WO2015141761A1 - フラビン結合型グルコース脱水素酵素 - Google Patents

フラビン結合型グルコース脱水素酵素 Download PDF

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WO2015141761A1
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glucose dehydrogenase
seq
amino acid
glucose
flavin
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PCT/JP2015/058171
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高史 宅見
みづき 重白
佐藤　大祐
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池田食研株式会社
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
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    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a glucose dehydrogenase, a polynucleotide encoding the enzyme, a method for producing the enzyme, a method for measuring glucose using the enzyme, a measuring reagent composition, a biosensor, and the like.
  • Measurement of glucose (blood glucose) concentration in blood is mainly important in blood glucose control of diabetic patients.
  • biosensors are widely used as blood glucose measurement devices using enzymes.
  • Glucose oxidase and glucose dehydrogenase are known as enzymes that can be used in biosensors.
  • glucose oxidase has a problem that measurement errors occur due to dissolved oxygen in the blood.
  • glucose dehydrogenases flavin-binding glucose dehydrogenases derived from eukaryotic cells are not affected by dissolved oxygen, do not require the addition of coenzymes, and are excellent in substrate specificity. It is useful as an enzyme for use (Patent Documents 1 to 6).
  • the present invention provides a novel glucose dehydrogenase, a polynucleotide encoding the enzyme, a method for producing the enzyme, a method for measuring glucose using the enzyme, a measurement reagent composition, and a biosensor. Furthermore, it aims at providing the manufacturing method of a measuring reagent composition, and the manufacturing method of a biosensor.
  • the inventors searched for glucose dehydrogenases derived from various microorganisms, and found a novel flavin-binding glucose dehydrogenase from microorganisms belonging to the genus Penicillium. Furthermore, they found an efficient method for producing flavin-binding glucose dehydrogenase and completed the present invention.
  • a flavin-binding glucose dehydrogenase comprising a protein having the following amino acid sequence (a), (b) or (c) and having glucose dehydrogenase activity: (A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, or 9; (B) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8 or 9; (C) at least 85% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3, at least 95% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or 9 Amino acid sequence having at least 80% identity.
  • the flavin-binding glucose dehydrogenase according to [1] having the following properties: (1) Action: Oxidizes the hydroxyl group at the 1-position of glucose in the presence of an electron acceptor; (2) soluble; (3) When the activity on glucose is 100%, the activity on maltose is at most 1.5%; (4) the molecular weight of the polypeptide of the enzyme is 60-70 kDa; and (5) stable at pH 3.8. [3] (6) The flavin-binding glucose dehydrogenase according to [1] or [2], which is derived from a microorganism belonging to the genus Penicillium.
  • a polynucleotide comprising the following (i), (ii), (iii), (iv) or (v): (I) a polynucleotide encoding the protein according to [1]; (Ii) a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4 or 7; (Iii) Poly encoding a protein having a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4 or 7 and having glucose dehydrogenase activity nucleotide; (Iv) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, or 7 under a stringent condition and encodes a protein having glucose dehydrogenase activity; (V) a polynucleotide encoding a protein having a base sequence having at least 80% identity with the base sequence shown
  • [10] A method for measuring glucose using the flavin-binding glucose dehydrogenase according to any one of [1] to [3] and [9].
  • [11] A glucose measurement reagent composition comprising the flavin-binding glucose dehydrogenase according to any one of [1] to [3] and [9].
  • [12] A glucose measuring biosensor comprising the flavin-binding glucose dehydrogenase according to any one of [1] to [3] and [9].
  • a novel flavin-binding glucose dehydrogenase was obtained, and the enzyme could be easily produced.
  • Glucose measurement using the enzyme has become possible, and a glucose measurement reagent composition and glucose measurement biosensor containing the enzyme can be produced.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention is a protein having the following amino acid sequence (a), (b) or (c) and having glucose dehydrogenase activity. “Protein” also includes glycoproteins.
  • A The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, or 9.
  • B An amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8 or 9.
  • the number of mutations is preferably at most 60, 55, 50, 40, 30, 20, 20, 15, 5, 3, or 2.
  • C at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% or 99% with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8 or 9.
  • Amino acid sequence with identity The enzyme is preferably a protein having the amino acid sequence of (a), (b) or (c) and having glucose dehydrogenase activity.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention is not particularly limited as long as it is a protein having the above sequence, and may be an enzyme derived from a wild strain, a recombinant enzyme obtained by gene recombination, or a synthetic enzyme obtained by synthesis. But you can. A recombinant enzyme is preferable.
  • the flavin-binding glucose dehydrogenase of the present invention preferably has the following properties (1) to (8).
  • flavins include flavin adenine dinucleotide (FAD) and flavin mononucleotide (FMN), and FAD is preferred.
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • FMN flavin mononucleotide
  • FAD is preferred.
  • Action An enzyme that oxidizes the hydroxyl group at the 1-position of glucose in the presence of an electron acceptor.
  • Soluble An enzyme that oxidizes the hydroxyl group at the 1-position of glucose in the presence of an electron acceptor.
  • the action on 50 mM glucose is 100%, the action on 50 mM maltose is at most 3.0%. Preferably, it is at most 2.5%, 2.0% or 1.5%.
  • the activity on 50 mM glucose is 100%, the activity on 50 mM xylose is preferably at most 30%, more preferably at most 20% or 15%.
  • the molecular weight of the enzyme polypeptide is 60 to 70 kDa. Preference is given to 65 to 70 kDa.
  • the molecular weight of the polypeptide of the enzyme is the molecular weight when the molecular weight of the protein part from which the sugar chain has been removed is measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the molecular weight of the entire enzyme as determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis varies depending on the culture conditions, purification conditions, etc., depending on the amount of glycan addition. The amount of added sugar changes and the molecular weight changes.
  • the enzyme activity before a process is set to 100%, and the relative activity after a 1 hour process is shown in 100 mM various buffer solutions at 30 degreeC. By having this stability, it can be used stably even in an acidic region.
  • Penicillium is preferably derived from a microorganism belonging to the genus Penicillium.
  • the microorganism include Penicillium sclerotiolum, Penicillium paneum, and Penicillium junchinerum.
  • Recombinant glucose dehydrogenase produced by introducing the obtained DNA into a suitable host microorganism by various known methods is also included in the glucose dehydrogenase of the present invention.
  • Penicillium is easy to handle because it has been widely used in industry. Since the growth is quite fast, the culture time may be short, and it is very easy to use and useful as a strain for screening, a strain for gene acquisition or a strain for enzyme production.
  • the Km for glucose is preferably 1.0 to 25 mM, more preferably 1.5 to 20 mM, and most preferably 15 mM, 10 mM or 5 mM.
  • the Km is a value calculated by Hanes-Woolf plot. With this Km, accurate measurement can be performed with a small amount of enzyme even in a low concentration region of the substrate.
  • the activity value at 25 ° C. is preferably at least 50%. If it is this temperature characteristic, there will be little change of the enzyme activity by temperature. Therefore, it is difficult to be affected by the environmental temperature at the time of measurement, so that it can be measured accurately.
  • the polynucleotide of the present invention comprises the following (i), (ii), (iii), (iv) or (v).
  • V at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4 or 7
  • hybridization under stringent conditions include, for example, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM sodium chloride, 15 mM trisodium citrate, 10 mM sodium phosphate. 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, pH 7.2), 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.1% SDS, 10% dextran sulfate and 100 ⁇ g / mL denatured salmon sperm DNA, incubated at 42 ° C., and then filtered with 0.2 X Washing at 42 ° C. in SSC can be exemplified.
  • the identity is based on the identity value calculated by homology analysis between the base sequences of GENETYX (manufactured by Genetics) or between amino acid sequences.
  • the polynucleotide of the present invention can be preferably obtained from a microorganism belonging to the genus Penicillium.
  • the microorganism include Penicillium sclerotiolum, Penicillium paneum, and Penicillium junchinerum.
  • the obtaining method may be to obtain the full length gene encoding glucose dehydrogenase from the chromosomal DNA or mRNA of the microorganism by PCR or the like, or artificially construct the full length gene sequence from the gene information described in SEQ ID NO: 1, 4 or 7. May be synthesized.
  • a polynucleotide obtained by partially modifying a polynucleotide obtained by these methods and encoding a glucose dehydrogenase is also a polynucleotide of the present invention.
  • Penicillium is easy to handle because it has been widely used in industry.
  • the polynucleotide of the present invention may be chromosomal DNA or cDNA.
  • the recombinant vector of the present invention is a cloning vector or an expression vector, and the vector is appropriately selected and contains the polynucleotide of the present invention as an insert.
  • a polynucleotide optimized for codon usage may be introduced corresponding to the host cell.
  • a gene not containing an intron is used.
  • a gene containing an intron may be used.
  • the expression level of the recombinant protein may be improved by replacing the stop codon with a stop codon optimal for the host.
  • a vector to be expressed as a fusion protein may be selected by adding the start codon to the insert side or using the start codon on the vector side.
  • the expression vector may be either a prokaryotic cell expression vector or a eukaryotic cell expression vector. If necessary, a polynucleotide that contributes to the expression of chaperone, lysozyme, and the like can be introduced into the same and / or different vector as the polynucleotide of the present invention.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention may be expressed using a vector that can be expressed as a fusion protein to which various tags such as a His tag, a FLAG tag, and GFP are added.
  • a recombinant protein When a recombinant protein is expressed in a Gram-negative bacterium such as Escherichia coli using a glucose dehydrogenase gene containing a sequence encoding a secretory signal sequence such as SEQ ID NO: 1, 4 or 7, the recombinant protein becomes periplasm. Productivity is poor because it is migrated. Therefore, when it is desired to efficiently recover the recombinant protein, it is preferable to use a sequence in which the gene sequence encoding the signal sequence is deleted.
  • a polynucleotide not containing an intron and not containing a sequence encoding a signal sequence for example, a polynucleotide obtained by adding an initiation codon ATG to a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 6 or 9 Is preferred.
  • the expression vector include pUC system, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system, pCold expression system and the like.
  • the entire glucose dehydrogenase gene including a sequence encoding a secretory signal sequence such as SEQ ID NO: 1, 4 or 7 may be inserted into the vector.
  • a polynucleotide in which a sequence encoding a signal sequence is substituted with a sequence appropriate for a host, for example, may be used.
  • a sequence encoding a signal sequence on the vector side may be used. Examples of expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, and pYE82.
  • the secretory signal sequence can be estimated by comparing with the signal sequence of the glucose dehydrogenase sequence derived from Aspergillus terreus described in, for example, International Publication No. 2006/101239 (amino acid sequence represented by 1 to 19 in SEQ ID NO: 2). . Furthermore, it can also be estimated using a signal sequence prediction site (for example, Signal P: http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). For example, MKGFSGALLLPLAAAIPHASR can be inferred as the signal sequence in SEQ ID NO: 2, MRSLIGALLLPLAVAVPHASHHK in SEQ ID NO: 5, and MLVPKTLSSVYFAAVAAAA in SEQ ID NO: 8.
  • Examples of the transformed cells of the present invention include prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, eukaryotic cells such as fungi (yeast, Aspergillus or other ascomycetes, basidiomycetes, etc.), insect cells, mammalian cells, and the like. And can be obtained by transformation with the vector of the present invention.
  • the vector may be maintained in a transformed cell in the state of a plasmid, or may be maintained by being incorporated into a chromosome.
  • the host can be appropriately selected according to the necessity of the sugar chain, the necessity, and the necessity of other peptide modifications. However, it is possible to select a host to which a sugar chain can be added and produce an enzyme having a sugar chain. preferable.
  • Recombinant glucose dehydrogenase can be produced by collecting glucose dehydrogenase from a culture obtained by culturing the transformed cells of the present invention.
  • a normal microbial culture medium For cultivation of the glucose dehydrogenase-producing bacterium used in the present invention, a normal microbial culture medium can be used.
  • any of a synthetic medium and a natural medium can be used as long as they contain moderate amounts of carbon sources, nitrogen sources, vitamins, inorganic substances, and other micronutrients required by microorganisms to be used.
  • the carbon source glucose, sucrose, dextrin, starch, glycerin, molasses and the like can be used.
  • nitrogen sources include inorganic salts such as ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate and ammonium phosphate, amino acids such as DL-alanine and L-glutamic acid, and peptone, meat extract, yeast extract, malt extract and corn steep liquor Nitrogen-containing natural products can be used.
  • inorganic salts such as ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium
  • the culture for obtaining the glucose dehydrogenase of the present invention is usually preferably carried out under aerobic conditions by methods such as shaking culture and aeration stirring.
  • culture conditions suitable for the production of glucose dehydrogenase may be set.
  • the culture temperature is preferably 20 to 50 ° C. and pH 4 to pH 8, and the pH may be adjusted during the culture in consideration of productivity.
  • the culture period is preferably in the range of 2 days to 10 days.
  • an ordinary protein production method can be used as a method for obtaining glucose dehydrogenase from the culture. For example, after first culturing a glucose dehydrogenase-producing bacterium, a culture supernatant is obtained by centrifugation. Alternatively, cultured cells are obtained, the cultured microorganisms are crushed by an appropriate method, and a supernatant is obtained from the crushed liquid by centrifugation or the like. Next, the glucose dehydrogenase contained in these supernatants can be purified by an ordinary protein purification method to obtain a purified enzyme. For example, it can be purified by combining purification operations such as ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, heat treatment, dialysis, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and affinity chromatography.
  • purification operations such as ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, heat treatment, dialysis, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and affinity chromat
  • Glucose can be measured using the glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the glucose measurement method of the present invention can quantitate glucose in a test sample by including a step of bringing a test sample containing glucose into contact with the glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the measuring object of this invention is not specifically limited, For example, a biological sample can be illustrated and a blood sample can be illustrated as a specific example.
  • the enzyme of the present invention is particularly useful for blood glucose measurement.
  • the present invention provides a method for producing a reagent composition for producing a glucose measuring reagent composition using the glucose dehydrogenase of the present invention or a method for producing a biosensor for producing a glucose measuring biosensor.
  • the production method is preferably maintained in the range of pH 3.8 or more, more preferably in the range of pH 3.8 to 6.7. However, in the case where the stability of the enzyme can be maintained by a stabilizer or the like, the range is maintained. Not exclusively.
  • the reagent composition of the present invention may be a reagent composition containing the glucose dehydrogenase of the present invention as an enzyme.
  • the amount of enzyme in the composition is not particularly limited as long as the measurement target can be measured, but is preferably about 0.05 to 50 U, more preferably about 0.1 to 20 U.
  • the composition may appropriately contain other optional components known to those skilled in the art, such as a stabilizer or a buffer, to enhance the thermal stability and storage stability of the enzyme and reagent components. Examples of the component include bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin, saccharides or sugar alcohols having no activity with the enzyme, carboxyl group-containing compounds, alkaline earth metal compounds, ammonium salts, sulfates or proteins. .
  • BSA bovine serum albumin
  • a known substance that suppresses the influence of a contaminant substance that affects the measurement present in the test sample may be included in the measurement reagent.
  • the biosensor of the present invention may be any sensor that includes the glucose dehydrogenase of the present invention as an enzyme in the reaction layer.
  • an electrochemical biosensor is manufactured by forming an electrode system including a counter electrode and a working electrode on an insulating substrate using a method such as screen printing or vapor deposition, and further including the enzyme and a mediator.
  • mediators include proteinaceous electron mediators such as heme, ferricyanide compounds, quinone compounds, osmium compounds, phenazine compounds, and phenothiazine compounds.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention can be used in a biobattery.
  • the biobattery according to the present invention includes an anode electrode that performs an oxidation reaction and a cathode electrode that performs a reduction reaction, and includes an electrolyte layer that separates the anode and the cathode as necessary.
  • An enzyme electrode containing the above-mentioned electron mediator and glucose dehydrogenase is used as an anode electrode, and electrons generated by oxidizing the substrate are taken out to the electrode and protons are generated.
  • an enzyme generally used for the cathode electrode may be used on the cathode side, for example, by using laccase, ascorbate oxidase or bilirubin oxidase, and reacting protons generated on the anode side with oxygen. Generate water.
  • an electrode generally used for a bio battery such as carbon, gold, or platinum can be used.
  • the enzyme is preferably diluted as appropriate so that the final concentration is 0.15-0.6 U / mL.
  • the enzyme activity unit (U) of the enzyme is an enzyme activity that oxidizes 1 ⁇ mol of glucose per minute.
  • the enzyme activity of the glucose dehydrogenase of the present invention can be measured by the following method.
  • the amount of decrease per minute ( ⁇ A600) in absorbance at 600 nm accompanying the progress of the enzyme reaction was measured for 5 minutes from the start of the reaction, and the enzyme activity was calculated from the linear portion according to the following formula. At this time, the enzyme activity was defined as 1 U for the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute at 37 ° C. and pH 6.0.
  • 3.0 is the amount of reaction reagent + enzyme solution (mL)
  • 10.8 is the molar extinction coefficient of DCIP at pH 6.0
  • 1.0 is the optical path length (cm) of the cell
  • 0.05 represents the amount of the enzyme solution (mL)
  • ⁇ A600 blank represents the amount of decrease in absorbance per minute at 600 nm when the reaction was started by adding a diluted enzyme solution instead of the enzyme solution.
  • Example 1 (Acquisition of flavin-binding glucose dehydrogenase (GLD))
  • GLD activity could be confirmed in the culture supernatants of the three strains.
  • they were Penicillium sclerotiolum, Penicillium paneum, and Penicillium junchinerum.
  • the respective enzymes derived from these GLD-producing bacteria were cloned.
  • cDNA library was prepared from each RNA obtained in (2) by a reverse transcription reaction using a reverse transcriptase and an oligo dT primer with an adapter sequence.
  • a reaction reagent “SMARTER RACE cDNA Amplification kit” (manufactured by Takara Bio Inc.) was used, and the reaction conditions were performed according to the protocol described in the instructions.
  • E. coli JM109 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were each transformed by a known method.
  • Each plasmid vector was extracted and purified from each obtained transformant using illustra plasmid-Prep Mini Spin Kit (manufactured by GE Healthcare), and the base sequence of each insert was determined.
  • each primer for elucidating the upstream and downstream sequences of each GLD gene was designed. Using these primers, the full length of each GLD gene was elucidated by 5'RACE method and 3'RACE method.
  • GLD gene sequences derived from Penicillium scleriothiolum, Penicillium paneum or Penicillium janchinerum are shown in SEQ ID NO: 1, 4 or 7. Further, the amino acid sequence predicted from the gene sequence is shown in SEQ ID NO: 2, 5 or 8. SEQ ID NO: 3, 6 or 9 is a sequence obtained by removing the signal portion predicted by Signal P4.1 for the sequence of SEQ ID NO: 2, 5 or 8.
  • GLD derived from Penicillium scleriothiolum is represented as PsGLD
  • GLD derived from Penicillium paneum is represented as PpGLD
  • GLD derived from Penicillium janchinerum is represented as PjGLD.
  • Plasmid vectors were prepared using an improved promoter of the amylase system derived from oryzae. First, PCR was performed using each cDNA library obtained in (3) as a template to obtain a PCR product containing each GLD gene.
  • the following primer pairs of S158-Ori (SEQ ID NO: 10) and S158-R-1st (SEQ ID NO: 11) were used using cDNA derived from Penicillium sclerothiolum as a template.
  • the following primer pairs of S1268-Ao (SEQ ID NO: 13) and S1268-R-1st (SEQ ID NO: 14) were used using a cDNA derived from Penicillium / Paneum as a template.
  • T475-Ori SEQ ID NO: 16
  • T475-R-1st SEQ ID NO: 17
  • primer pairs were used using cDNA derived from Penicillium junchinerum as a template.
  • PCR was carried out using each PCR product as a template to prepare each GLD gene for vector insertion.
  • a primer pair of S158-Ori SEQ ID NO: 10
  • S158-R-2nd SEQ ID NO: 12
  • a primer pair of S1268-Ao (SEQ ID NO: 13) and S1268-R-2nd (SEQ ID NO: 15) was used with a PCR product containing the PpGLD gene as a template.
  • a primer pair of T475-Ori (SEQ ID NO: 16) and T475-R-2nd (SEQ ID NO: 18) was used with a PCR product containing the PjGLD gene as a template.
  • PsGLD gene, PpGLD gene or PjGLD gene prepared downstream of the promoter was ligated to prepare each plasmid vector capable of expressing the gene.
  • Each of the prepared plasmid vectors for expression was introduced into E. coli strain JM109 and transformed.
  • Each obtained transformant was cultured, and each plasmid vector was extracted from each collected bacterial body using illustra plasmid-Prep Mini Spin Kit.
  • a base sequence containing each GLD gene could be confirmed.
  • S158-Ori (SEQ ID NO: 10): 5 '-(CCGCAGCTCGTCAAA) ATGAAGGGATTCTCGGGTC-3' (In parentheses: transcription enhancer) S158-R-1st (SEQ ID NO: 11): 5'- ((GTTCATTTA)) GATCTTTCCCTTGATAATGTC-3 ' (In double brackets: pSEN vector sequence) S158-R-2nd (SEQ ID NO: 12): 5'- ((GTTACGCTTCTAGA GCATGC GTTCATTTA)) GATCTTTCCC-3 ' (In double brackets: pSEN vector sequence, underlined: restriction enzyme site (SphI)) S1268-Ao (SEQ ID NO: 13): 5′-CCGGCTGGACGGGCCGTTCCCCATGCCTCACACAAG-3 ′ S1268-R-1st (SEQ ID NO: 14): 5 '-((GTTCATTTA)) GTAGCACGCCTTGATGATAT-3' (In
  • Each of the transformants obtained in (6) was inoculated into each cooled liquid medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 4 days. After completion of the culture, each supernatant was collected by centrifugation, and GLD activity was measured using a plate reader in accordance with the aforementioned GLD activity measurement method.
  • each seed culture solution was inoculated into each cooled liquid medium and cultured at 30 ° C., 400 rpm, 1 v / v / m for 4 days.
  • each culture solution was filtered with a filter cloth, and the collected filtrate was centrifuged to collect a supernatant, and further filtered with a membrane filter (10 ⁇ m, manufactured by Advantech) to collect each culture supernatant.
  • a membrane filter (10 ⁇ m, manufactured by Advantech
  • the enzyme was eluted by a gradient elution method from the buffer to 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and the active fraction was collected.
  • the collected active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 10,000, desalted, and equilibrated with 1 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0).
  • the enzyme was adsorbed by passing through a DEAE Cellulofine A-500m (manufactured by Chisso) column pre-equilibrated with the same buffer.
  • the column was washed with the same buffer, and then the enzyme was eluted by a gradient elution method from the buffer to 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) to collect the active fraction.
  • the collected active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 8,000, and then water-substituted sample was used as a purified PsGLD sample.
  • the enzyme was eluted from the same buffer to a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 20% saturated ammonium sulfate, and the active fraction was recovered. .
  • the collected active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 10,000, desalted, and equilibrated with 1 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0).
  • the enzyme was adsorbed by passing through a DEAE Cellulofine A-500m (manufactured by Chisso) column pre-equilibrated with the same buffer.
  • the column was washed with the same buffer, and then the enzyme was eluted by a gradient elution method from the buffer to 150 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) to collect the active fraction.
  • the collected active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 8,000, and then water-substituted sample was used as a purified PpGLD sample.
  • Example 2 (Examination of enzymatic chemistry of GLD of the present invention) Various properties of each purified GLD obtained in Example 1 were examined.
  • the absorption spectrum at 200-700 nm before and after the addition of D-glucose was measured using a plate reader (SPECTRA MAX PLUS 384, manufactured by Molecular Devices).
  • SPECTRA MAX PLUS 384 manufactured by Molecular Devices.
  • GOD activity (U / mL) (( ⁇ A500 ⁇ A500blank) ⁇ 3.0 ⁇ dilution ratio of enzyme) / (10.66 ⁇ 0.5 ⁇ 1.0 ⁇ 0.05)
  • 3.0 is the amount of reaction reagent + enzyme solution (mL)
  • 10.66 is the molar extinction coefficient of the quinone dye under the present measurement conditions
  • 0.5 is the amount of 1 mol of hydrogen peroxide produced.
  • the amount of quinone dye produced with respect to the cell 1.0 is the optical path length of the cell (cm), 0.05 is the amount of the enzyme solution (mL), ⁇ A500 blank is the reaction start by adding a diluted enzyme solution instead of the enzyme solution Represents the amount of increase in absorbance per minute at 500 nm when the reaction was started.
  • the GLD of the present invention had an activity against maltose of 2.0% or less and an activity against D-xylose of 30% or less, assuming that the activity against D-glucose was 100%.
  • Km value for glucose According to the GLD activity measurement method, the activity of each GLD was measured by changing the concentration of D-glucose as a substrate. PsGLD was measured at glucose concentrations of 10, 20, 40 and 60 mM, PpGLD was measured at glucose concentrations of 5, 10, 20 and 50 mM, and PjGLD was measured at glucose concentrations of 1, 2, 5 and 10 mM. The Michaelis constant (Km value) was determined from each activity measurement value by Hanes-Woolf plot. As a result, the Km value for D-glucose of each GLD was 14 mM for PsGLD, 3.3 mM for PpGLD, and 3.6 mM for PjGLD. Therefore, the Km value of the GLD of the present invention is considered to be about 1.0 to 25 mM.
  • Buffers include sodium acetate buffer (plotted with diamonds in the figure), sodium citrate buffer (plotted with squares in the figure), sodium phosphate buffer (plotted with black circles in the figure), potassium phosphate buffer (Plotted with triangles in the figure), Tris-HCl buffer (plotted with white circles in the figure) or glycine-NaOH buffer (plotted with x in the figure) was used.
  • the enzyme activity before the treatment was assumed to be 100%, the residual activity after the treatment was calculated as a relative value, and the pH stability is shown in the figure.
  • the relative activity of PsGLD is at least 80% at pH 3.5 to 6.8
  • the relative activity of PpGLD is at least 70% at pH 3.5 to 6.7
  • PjGLD The relative activity of was at least 80% at pH 3.8-7.4.
  • the GLD of the present invention appeared to be stable in the acidic range.
  • the activity of each GLD was measured at 25 ° C or 37 ° C.
  • the final concentration of the substrate was 50 mM.
  • the relative activity of each GLD at 25 ° C. was at least 70% for PsGLD, at least 70% for PpGLD, and at least 50% for PjGLD.

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Abstract

【課題】グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサを提供すること。 【解決手段】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素： （ａ）配列番号２、３、５、６、８又は９に示されるアミノ酸配列； （ｂ）配列番号２、３、５、６、８又は９に示されるアミノ酸配列において１又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列； （ｃ）配列番号２もしくは３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性、配列番号５もしくは６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性又は配列番号８もしくは９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。

Description

フラビン結合型グルコース脱水素酵素
　本発明は、グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサ等に関する。
　血液中のグルコース（血糖）濃度の測定は、主に糖尿病患者の血糖コントロールにおいて重要である。血糖測定において、酵素を利用した血糖測定機器として、バイオセンサが広く使われている。
　バイオセンサに使用可能な酵素として、グルコース酸化酵素やグルコース脱水素酵素が知られている。しかし、グルコース酸化酵素は、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があった。グルコース脱水素酵素のうち、真核細胞由来のフラビン結合型グルコース脱水素酵素は、溶存酸素の影響を受けないこと、補酵素の添加を必要としないこと及び基質特異性に優れることから、バイオセンサ用の酵素として有用である（特許文献１～６）。
国際公開２００４／０５８９５８号パンフレット 国際公開２００６／１０１２３９号パンフレット 国際公開２００８／００１９０３号パンフレット 国際公開２００７／１１６７１０号パンフレット 国際公開２０１３／０３１６６４号パンフレット 国際公開２０１３／１４７２０６号パンフレット
　本発明は、新規なグルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサを提供する。更に、測定試薬組成物の製造方法及びバイオセンサの製造方法を提供することを目的とする。
　発明者らは、種々の微生物由来のグルコース脱水素酵素を探索し、ペニシリウム属に属する微生物から、新規なフラビン結合型グルコース脱水素酵素を見出した。更に、効率的なフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法を見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［１２］の態様に関する。
［１］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素：
（ａ）配列番号２、３、５、６、８又は９に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、３、５、６、８又は９に示されるアミノ酸配列において１又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２もしくは３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性、配列番号５もしくは６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性又は配列番号８もしくは９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。
［２］以下の性質を有する、［１］に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素：
　（１）作用：電子受容体存在下で、グルコースの１位の水酸基を酸化する；
　（２）可溶性である；
　（３）グルコースに対する作用性を１００％とした場合に、マルトースに対する作用性が多くとも１．５％である；
　（４）酵素のポリペプチドの分子量が６０～７０ｋＤａである；及び
　（５）ｐＨ３．８で安定である。
［３］（６）ペニシリウム属に属する微生物由来である、［１］又は［２］記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
［４］以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は（ｖ）からなるポリヌクレオチド：
（ｉ）［１］記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｖ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［５］ペニシリウム属に属する微生物由来である、［４］に記載のポリヌクレオチド。
［６］［４］又は［５］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［７］［６］に記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
［８］［７］に記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
［９］［８］の製造方法によって得られたフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
［１０］［１］～［３］及び［９］の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用するグルコースの測定方法。
［１１］［１］～［３］及び［９］の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物。
［１２］［１］～［３］及び［９］の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ。
　本発明によって、新規なフラビン結合型グルコース脱水素酵素が得られ、更に該酵素を簡便に製造できるようになった。該酵素を使用したグルコース測定が可能になり、更に該酵素を含むグルコース測定試薬組成物やグルコース測定用バイオセンサが製造できるようになった。
ｐＨ安定性を示す図である。 Ｄ－グルコース測定結果を示す図である。
　本発明のグルコース脱水素酵素は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。「タンパク質」とは糖タンパク質も含む。
（ａ）配列番号２、３、５、６、８又は９に示されるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号２、３、５、６、８又は９に示されるアミノ酸配列において１又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。変異数は、好ましくは多くとも６０個、５５個、５０個、４０個、３０個、２０個、１５個、１０個、５個、３個又は２個である。
（ｃ）配列番号２、３、５、６、８又は９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列。
　該酵素は、好ましくは（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。
　本発明のグルコース脱水素酵素は、前記配列を有するタンパク質であれば特に限定されず、野生株由来の酵素でもよく、遺伝子組換えによって得られた組換え酵素でもよく、合成によって得られた合成酵素でもよい。好ましくは組換え酵素である。
　本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素は、下記の性質（１）～（８）を有することが好ましい。フラビンとしては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）が挙げられ、好ましくはＦＡＤである。
　（１）作用：電子受容体存在下で、グルコースの１位の水酸基を酸化する酵素である。
　（２）可溶性である。
　（３）基質特異性が良い。５０ｍＭグルコースに対する作用性を１００％とした場合に、５０ｍＭマルトースに対する作用性が多くとも３．０％である。好ましくは、多くとも２．５％、２．０％又は１．５％である。５０ｍＭグルコースに対する作用性を１００％とした場合に、５０ｍＭキシロースに対する作用性が、好ましくは多くとも３０％、より好ましくは多くとも２０％又は１５％である。該基質特異性を有することによって、測定時に夾雑物の影響を受け難く、正確に測定できる。
　（４）酵素のポリペプチドの分子量が６０～７０ｋＤａである。好ましは、６５～７０ｋＤａである。酵素のポリペプチドの分子量とは、糖鎖を除去したタンパク質部分をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定した場合の分子量のことである。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による酵素全体の分子量については、培養条件や精製条件等により、糖鎖付加量が変われば分子量は異なり、組換え酵素においてはその宿主等によっても糖鎖の有無や糖付加量が変わり、分子量は異なってくる。
　（５）酸性域で安定であることが好ましい。ｐＨ３．８で安定であることがより好ましく、ｐＨ３．８～６．７で安定であることが更に好ましい。ｐＨ３．８で少なくとも８０％の残存活性を有することが好ましく、ｐＨ３．８～６．７で少なくとも７０％の残存活性を有することが更に好ましい。尚、処理前の酵素活性を１００％として、１００ｍＭの各種緩衝液中で、３０℃、１時間処理後の相対活性を表す。該安定性を有することによって、酸性域でも安定に使用できる。
　（６）ペニシリウム属に属する微生物由来であることが好ましい。該微生物としては、ペニシリウム・スクレロチオルム、ペニシリウム・パネウム又はペニシリウム・ジャンチネルムを例示できる。更に、ペニシリウム属に属するグルコース脱水素酵素生産微生物から公知の遺伝子工学的手法によって取得したグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子若しくは該遺伝子情報を基に人工的に合成したＤＮＡ、又はそれらを一部改変したＤＮＡを、適当な宿主微生物に各種公知の手法により導入して生産された組換えグルコース脱水素酵素も、本発明のグルコース脱水素酵素に含まれる。ペニシリウムは、産業上、よく利用されてきたため、扱い易い。生育がかなり速いため培養時間が短くてよく、スクリーニング用の株、遺伝子取得用の株又は酵素生産用の株として非常に使い易く、有用である。
　（７）グルコースに対するＫｍが１．０～２５ｍＭであることが好ましく、１．５～２０ｍＭであることがより好ましく、多くとも１５ｍＭ、１０ｍＭ又は５ｍＭであることが更に好ましい。尚、該Ｋｍは、Ｈａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆプロットにより算出した値である。該Ｋｍであれば、低濃度の基質濃度域でも、少量の酵素量で正確に測定できる。
　（８）３７℃における活性値を１００％とした場合に、２５℃における活性値が少なくとも５０％であることが好ましい。該温度特性であれば、温度による酵素活性の変化が少ない。よって、測定時に環境温度の影響を受けにくいため、正確に測定できる。
　本発明のポリヌクレオチドは、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は（ｖ）からなる。
（ｉ）前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。（ｉｉ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｉｉｉ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。変異数は、好ましくは多くとも１０個、８個、５個、３個又は２個である。
（ｉｖ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｖ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　本発明において、ハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」の具体的な条件とは、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム、１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’s）溶液、０．１％　ＳＤＳ、１０％　デキストラン硫酸及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡで４２℃インキュベーションした後、フィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄することを例示することができる。
　同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）の塩基配列同士又はアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。
　本発明のポリヌクレオチドは、好ましくはペニシリウム属に属する微生物から取得できる。該微生物としては、ペニシリウム・スクレロチオルム、ペニシリウム・パネウム又はペニシリウム・ジャンチネルムが例示できる。取得方法は、前記微生物の染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡからＰＣＲ等によってグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子全長を取得しても良く、又は配列番号１、４又は７に記載の遺伝子情報から全長遺伝子配列を人工的に合成しても良い。更に、それらの方法で取得したポリヌクレオチドを一部改変したポリヌクレオチドであって、グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドも、本発明のポリヌクレオチドである。ペニシリウムは、産業上、よく利用されてきたため、扱い易い。本発明のポリヌクレオチドは、染色体ＤＮＡでも良く、ｃＤＮＡでも良い。
　本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、ベクターは適宜選択し、インサートとして本発明のポリヌクレオチドを含む。インサートとしては、宿主細胞に対応して、コドンユーセージを最適化したポリヌクレオチドを導入しても良い。更に、宿主が原核細胞の場合は、イントロンを含まない遺伝子を用いる。真核細胞の場合、イントロンを含んだ遺伝子でも良い。終止コドンを宿主に最適な終止コドンに置換することで組換えタンパク質の発現量を向上させても良い。インサート側に開始コドンを含まない場合は、インサート側に開始コドンを付加するか、又はベクター側の開始コドンを利用して、融合タンパク質として発現するベクターを選択しても良い。発現ベクターとしては、原核細胞発現用ベクター又は真核細胞発現用ベクターの何れでも良い。尚、必要に応じて、シャペロンやリゾチームなどの発現に寄与するポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドと同一及び／又は別のベクターに導入することも可能である。更に、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質として発現できるベクターを使用して、本発明のグルコース脱水素酵素を発現しても良い。
　配列番号１、４又は７のような分泌シグナル配列をコードする配列を含むグルコース脱水素酵素遺伝子を用いて、大腸菌などのグラム陰性菌で組換えタンパク質を発現させる場合は、組換えタンパク質がペリプラズムに移行されるため、生産性が悪い。そのため、組換えタンパク質を効率よく回収したい場合は、シグナル配列をコードする遺伝子配列を削除した配列を用いるのが良い。特にグラム陰性菌の場合、イントロンを含まずシグナル配列をコードする配列を含まないポリヌクレオチド、例えば配列番号３、６又は９に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに開始コドンＡＴＧを付加したポリヌクレオチドが好ましい。発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システムなどが例示できる。
　一方、真核細胞で発現させて生産させる場合には、配列番号１、４又は７のような分泌シグナル配列をコードする配列を含むグルコース脱水素酵素遺伝子全体をベクターに挿入すれば良い。又は、シグナル配列をコードする配列を、例えば宿主に適切な配列に置換したポリヌクレオチドでも良い。更に、ベクター側のシグナル配列をコードする配列を利用しても良い。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ-ＣＭＶ、ｐＢＫ-ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ８２などが例示できる。
　分泌シグナル配列は、例えば国際公開２００６／１０１２３９に記載のアスペルギルス・テレウス由来グルコース脱水素酵素配列のシグナル配列（該公報の配列番号２の１～１９に示されるアミノ酸配列）と比較することで推測できる。更に、シグナル配列予測サイト（例：Ｓｉｇｎａｌ　Ｐ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いても推測できる。例えば、配列番号２ではＭＫＧＦＳＧＬＡＬＬＰＬＡＡＡＩＰＨＡＳＲ、配列番号５ではＭＲＳＬＩＧＬＡＬＬＰＬＡＶＡＶＰＨＡＳＨＫ、配列番号８ではＭＬＶＰＫＴＬＳＳＶＹＦＡＡＶＡＡＡＡをシグナル配列と推測できる。
　本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌（酵母、アスペルギルス属などの子嚢菌、担子菌等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができ、本発明のベクターで形質転換させて得ることができる。前記ベクターを、プラスミドのような状態で形質転換細胞内に維持しても良く、染色体中に組みこませて維持しても良い。更に、糖鎖の要、不要、その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができるが、糖鎖付加可能な宿主を選択し、糖鎖を有する酵素を製造することが好ましい。
　本発明の形質転換細胞を培養して得られた培養物からグルコース脱水素酵素を採取することによって、組換えグルコース脱水素酵素を製造することができる。
　本発明で使用されるグルコース脱水素酵素生産菌の培養には、通常の微生物培養用培地が使用できる。例えば、炭素源、窒素源、ビタミン類、無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン及び糖蜜等が使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機塩類、ＤＬ－アラニン及びＬ－グルタミン酸等のアミノ酸類、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス及びコーンスティープリカー等の窒素含有天然物が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム及び塩化第二鉄等が使用できる。
　本発明のグルコース脱水素酵素を得るための培養は、通常、振盪培養や通気攪拌等の方法による好気的条件下で行うのが良い。グルコース脱水素酵素生産菌の特性を踏まえて、グルコース脱水素酵素の生産に適した培養条件に設定すれば良い。例えば、培養温度は２０℃から５０℃、かつｐＨ４からｐＨ８の範囲で行うのが好ましく、生産性を考慮して培養中にｐＨ調整をしても良い。培養期間は、２日から１０日の範囲が好ましい。この様な方法で培養することにより、培養物中にグルコース脱水素酵素を生成蓄積することができる。
　培養物中からグルコース脱水素酵素を得る方法は、通常のタンパク質の製造方法が利用できる。例えば、最初にグルコース脱水素酵素生産菌を培養後、遠心分離により培養上清液を得る。又は培養菌体を得、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離等によって上清液を得る。次に、これらの上清液中に含まれるグルコース脱水素酵素を、通常のタンパク質の精製方法で精製し、精製酵素を得ることができる。例えば、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等の精製操作を組み合わせることによって精製できる。
　本発明のグルコース脱水素酵素を用いて、グルコースを測定することができる。本発明のグルコース測定方法は、グルコースを含む被検試料と本発明のグルコース脱水素酵素とを接触させる工程を含むことにより、被検試料中のグルコースを定量できる。本発明の測定対象は特に限定されないが、例えば生体試料が例示でき、具体例として血液試料が例示できる。本発明の酵素は、特に血糖測定に有用である。
　本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素を用いてグルコース測定試薬組成物を製造する試薬組成物の製造方法又はグルコース測定用バイオセンサを製造するバイオセンサの製造方法を提供する。該製造方法は、好ましくはｐＨ３．８以上の範囲に保ち、より好ましくはｐＨ３．８～６．７の範囲に保っても良いが、安定剤等によって酵素の安定性を保てる場合は該範囲に限らない。
　本発明の試薬組成物は、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を含む試薬組成物であれば良い。該組成物中の酵素量は、測定対象を測定できれば特に限定されないが、０．０５から５０Ｕ程度が好ましく、０．１から２０Ｕ程度がより好ましい。該組成物は、安定化剤又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めても良い。前記成分としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等を例示できる。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を、該測定試薬に含ませても良い。
　本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を反応層に含むセンサであれば良い。例えば、電気化学式バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷や蒸着等の方法を利用して対極及び作用極を備える電極系を形成し、更に該酵素とメディエータとを備えることによって作製される。メディエータは、ヘム等の蛋白質性電子メディエータや、フェリシアン化化合物、キノン系化合物、オスミウム系化合物、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物等が例示できる。この他に、イオン変化、発色強度又はｐＨ変化等を検知する方式のバイオセンサも構築可能である。
　更に本発明のグルコース脱水素酵素は、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及びグルコース脱水素酵素を含む酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。
　本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．１５－０．６Ｕ／ｍＬになるように適宜希釈して用いる。尚、該酵素の酵素活性単位（Ｕ）は１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明のグルコース脱水素酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。
（グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）活性測定法）
　１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ　Ｄ－グルコース溶液１．００ｍＬ、３ｍＭ ２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰという）０．１４ｍＬ及び３ｍＭ　１－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェイト０．２０ｍＬ及び超純水０．６１ｍＬを混合し、３７℃で１０分間保温後、酵素溶液０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、直線部分から次式に従い酵素活性を算出した。この際、酵素活性は、３７℃、ｐＨ６．０で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。
　グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）活性（Ｕ／ｍＬ）＝（－（ΔＡ６００－ΔＡ６００ｂｌａｎｋ）×３．０×酵素の希釈倍率）／（１０．８×１．０×０．０５）
　尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．８はｐＨ６．０におけるＤＣＩＰのモル吸光係数、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を表す。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］
（フラビン結合型グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）の取得）
　自然界から分離した菌株からＧＬＤ生産菌の探索を行った結果、３菌株の培養上清にＧＬＤ活性が確認できた。該菌株を同定した結果、ペニシリウム・スクレロチオルム、ペニシリウム・パネウム及びペニシリウム・ジャンチネルムだった。これらのＧＬＤ生産菌由来の各酵素のクローニングを行った。
（１）菌体培養
　パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコ３本に各々入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した各液体培地に、前記ＧＬＤ生産菌を各々接種し、２５℃で７２時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を各々回収した。
（２）全ＲＮＡの単離
　（１）で取得した各湿菌体２００ｍｇを－８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いて各１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。
（３）ｃＤＮＡライブラリーの調製
　（２）で取得した各ＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応により各ｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、「ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ」（タカラバイオ社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。
（４）ＧＬＤ遺伝子のクローニング
　（３）で取得した各ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＧＬＤ遺伝子取得用プライマー対を用いてＰＣＲを行った。その結果、何れもＧＬＤ遺伝子の内部配列と思われるＰＣＲ産物が確認された。尚、前記プライマー対は、本発明者らによって既に解明されていた複数のＧＬＤ配列を基に、種々のＧＬＤ遺伝子取得用に設計したプライマーである。前記ＰＣＲ産物を各々精製し、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ　ＰＭＤ２０（タカラバイオ社製）にライゲーションした。
　得られた各プラスミドベクターを用い、公知の方法で大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製）を各々形質転換した。得られた各形質転換体からｉｌｌｕｓｔｒａ　ｐｌａｓｍｉｄ－Ｐｒｅｐ　Ｍｉｎｉ　Ｓｐｉｎ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて各プラスミドベクターを抽出・精製し、各インサートの塩基配列を決定した。決定した各塩基配列を基に、各ＧＬＤ遺伝子の上流及び下流配列を解明するための各プライマーを設計した。これらのプライマーを用いて５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法によって、各ＧＬＤ遺伝子全長を解明した。
　ペニシリウム・スクレロチオルム、ペニシリウム・パネウム又はペニシリウム・ジャンチネルムに由来する各ＧＬＤ遺伝子配列を配列番号１、４又は７に示した。更に、当該遺伝子配列より予測したアミノ酸配列を配列番号２、５又は８に示した。配列番号３、６又は９は、配列番号２、５又は８の配列について、ＳｉｇｎａｌＰ４．１で予測したシグナル部分を除いた配列である。尚、ペニシリウム・スクレロチオルムに由来するＧＬＤをＰｓＧＬＤ、ペニシリウム・パネウムに由来するＧＬＤをＰｐＧＬＤ、ペニシリウム・ジャンチネルムに由来するＧＬＤをＰｊＧＬＤと表す。
（５）ＧＬＤ遺伝子を含む発現用プラスミドベクターの調製
　公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１－８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最初に、（３）で取得した各ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、各ＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。ＰｓＧＬＤ遺伝子の増幅には、ペニシリウム・スクレロチオルム由来のｃＤＮＡを鋳型として下記のS158-Ori（配列番号１０）及びS158-R-1st（配列番号１１）のプライマー対を使用した。ＰｐＧＬＤ遺伝子の増幅には、ペニシリウム・パネウム由来のｃＤＮＡを鋳型として下記のS1268-A.o（配列番号１３）及びS1268-R-1st（配列番号１４）のプライマー対を使用した。ＰｊＧＬＤ遺伝子の増幅には、ペニシリウム・ジャンチネルム由来のｃＤＮＡを鋳型として下記のT475-Ori（配列番号１６）及びT475-R-1st（配列番号１７）のプライマー対を使用した。次に、前記各ＰＣＲ産物を鋳型としてＰＣＲを行い、ベクター挿入用の各ＧＬＤ遺伝子を調製した。ＰｓＧＬＤ遺伝子の調製には、ＰｓＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物を鋳型としてS158-Ori（配列番号１０）及びS158-R-2nd（配列番号１２）のプライマー対を使用した。ＰｐＧＬＤ遺伝子の調製には、ＰｐＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物を鋳型としてS1268-A.o（配列番号１３）及びS1268-R-2nd（配列番号１５）のプライマー対を使用した。ＰｊＧＬＤ遺伝子の調製には、ＰｊＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物を鋳型としてT475-Ori（配列番号１６）及びT475-R-2nd（配列番号１８）のプライマー対を使用した。
　最終的に、前記プロモーターの下流に調製したＰｓＧＬＤ遺伝子、ＰｐＧＬＤ遺伝子又はＰｊＧＬＤ遺伝子を結合させて、該遺伝子が発現可能な各プラスミドベクターを作製した。作製した各発現用プラスミドベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に各々導入して形質転換した。得られた各形質転換体を培養して、集菌した各菌体から、ｉｌｌｕｓｔｒａ　ｐｌａｓｍｉｄ－Ｐｒｅｐ　Ｍｉｎｉ　Ｓｐｉｎ　Ｋｉｔを用いて各プラスミドベクターを抽出した。該プラスミドベクター中の各インサートの配列解析を行ったところ、各ＧＬＤ遺伝子を含む塩基配列が確認できた。
S158-Ori（配列番号１０）：5’－(CCGCAGCTCGTCAAA)ATGAAGGGATTCTCGGGTC－3’
（括弧内：転写増強因子）
S158-R-1st（配列番号１１）：5’－ ((GTTCATTTA))GATCTTTCCCTTGATAATGTC－3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮベクター配列）
S158-R-2nd（配列番号１２）：5’－ ((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))GATCTTTCCC－3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
S1268-A.o（配列番号１３）：5’－CCGGCTGGACGGGCCGTTCCCCATGCCTCACACAAG－3’
S1268-R-1st（配列番号１４）：5’－((GTTCATTTA))GTAGCACGCCTTGATGATAT－3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮベクター配列）
S1268-R-2nd（配列番号１５）：5’－((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))GTAGCACGC－3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
T475-Ori（配列番号１６）：5’－(CCGCAGCTCGTCAAA)ATGCTGGTCCCCAAGACTC－3’
（括弧内：転写増強因子）
T475-R-1st（配列番号１７）：5’－((GTTCATTTA))AACGCTTCCAGCCTTGATC－3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮベクター配列）
T475-R-2nd（配列番号１８）：5’－((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))AACGCTTCCA－3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
（６）形質転換体の取得
　（５）で抽出した各プラスミドベクターを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７－１３６９，１９９７）及び公知文献３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４－５０２、２０００）に記載の方法に準じて、各ＧＬＤを生産する各組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製した。得られた各組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、公知文献２にあるように、１９９７年（平成９年）に醸造試験所で育種され、現在は、独立行政法人酒類総合研究所で分譲されているものが入手可能である。
（７）組換えカビ由来ＧＬＤの確認
　パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１０ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）３本に各々入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した各液体培地に、（６）で取得した各形質転換体を各々植菌し、３０℃で４日間振とう培養した。培養終了後、遠心して各上清を回収し、前述のＧＬＤ活性測定法に準じ、プレートリーダーを用いてＧＬＤ活性を測定したところ、何れも本発明のＧＬＤ活性が確認できた。
（８）ＧＬＤの精製
（８－１）粗酵素液の取得
　（７）に記載の液体培地１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコ３本に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した各液体培地に、（６）で取得した各形質転換体を各々植菌し、３０℃で３日間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成に０．００５％クロラムフェニコール（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、消泡剤を添加した培地３．５Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンター３基に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した各液体培地に、前記種培養液を各５０ｍＬ植菌し、３０℃、４００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで４日間培養した。培養終了後、各培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して各培養上清を回収した。回収した各培養上清を、分画分子量１０，０００の限外ろ過膜（ミリポア社製）で濃縮して、ＰｓＧＬＤ、ＰｐＧＬＤ及びＰｊＧＬＤの各粗酵素液とした。
（８－２－１）ＰｓＧＬＤの精製
　（８－１）で取得したＰｓＧＬＤの粗酵素液を、６０％飽和硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ６．０）になるように調整し、４℃で一晩放置後、遠心分離して上清を回収した。該上清を、６０％飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｃ（東ソー社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量１０，０００の限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、１ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と平衡化させた。同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥセルロファインＡ－５００ｍ（チッソ社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換したサンプルを、精製ＰｓＧＬＤサンプルとした。
（８－２－２）ＰｐＧＬＤの精製
　（８－１）で取得したＰｐＧＬＤの粗酵素液を、６０％飽和硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ６．０）になるように調整し、４℃で一時間放置後、遠心分離して上清を回収した。該上清を、６０％飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｃ（東ソー社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から２０％飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量１０，０００の限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、１ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と平衡化させた。同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥセルロファインＡ－５００ｍ（チッソ社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換したサンプルを、精製ＰｐＧＬＤサンプルとした。
（８－２－３）ＰｊＧＬＤの精製
　（８－１）で取得したＰｊＧＬＤの粗酵素液を５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥセルロファインＡ－５００ｍ（チッソ社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した後、同緩衝液から１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換したサンプルを、精製ＰｊＧＬＤサンプルとした。
［実施例２］
（本発明のＧＬＤの酵素化学的性質の検討）
　実施例１で得られた各精製ＧＬＤの諸性質を調べた。
（１）吸収スペクトルの測定
　本発明のＧＬＤについて、Ｄ－グルコース添加前後の２００－７００ｎｍにおける吸収スペクトルをプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＰＬＵＳ ３８４、モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。その結果、何れのＧＬＤにおいても、波長３６０－３８０ｎｍ付近及び波長４５０－４６０ｎｍ付近に認められた吸収極大が、Ｄ－グルコース添加により消失したことから、本発明のＧＬＤはフラビン結合型タンパク質であることが明らかになった。
（２）グルコース酸化酵素（ＧＯＤ）活性の測定
　本発明のＧＬＤのＧＯＤ活性を調べた結果、何れのＧＬＤにおいても、ＧＯＤ活性は見られなかった。よって、本発明のＧＬＤは酸素を電子受容体として利用しないため、Ｄ－グルコースを定量する際に反応系の溶存酸素の影響を受けにくいことが示された。ＧＯＤ活性は、以下の方法で測定した。
　１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．００ｍＬ、１Ｍ　Ｄ－グルコース１．００ｍＬ、２５ｍＭ　４－アミノアンチピリン０．１０ｍＬ、４２０ｍＭフェノール０．１０ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬペルオキシダーゼ０．１０ｍＬ及び超純水０．６５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う５００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量（ΔＡ５００）を測定し、直線部分から次式に従いＧＯＤ活性を算出した。この際、ＧＯＤ活性は、３７℃、ｐＨ７．０で、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
　ＧＯＤ活性（Ｕ／ｍＬ）＝（（ΔＡ５００－ΔＡ５００ｂｌａｎｋ）×３．０×酵素の希釈倍率）／（１０．６６×０．５×１．０×０．０５）
　尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．６６は本測定条件におけるキノン型色素のモル吸光係数、０．５は１モルの過酸化水素の生成量に対するキノン型色素の生成量、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ５００ｂｌａｎｋは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の反応開始した場合の５００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量を表す。
（３）基質特異性
　前記ＧＬＤ活性測定法に準じ、基質に終濃度５０ｍＭのＤ－グルコース、マルトース又はＤ－キシロースをそれぞれ用いて、各基質に対する各ＧＬＤの活性を測定した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明のＧＬＤは、Ｄ－グルコースに対する活性を１００％とした場合に、マルトースに対する活性は２．０％以下で、Ｄ－キシロースに対する活性は３０％以下だった。
（４）グルコースに対するＫｍ値
　前記ＧＬＤ活性測定法に準じ、基質であるＤ－グルコース濃度を変化させて、各ＧＬＤの活性測定を行った。ＰｓＧＬＤは１０、２０、４０及び６０ｍＭの各グルコース濃度で、ＰｐＧＬＤは５、１０、２０及び５０ｍＭの各グルコース濃度で、ＰｊＧＬＤは１、２、５及び１０ｍＭの各グルコース濃度で測定した。各活性測定値からＨａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆプロットによりミカエリス定数（Ｋｍ値）を求めた。
　その結果、各ＧＬＤのＤ－グルコースに対するＫｍ値は、ＰｓＧＬＤが１４ｍＭ、ＰｐＧＬＤが３．３ｍＭ、ＰｊＧＬＤが３．６ｍＭだった。よって、本発明のＧＬＤのＫｍ値は約１．０～２５ｍＭと考えられる。
（５）ｐＨ安定性
　各ＧＬＤの終濃度が６Ｕ／ｍＬ、各緩衝液の終濃度が１００ｍＭになるように混合し、３０℃で１時間処理した後、前記ＧＬＤ活性測定法で酵素活性を測定した。緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液（図中ひし形印でプロット）、クエン酸ナトリウム緩衝液（図中四角印でプロット）、リン酸ナトリウム緩衝液（図中黒丸印でプロット）、リン酸カリウム緩衝液（図中三角印でプロット）、トリス塩酸緩衝液（図中白丸印でプロット）又はグリシン－ＮａＯＨ緩衝液（図中×でプロット）を使用した。処理前の酵素活性を１００％として、処理後の残存活性を相対値で算出し、ｐＨ安定性として図に示した。
　その結果、ＰｓＧＬＤの相対活性はｐＨ３．５～６．８で少なくとも８０％、ＰｐＧＬＤの相対活性はｐＨ３．５～６．７で少なくとも７０％及びｐＨ３．５～６．２で少なくとも８０％、ＰｊＧＬＤの相対活性はｐＨ３．８～７．４で少なくとも８０％だった。本発明のＧＬＤは酸性域で安定と思われた。
（６）温度特性
　前記ＧＬＤ活性測定法に準じ、２５℃又は３７℃にて各ＧＬＤの活性を測定した。基質の終濃度は５０ｍＭとした。
　その結果、各ＧＬＤの３７℃における活性を１００％とした場合に、２５℃における各ＧＬＤの相対活性は、ＰｓＧＬＤが少なくとも７０％、ＰｐＧＬＤが少なくとも７０％、ＰｊＧＬＤが少なくとも５０％だった。
（５）グルコースの測定
　前記ＧＬＤ活性測定法に準じ、１～６０ｍＭの各グルコース濃度で各ＧＬＤの活性測定を行い、各ＧＬＤの測定値を、相対活性で図１に示した。
　その結果、本発明のＧＬＤでＤ－グルコースの定量が可能であることが示された。

Claims (12)

  1. 　以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素：
    （ａ）配列番号２、３、５、６、８又は９に示されるアミノ酸配列；、
    （ｂ）配列番号２、３、５、６、８又は９に示されるアミノ酸配列において１又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号２もしくは３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性、配列番号５もしくは６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性又は配列番号８もしくは９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。
  2. 　以下の性質を有する、請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素：
    　（１）作用：電子受容体存在下で、グルコースの１位の水酸基を酸化する；
    　（２）可溶性である；
    　（３）グルコースに対する作用性を１００％とした場合に、マルトースに対する作用性が多くとも１．５％である；
    　（４）酵素のポリペプチドの分子量が６０～７０ｋＤａである；及び
    　（５）ｐＨ３．８で安定である。
  3. 　（６）ペニシリウム属に属する微生物由来である、請求項１又は２記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
  4. 　以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は（ｖ）からなるポリヌクレオチド：
    （ｉ）請求項１記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｖ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｖ）配列番号１、４又は７に示される塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  5. ペニシリウム属に属する微生物由来である、請求項４記載のポリヌクレオチド。
  6. 　請求項４又は５記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  7. 　請求項６記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
  8. 　請求項７記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
  9. 　請求項８記載の製造方法によって得られたフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
  10. 　請求項１～３又は９の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用するグルコースの測定方法。
  11. 　請求項１～３又は９の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物。
  12. 　請求項１～３又は９の何れかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ。
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