、PpGLD及びPjGLDの各粗酵素液とした。
(8−1)で取得したPsGLDの粗酵素液を、60%飽和硫酸アンモニウム溶液(pH6.0)になるように調整し、4℃で一晩放置後、遠心分離して上清を回収した。該上清を、60%飽和硫酸アンモニウムを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)で予め平衡化したTOYOPEARL Butyl−650C(東ソー社製)カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量10,000の限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、1mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)と平衡化させた。同緩衝液で予め平衡化したDEAEセルロファインA−500m(チッソ社製)カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から200mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量8,000の限外ろ過膜で濃縮後、水置換したサンプルを、精製PsGLDサンプルとした。
(8−1)で取得したPpGLDの粗酵素液を、60%飽和硫酸アンモニウム溶液(pH6.0)になるように調整し、4℃で一時間放置後、遠心分離して上清を回収した。該上清を、60%飽和硫酸アンモニウムを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)で予め平衡化したTOYOPEARL Butyl−650C(東ソー社製)カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から20%飽和硫酸アンモニウムを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量10,000の限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、1mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)と平衡化させた。同緩衝液で予め平衡化したDEAEセルロファインA−500m(チッソ社製)カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から150mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量8,000の限外ろ過膜で濃縮後、水置換したサンプルを、精製PpGLDサンプルとした。
(8−1)で取得したPjGLDの粗酵素液を5mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)と平衡化させ、同緩衝液で予め平衡化したDEAEセルロファインA−500m(チッソ社製)カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを10mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)で洗浄した後、同緩衝液から100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量8,000の限外ろ過膜で濃縮後、水置換したサンプルを、精製PjGLDサンプルとした。
(本発明のGLDの酵素化学的性質の検討)
実施例1で得られた各精製GLDの諸性質を調べた。
(1)吸収スペクトルの測定
本発明のGLDについて、D−グルコース添加前後の200−700nmにおける吸収スペクトルをプレートリーダー(SPECTRA MAX PLUS 384、モレキュラーデバイス社製)を用いて測定した。その結果、何れのGLDにおいても、波長360−380nm付近及び波長450−460nm付近に認められた吸収極大が、D−グルコース添加により消失したことから、本発明のGLDはフラビン結合型タンパク質であることが明らかになった。
本発明のGLDのGOD活性を調べた結果、何れのGLDにおいても、GOD活性は見られなかった。よって、本発明のGLDは酸素を電子受容体として利用しないため、D−グルコースを定量する際に反応系の溶存酸素の影響を受けにくいことが示された。GOD活性は、以下の方法で測定した。
尚、式中の3.0は反応試薬+酵素溶液の液量(mL)、10.66は本測定条件におけるキノン型色素のモル吸光係数、0.5は1モルの過酸化水素の生成量に対するキノン型色素の生成量、1.0はセルの光路長(cm)、0.05は酵素溶液の液量(mL)、ΔA500blankは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の反応開始した場合の500nmにおける吸光度の1分間あたりの増加量を表す。
前記GLD活性測定法に準じ、基質に終濃度50mMのD−グルコース、マルトース又はD−キシロースをそれぞれ用いて、各基質に対する各GLDの活性を測定した。結果を表1に示す。
前記GLD活性測定法に準じ、基質であるD−グルコース濃度を変化させて、各GLDの活性測定を行った。PsGLDは10、20、40及び60mMの各グルコース濃度で、PpGLDは5、10、20及び50mMの各グルコース濃度で、PjGLDは1、2、5及び10mMの各グルコース濃度で測定した。各活性測定値からHanes−Woolfプロットによりミカエリス定数(Km値)を求めた。
その結果、各GLDのD−グルコースに対するKm値は、PsGLDが14mM、PpGLDが3.3mM、PjGLDが3.6mMだった。よって、本発明のGLDのKm値は約1.0〜25mMと考えられる。
各GLDの終濃度が6U/mL、各緩衝液の終濃度が100mMになるように混合し、30℃で1時間処理した後、前記GLD活性測定法で酵素活性を測定した。緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液(図中ひし形印でプロット)、クエン酸ナトリウム緩衝液(図中四角印でプロット)、リン酸ナトリウム緩衝液(図中黒丸印でプロット)、リン酸カリウム緩衝液(図中三角印でプロット)、トリス塩酸緩衝液(図中白丸印でプロット)又はグリシン−NaOH緩衝液(図中×でプロット)を使用した。処理前の酵素活性を100%として、処理後の残存活性を相対値で算出し、pH安定性として図に示した。
その結果、PsGLDの相対活性はpH3.5〜6.8で少なくとも80%、PpGLDの相対活性はpH3.5〜6.7で少なくとも70%及びpH3.5〜6.2で少なくとも80%、PjGLDの相対活性はpH3.8〜7.4で少なくとも80%だった。本発明のGLDは酸性域で安定と思われた。
前記GLD活性測定法に準じ、25℃又は37℃にて各GLDの活性を測定した。基質の終濃度は50mMとした。
その結果、各GLDの37℃における活性を100%とした場合に、25℃における各GLDの相対活性は、PsGLDが少なくとも70%、PpGLDが少なくとも70%、PjGLDが少なくとも50%だった。
前記GLD活性測定法に準じ、1〜60mMの各グルコース濃度で各GLDの活性測定を行い、各GLDの測定値を、相対活性で図1に示した。
その結果、本発明のGLDでD−グルコースの定量が可能であることが示された。
Claims (12)
- 以下の(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素:
(a)配列番号2、3、5、6、8又は9に示されるアミノ酸配列;、
(b)配列番号2、3、5、6、8又は9に示されるアミノ酸配列において1又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号2もしくは3に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性、配列番号5もしくは6に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性又は配列番号8もしくは9に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列。 - 以下の性質を有する、請求項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素:
(1)作用:電子受容体存在下で、グルコースの1位の水酸基を酸化する;
(2)可溶性である;
(3)グルコースに対する作用性を100%とした場合に、マルトースに対する作用性が多くとも1.5%である;
(4)酵素のポリペプチドの分子量が60〜70kDaである;及び
(5)pH3.8で安定である。 - (6)ペニシリウム属に属する微生物由来である、請求項1又は2記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
- 以下の(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)からなるポリヌクレオチド:
(i)請求項1記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(ii)配列番号1、4又は7に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド;
(iii)配列番号1、4又は7に示される塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(iv)配列番号1、4又は7に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(v)配列番号1、4又は7に示される塩基配列と少なくとも80%の同一性を有する塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - ペニシリウム属に属する微生物由来である、請求項4記載のポリヌクレオチド。
- 請求項4又は5記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項6記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
- 請求項7記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
- 請求項8記載の製造方法によって得られたフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
- 請求項1〜3又は9の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用するグルコースの測定方法。
- 請求項1〜3又は9の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物。
- 請求項1〜3又は9の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ。
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