JP2016034280A - 変異酵素及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]微生物由来グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列において、以下の(1)〜(13)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異酵素:
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列の115位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列の131位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(3)配列番号1に示すアミノ酸配列の132位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(4)配列番号1に示すアミノ酸配列の193位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(5)配列番号1に示すアミノ酸配列の353位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(6)配列番号1に示すアミノ酸配列の436位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(7)配列番号1に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(8)配列番号1に示すアミノ酸配列の472位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(9)配列番号1に示すアミノ酸配列の511位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(10)配列番号1に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(11)配列番号1に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(12)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(13)配列番号1に示すアミノ酸配列の583位アミノ酸に相当するアミノ酸。
[2]微生物由来グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列が配列番号1又は2のアミノ酸配列である、[1]に記載の変異酵素。
[3]置換されるアミノ酸が、(3)のアミノ酸、(5)のアミノ酸、(7)のアミノ酸又は(12)のアミノ酸、或いはこれらの中から選択される二以上のアミノ酸の組合せである、[1]又は[2]に記載の変異酵素。
[4]置換後のアミノ酸が、(3)のアミノ酸についてはアラニンであり、(5)のアミノ酸についてはアラニンであり、(7)のアミノ酸についてはヒスチジンであり、(12)のアミノ酸についてはセリン、アルギニン、ロイシン又はプロリンである、[3]に記載の変異酵素。
[5]置換されるアミノ酸が、(3)のアミノ酸、(7)のアミノ酸又は(12)のアミノ酸、或いはこれらの中から選択される二以上のアミノ酸の組合せである、[1]又は[2]に記載の変異酵素。
[6]置換後のアミノ酸が、(3)のアミノ酸についてはアラニンであり、(7)のアミノ酸についてはヒスチジンであり、(12)のアミノ酸についてはセリン、アルギニン、ロイシン又はプロリンである、[5]に記載の変異酵素。
[7]置換されるアミノ酸が、(7)のアミノ酸及び(12)のアミノ酸である、[1]又は[2]に記載の変異酵素。
[8]置換後のアミノ酸が、(7)のアミノ酸についてはヒスチジンであり、(12)のアミノ酸についてはセリン、アルギニン、ロイシン又はプロリンである、[7]に記載の変異酵素。
[9]配列番号7〜21、59〜61のいずれかのアミノ酸配列からなる、[1]に記載の変異酵素。
[10][1]〜[9]のいずれか一項に記載の変異酵素をコードする遺伝子。
[11]配列番号22〜36、62〜64のいずれかの塩基配列を含む、[10]に記載の遺伝子。
[12][10]又は[11]に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
[13][12]に記載の組換えDNAを保有する微生物。
[14][1]〜[9]のいずれか一項に記載の変異酵素を用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
[15][1]〜[9]のいずれか一項に記載の変異酵素を含むことを特徴とするグルコース測定用試薬。
[16][15]に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
[17][1]〜[9]のいずれか一項に記載の変異酵素を用いて工業製品又はその原料中のグルコース量を低下させることを特徴とする方法。
[18][1]〜[9]のいずれか一項に記載の変異酵素を含有する酵素剤。
[19]以下のステップ(i)及び(ii)を含む、変異酵素の設計法:
(i)微生物由来グルコースオキシダーゼ又は微生物由来フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼである変異対象酵素のアミノ酸配列において、以下の(1)〜(13)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸を特定するステップ:
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列の115位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列の131位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(3)配列番号1に示すアミノ酸配列の132位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(4)配列番号1に示すアミノ酸配列の193位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(5)配列番号1に示すアミノ酸配列の353位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(6)配列番号1に示すアミノ酸配列の436位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(7)配列番号1に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(8)配列番号1に示すアミノ酸配列の472位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(9)配列番号1に示すアミノ酸配列の511位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(10)配列番号1に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(11)配列番号1に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(12)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(13)配列番号1に示すアミノ酸配列の583位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(ii)変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定されたアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を構築するステップ。
[20]変異対象酵素が微生物由来グルコースオキシダーゼであり、ステップ(i)において置換されるアミノ酸が、(3)のアミノ酸、(5)のアミノ酸、(7)のアミノ酸又は(12)のアミノ酸、或いはこれらの中から選択される二以上のアミノ酸の組合せである、[19]に記載の設計法。
[21]変異対象酵素が微生物由来グルコースオキシダーゼであり、ステップ(i)において置換されるアミノ酸が、(3)のアミノ酸、(7)のアミノ酸又は(12)のアミノ酸、或いはこれらの中から選択される二以上のアミノ酸の組合せである、[19]に記載の設計法。
[22]変異対象酵素が微生物由来グルコースオキシダーゼであり、ステップ(i)において置換されるアミノ酸が、(7)のアミノ酸及び(12)のアミノ酸である、[19]に記載の設計法。
[23]微生物由来グルコースオキシダーゼが、アスペルギルス・ニガー又はペニシリウム・アマガサキエンスのグルコースオキシダーゼである、[20]〜[22]のいずれか一項に記載の設計法。
[24]グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列が配列番号1又は2のアミノ酸配列である、[23]に記載の設計法。
[25]変異対象酵素が、ペニシリウム・イタリカム、ペニシリウム・リラシノエチヌラティウム、アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・テレウスのフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼである、[19]に記載の設計法。
[26]フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が配列番号3〜6のいずれかのアミノ酸配列である、[25]に記載の設計法。
[27]以下のステップ(I)〜(III)を含む、変異酵素の調製法:
(I)配列番号7〜21、59〜61のいずれかのアミノ酸配列、又は[19]〜[26]のいずれか一項に記載の設計法によって構築されたアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。
(用語)
用語「変異酵素」とは、本明細書が開示する手法によって、「基になる酵素」を変異ないし改変して得られる酵素である。「変異酵素」、「変異型酵素」及び「改変型酵素」は置換可能に用いられる。基になる酵素は典型的には野生型酵素である。但し、既に人為的操作が施されている酵素を「基になる酵素」として本発明に適用することを妨げるものではない。尚、「基になる酵素」のことを本明細書では「変異対象酵素」又は「標的酵素」とも呼ぶ。
本発明の第1の局面は微生物由来のグルコースオキシダーゼ(GO)を変異させた酵素(以下「変異GO」とも呼ぶ)に関する。本発明の変異GOは、微生物由来のGO(変異対象酵素)のアミノ酸配列において、以下の(1)〜(13)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列の115位アミノ酸に相当するアミノ酸
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列の131位アミノ酸に相当するアミノ酸
(3)配列番号1に示すアミノ酸配列の132位アミノ酸に相当するアミノ酸
(4)配列番号1に示すアミノ酸配列の193位アミノ酸に相当するアミノ酸
(5)配列番号1に示すアミノ酸配列の353位アミノ酸に相当するアミノ酸
(6)配列番号1に示すアミノ酸配列の436位アミノ酸に相当するアミノ酸
(7)配列番号1に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸
(8)配列番号1に示すアミノ酸配列の472位アミノ酸に相当するアミノ酸
(9)配列番号1に示すアミノ酸配列の511位アミノ酸に相当するアミノ酸
(10)配列番号1に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸
(11)配列番号1に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸
(12)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸
(13)配列番号1に示すアミノ酸配列の583位アミノ酸に相当するアミノ酸
(1)タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度で安定な保存法として産業上の有用性もある。この場合、リガンドとして基質もしくはそのアナログ化合物を結合したタンパク質を結晶化すると良い。
(2)作製した結晶にX線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はX線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に−173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
(3)結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が未知の場合、分子置換法で構造決定することは不可能であり、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなX線散乱能のX線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を0に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善されるのである。また、非対称単位に複数の分子が含まれている場合、これらの分子の電子密度を平均化することにより位相が更に大幅に改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、MSI社(アメリカ)のQUANTA等のプログラムを用いて行われる。この後、MSI社のX-PLOR等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が既知の場合は、既知タンパク質の原子座標を用いて分子置換法により決定できる。分子置換と構造精密化はプログラム CNS_SOLVE ver.11などを用いて行うことができる。
(3)と(5)の組合せ
(3)と(7)の組合せ
(3)と(12)の組合せ
(5)と(7)の組合せ
(5)と(12)の組合せ
(7)と(12)の組合せ
(3)と(5)と(7)の組合せ
(3)と(5)と(12)の組合せ
(3)と(7)と(12)の組合せ
(5)と(7)と(12)の組合せ
(3)と(5)と(7)と(12)の組合せ
配列番号11: (3)と(5)の組合せ
配列番号12: (3)と(7)の組合せ
配列番号13: (3)と(12)の組合せ
配列番号14: (5)と(7)の組合せ
配列番号15: (5)と(12)の組合せ
配列番号16: (7)と(12)の組合せ
配列番号17: (3)と(5)と(7)の組合せ
配列番号18: (3)と(5)と(12)の組合せ
配列番号19: (3)と(7)と(12)の組合せ
配列番号20: (5)と(7)と(12)の組合せ
配列番号21: (3)と(5)と(7)と(12)の組合せ
配列番号59: (7)と(12)の組合せ
配列番号60: (7)と(12)の組合せ
配列番号61: (7)と(12)の組合せ
本発明の第2の局面は本発明の変異GOに関連する核酸を提供する。即ち、変異GOをコードする遺伝子、変異GOをコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、変異GOをコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
配列番号22: T132A
配列番号23: T353A
配列番号24: D446H
配列番号25: V582S
配列番号26: T132A及びT353A
配列番号27: T132A及びD446H
配列番号28: T132A及びV582S
配列番号29: T353A及びD446H
配列番号30: T353A及びV582S
配列番号31: D446H及びV582S
配列番号32: T132A、T353A及びD446H
配列番号33: T132A、T353A及びV582S
配列番号34: T132A、D446H及びV582S
配列番号35: T353A、D446H及びV582S
配列番号36: T132A、T353A、D446H及びV582S
配列番号62: D446H及びV582R
配列番号63: D446H及びV582L
配列番号64: D446H及びV582P
本発明の第3の局面は変異GOの用途に関する。この局面ではまず、変異GOを用いたグルコース測定法が提供される。本発明のグルコース測定法では本酵素による酸化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定する。本発明は例えば血糖値の測定、食品(調味料や飲料など)中のグルコース濃度の測定などに利用される。また、発酵食品(例えば食酢)又は発酵飲料(例えばビールや酒)の製造工程において発酵度を調べるために本発明を利用してもよい。
本発明の別の局面は変異酵素の設計法に関する。本発明の設計法では、以下のステップ(i)及び(ii)を実施する。
ステップ(i):微生物由来グルコースオキシダーゼ(微生物由来GO)又は微生物由来フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(微生物由来FDA-GDH)である変異対象酵素のアミノ酸配列において、以下の群より選択される一又は二以上のアミノ酸を特定する。
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列の115位アミノ酸に相当するアミノ酸
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列の131位アミノ酸に相当するアミノ酸
(3)配列番号1に示すアミノ酸配列の132位アミノ酸に相当するアミノ酸
(4)配列番号1に示すアミノ酸配列の193位アミノ酸に相当するアミノ酸
(5)配列番号1に示すアミノ酸配列の353位アミノ酸に相当するアミノ酸
(6)配列番号1に示すアミノ酸配列の436位アミノ酸に相当するアミノ酸
(7)配列番号1に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸
(8)配列番号1に示すアミノ酸配列の472位アミノ酸に相当するアミノ酸
(9)配列番号1に示すアミノ酸配列の511位アミノ酸に相当するアミノ酸
(10)配列番号1に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸
(11)配列番号1に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸
(12)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸
(13)配列番号1に示すアミノ酸配列の583位アミノ酸に相当するアミノ酸
アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)のGO: 配列番号1のアミノ酸配列
ペニシリウム・アマガサキエンス(Penicillium amagasakiense)のGO: 配列番号2のアミノ酸配列
ペニシリウム・イタリカム(Penicillium italicum)のFAD-GDH: 配列番号3のアミノ酸配列
ペニシリウム・リラシノエチヌラティウム(Penicillium lilacinoechinulatum)のFAD-GDH: 配列番号4のアミノ酸配列
アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)のFAD-GDH: 配列番号5のアミノ酸配列
アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)のFAD-GDH: 配列番号6のアミノ酸配列
尚、以上例示した各酵素について、上記(1)〜(13)のアミノ酸に該当するアミノ酸を図10の表にまとめて示す。
ステップ(ii):変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定されたアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を構築する。
本発明の更なる局面は変異酵素の調製法に関する。本発明の変異酵素調製法の一態様では、本発明者らが取得に成功した変異GOを遺伝子工学的手法で調製する。この態様の場合、配列番号7〜10のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を用意する(ステップ(I))。ここで、「特定のアミノ酸配列をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するポリペプチドが得られる核酸であり、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列からなる核酸は勿論のこと、そのような核酸に余分な配列(アミノ酸配列をコードする配列であっても、アミノ酸配列をコードしない配列であってもよい)が付加されていてもよい。また、コドンの縮重も考慮される。「配列番号7〜10のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸」は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。ここで、配列番号7〜10のアミノ酸配列はいずれも、アスペルギルス・ニガー由来GOのアミノ酸配列に変異を施したものである。従って、アスペルギルス・ニガー由来GOをコードする遺伝子(配列番号38)に対して必要な変異を加えることによっても、配列番号7〜10のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸(遺伝子)を得ることができる。位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照)、その中から適切な方法を選択して用いることができる。位置特異的変異導入法として、位置特異的アミノ酸飽和変異法を採用することができる。位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造を基に、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Semi-rational,semi-random」手法である(J.Mol.Biol.331,585-592(2003))。例えば、Quick change(ストラタジーン社)等のキット、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res. 16,7351-7367(1988))を用いて位置特異的アミノ酸飽和変異を導入することが可能である。PCRに用いるDNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼ等を用いることができる。但し、KOD-PLUS-(東洋紡社)、Pfu turbo(ストラタジーン社)などの精度の高いDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
アスペルギルス・ニガー由来GOと現在、アミノ酸配列の分かっているアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス、ペニシリウム・イタリカム、ペニシリウム・リラシノエチヌラティウム由来FAD-GDHのアライメント比較、及びすでに立体構造が明らかとなっているアスペルギルス・ニガー由来GOの立体構造から、GOの活性中心付近にあるアミノ酸の中で、FAD-GDH間では保存されている(共通性が高い)が、GOとFAD-GDHの間においては相違するアミノ酸を検索した(図2、3)。尚、アライメント比較にはClustalW2(EMBL(European Molecular Biology Laboratory)-EBI(European Bioinformatics Institute)のホームページ内に専用のサイトが設けられている。http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)を用いた。
GO遺伝子については、過去、大腸菌で発現させた報告が無いことからpYES2(インビトロジェン社)のHindIII-XhoII部分にGO遺伝子を挿入し、サッカロマイセス・セレビシエ(S.cerevisiae)を宿主として発現させることとした。
10×LAバッファー(タカラバイオ株式会社) 5μL
2.5mM dNTPs(タカラバイオ株式会社) 8μL
25mM MgCl2(タカラバイオ株式会社) 5μL
フォワードプライマー(50μM) 1μL
リバースプライマー(50μM) 1μL
Template 1μL
LA Taq(タカラバイオ株式会社) 0.5μL
stH2O 28.5μL
フォワードプライマー:GATCAGAAGCTTAAAAAAATGTCTACTCTCCTTGTGAGCTCG(配列番号39)
リバースプライマー:GATCAGCTCGAGTCACTGCATGGAAGCATAATC(配列番号40)
94℃で2分反応させた後、94℃で30秒、52℃で30秒、72℃で2分の反応サイクルを35回繰り返した後、72℃で7分反応させ、最後に4℃で放置
GO-L115-変異用プライマー:CCACCAACAATCAGACTGCGNNNATCCGCTCCGGAAATGG(配列番号41)
GO-G131-変異用プライマー:GCTCTACCCTCGTCAACGGTNNNACCTGGACTCGCCCC(配列番号42)
GO-T132-変異用プライマー:CTCGTCAACGGTGGCNNNTGGACTCGCCCCCAC(配列番号43)
GO-V193-変異用プライマー:CATGGTATCAATGGTACTNNNCACGCCGGACCCCGCG(配列番号44)
GO-T353-変異用プライマー:CAACCTTCAGGACCAGACCNNNTCTACCGTCCGCTCAC(配列番号45)
GO-F436-変異用プライマー:GTCGCATACTCGGAACTCNNNCTCGACACGGCCGGAG(配列番号46)
GO-D446-変異用プライマー:GCCGGAGTGGCCAGTTTCNNNGTGTGGGATCTTCTGC(配列番号47)
GO-Y472-変異用プライマー:CATCCTCCGCCATTTCGCANNNGACCCTCAGTACTTTCTCAAC(配列番号48)
GO-I551-変異用プライマー:CTTATTTCGCTGGAGAGACTNNNCCCGGTGACAACCTCGC(配列番号49)
GO-P535-変異用プライマー:CCCGTACAACTTCCGCNNNAACTACCATGGTGTGGGTACTTG(配列番号50)
GO-Y537-変異用プライマー:GTACAACTTCCGCCCTAACNNNCATGGTGTGGGTACTTGCTC(配列番号51)
GO-V582-変異用プライマー:CTACGCAAATGTCGTCCCATNNNATGACGGTCTTTTATGCCATGG(配列番号52)
GO-M583-変異用プライマー:CTACGCAAATGTCGTCCCATGTTNNNACGGTCTTTTATGCCATGG(配列番号53)
各々の発色液を80mmのろ紙に浸した後、プレートの上にのせ発色を確認した。
<GOアッセイ>
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 20mL
10% グルコース 5mL
25u/mL PO”Amano”3(天野エンザイム社) 5mL
o-ジアニジン 5mg
<GDHアッセイ>
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 23mL
10% グルコース 5mL
3mmol/L 1-メトキシPMS 1mL
6.6mmol/L NTB 1mL
プレートアッセイで確認できた陽性コロニー(GOアッセイで発色せず、GDHアッセイで発色したもの)について液体培養を行い、GO活性及びGDH活性を調べた。尚、実験操作はpYES2のマニュアルを参考にした。
<GOアッセイ用試薬>
フェノール含有リン酸緩衝液 19mL
10% グルコース 5mL
25u/mL PO”Amano”3(天野エンザイム社) 5mL
0.4g/dL 4-アミノアンチピリン 1mL
<GDHアッセイ用試薬>
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 21mL
10% グルコース 5mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
T132A:配列番号7:配列番号22
T353A:配列番号8:配列番号23
D446H:配列番号9:配列番号24
V582S:配列番号10:配列番号25
T132A及びT353A:配列番号11:配列番号26
T132A及びD446H:配列番号12:配列番号27
T132A及びV582S:配列番号13:配列番号28
T353A及びD446H:配列番号14:配列番号29
T353A及びV582S:配列番号15:配列番号30
D446H及びV582S:配列番号16:配列番号31
T132A、T353A及びD446H:配列番号17:配列番号32
T132A、T353A及びV582S:配列番号18:配列番号33
T132A、D446H及びV582S:配列番号19:配列番号34
T353A、D446H及びV582S:配列番号20:配列番号35
T132A、T353A、D446H及びV582S:配列番号21:配列番号36
有効な変異を有する酵素(変異型GO)についてGDH活性における基質特異性を調べた。
<GDHアッセイ用試薬>
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 21mL
10% 基質 5mL
3mmol/L PMS 1mL
6.6mmol/L NTB 3mL
有効な変異と考えられた遺伝子変異の組み合わせについて、効果を検証した。後の精製を簡略化するため、アスペルギルス・ニガーGO-1号菌由来グルコースオキシダーゼ遺伝子のC末端にヒスチジンタグを付加したGO遺伝子(GO-3)をPCR反応により作製し、pYES2に挿入してpYES-GO-3プラスミドを構築した。
10×LAバッファー(タカラバイオ株式会社) 5μL
2.5mM dNTPs(タカラバイオ株式会社) 8μL
25mM MgCl2(タカラバイオ株式会社) 5μL
フォワードプライマー(50μM) 1μL
リバースプライマー(50μM) 1μL
Template 1μL
LA Taq(タカラバイオ株式会社) 0.5μL
stH2O 28.5μL
フォワードプライマー:GATCAGAAGCTTAAAAAAATGTCTACTCTCCTTGTGAGCTCG(配列番号39)
リバースプライマー:GATCAGCTCGAGTCAATGGTGATGGTGATGATGCTGCATGGAAGCATAATC(配列番号54)
94℃で2分反応させた後、94℃で30秒、52℃で30秒、72℃で2分の反応サイクルを35回繰り返した後、72℃で7分反応させ、最後に4℃で放置
GO-T353A-1:CCTTCAGGACCAGACCGCTTCTACCGTCCGCTCAC(配列番号56)
GO-D446H-1:GGAGTGGCCAGTTTCCATGTGTGGGATCTTCTGC(配列番号57)
GO-V582S-1:CGCAAATGTCGTCCCATTCTATGACGGTCTTTTATGCCATGG(配列番号58)
フェーノール含有リン酸緩衝液 19mL
10% グルコース 5mL
25u/mL PO-3 5mL
0.4g/dL 4-A.A 1mL
<GDHアッセイ用試薬>
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 21mL
10% グルコース 5mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
次に、効果の認められたT132A、D446H、V582Sの組み合わせ(T132A及びD446H、T132A及びV582S、D446H及びV582S、T132A、D446H及びV582S)について、形質転換株の液体培養を行い、Ni-Sepharoseを用いて精製後、比活性及び基質特異性を調べた。なお、液体培養での発現はpYES2のマニュアルを参考にした。
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH7.0 21mL
10% グルコース 5mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 21mL
10% 基質 5mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
D446及びV582の変異組み合わせについて、各々のアミノ酸が最適なアミノ酸の組み合わせになるように、pYES-GO-K-P-2プラスミドを鋳型として、配列番号47及び配列番号52の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuikChange Site-Directed Mutagensesis Kit(ストラタジーン社)を用い、添付のプロトコールに従って変異操作を行い、変異グルコースオキシダーゼを有するプラスミドを構築した。変異導入後のプラスミドを大腸菌DH5αに形質転換後、プラスミド抽出を行い、D446及びV582多重変異ライブラリーを作製した。得られたライブラリーをサッカロマイセス・セレビシエINVSc1(インビトロジェン社)に形質転換し、得られた形質転換体について、96穴ディープウェルを用いて液体培養を行い、検討実施前の組み合わせであるD446H及びV582Sをコントロールとして、GDH活性及びGDH/GO活性比が向上したものを取得した。尚、実験操作はpYES2のマニュアルを参考にした。
(1)培養及び精製
液体培養での発現はpYES2のマニュアルを参考にし、保存プレートより500mL坂口フラスコに調製した100mLの0.67% アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製)、2% グルコースを含有する培地(pH5.4)に接種し、30℃、140回転/分、20時間前培養を行った。
変異型GO部分精製酵素(D446H,V582P多重変異酵素)について、GDH活性における基質特異性を調べた。
<GDHアッセイ用試薬>
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 21mL
10% 基質 5mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
配列番号41〜53、55〜58:人工配列の説明:変異導入用プライマー
Claims (13)
- 配列番号2のアミノ酸配列において、以下の(a)及び/又は(b)のアミノ酸置換が行われたアミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなる、基になる酵素と比較してグルコースデヒドロゲナーゼ/グルコースオキシダーゼ活性比が向上した変異酵素:
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸のヒスチジンへの置換;
(b)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸のプロリンへの置換。 - 請求項1に記載の変異酵素をコードする遺伝子。
- 請求項2に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
- 請求項3に記載の組換えDNAを保有する微生物。
- 請求項1に記載の変異酵素を用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
- 請求項1に記載の変異酵素を含むことを特徴とするグルコース測定用試薬。
- 請求項6に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
- 請求項1に記載の変異酵素を用いて工業製品又はその原料中のグルコース量を低下させることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の変異酵素を含有する酵素剤。
- 以下のステップ(i)及び(ii)を含む、基になる酵素と比較してグルコースデヒドロゲナーゼ/グルコースオキシダーゼ活性比が向上した変異酵素の設計法:
(i)ペニシリウム・アマガサキエンス由来グルコースオキシダーゼである変異対象酵素のアミノ酸配列において、以下の(7)及び/又は(12)のアミノ酸を特定するステップ:
(7)配列番号1に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(12)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(ii)変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定されたアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を構築するステップ。 - ステップ(i)において置換されるアミノ酸が、(7)のアミノ酸及び(12)のアミノ酸である、請求項10に記載の設計法。
- グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列が配列番号2のアミノ酸配列である、請求項10〜11のいずれか一項に記載の設計法。
- 以下のステップ(I)〜(III)を含む、変異酵素の調製法:
(I)請求項10〜12のいずれか一項に記載の設計法によって構築されたアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。
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