JPWO2020116330A1 - グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
[1]以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列を有し、50℃で10分処理後の相対残存活性が50%以上である、グルコースデヒドロゲナーゼ:
(a)配列番号1又は配列番号13のアミノ酸配列に90%以上の同一性を示し、且つ配列番号1のアミノ酸配列の429位アミノ酸に相当するアミノ酸はフェニルアラニン(F)であるアミノ酸配列;
(b)配列番号2又は配列番号14のアミノ酸配列に90%以上の同一性を示し、且つ配列番号2のアミノ酸配列の429位アミノ酸に相当するアミノ酸はフェニルアラニン(F)であるアミノ酸配列。
[2](a)における前記同一性と(b)における前記同一性が95%以上である、[1]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[3](a)における前記同一性と(b)における前記同一性が97%以上である、[1]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[4](a)における前記同一性と(b)における前記同一性が98%以上である、[1]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[5](a)における前記同一性と(b)における前記同一性が99%以上である、[1]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[6]配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列からなる、[1]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[7]以下の(A)〜(C)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子:
(A)[1]の(a)又は(b)のアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号5、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号15又は配列番号16の塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号5、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号15又は配列番号16の塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[8][7]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
[9][8]に記載の組換えDNAを保有する微生物。
[10]以下のステップ(1)〜(3)を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの調製法:
(1)[7]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を用意するステップ;
(2)前記遺伝子を発現させるステップ、及び
(3)発現産物を回収するステップ。
[11][1]〜[6]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
[12][1]〜[6]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。
[13][12]に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
[14][1]〜[6]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
[15][1]〜[6]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有する酵素剤。
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。用語「単離された」は、人為的操作が介在することなく産生される物の場合、天然の状態、即ち、自然界において存在している状態のものと区別するために使用され、人為的操作が介在して生産される物の場合、単離工程又は精製工程を経ていないものと区別するために使用される。前者の場合、単離するという人為的操作によって、天然の状態とは異なる状態である「単離された状態」となり、単離されたものは天然物自体と明確且つ決定的に相違する。一方、後者の場合、典型的には、単離工程又は精製工程によって不純物が除去され又はその量が低減され、純度が高まる。単離された酵素の純度は特に限定されない。但し、純度の高いことが要求される用途への適用が予定されるのであれば、単離された酵素の純度は高いことが好ましい。
本発明の第1の局面はグルコースデヒドロゲナーゼ(以下、本酵素とも呼ぶ)に関する。本酵素の一態様(第1態様)は、配列番号1又は配列番号13のアミノ酸配列に90%以上の同一性を示し、且つ配列番号1のアミノ酸配列の429位アミノ酸(配列番号13のアミノ酸配列では414位アミノ酸)に相当するアミノ酸はフェニルアラニン(F)である、アミノ酸配列を有する。配列番号1のアミノ酸配列はペシロマイセス・バリオチ(Paecilomyces variotii) NBRC 4855株の産生するグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列であり、配列番号13は配列番号1からシグナルペプチド配列を除外したアミノ酸配列である。当該菌株は独立行政法人製品評価技術基盤機構(NBRC)(〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に保存されており、所定の手続きを経ることによってその分譲を受けることができる。
(1)タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度で安定な保存法として産業上の有用性もある。この場合、リガンドとして基質もしくはそのアナログ化合物を結合したタンパク質を結晶化すると良い。
(2)作製した結晶にX線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はX線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に−173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
(3)結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が未知の場合、分子置換法で構造決定することは不可能であり、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなX線散乱能のX線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を0に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善されるのである。また、非対称単位に複数の分子が含まれている場合、これらの分子の電子密度を平均化することにより位相が更に大幅に改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、MSI社(アメリカ)のQUANTA等のプログラムを用いて行われる。この後、MSI社のX-PLOR等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が既知の場合は、既知タンパク質の原子座標を用いて分子置換法により決定できる。分子置換と構造精密化はプログラム CNS_SOLVE ver.11などを用いて行うことができる。
本発明の第2の局面は本酵素に関連する核酸を提供する。即ち、本酵素をコードする遺伝子、本酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、本酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
本発明の更なる局面は本酵素の調製法に関する。本発明の調製法では、本発明者らが取得に成功した本酵素を遺伝子工学的手法で調製する。具体的には、まず本酵素をコードする遺伝子を用意する(ステップ(1))。具体的には、例えば、配列番号1、配列番号2、配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列をコードする核酸を用意する。ここで、「配列番号1、配列番号2、配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するポリペプチドが得られる核酸であり、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列からなる核酸は勿論のこと、そのような核酸に余分な配列(アミノ酸配列をコードする配列であっても、アミノ酸配列をコードしない配列であってもよい)が付加されていてもよい。また、コドンの縮重も考慮される。「配列番号1、配列番号2、配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列をコードする核酸」は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。
本発明の更なる局面は本酵素の用途に関する。この局面ではまず、本酵素を用いたグルコース測定法が提供される。本発明のグルコース測定法では本酵素による酸化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定する。この反応による変化が利用できる各種用途に本発明を適用可能である。
公的機関から入手した保存菌株や自然界から入手した様々な菌株を培養して得られた培養液を試料として、自己血糖測定(SMBG)や持続血糖測定(CGM)に利用される酵素として有利な熱安定性の高いFAD-GDHを探索した。
(1)培養液の取得
300 mL容三角フラスコを用いて各種菌株を30℃で振とう培養した。培養液から菌体を除去した上清を限外ろ過濃縮したものを培養上清サンプルとした。熱安定性については、培養上清サンプルを0.1mol/Lリン酸緩衝液(リン酸水素二ナトリウム+リン酸二水素カリウム)(pH7.0)中で50℃、10分保温後の残存活性を測定することで分析した。基質特異性については、培養上清サンプルを用いて、基質となるD-グルコースをマルトース又はキシロースへ変更して同様に測定することで分析した。
0.1%(w/v)トリトンX-100を含む100mmol/L PIPES-NaOH緩衝液(pH7.0) 2.4mL、1mol/L D-グルコース溶液0.3mL、3 mmol/L PMS溶液0.2mL、及び6.6 mmol/L NTB溶液0.1mLを混合し、37℃で5分間保温後、酵素液0.1mLを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行と共に570nmに吸収を持つDiformazanが生成される。1分間あたりの570nmにおける吸光度の増加を測定し、FAD-GDH活性を測定した。
熱処理(50℃、10分)後の相対残存活性(熱処理後の酵素活性を、熱処理前の酵素活性を100%としたときの相対値(%)で表したもの)で熱安定性を評価した結果、熱安定性が比較的高い二つのFAD-GDHと熱安定性が非常に高い二つのFAD-GDHが見出された(図1)。後者(Paecilomyces variotii NBRC 4855株 由来FAD-GDH及びPaecilomyces variotii AHU 9417株由来FAD-GDH)では90%以上活性が残存しており、非常に高い安定性が確認できた。尚、比較にはアスペルギルス・オリゼ(A.oryzae) BB-56株のFAD-GDH(国際公開第2007/139013号パンフレットを参照)を用いた。
(1)培養
P. variotii NBRC4855株をポテトデキストロース寒天培地上で培養したスラント菌体を以下の培地に接種し、30℃、7日間培養した。得られた培養液から菌体を除去し、限外ろ過膜で濃縮、脱塩、分画精製するとともに5mM酢酸酸緩衝液(pH4.5)にバッファー交換した。尚、比較のために、P. variotii IAM12157株も同様に培養することにした。
(培地)
グルコース: 15.0%(w/v)
酵母エキス: 3.0%(w/v)
大豆ペプトン: 6.0%(w/v)
KH2PO4: 0.3%(w/v)
K2HPO4: 0.2%(w/v)
ヒドロキノン(pH6.0): 4mM
該濃縮液を5mM酢酸緩衝液pH 4.5で平衡化したSP SepharoseTM Fast Flowにアプライし、FAD-GDHをカラムに吸着させた。30mM NaClを含む5mM酢酸緩衝液pH4.5でカラムを洗浄後、60mM NaClを含む5mM pH4.5でFAD-GDHを溶出させ、精製酵素サンプルとした。
(1)熱安定性
精製酵素サンプルを0.1mol/Lリン酸緩衝液(リン酸水素二ナトリウム+リン酸二水素カリウム)(pH7.0)中で熱処理(50℃、10分保温)し、残存活性を測定した。測定結果を図2に示す。P. variotii NBRC4855株由来FAD-GDHが特に高い熱安定性を有することが判明した。
上記の「グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法」においてD-グルコースをD-マルトース又はD-キシロースへ変更し、D-マルトースに対する反応性とD-キシロースに対する反応性を調べた。D-グルコースへの反応性を100%とした場合の相対活性(%)として、D-マルトースに対する反応性とD-キシロースに対する反応性を評価した。結果を図3に示す。Paecilomyces variotii NBRC4855株由来FAD-GDHはA. oryzae BB-56株のFAD-GDHに比べてキシロースへの反応性が低く、有用であることが判明した。
各菌株の培養菌体から、カネカ簡易DNA抽出キットversion 2使用してゲノムDNAを取得した。公開されているPaecilomycesのゲノム情報より、A. oryzae由来のFAD-GDHと比較的相同性の高い配列を見出し、その前後配列よりプライマーを設計した。タカラバイオ製PrimeSTAR(登録商標) Max DNA PolymeraseによりPCRを実施して得られた部分断片を組み合わせることで遺伝子の全長配列の情報を得た。また、各遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を特定した。各菌株由来のFAD-GDHのアミノ酸配列を図4(P. variotii NBRC 4855株)、図5(P. variotii AHU 9417株)、図6(P. variotii IAM 12157株)、及び図7(P. brunneolus NBRC 7563株)に示す。また、各菌株由来のFAD-GDHの遺伝子配列を図8(P. variotii NBRC 4855株、ゲノムDNA配列)、図9(P. variotii AHU 9417株、ゲノムDNA配列)、図10(P. variotii IAM 12157株、ゲノムDNA配列)、及び図11(P. brunneolus NBRC 7563株、ゲノムDNA配列)、図12(P. variotii NBRC 4855株、cDNA配列)、図13(P. variotii AHU 9417株、cDNA配列)、図14(P. variotii IAM 12157株、cDNA配列)、及び図15(P. brunneolus NBRC 7563株、cDNA配列)に示す。精製酵素のN末端アミノ酸配列情報から、P. variotii NBRC 4855株由来FAD-GDHとP. variotii AHU 9417株由来FAD-GDHの精製酵素のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号13の配列と配列番号14の配列であると推定された。
P. variotii NBRC 4855株由来FAD-GDH、P. variotii AHU 9417株由来FAD-GDH及びP. variotii IAM 12157株由来FAD-GDHを各々大腸菌で組換え発現し、性質を確認した。各FAD-GDH遺伝子の5’末端側シグナルペプチドをコードする塩基配列は、メチオニンがN末端に入るように制限酵素NcoIサイトを導入したプライマーを使用してPCR法により除去した。イントロンもPCR法により除去し、大腸菌発現用遺伝子とした。NcoI-HindIIIサイトを用いた制限酵素処理、その後ライゲーションにより、発現ベクター pTrc99Aに、シグナルペプチドとイントロンを除去した遺伝子を導入し、大腸菌DH5αコンピテントセルに形質転換した。形質転換体を、アンピシリン存在下(50〜100μg/mL)のLB培地を用い、28℃で培養した。遠心分離によって回収した菌体をビーズショッカーで破砕し、菌体内成分を抽出した。遠心処理後、上清を回収し、0.45μmの膜ろ過後、FAD-GDH活性を確認した。FAD-GDH遺伝子を挿入していないpTrc99Aを形質転換した株をコントロールとして用いた。全ての株でFAD-GDH活性を確認できた。また、基質特異性を確認した結果、図16に示すように、組換え発現した酵素においても、P. variotii NBRC 4855株由来FAD-GDHにおいてD-マルトースとD-キシロースに対する反応性は低く、血糖測定(SMBG用途、CGM用途)に極めて有用であることが判明した。
P. variotii AHU 9417株由来FAD-GDHの429番目のアミノ酸(F)をL、A、G又はKに置換したFAD-GDHを各々大腸菌で組換え発現し、熱安定性を確認した。酵素サンプルを0.1mol/Lリン酸緩衝液(リン酸水素二ナトリウム+リン酸二水素カリウム)(pH7.0)中で熱処理(45℃、15分保温)し、残存活性を測定した。置換前のFAD-GDH(F429)を100%としたときの相対値で評価した。その結果、429番目のFを他のアミノ酸に置換することで熱安定性が低下した(図17)。即ち、429番目のFが熱安定性向上に関与していることが裏付けられた。
Claims (15)
- 以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列を有し、50℃で10分処理後の相対残存活性が50%以上である、グルコースデヒドロゲナーゼ:
(a)配列番号1又は配列番号13のアミノ酸配列に90%以上の同一性を示し、且つ配列番号1のアミノ酸配列の429位アミノ酸に相当するアミノ酸はフェニルアラニン(F)であるアミノ酸配列;
(b)配列番号2又は配列番号14のアミノ酸配列に90%以上の同一性を示し、且つ配列番号2のアミノ酸配列の429位アミノ酸に相当するアミノ酸はフェニルアラニン(F)であるアミノ酸配列。 - (a)における前記同一性と(b)における前記同一性が95%以上である、請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
- (a)における前記同一性と(b)における前記同一性が97%以上である、請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
- (a)における前記同一性と(b)における前記同一性が98%以上である、請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
- (a)における前記同一性と(b)における前記同一性が99%以上である、請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
- 配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
- 以下の(A)〜(C)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子:
(A)請求項1の(a)又は(b)のアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号5、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号15又は配列番号16の塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号5、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号15又は配列番号16の塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項7に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
- 請求項8に記載の組換えDNAを保有する微生物。
- 以下のステップ(1)〜(3)を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの調製法:
(1)請求項7に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を用意するステップ;
(2)前記遺伝子を発現させるステップ、及び
(3)発現産物を回収するステップ。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。
- 請求項12に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有する酵素剤。
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