JP5846687B2 - 変異酵素及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は変異酵素及び酵素の改変法に関し、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）化されたグルコースオキシダーゼ及びその調製法等を提供する。本出願は、２００９年１２月５日に出願された日本国特許出願第２００９−２７７０９６号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
電気化学的バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられている。当該バイオセンサにはグルコースを基質とする酵素であるグルコースオキシダーゼ（以下「GO」と略称する）やグルコースデヒドロゲナーゼ（以下「GDH」と略称する）が利用されている。GOはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点がある一方で、それを用いた測定においては測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。
一方、溶存酸素の影響を受けず且つNAD(P)非存在下でグルコースに作用する酵素としてピロロキノリン（PQQ）を補酵素とするGDH（以下、「PQQ-GDH」と略称する）が知られている（例えば特許文献１〜３を参照）。しかしながらPQQ-GDHには、（１）PQQが酵素から解離しやすいこと、（２）グルコースに対する選択性が低いこと、及び（３）一般に膜画分に存在していることからその抽出・単離操作に困難を伴うことなどの問題がある。
PQQ-GDHの他、溶存酸素の影響を受けず且つNAD(P)非存在下でグルコースに作用する酵素としてフラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするGDH（以下、「FAD-GDH」と略称する）が知られている。これまでに、アスペルギルス・オリゼ（非特許文献１〜４、特許文献４）及びアスペルギルス・テレウス（特許文献５）からそれぞれFAD-GDHが取得されている。FAD-GDHの一般的な特性としてキシロースに対する反応性が比較的高いこと（例えば特許文献５に開示されたFAD-GDHの場合、キシロースに対する反応性はグルコースに対する作用性の10％程度）及び至適温度が高いこと（例えば特許文献４に開示されたFAD-GDHの至適温度は約60℃）が知られている。尚、実用性を高める等の目的の下、酵素の改変が精力的に試みられている。FAD-GDHの改変を報告する文献を以下に示す（特許文献６〜９）。
最近、GOの構造を利用してFAD-GDHの立体構造解析を行い、Glu414及びArg502が基質認識に重要であることが報告された（非特許文献５、６）。
特開２０００−３５０５８８号公報 特開２００１−１９７８８８号公報 特開２００１−３４６５８７号公報 国際公開第２００７／１３９０１３号パンフレット 国際公開第２００４／０５８９５８号パンフレット 特開２００９−２２５８０１号公報 特開２００９−２２５８００号公報 特開２００９−１５９９６４号公報 特開２００８−２３７２１０号公報
Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. I. Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 139, 265-276 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purification and physical and chemical properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 139, 277-293 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. III. General enzymatic properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 146, 317-327 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 146, 328-335 (1967). 2009年度 日本薬学会 年会要旨集 巻：129 号：3 ページ：118 演題番号：26Q-pm115 2009年度 日本生化学会 大会要旨集 演題番号：3T5a-5（3P-109）
FAD-GDHにはPQQ-GDHに比較して有利な点がある。その一方で、FAD-GDHはキシロースに対する反応性が比較的高いため、キシロース負荷試験を受けている者の血糖を測定する場合には正確な測定値を検出し難いという問題を抱える。また、至適温度が高いため、寒冷地での測定など、温度が低い環境下で測定する場合には十分な活性を発揮できない。このような測定条件では温度補正が必要であり測定誤差も生じ易い。以上のように既存のFAD-GDHには改善すべき点があり、実用性の更なる向上が望まれるところである。本発明の課題の一つはこのような要望に応えることにある。本発明の今ひとつの課題は、酵素の改変に関して新規な手法を提供することである。
実用性の高いGDHを得るためのアプローチとしては大別して（１）既存のGDH（FAD-GDHやPQQ-GDH）を改変する方法と（２）微生物等をスクリーニングする方法の二つがある。これらのアプローチは既に多数の試みがあり（例えば上掲の特許文献６、７）、今後、より有効な酵素の創出に繋がる可能性は低い。この状況に鑑みて本発明者らは、グルコースオキシダーゼ（GO）にはFAD-GDHが抱える上記問題点がないことに着目した。GOとFAD-GDHはアミノ酸配列の相同性が比較的高いことが知られている。この相同性に注目し、GOにGDH活性を付与すること、即ちGOをGDH化するという、新たなアプローチを採ることにした。まず、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のGOを選択し、そのアミノ酸配列を既知の複数のFAD-GDHのアミノ酸配列とマルチプルアライメントした。そして、アライメント結果とGOの立体構造データを利用することにより、GOの活性中心付近にあるアミノ酸の中で、FAD-GDH間では保存されている（共通性が高い）が、GOとFAD-GDHの間においては相違するアミノ酸を検索した。結果、13箇所のアミノ酸位置が特定された。次に、これらのアミノ酸位置に変異を導入した変異酵素を作製してその特性を調べたところ、GDH活性とGO活性の比率（GDH活性／GO活性）が上昇した変異酵素を認めた。そこで、当該変異酵素の配列を解析することにした。このようにして、GDH活性の上昇、即ちGDH化に有効な4箇所のアミノ酸位置を特定することに成功した。この結果は一方で、最初に特定された13箇所の内、当該4箇所以外はGDH活性の上昇に有効でないことを示唆する。しかしながら、GOとFAD-GDHの詳細な比較により見出されたアミノ酸位置であることには相違ないことから、残りの9箇所についても基質特性、補酵素特異性、温度安定性など、他の特性の改良・改善に有用である可能性を秘める。また、二つ以上を併用することによってGDH活性やその他の特性が向上する可能性もある。このように、残りの9箇所のアミノ酸位置にも価値があり、その活用が期待される。
一方、更なる検討の結果、GDH化に特に有効な置換位置の組合せを特定することに成功した。当該組合せを採用した場合、基質特異性も良好（キシロースへの反応性が低い）であった。また、最も優れた組合せについて、置換の最適化（即ち、最も有効な置換後のアミノ酸の特定）を試みた結果、GDH化に有効な置換後のアミノ酸が特定されるとともに、完全なGDH化をもたらす、置換後のアミノ酸が見出された。尚、完全にGDH化された変異体は基質特異性にも優れる（キシロースへの反応性が低い）ことが確認された。
ところで、効果的な二つのアミノ酸変異を組み合わせることによって相加的又は相乗的効果が生まれる可能性が高いことも多く経験するところである。従って、特定に成功した4箇所の変異対象位置は単独に限らず、その組合せについてもGDH化に有効といえる。
また、同種の酵素については構造（一次構造、立体構造）の類似性が高く、同様の変異が同様の効果を生む蓋然性が高いという技術常識に鑑みれば、後述の実施例に示したアスペルギルス・ニガーのGOとの間で実際に構造上の類似性が非常に高いペニシリウム・アマガサキエンス（Penicillium amagasakiense）のGOやその他のGOについても、本発明者らが見出した変異手法を適用可能といえる。
以上のように本発明者らは、GOをGDH化することに成功し、GDH活性の高い変異型GOを創出した。併せて、GOの変異に有効なアミノ酸位置を特定することにも成功した。得られた変異型GOの中にはキシロースへの反応性を示さないものがあった。即ち、キシロースへの反応性を示さない点において既存のFAD-GDHを凌駕するGDHの取得に成功した。
以上の成果は一方で、構造の類似性の高い二種類の酵素間においては、アミノ酸配列を網羅的に比較するとともに活性中心付近の立体構造を利用するというアプローチが酵素の改変（特に、改変対象の酵素に対して、他方の酵素が有する特性又は他方の酵素の方がより好ましい状態で備える特性を付与すること）に有効であることを裏付ける。
以下に示す本発明は以上の成果に基づく。
［１］微生物由来グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列において、以下の(1)〜(13)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異酵素：
(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の115位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の131位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の132位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(4)配列番号１に示すアミノ酸配列の193位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(5)配列番号１に示すアミノ酸配列の353位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(6)配列番号１に示すアミノ酸配列の436位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(7)配列番号１に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(8)配列番号１に示すアミノ酸配列の472位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(9)配列番号１に示すアミノ酸配列の511位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(10)配列番号１に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(11)配列番号１に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(12)配列番号１に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(13)配列番号１に示すアミノ酸配列の583位アミノ酸に相当するアミノ酸。
［２］微生物由来グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列が配列番号１又は２のアミノ酸配列である、［１］に記載の変異酵素。
［３］置換されるアミノ酸が、(3)のアミノ酸、(5)のアミノ酸、(7)のアミノ酸又は(12)のアミノ酸、或いはこれらの中から選択される二以上のアミノ酸の組合せである、［１］又は［２］に記載の変異酵素。
［４］置換後のアミノ酸が、(3)のアミノ酸についてはアラニンであり、(5)のアミノ酸についてはアラニンであり、(7)のアミノ酸についてはヒスチジンであり、(12)のアミノ酸についてはセリン、アルギニン、ロイシン又はプロリンである、［３］に記載の変異酵素。
［５］置換されるアミノ酸が、(3)のアミノ酸、(7)のアミノ酸又は(12)のアミノ酸、或いはこれらの中から選択される二以上のアミノ酸の組合せである、［１］又は［２］に記載の変異酵素。
［６］置換後のアミノ酸が、(3)のアミノ酸についてはアラニンであり、(7)のアミノ酸についてはヒスチジンであり、(12)のアミノ酸についてはセリン、アルギニン、ロイシン又はプロリンである、［５］に記載の変異酵素。
［７］置換されるアミノ酸が、(7)のアミノ酸及び(12)のアミノ酸である、［１］又は［２］に記載の変異酵素。
［８］置換後のアミノ酸が、(7)のアミノ酸についてはヒスチジンであり、(12)のアミノ酸についてはセリン、アルギニン、ロイシン又はプロリンである、［７］に記載の変異酵素。
［９］配列番号７〜２１、５９〜６１のいずれかのアミノ酸配列からなる、［１］に記載の変異酵素。
［１０］［１］〜［９］のいずれか一項に記載の変異酵素をコードする遺伝子。
［１１］配列番号２２〜３６、６２〜６４のいずれかの塩基配列を含む、［１０］に記載の遺伝子。
［１２］［１０］又は［１１］に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
［１３］［１２］に記載の組換えDNAを保有する微生物。
［１４］［１］〜［９］のいずれか一項に記載の変異酵素を用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
［１５］［１］〜［９］のいずれか一項に記載の変異酵素を含むことを特徴とするグルコース測定用試薬。
［１６］［１５］に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
［１７］［１］〜［９］のいずれか一項に記載の変異酵素を用いて工業製品又はその原料中のグルコース量を低下させることを特徴とする方法。
［１８］［１］〜［９］のいずれか一項に記載の変異酵素を含有する酵素剤。
［１９］以下のステップ(i)及び(ii)を含む、変異酵素の設計法：
(i)微生物由来グルコースオキシダーゼ又は微生物由来フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼである変異対象酵素のアミノ酸配列において、以下の(1)〜(13)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸を特定するステップ：
(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の115位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の131位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の132位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(4)配列番号１に示すアミノ酸配列の193位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(5)配列番号１に示すアミノ酸配列の353位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(6)配列番号１に示すアミノ酸配列の436位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(7)配列番号１に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(8)配列番号１に示すアミノ酸配列の472位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(9)配列番号１に示すアミノ酸配列の511位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(10)配列番号１に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(11)配列番号１に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(12)配列番号１に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(13)配列番号１に示すアミノ酸配列の583位アミノ酸に相当するアミノ酸；
(ii)変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定されたアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を構築するステップ。
［２０］変異対象酵素が微生物由来グルコースオキシダーゼであり、ステップ(i)において置換されるアミノ酸が、(3)のアミノ酸、(5)のアミノ酸、(7)のアミノ酸又は(12)のアミノ酸、或いはこれらの中から選択される二以上のアミノ酸の組合せである、［１９］に記載の設計法。
［２１］変異対象酵素が微生物由来グルコースオキシダーゼであり、ステップ(i)において置換されるアミノ酸が、(3)のアミノ酸、(7)のアミノ酸又は(12)のアミノ酸、或いはこれらの中から選択される二以上のアミノ酸の組合せである、［１９］に記載の設計法。
［２２］変異対象酵素が微生物由来グルコースオキシダーゼであり、ステップ(i)において置換されるアミノ酸が、(7)のアミノ酸及び(12)のアミノ酸である、［１９］に記載の設計法。
［２３］微生物由来グルコースオキシダーゼが、アスペルギルス・ニガー又はペニシリウム・アマガサキエンスのグルコースオキシダーゼである、［２０］〜［２２］のいずれか一項に記載の設計法。
［２４］グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列が配列番号１又は２のアミノ酸配列である、［２３］に記載の設計法。
［２５］変異対象酵素が、ペニシリウム・イタリカム、ペニシリウム・リラシノエチヌラティウム、アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・テレウスのフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼである、［１９］に記載の設計法。
［２６］フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列である、［２５］に記載の設計法。
［２７］以下のステップ(I)〜(III)を含む、変異酵素の調製法：
(I)配列番号７〜２１、５９〜６１のいずれかのアミノ酸配列、又は［１９］〜［２６］のいずれか一項に記載の設計法によって構築されたアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ；
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。
アスペルギルス・ニガー由来GOのアミノ酸配列とペニシリウム・アマガサキエンス由来GOのアミノ酸配列の比較。変異対象のアミノ酸を下線で示した。変異対象のアミノ酸の内、GDH活性の向上に有効であったアミノ酸を太字で示した。矢印は活性中心のアミノ酸。「＊」は同一（identical）を表し、「：」は保存的置換（conserved substitutions）を表し、「．」は半保存的置換（semi-conserved substitutions）を表す。 微生物由来GOと微生物由来FAD-GDHのアミノ酸配列の比較。上段から順にペニシリウム・イタリカムFAD-GDHのアミノ酸配列（配列番号３のN末端側部分）、ペニシリウム・リラシノエチヌラティウムFAD-GDHのアミノ酸配列（配列番号４のN末端側部分）、アスペルギルス・オリゼFAD-GDHのアミノ酸配列（配列番号５のN末端側部分）、アスペルギルス・テレウスFAD-GDHのアミノ酸配列（配列番号６のN末端側部分）、アスペルギルス・ニガーGOのアミノ酸配列（配列番号１のN末端側部分）が示される。GOの活性中心付近にあるアミノ酸の中で、FAD-GDH間では保存されている（共通性が高い）が、GOとFAD-GDHの間においては相違するアミノを下線で示すとともにN末端側から順に番号を付した。 微生物由来GOと微生物由来FAD-GDHのアミノ酸配列の比較（図１の続き）。上段から順にペニシリウム・イタリカムFAD-GDHのアミノ酸配列（配列番号３のC末端側部分）、ペニシリウム・リラシノエチヌラティウムFAD-GDHのアミノ酸配列（配列番号４のC末端側部分）、アスペルギルス・オリゼFAD-GDHのアミノ酸配列（配列番号５のC末端側部分）、アスペルギルス・テレウスFAD-GDHのアミノ酸配列（配列番号６のC末端側部分）、アスペルギルス・ニガーGOのアミノ酸配列（配列番号１のC末端側部分）が示される。GOの活性中心付近にあるアミノ酸の中で、FAD-GDH間では保存されている（共通性が高い）が、GOとFAD-GDHの間においては相違するアミノを下線で示し、N末端側から順に番号を付した。矢印はGOの活性中心のアミノ酸。 PCRで増幅されたアスペルギルス・ニガーGOの遺伝子配列を含む配列（配列番号３７）。5'末端にはHindIIIサイト（囲み）とKozak配列（下線）を、3'末端側にはXhoIサイト（囲み）を付加している。尚、Kozak配列を付加したことにより2つ目のアミノ酸がグルタミンからセリンに変更している。アスペルギルス・ニガーGOの遺伝子配列を配列番号３８に示す。 プレートアッセイの結果。変異を導入したプラスミドを含むライブラリー（サッカロマイセス・セレビシエ）を作製し、生育してきたコロニーを発現プレートにレプリカ後、プレートアッセイでGO活性及びGDH活性を調べた。 液体培養での活性確認の結果を示す表。変異酵素形質転換株の内、陽性コロニー（GOアッセイで発色せず、GDHアッセイで発色したもの）を確認できたものについて液体培養し、GO活性及びGDH活性を比較した。未変異（pYES-GO）に比較し、GDH活性値及びGDH活性とGO活性の比（GDH活性／GO活性）がともに高いものを網掛けで示した。表中のpYES-GOは未変異の形質転換株を、同pYES2は遺伝子を挿入する前のプラスミドで形質転換した形質転換株を、同GOはGO”Amano”2(天野エンザイム社)を、同FAD-GDHはGDH”Amano”8(天野エンザイム社)をそれぞれ表す。 液体培養での活性確認の結果を示すグラフ。各変異酵素形質転換株のGOH活性及びGO活性をバーで示し、GDH活性／GO活性を折れ線で示す。pYES-GOは未変異の形質転換株を表す。グラフ中のpYES-GOは未変異の形質転換株を、同pYES2は遺伝子を挿入する前のプラスミドで形質転換した形質転換株を、同GOはGO”Amano”2(天野エンザイム社)を、同FAD-GDHはGDH”Amano”8(天野エンザイム社)をそれぞれ表す。 GDH/GO活性比に大きな変化を認めた変異酵素形質転換株の変異を示す表。5-1-5のT353Hは混合に起因すると推測した。同様に、7-2-17のD446S及び7-2-42のD446Rも混合に起因すると推測した。 変異型GOの基質特異性を示すグラフ。グルコースへの反応性に対する相対値として各基質への反応性を算出した。pYES-GOは未変異の形質転換株を表す。 各酵素における変異対象アミノ酸を示す表。(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の115位アミノ酸に相当するアミノ酸、(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の131位アミノ酸に相当するアミノ酸、(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の132位アミノ酸に相当するアミノ酸、(4)配列番号１に示すアミノ酸配列の193位アミノ酸に相当するアミノ酸、(5)配列番号１に示すアミノ酸配列の353位アミノ酸に相当するアミノ酸、(6)配列番号１に示すアミノ酸配列の436位アミノ酸に相当するアミノ酸、(7)配列番号１に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸、(8)配列番号１に示すアミノ酸配列の472位アミノ酸に相当するアミノ酸、(9)配列番号１に示すアミノ酸配列の511位アミノ酸に相当するアミノ酸、(10)配列番号１に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸、(11)配列番号１に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸、(12)配列番号１に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸、(13)配列番号１に示すアミノ酸配列の583位アミノ酸に相当するアミノ酸を酵素毎に示した。 多重変異型GOの活性の比較。変異の組合せが異なる各種形質転換株のGDH/GO活性比を、培養上清をサンプルとして比較した。各変異酵素形質転換株が有する変異を○で示した。 有効な変異の組合せを有する変異酵素形質転換株が産生する変異型酵素の比活性。各変異酵素形質転換株が有する変異を○で示した。 有効な変異の組合せを有する変異酵素形質転換株が産生する変異型酵素の基質特異性。マルトース、キシロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース及びラクトースへの反応性を比較した。 D446及びV582多重変異酵素の活性の比較。置換後のアミノ酸が異なる各種酵素についてGDH/GO活性比を比較した。＊：GO活性が検出限界以下。 D446H及びV582P多重変異酵素の基質特異性。マルトース、キシロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース及びラクトースへの反応性をFAD-GDH（GDH”Amano”8(天野エンザイム社)）と比較した。
説明の便宜上、本発明に関して使用する用語の一部について以下で定義する。
（用語）
用語「変異酵素」とは、本明細書が開示する手法によって、「基になる酵素」を変異ないし改変して得られる酵素である。「変異酵素」、「変異型酵素」及び「改変型酵素」は置換可能に用いられる。基になる酵素は典型的には野生型酵素である。但し、既に人為的操作が施されている酵素を「基になる酵素」として本発明に適用することを妨げるものではない。尚、「基になる酵素」のことを本明細書では「変異対象酵素」又は「標的酵素」とも呼ぶ。
ある酵素（説明の便宜上A酵素と呼ぶ）を別の酵素（説明の便宜上B酵素と呼ぶ）に近似させること、即ちA酵素の一つ以上の特性をB酵素の対応する特性に近づけるように改変することを「A酵素をB酵素化する」と称する。ここでの「特性」の例は酵素活性（例えばA酵素がグルコースオキシダーゼの場合にはグルコースオキシダーゼ活性）、基質特異性、温度特性（至適温度、温度安定性など）、pH特性（至適pH、pH安定性）、補酵素特異性、メディエーターとの反応性である。
（グルコースオキシダーゼを変異させた酵素）
本発明の第１の局面は微生物由来のグルコースオキシダーゼ（GO）を変異させた酵素（以下「変異GO」とも呼ぶ）に関する。本発明の変異GOは、微生物由来のGO（変異対象酵素）のアミノ酸配列において、以下の(1)〜(13)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。
(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の115位アミノ酸に相当するアミノ酸
(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の131位アミノ酸に相当するアミノ酸
(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の132位アミノ酸に相当するアミノ酸
(4)配列番号１に示すアミノ酸配列の193位アミノ酸に相当するアミノ酸
(5)配列番号１に示すアミノ酸配列の353位アミノ酸に相当するアミノ酸
(6)配列番号１に示すアミノ酸配列の436位アミノ酸に相当するアミノ酸
(7)配列番号１に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸
(8)配列番号１に示すアミノ酸配列の472位アミノ酸に相当するアミノ酸
(9)配列番号１に示すアミノ酸配列の511位アミノ酸に相当するアミノ酸
(10)配列番号１に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸
(11)配列番号１に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸
(12)配列番号１に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸
(13)配列番号１に示すアミノ酸配列の583位アミノ酸に相当するアミノ酸
後述の実施例に示す通り、上記115位アミノ酸、131位アミノ酸、132位アミノ酸、193位アミノ酸、353位アミノ酸、436位アミノ酸、446位アミノ酸、472位アミノ酸、511位アミノ酸、535位アミノ酸、537位アミノ酸、582位アミノ酸及び583位アミノ酸は、アスペルギルス・ニガーのGOと複数種のFAD-GDHとの比較によって見出されたアミノ酸であり、GOの活性中心付近にあり且つGOに特徴的である。本発明では、GOの特性に重要な役割を果たすと考えられる、これらのアミノ酸に相当するアミノ酸を変異させることによって、酵素の特性の改良・改善を図る。
ここで、本明細書においてアミノ酸残基について使用する場合の用語「相当する」とは、比較されるタンパク質（酵素）間においてその機能の発揮に同等の貢献をしていることを意味する。例えば、基準のアミノ酸配列（即ち配列番号１のアミノ酸配列）に対して比較対象のアミノ酸配列を、一次構造（アミノ酸配列）の部分的な相同性を考慮しつつ、最適な比較ができるように並べたときに（このときに必要に応じてギャップを導入し、アライメントを最適化してもよい）、基準のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を「相当するアミノ酸」として特定することができる。一次構造同士の比較に代えて、又はこれに加えて立体構造（三次元構造）同士の比較によって「相当するアミノ酸」を特定することもできる。立体構造情報を利用することによって信頼性の高い比較結果が得られる。この場合は、複数の酵素の立体構造の原子座標を比較しながらアライメントを行っていく手法を採用できる。変異対象酵素の立体構造情報は例えばProtein Data Bank（http://www.pdbj.org/index_j.html）より取得することができる。
Ｘ線結晶構造解析によるタンパク質立体構造の決定方法の一例を以下に示す。
（１）タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度で安定な保存法として産業上の有用性もある。この場合、リガンドとして基質もしくはそのアナログ化合物を結合したタンパク質を結晶化すると良い。
（２）作製した結晶にＸ線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はＸ線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に−173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
（３）結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が未知の場合、分子置換法で構造決定することは不可能であり、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなＸ線散乱能のＸ線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を０に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善されるのである。また、非対称単位に複数の分子が含まれている場合、これらの分子の電子密度を平均化することにより位相が更に大幅に改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、MSI社（アメリカ）のQUANTA等のプログラムを用いて行われる。この後、MSI社のX-PLOR等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が既知の場合は、既知タンパク質の原子座標を用いて分子置換法により決定できる。分子置換と構造精密化はプログラム CNS_SOLVE ver.11などを用いて行うことができる。
変異対象酵素である微生物由来GOの例はアスペルギルス・ニガー由来GO及びペニシリウム・アマガサキエンス由来GOである。公共のデータベースに登録されているアスペルギルス・ニガー由来GOのアミノ酸配列及びペニシリウム・アマガサキエンス由来GOのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。また、これら二つのアミノ酸配列のアライメント比較を図１に示す。
配列番号１のアミノ酸配列を有するアスペルギルス・ニガー由来GOを変異対象酵素としたとき、上記(1)のアミノ酸は配列番号１の115位アミノ酸となり、上記(2)のアミノ酸は配列番号１の131位アミノ酸となり、上記(3)のアミノ酸は配列番号１の132位アミノ酸となり、上記(4)のアミノ酸は配列番号１の193位アミノ酸となり、上記(5)のアミノ酸は配列番号１の353位アミノ酸となり、上記(6)のアミノ酸は配列番号１の436位アミノ酸となり、上記(7)のアミノ酸は配列番号１の446位アミノ酸となり、上記(8)のアミノ酸は配列番号１の472位アミノ酸となり、上記(9)のアミノ酸は配列番号１の511位アミノ酸となり、上記(10)のアミノ酸は配列番号１の535位アミノ酸となり、上記(11)のアミノ酸は配列番号１の537位アミノ酸となり、上記(12)のアミノ酸は配列番号１の582位アミノ酸となり、上記(13)のアミノ酸は配列番号１の583位アミノ酸となる。
一方、配列番号２のアミノ酸配列を有するペニシリウム・アマガサキエンス由来GOを変異対象酵素としたとき、上記(1)のアミノ酸は配列番号２の115位アミノ酸となり、上記(2)のアミノ酸は配列番号２の131位アミノ酸となり、上記(3)のアミノ酸は配列番号２の132位アミノ酸となり、上記(4)のアミノ酸は配列番号２の193位アミノ酸となり、上記(5)のアミノ酸は配列番号２の353位アミノ酸となり、上記(6)のアミノ酸は配列番号２の436位アミノ酸となり、上記(7)のアミノ酸は配列番号２の446位アミノ酸となり、上記(8)のアミノ酸は配列番号２の472位アミノ酸となり、上記(9)のアミノ酸は配列番号２の511位アミノ酸となり、上記(10)のアミノ酸は配列番号２の535位アミノ酸となり、上記(11)のアミノ酸は配列番号２の537位アミノ酸となり、上記(12)のアミノ酸は配列番号２の582位アミノ酸となり、上記(13)のアミノ酸は配列番号２の583位アミノ酸となる。
置換されるアミノ酸は、好ましくは、(3)のアミノ酸、(5)のアミノ酸、(7)のアミノ酸又は(12)のアミノ酸である。これらは、後述の実施例に示す通り、GDH活性の向上に有効であることが確認されたアミノ酸である。これらのアミノ酸の少なくとも一つが置換された変異GOでは、変異前の酵素に比較して高いGDH活性を発揮し得る。(3)のアミノ酸が置換されている変異GOの具体例は配列番号７のアミノ酸配列からなる酵素である。同様に、(5)のアミノ酸が置換されている変異GOの具体例は配列番号８のアミノ酸配列からなる酵素であり、(7)のアミノ酸が置換されている変異GOの具体例は配列番号９のアミノ酸配列からなる酵素であり、(12)のアミノ酸が置換されている変異GOの具体例は配列番号１０のアミノ酸配列からなる酵素である。これらの変異GOはいずれも、変異前の酵素であるアスペルギルス・ニガー由来GOに比較して高いGDH活性を示す。
置換後のアミノ酸の種類は特に限定されないが、好ましくは、いわゆる「保存的アミノ酸置換」に該当しないように、置換後のアミノ酸が選択される。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は典型的には同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
置換後のアミノ酸の例を挙げると、(3)のアミノ酸についてはアラニンであり、(5)のアミノ酸についてはアラニンであり、(7)のアミノ酸についてはヒスチジンであり、(12)のアミノ酸についてセリン、アルギニン、ロイシン及びプロリンである。
上記(1)〜(13)のアミノ酸の内、二つ以上のアミノ酸が置換されていてもよい。置換されるアミノ酸の組合せの例を以下に列挙する。
(3)と(5)の組合せ
(3)と(7)の組合せ
(3)と(12)の組合せ
(5)と(7)の組合せ
(5)と(12)の組合せ
(7)と(12)の組合せ
(3)と(5)と(7)の組合せ
(3)と(5)と(12)の組合せ
(3)と(7)と(12)の組合せ
(5)と(7)と(12)の組合せ
(3)と(5)と(7)と(12)の組合せ
以上の組合せを適用して得られる変異酵素のアミノ酸配列の例を配列番号１１〜２１に示す。これらの配列はアスペルギルス・ニガーのGOに対して上記組合せを適用して得られる変異GOのアミノ酸配列である。配列番号と変異の組合せの対応関係は次の通りである。
配列番号１１： (3)と(5)の組合せ
配列番号１２： (3)と(7)の組合せ
配列番号１３： (3)と(12)の組合せ
配列番号１４： (5)と(7)の組合せ
配列番号１５： (5)と(12)の組合せ
配列番号１６： (7)と(12)の組合せ
配列番号１７： (3)と(5)と(7)の組合せ
配列番号１８： (3)と(5)と(12)の組合せ
配列番号１９： (3)と(7)と(12)の組合せ
配列番号２０： (5)と(7)と(12)の組合せ
配列番号２１： (3)と(5)と(7)と(12)の組合せ
配列番号５９： (7)と(12)の組合せ
配列番号６０： (7)と(12)の組合せ
配列番号６１： (7)と(12)の組合せ
後述の実施例（変異の組合せの効果の確認）に示した実験結果を踏まえると、以上の組合せの中でも、(3)と(12)の組合せ、(7)と(12)の組合せ、及び(3)と(7)と(12)の組合せが好ましい。特に好ましい組合せは、(7)と(12)の組合せ（この組合せの変異酵素のアミノ酸配列の具体例は上記の通り配列番号１６、５９〜６１である）である。置換後のアミノ酸は(7)についてはヒスチジンが好ましく、(12)についてはセリン（配列番号１６）、アルギニン（配列番号５９）、ロイシン（配列番号６０）又はプロリン（配列番号６１）が好ましい。(12)については、置換後のアミノ酸がプロリンであることが特に好ましい。
ところで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部を変異させた場合において変異後のタンパク質が変異前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の変異がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が変異前後において維持されることがある。この技術常識を考慮すれば、上記(1)〜(13)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異GOと比較した場合に、アミノ酸配列の僅かな相違が認められるものの（但し、アミノ酸配列の相違は上記アミノ酸置換が施された位置以外の位置で生ずることとする）、特性に実質的な差が認められないものは、上記変異GOと実質同一の酵素とみなすことができる。ここでの「アミノ酸配列の僅かな相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。「実質同一の酵素」のアミノ酸配列と、基準となる上記変異GOのアミノ酸配列との同一性（％）は、好ましくは90%以上であり、更に好ましくは95%以上であり、更に更に好ましくは98%以上であり、最も好ましくは99%以上である。尚、アミノ酸配列の相違は複数の位置で生じていてもよい。「アミノ酸配列の僅かな相違」は、好ましくは保存的アミノ酸置換により生じている。
（変異GOをコードする核酸等）
本発明の第２の局面は本発明の変異GOに関連する核酸を提供する。即ち、変異GOをコードする遺伝子、変異GOをコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、変異GOをコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
変異GOをコードする遺伝子は典型的には変異GOの調製に利用される。変異GOをコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的調製法によれば、より均質な状態の変異GOを得ることが可能である。また、当該方法は大量の変異GOを調製する場合にも好適な方法といえる。尚、変異GOをコードする遺伝子の用途は変異GOの調製に限られない。例えば、変異GOの作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いは酵素の更なる変異体をデザイン又は作製するためのツールとして、当該核酸を利用することもできる。
本明細書において「変異GOをコードする遺伝子」とは、それを発現させた場合に当該変異GOが得られる核酸のことをいい、当該変異GOのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸をも含む。また、コドンの縮重も考慮される。
変異GOをコードする遺伝子の配列の例を配列番号２２〜３６、６２〜６４に示す。これらの配列はアスペルギルス・ニガーのGOに特定のアミノ酸置換が施された変異GOをコードする遺伝子である。各配列におけるアミノ酸置換は次の通りである。
配列番号２２： T132A
配列番号２３： T353A
配列番号２４： D446H
配列番号２５： V582S
配列番号２６： T132A及びT353A
配列番号２７： T132A及びD446H
配列番号２８： T132A及びV582S
配列番号２９： T353A及びD446H
配列番号３０： T353A及びV582S
配列番号３１： D446H及びV582S
配列番号３２： T132A、T353A及びD446H
配列番号３３： T132A、T353A及びV582S
配列番号３４： T132A、D446H及びV582S
配列番号３５： T353A、D446H及びV582S
配列番号３６： T132A、T353A、D446H及びV582S
配列番号６２： D446H及びV582R
配列番号６３： D446H及びV582L
配列番号６４： D446H及びV582P
本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。
本発明の他の態様では、本発明の変異GOをコードする遺伝子の塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸（以下、「相同核酸」ともいう。また、相同核酸を規定する塩基配列を「相同塩基配列」ともいう）が提供される。相同核酸の例として、本発明の変異GOをコードする核酸の塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、変異GOに特徴的な酵素活性（即ちGDH活性）を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。
以上のような相同核酸は例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などによって得られる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。
本発明の他の態様は、本発明の変異GOをコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸に関する。本発明の更に他の態様は、本発明の変異GOをコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列に対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
本発明の更に別の態様は、本発明の変異GOをコードする遺伝子の塩基配列又はその相同塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
本発明の更に他の態様は、本発明の変異GOをコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（核酸断片）を提供する。このような核酸断片は、本発明の変異GOをコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸などを検出、同定、及び／又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、本発明の変異GOをコードする遺伝子の塩基配列において連続するヌクレオチド部分（例えば約10〜約100塩基長、好ましくは約20〜約100塩基長、更に好ましくは約30〜約100塩基長）にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
本発明のさらに他の局面は、本発明の遺伝子（変異GOをコードする遺伝子）を含む組換えDNAに関する。本発明の組換えDNAは例えばベクターの形態で提供される。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいう。
使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）などの微生物を用いることが好ましいが、組換えDNAが複製可能で且つ変異GOの遺伝子が発現可能な宿主細胞であれば利用可能である。大腸菌の例としてT7系プロモーターを利用する場合は大腸菌BL21(DE3)pLysS、そうでない場合は大腸菌JM109を挙げることができる。また、出芽酵母の例として出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22あるいは出芽酵母INVSc1（インビトロジェン社）を挙げることができる。
本発明の他の局面は、本発明の組換えDNAを保有する微生物（即ち形質転換体）に関する。本発明の微生物は、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。例えば、塩化カルシウム法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(J.Mol. Biol.)、第53巻、第159頁 (1970)）、ハナハン（Hanahan）法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第166巻、第557頁 (1983)）、SEM法（ジーン（Gene)、第96巻、第23頁(1990)〕、チャング（Chung）らの方法（プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第86巻、第2172頁(1989)）、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))等によって実施することができる。尚、本発明の微生物は、本発明の変異GOを生産することに利用することができる（後述の変異酵素の調製法の欄を参照）。
（変異GOの用途）
本発明の第３の局面は変異GOの用途に関する。この局面ではまず、変異GOを用いたグルコース測定法が提供される。本発明のグルコース測定法では本酵素による酸化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定する。本発明は例えば血糖値の測定、食品（調味料や飲料など）中のグルコース濃度の測定などに利用される。また、発酵食品（例えば食酢）又は発酵飲料（例えばビールや酒）の製造工程において発酵度を調べるために本発明を利用してもよい。
本発明はまた、本酵素を含むグルコース測定用試薬を提供する。当該試薬は上記の本発明のグルコース測定法に使用される。
本発明は更に、本発明のグルコース測定法を実施するためのキット（グルコース測定用キット）を提供する。本発明のキットは、本酵素を含むグルコース測定用試薬の他、反応用試薬、緩衝液、グルコース標準液などを任意の要素として含む。また、本発明のグルコース測定キットには通常、使用説明書が添付される。
本発明は更なる用途として、工業製品（各種加工食品、菓子類、清涼飲料水、アルコール飲料、栄養補助食品等の食品や化粧料など）又はその原料等に本発明の変異GOを作用させることによってグルコース含量を低下させる方法及び当該用途に使用される酵素剤を提供する。例えば、本発明の変異GOを食品に適用した場合には、グルコース含量の低下によりメイラード反応を抑制すること等が可能である。本発明の酵素剤は有効成分（変異GO）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
（変異酵素の設計法）
本発明の別の局面は変異酵素の設計法に関する。本発明の設計法では、以下のステップ(i)及び(ii)を実施する。
ステップ(i)：微生物由来グルコースオキシダーゼ（微生物由来GO）又は微生物由来フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（微生物由来FDA-GDH）である変異対象酵素のアミノ酸配列において、以下の群より選択される一又は二以上のアミノ酸を特定する。
(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の115位アミノ酸に相当するアミノ酸
(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の131位アミノ酸に相当するアミノ酸
(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の132位アミノ酸に相当するアミノ酸
(4)配列番号１に示すアミノ酸配列の193位アミノ酸に相当するアミノ酸
(5)配列番号１に示すアミノ酸配列の353位アミノ酸に相当するアミノ酸
(6)配列番号１に示すアミノ酸配列の436位アミノ酸に相当するアミノ酸
(7)配列番号１に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸
(8)配列番号１に示すアミノ酸配列の472位アミノ酸に相当するアミノ酸
(9)配列番号１に示すアミノ酸配列の511位アミノ酸に相当するアミノ酸
(10)配列番号１に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸
(11)配列番号１に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸
(12)配列番号１に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸
(13)配列番号１に示すアミノ酸配列の583位アミノ酸に相当するアミノ酸
上記置換対象アミノ酸(1)〜(13)は微生物由来GOと複数種類の微生物由来FAD-GDHの比較によって見出されたものである。これらのアミノ酸を置換することによって酵素の特性が変化することが期待される。変化し得る特性の例を列挙すると、GO活性、GDH活性、基質特異性、温度特性（至適温度、温度安定性など）、pH特性（至適pH、pH安定性）、補酵素特異性、メディエーターとの反応性である。
本発明の設計法における変異対象酵素は微生物由来GO又は微生物由来FAD-GDHである。変異対象酵素は典型的には野生型酵素（天然において見出される酵素）である。しかしながら、既に何らかの変異ないし改変が施された酵素を変位対象酵素とすることを妨げるものではない。微生物由来GOの例はアスペルギルス・ニガーのGO及びペニシリウム・アマガサキエンスのGOであり、微生物由来FAD-GDHの例はペニシリウム・イタリカムのFAD-GDH、ペニシリウム・リラシノエチヌラティウムのFAD-GDH、アスペルギルス・オリゼのFAD-GDH及びアスペルギルス・テレウスのFAD-GDHである。ここで例示した酵素のアミノ酸配列として、公共のデータベースに登録されているものを以下に示す。尚、好ましい一態様では、これらの中のいずれかのアミノ酸配列からなる酵素を変異対象酵素とする。
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のGO： 配列番号１のアミノ酸配列
ペニシリウム・アマガサキエンス（Penicillium amagasakiense）のGO： 配列番号２のアミノ酸配列
ペニシリウム・イタリカム（Penicillium italicum）のFAD-GDH： 配列番号３のアミノ酸配列
ペニシリウム・リラシノエチヌラティウム（Penicillium lilacinoechinulatum）のFAD-GDH： 配列番号４のアミノ酸配列
アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のFAD-GDH： 配列番号５のアミノ酸配列
アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）のFAD-GDH： 配列番号６のアミノ酸配列
尚、以上例示した各酵素について、上記(1)〜(13)のアミノ酸に該当するアミノ酸を図１０の表にまとめて示す。
本発明ではステップ(i)の後、以下のステップ(ii)を行う。
ステップ(ii)：変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定されたアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を構築する。
置換後のアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。従って、保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよい。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
（変異酵素の調製法）
本発明の更なる局面は変異酵素の調製法に関する。本発明の変異酵素調製法の一態様では、本発明者らが取得に成功した変異GOを遺伝子工学的手法で調製する。この態様の場合、配列番号７〜１０のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を用意する（ステップ(I)）。ここで、「特定のアミノ酸配列をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するポリペプチドが得られる核酸であり、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列からなる核酸は勿論のこと、そのような核酸に余分な配列（アミノ酸配列をコードする配列であっても、アミノ酸配列をコードしない配列であってもよい）が付加されていてもよい。また、コドンの縮重も考慮される。「配列番号７〜１０のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸」は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。ここで、配列番号７〜１０のアミノ酸配列はいずれも、アスペルギルス・ニガー由来GOのアミノ酸配列に変異を施したものである。従って、アスペルギルス・ニガー由来GOをコードする遺伝子（配列番号３８）に対して必要な変異を加えることによっても、配列番号７〜１０のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸（遺伝子）を得ることができる。位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照）、その中から適切な方法を選択して用いることができる。位置特異的変異導入法として、位置特異的アミノ酸飽和変異法を採用することができる。位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造を基に、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Semi-rational,semi-random」手法である（J.Mol.Biol.331,585-592(2003)）。例えば、Quick change（ストラタジーン社）等のキット、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res. 16,7351-7367(1988)）を用いて位置特異的アミノ酸飽和変異を導入することが可能である。PCRに用いるDNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼ等を用いることができる。但し、KOD-PLUS-（東洋紡社）、Pfu turbo（ストラタジーン社）などの精度の高いDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
本発明の他の一態様では本発明の設計法によって設計されたアミノ酸配列を基にして変異酵素を調製する。この態様の場合ステップ(I)では本発明の設計法によって構築されたアミノ酸配列をコードする核酸を用意することになる。例えば、本発明の設計法によって構築されたアミノ酸配列に基づいて、変異対象酵素をコードする遺伝子に対して必要な変異（即ち、発現産物であるタンパク質における、特定位置でのアミノ酸の置換）を加え、変異酵素をコードする核酸（遺伝子）を得る。
ステップ（I)に続いて、用意した核酸を発現させる（ステップ(II)）。例えば、まず上記核酸を挿入した発現ベクターを用意し、これを用いて宿主細胞を形質転換する。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
次に、発現産物である変異酵素が産生される条件下で形質転換体を培養する。形質転換体の培養は常法に従えばよい。培地に使用する炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
一方、培養温度は30℃〜40℃の範囲内（好ましくは37℃付近）で設定することができる。培養時間は、培養対象の形質転換体の生育特性や変異型酵素の産生特性などを考慮して設定することができる。培地のpHは、形質転換体が生育し且つ酵素が産生される範囲内に調製される。好ましくは培地のpHを6.0〜9.0程度（好ましくはpH7.0付近）とする。
続いて、発現産物（変異酵素）を回収する（ステップ(III)）。培養後の菌体を含む培養液をそのまま、或いは濃縮、不純物の除去などを経た後に酵素溶液として利用することもできるが、一般的には培養液又は菌体より発現産物を一旦回収する。発現産物が分泌型タンパク質であれば培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを利用した塩析、メタノールやエタノール又はアセトンなどによる分別沈殿法、透析、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過や吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー（例えば、セファデックス（Sephadex）ゲル（GEヘルスケアバイオサイエンス）などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL-6B （GEヘルスケアバイオサイエンス）、オクチルセファロースCL-6B （GEヘルスケアバイオサイエンス）、CMセファロースCL-6B（GEヘルスケアバイオサイエンス））などを組み合わせて分離、精製を行ことにより変異酵素の精製品を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、培養液をろ過、遠心処理等することによって菌体を採取し、次いで菌体を加圧処理、超音波処理などの機械的方法またはリゾチームなどによる酵素的方法で破壊した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより変異酵素の精製品を得ることができる。
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレードライなどにより粉末化して提供することも可能である。その際、精製酵素を予めリン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、トリス塩酸緩衝液やGOODの緩衝液に溶解させておいてもよい。好ましくは、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液を使用することができる。尚、ここでGOODの緩衝液としてはPIPES、MES又はMOPSが挙げられる。
通常は、以上のように適当な宿主−ベクター系を利用して遺伝子の発現〜発現産物（変異酵素）の回収を行うが、無細胞合成系を利用することにしてもよい。ここで、「無細胞合成系（無細胞転写系、無細胞転写／翻訳系）」とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の（或いは遺伝子工学的手法で得られた）リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸（DNAやmRNA）からそれがコードするmRNAやタンパク質をin vitroで合成することをいう。無細胞合成系では一般に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。細胞抽出液には一般に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、tRNAなどの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、この細胞抽出液に各種アミノ酸、ATP、GTPなどのエネルギー源、クレアチンリン酸など、タンパク質の合成に必要なその他の物質を添加する。勿論、タンパク質合成の際に、別途用意したリボソームや各種因子、及び／又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。
タンパク質合成に必要な各分子（因子）を再構成した転写／翻訳系の開発も報告されている（Shimizu, Y. et al.: Nature Biotech., 19, 751-755, 2001）。この合成系では、バクテリアのタンパク質合成系を構成する３種類の開始因子、３種類の伸長因子、終結に関与する４種類の因子、各アミノ酸をtRNAに結合させる２０種類のアミノアシルtRNA合成酵素、及びメチオニルtRNAホルミル転移酵素からなる３１種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いてタンパク質合成系をin vitroで再構成している。本発明ではこのような再構成した合成系を利用してもよい。
用語「無細胞転写／翻訳系」は、無細胞タンパク質合成系、in vitro翻訳系又はin vitro転写／翻訳系と交換可能に使用される。in vitro翻訳系ではRNAが鋳型として用いられてタンパク質が合成される。鋳型RNAとしては全RNA、mRNA、in vitro転写産物などが使用される。他方のin vitro転写／翻訳系ではDNAが鋳型として用いられる。鋳型DNAはリボソーム結合領域を含むべきであって、また適切なターミネータ配列を含むことが好ましい。尚、in vitro転写／翻訳系では、転写反応及び翻訳反応が連続して進行するように各反応に必要な因子が添加された条件が設定される。
実用性の高いGDHを創出するという目的の下、従来の方法（既存のGDHを改変する方法やスクリーニングを中心とした方法）に代わる新たな手法を模索した。まず、FAD-GDHに特有の問題点（キシロースに対する反応性が比較的高いこと、至適温度が高いこと）がないグルコースオキシダーゼ（GO）に着目した。GOとFAD-GDHはアミノ酸配列の相同性が比較的高いことが知られている。この相同性に注目し、GOにGDH活性を付与すること、即ち改変によりGOをGDH化するという、新たなアプローチを採ることにした。
１．GO及びFAD-GDHのアライメント比較
アスペルギルス・ニガー由来GOと現在、アミノ酸配列の分かっているアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス、ペニシリウム・イタリカム、ペニシリウム・リラシノエチヌラティウム由来FAD-GDHのアライメント比較、及びすでに立体構造が明らかとなっているアスペルギルス・ニガー由来GOの立体構造から、GOの活性中心付近にあるアミノ酸の中で、FAD-GDH間では保存されている（共通性が高い）が、GOとFAD-GDHの間においては相違するアミノ酸を検索した（図２、３）。尚、アライメント比較にはClustalW2（EMBL（European Molecular Biology Laboratory）-EBI（European Bioinformatics Institute）のホームページ内に専用のサイトが設けられている。http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html）を用いた。
検索によって特定した１３個のアミノ酸（L115、G131、T132、V193、T353、F436、D446、Y472、I511、P535、Y537、V582、M583）を変異導入対象とした。
２．GO遺伝子の取得、変異導入及びプレートアッセイ
GO遺伝子については、過去、大腸菌で発現させた報告が無いことからpYES2（インビトロジェン社）のHindIII-XhoII部分にGO遺伝子を挿入し、サッカロマイセス・セレビシエ（S.cerevisiae）を宿主として発現させることとした。
アスペルギルス・ニガーGO-1号菌（天野エンザイム社保有）からGen Elute Plant Genomic DNA kit(シグマ社)を用いてゲノムDNAを抽出した後、PCRによりGO遺伝子を取得した。以下、PCRの条件を示す。
（反応液の組成）
10×LAバッファー(タカラバイオ株式会社) 5μL
2.5mM dNTPs(タカラバイオ株式会社) 8μL
25mM MgCl2(タカラバイオ株式会社) 5μL
フォワードプライマー(50μM) 1μL
リバースプライマー(50μM) 1μL
Template 1μL
LA Taq(タカラバイオ株式会社) 0.5μL
stH2O 28.5μL
（プライマーの配列）
フォワードプライマー:GATCAGAAGCTTAAAAAAATGTCTACTCTCCTTGTGAGCTCG（配列番号３９）
リバースプライマー:GATCAGCTCGAGTCACTGCATGGAAGCATAATC（配列番号４０）
（反応条件）
94℃で2分反応させた後、94℃で30秒、52℃で30秒、72℃で2分の反応サイクルを35回繰り返した後、72℃で7分反応させ、最後に4℃で放置
PCR後の増幅産物をpYES2に挿入してpYES-GO-K-P-2プラスミドとし、インサートのシークエンスを確認した（図４）。シークエンスに問題が認められなかったことから、構築したpYES-GO-K-P-2プラスミドを鋳型として、L115、G131、T132、V193、T353、F436、D446、Y472、I511、P535、Y537、V582、M583をそれぞれ複数種のアミノ酸に置換するよう設計した下記の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuikChange Site-Directed Mutagensesis Kit（ストラタジーン社）を用い、添付のプロトコールに従って変異操作を行い、変異グルコースオキシダーゼを有するプラスミドを構築した。
GO-L115-変異用プライマー：CCACCAACAATCAGACTGCGNNNATCCGCTCCGGAAATGG（配列番号４１）
GO-G131-変異用プライマー：GCTCTACCCTCGTCAACGGTNNNACCTGGACTCGCCCC（配列番号４２）
GO-T132-変異用プライマー：CTCGTCAACGGTGGCNNNTGGACTCGCCCCCAC（配列番号４３）
GO-V193-変異用プライマー：CATGGTATCAATGGTACTNNNCACGCCGGACCCCGCG（配列番号４４）
GO-T353-変異用プライマー：CAACCTTCAGGACCAGACCNNNTCTACCGTCCGCTCAC（配列番号４５）
GO-F436-変異用プライマー：GTCGCATACTCGGAACTCNNNCTCGACACGGCCGGAG（配列番号４６）
GO-D446-変異用プライマー：GCCGGAGTGGCCAGTTTCNNNGTGTGGGATCTTCTGC（配列番号４７）
GO-Y472-変異用プライマー：CATCCTCCGCCATTTCGCANNNGACCCTCAGTACTTTCTCAAC（配列番号４８）
GO-I551-変異用プライマー：CTTATTTCGCTGGAGAGACTNNNCCCGGTGACAACCTCGC（配列番号４９）
GO-P535-変異用プライマー：CCCGTACAACTTCCGCNNNAACTACCATGGTGTGGGTACTTG（配列番号５０）
GO-Y537-変異用プライマー：GTACAACTTCCGCCCTAACNNNCATGGTGTGGGTACTTGCTC（配列番号５１）
GO-V582-変異用プライマー：CTACGCAAATGTCGTCCCATNNNATGACGGTCTTTTATGCCATGG（配列番号５２）
GO-M583-変異用プライマー：CTACGCAAATGTCGTCCCATGTTNNNACGGTCTTTTATGCCATGG（配列番号５３）
変異導入後のプラスミドを大腸菌DH5αに形質転換後、プラスミド抽出を行い、変異ライブラリーを作製した。得られたライブラリーをサッカロマイセス・セレビシエINVSc1（インビトロジェン社）に形質転換し、生育してきたコロニーを発現プレートにレプリカ後、プレートアッセイにて発現及び変異導入を確認した（図５）。F436については変異酵素形質転換株の生育を確認できなかった。尚、実験操作はpYES2のマニュアルを参考にした。
プレートアッセイ方法
各々の発色液を80mmのろ紙に浸した後、プレートの上にのせ発色を確認した。
＜GOアッセイ＞
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 20mL
10% グルコース 5mL
25u/mL PO”Amano”3(天野エンザイム社) 5mL
o-ジアニジン 5mg
＜GDHアッセイ＞
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 23mL
10% グルコース 5mL
3mmol/L 1-メトキシPMS 1mL
6.6mmol/L NTB 1mL
３．液体培養での活性の確認
プレートアッセイで確認できた陽性コロニー(GOアッセイで発色せず、GDHアッセイで発色したもの)について液体培養を行い、GO活性及びGDH活性を調べた。尚、実験操作はpYES2のマニュアルを参考にした。
＜GOアッセイ用試薬＞
フェノール含有リン酸緩衝液 19mL
10% グルコース 5mL
25u/mL PO”Amano”3(天野エンザイム社) 5mL
0.4g/dL 4-アミノアンチピリン 1mL
＜GDHアッセイ用試薬＞
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 21mL
10% グルコース 5mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
各試薬200μL対して20μLの培養上清を添加し、37℃で反応させた。反応開始後10分と60分に吸光度を測定し、吸光度差からGO活性及びGDH活性を求めた。各変異酵素形質転換株についてGDH活性とGO活性の比（GDH活性／GO活性）を算出し、比較した（図６、７）。尚、未変異GOを有する形質転換株（図６、７ではpYES-GOと表示）、GO遺伝子を挿入する前のプラスミドで形質転換した形質転換株（図６、７ではpYES-2と表示）、 GO”Amano”2（図６、７ではGOと表示）、GDH”Amano”8（図６、７ではFAD-GDHと表示）を比較対象（コントロール）とした。
GDH/GO活性比に大きな変化を認めた変異酵素形質転換株について変異導入点のアミノ酸配列を確認した（図８）。図６〜８に示した結果に基づき有効な変異を特定した。まず、T132については、T132V（スレオニンからバリンへの置換）を有する変異酵素形質転換株よりもT132A（スレオニンからアラニンへの置換）を有する変異酵素形質転換株の方がGDH/GO活性比が高いことから、T132Aを有効な変異とした。T353については、変異酵素形質転換株（5-1-5）において二つの変異T353A及びT353Hを認めたが、T353Aを単独で有する変異酵素形質転換株（5-1-9, 5-1-44）が存在することから5-1-5株は二つの株の混合であると推測し、T353Aを有効な変異とした。D446についても同様の推測に基づきD446Hを有効な変異とした。また、変異酵素形質転換株12-1-49が有する変異V582Sも有効な変異とした。尚、以上４つの変異を単独で又は組合せで有するGOのアミノ酸配列及び対応する塩基配列（遺伝子配列）を以下に列挙する。
変異：アミノ酸配列：塩基配列
T132A：配列番号７：配列番号２２
T353A：配列番号８：配列番号２３
D446H：配列番号９：配列番号２４
V582S：配列番号１０：配列番号２５
T132A及びT353A：配列番号１１：配列番号２６
T132A及びD446H：配列番号１２：配列番号２７
T132A及びV582S：配列番号１３：配列番号２８
T353A及びD446H：配列番号１４：配列番号２９
T353A及びV582S：配列番号１５：配列番号３０
D446H及びV582S：配列番号１６：配列番号３１
T132A、T353A及びD446H：配列番号１７：配列番号３２
T132A、T353A及びV582S：配列番号１８：配列番号３３
T132A、D446H及びV582S：配列番号１９：配列番号３４
T353A、D446H及びV582S：配列番号２０：配列番号３５
T132A、T353A、D446H及びV582S：配列番号２１：配列番号３６
４．変異型GOの基質特異性の確認
有効な変異を有する酵素（変異型GO）についてGDH活性における基質特異性を調べた。
＜GDHアッセイ用試薬＞
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 21mL
10% 基質 5mL
3mmol/L PMS 1mL
6.6mmol/L NTB 3mL
各試薬200μL対して変異酵素形質転換株（3-1-26, 3-2-26, 5-1-5, 5-1-9, 5-1-44, 7-1-7, 7-2-17, 7-2-30, 7-2-42, 12-1-49）の培養上清を20μL添加し、37℃で反応した。反応開始後10分と60分に吸光度を測定し、吸光度差からGDH活性を求めた。各基質を用いた場合のGDH活性を、グルコースを基質とした場合のGDH活性（100%）に対する比率で表した。尚、未変異GOを有する形質転換株（図９ではpYES-GOと表示）をコントロールとした。
図９に示す通り、変異酵素形質転換株では基質特異性に変化が認められる。変異酵素形質転換株5-1-5, 5-1-9, 7-1-7, 7-2-17, 7-2-30, 7-2-42, 12-1-49ではキシロースへの反応性がない。これらの形質転換株が保有する変異型GOは、キシロースへの反応性を示さない点において既存のFAD-GDHよりも優れるといえる。このようにアミノ酸置換によって、GOをGDH化しつつ既存のFAD-GDHに特有の問題を解消することに成功した。尚、T132に対する変異によってキシロースへの反応性が生じたことから、FAD-GDHでは当該変異に対応する部位がキシロースへの反応性に関与している可能性が示唆された。
５．変異の組み合わせの効果の確認
有効な変異と考えられた遺伝子変異の組み合わせについて、効果を検証した。後の精製を簡略化するため、アスペルギルス・ニガーGO-1号菌由来グルコースオキシダーゼ遺伝子のＣ末端にヒスチジンタグを付加したGO遺伝子(GO-3)をPCR反応により作製し、pYES2に挿入してpYES-GO-3プラスミドを構築した。
（反応液の組成）
10×LAバッファー(タカラバイオ株式会社) 5μL
2.5mM dNTPs(タカラバイオ株式会社) 8μL
25mM MgCl2(タカラバイオ株式会社) 5μL
フォワードプライマー(50μM) 1μL
リバースプライマー(50μM) 1μL
Template 1μL
LA Taq(タカラバイオ株式会社) 0.5μL
stH2O 28.5μL
（プライマーの配列）
フォワードプライマー:GATCAGAAGCTTAAAAAAATGTCTACTCTCCTTGTGAGCTCG（配列番号３９）
リバースプライマー:GATCAGCTCGAGTCAATGGTGATGGTGATGATGCTGCATGGAAGCATAATC（配列番号５４）
（反応条件）
94℃で2分反応させた後、94℃で30秒、52℃で30秒、72℃で2分の反応サイクルを35回繰り返した後、72℃で7分反応させ、最後に4℃で放置
PCR後の増幅産物をpYES2に挿入してpYES-GO-3プラスミドとし、インサートのシークエンスを確認した。シークエンスに問題が認められなかったことから、構築したpYES-GO-3プラスミドを鋳型として、T132A、T353A、D446H、V582Sに置換するよう設計した下記の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuikChange Site-Directed Mutagensesis Kit（ストラタジーン社）を用い、添付のプロトコールに従って変異操作を行い、多重変異グルコースオキシダーゼを有するプラスミドを構築した。
GO-T132A-1：CTCGTCAACGGTGGCGCTTGGACTCGCCCCCAC（配列番号５５）
GO-T353A-1：CCTTCAGGACCAGACCGCTTCTACCGTCCGCTCAC（配列番号５６）
GO-D446H-1：GGAGTGGCCAGTTTCCATGTGTGGGATCTTCTGC（配列番号５７）
GO-V582S-1：CGCAAATGTCGTCCCATTCTATGACGGTCTTTTATGCCATGG（配列番号５８）
変異導入後のプラスミドを大腸菌DH5αに形質転換後、プラスミド抽出を行い、変異ライブラリーを作製した。得られたライブラリーをサッカロマイセス・セレビシエINVSc1（インビトロジェン社）に形質転換し、生育してきたコロニーをについて、液体培養を行い、GO活性及びGDH活性を調べた。尚、実験操作はpYES2のマニュアルを参考にした。
＜GOアッセイ用試薬＞
フェーノール含有リン酸緩衝液 19mL
10% グルコース 5mL
25u/mL PO-3 5mL
0.4g/dL 4-A.A 1mL
＜GDHアッセイ用試薬＞
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 21mL
10% グルコース 5mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
各試薬200μL対して20μLの培養上清を添加し、37℃で反応させた。反応開始後10分と30分に吸光度を測定し、吸光度差からGO活性及びGDH活性を求めた。各変異酵素形質転換株についてGDH活性とGO活性の比（GDH活性／GO活性）を算出し、比較した。尚、ヒスチジンタグを挿入した未変異GOを有する形質転換株（pYES-GO-3と表示）、GO遺伝子を挿入する前のプラスミドで形質転換した形質転換株（pYES-2と表示）、GO”Amano”2（GOと表示）、GDH”Amano”8（FAD-GDHと表示）を比較対象（コントロール）とした。
結果を図１１に示す。T132A及びV582S（pYES-GO-M7）、D446H及びV582S（pYES-GO-M10）、T132A、D446H及びV582S（pYES-GO-M13）の多重変異酵素でそれぞれ単独の変異酵素又は変異導入前の野生酵素(pYES-GO-3)と比較してGDH/GO活性比に大きな変化を認めた。
６．精製多重変異型酵素の比活性及び基質特異性の確認
次に、効果の認められたT132A、D446H、V582Sの組み合わせ（T132A及びD446H、T132A及びV582S、D446H及びV582S、T132A、D446H及びV582S）について、形質転換株の液体培養を行い、Ni-Sepharoseを用いて精製後、比活性及び基質特異性を調べた。なお、液体培養での発現はpYES2のマニュアルを参考にした。
＜GDHアッセイ用試薬＞
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH7.0 21mL
10% グルコース 5mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
各試薬200μL対して20μLの精製酵素溶液又は標準酵素溶液を添加後、37℃で反応させ、反応開始より5分と10分との吸光度差を求めた。標準酵素で求めた検量線から活性値を求め、Bradford法で求めたタンパク量とともに比活性を算出した。結果を図１２に示す。得られた精製酵素の比活性は約3〜8u/mg（タンパク質）であった。
有効な変異を有する酵素について、精製酵素を用いてGDH活性における基質特異性を調べた。
＜GDHアッセイ用試薬＞
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 21mL
10% 基質 5mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
各試薬200μL対して変異酵素形質転換株（M6,M7,M10,M13）の培養上清を20μL添加し、37℃で反応させた。反応開始後5分と10分に吸光度を測定し、吸光度差からGDH活性を求めた。各基質を用いた場合のGDH活性を、グルコースを基質とした場合のGDH活性（100%）に対する比率で表した。尚、GDH”Amano”8（FAD-GDHと表示）をコントロールとした。
結果を図１３に示す。変異酵素形質転換株では基質特異性に変化が認められる。特にD446H及びV582S（pYES-GO-M10）ではキシロースへの反応性がない。本形質転換株が保有する変異型GOは、キシロースへの反応性を示さない点において既存のFAD-GDHよりも優れるといえる。このようにアミノ酸置換によって、GOをGDH化しつつ既存のFAD-GDHに特有の問題を解消することに成功した。
７．D446及びV582多重変異酵素の最適アミノ酸の検討
D446及びV582の変異組み合わせについて、各々のアミノ酸が最適なアミノ酸の組み合わせになるように、pYES-GO-K-P-2プラスミドを鋳型として、配列番号４７及び配列番号５２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuikChange Site-Directed Mutagensesis Kit（ストラタジーン社）を用い、添付のプロトコールに従って変異操作を行い、変異グルコースオキシダーゼを有するプラスミドを構築した。変異導入後のプラスミドを大腸菌DH5αに形質転換後、プラスミド抽出を行い、D446及びV582多重変異ライブラリーを作製した。得られたライブラリーをサッカロマイセス・セレビシエINVSc1（インビトロジェン社）に形質転換し、得られた形質転換体について、96穴ディープウェルを用いて液体培養を行い、検討実施前の組み合わせであるD446H及びV582Sをコントロールとして、GDH活性及びGDH/GO活性比が向上したものを取得した。尚、実験操作はpYES2のマニュアルを参考にした。
結果を図１４に示す。D446H及びV582R、D446H及びV582L、D446H及びV582Pの組み合わせで、検討実施前の組み合わせD446H及びV582SよりGDH活性及びGDH/GO活性比が向上した。中でもD446H及びV582PはGO活性が検出限界以下となっており、アミノ酸置換によって、完全なGDH化に成功した。
８．D446H及びV582P多重変異酵素の性質検討
（１）培養及び精製
液体培養での発現はpYES2のマニュアルを参考にし、保存プレートより500mL坂口フラスコに調製した100mLの0.67% アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製)、2% グルコースを含有する培地(pH5.4)に接種し、30℃、140回転/分、20時間前培養を行った。
前培養終了後、菌体を遠心で回収し、再度OD660=0.4になるように500mL坂口フラスコに調製した100mLの0.67% アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製)、2% ガラクトース及び1%ラフィノースを含有する培地(pH5.4)に接種し、30℃、140回転/分、5時間本培養を行った。
培養終了後、限外濾過膜（商品名 MICROZA、分画分子量6000、旭化成社製）により脱塩濃縮を行い、前記脱塩濃縮液について、20mMリン酸緩衝液（pH7.0）にて平衡化した陰イオン交換樹脂（商品名 HiTrap DEAE FF、GEヘルスケア・ジャパン社製）カラムに吸着させ、前記緩衝液にて洗浄を行った。洗浄後、NaCl含有30mM MOPS緩衝液（pH7.0）を用いて、NaCl濃度0〜1.0MのLiner gradient法により溶出させた。以上のような精製方法にて部分精製された変異型GO(D446H,V582P多重変異酵素)を得ることができた。
（２）基質特異性の確認
変異型GO部分精製酵素(D446H,V582P多重変異酵素)について、GDH活性における基質特異性を調べた。
＜GDHアッセイ用試薬＞
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 21mL
10% 基質 5mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
各試薬200μL対して変異型GO部分精製酵素(D446H,V582P多重変異酵素)を20μL添加し、37℃で反応させた。反応開始後10分と30分に吸光度を測定し、吸光度差からGDH活性を求めた。各基質を用いた場合のGDH活性を、グルコースを基質とした場合のGDH活性（100%）に対する比率で表した。尚、GDH”Amano”8（図６、７ではFAD-GDHと表示）をコントロールとした。
結果を図１５に示す。変異型GO部分精製酵素(D446H,V582P多重変異酵素)はキシロースへの反応性を示さず、GDH”Amano”8と比較して格段に基質特異性に優れていた。
本発明が提供する変異GOは試料中のグルコース量の検出・定量に有用である。一方、本発明の設計法・調製法は、特性が向上したGDH又はGOを取得する手段として利用される。特に、GDH化したGO又はGO化したGDHを取得するための手段としての利用が期待される。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
配列番号３９〜４０、５４：人工配列の説明：PCR用プライマー
配列番号４１〜５３、５５〜５８：人工配列の説明：変異導入用プライマー

Claims (22)

  1. 微生物由来グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列において、以下の(3)、(5)、(7)及び(12)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であって、置換後のアミノ酸が、(3)のアミノ酸についてはアラニンであり、(5)のアミノ酸についてはアラニンであり、(7)のアミノ酸についてはヒスチジンであり、(12)のアミノ酸についてはセリン、アルギニン、ロイシン又はプロリンであり、配列番号７〜２１、５９〜６１のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなる、基になる酵素と比較してグルコースデヒドロゲナーゼ／グルコースオキシダーゼ活性比が向上した変異酵素：
    (3)配列番号１に示すアミノ酸配列の132位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    (5)配列番号１に示すアミノ酸配列の353位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    (7)配列番号１に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    (12)配列番号１に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸。
  2. 微生物由来グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列である、請求項１に記載の変異酵素。
  3. 置換されるアミノ酸が、(3)のアミノ酸、(7)のアミノ酸又は(12)のアミノ酸、或いはこれらの中から選択される二以上のアミノ酸の組合せである、請求項１又は２に記載の変異酵素。
  4. 置換されるアミノ酸が、(7)のアミノ酸及び(12)のアミノ酸である、請求項１又は２に記載の変異酵素。
  5. 配列番号７〜２１、５９〜６１のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の変異酵素。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異酵素をコードする遺伝子。
  7. 配列番号２２〜３６、６２〜６４のいずれかの塩基配列を含む、請求項６に記載の遺伝子。
  8. 請求項６又は７に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
  9. 請求項８に記載の組換えDNAを保有する微生物。
  10. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異酵素を用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
  11. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異酵素を含むことを特徴とするグルコース測定用試薬。
  12. 請求項１１に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
  13. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異酵素を用いて工業製品又はその原料中のグルコース量を低下させることを特徴とする方法。
  14. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異酵素を含有する酵素剤。
  15. 以下のステップ(i)及び(ii)を含む、基になる酵素と比較してグルコースデヒドロゲナーゼ／グルコースオキシダーゼ活性比が向上した変異酵素の設計法：
    (i)アスペルギルス・ニガー由来グルコースオキシダーゼである変異対象酵素のアミノ酸配列において、以下の(3)、(5)、(7)及び(12)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸を特定するステップ：
    (3)配列番号１に示すアミノ酸配列の132位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    (5)配列番号１に示すアミノ酸配列の353位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    (7)配列番号１に示すアミノ酸配列の446位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    (12)配列番号１に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    (ii)変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定されたアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を構築するステップであって、置換後のアミノ酸が、(3)のアミノ酸についてはアラニンであり、(5)のアミノ酸についてはアラニンであり、(7)のアミノ酸についてはヒスチジンであり、(12)のアミノ酸についてはセリン、アルギニン、ロイシン又はプロリンであるステップ。
  16. ステップ(i)において置換されるアミノ酸が、(3)のアミノ酸、(7)のアミノ酸又は(12)のアミノ酸、或いはこれらの中から選択される二以上のアミノ酸の組合せである、請求項１５に記載の設計法。
  17. ステップ(i)において置換されるアミノ酸が、(7)のアミノ酸及び(12)のアミノ酸である、請求項１５に記載の設計法。
  18. グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の設計法。
  19. 以下のステップ(I)〜(III)を含む、変異酵素の調製法：
    (I)配列番号７〜２１、５９〜６１のいずれかのアミノ酸配列、又は請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の設計法によって構築されたアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ；
    (II)前記核酸を発現させるステップ、及び
    (III)発現産物を回収するステップ。
  20. 配列番号１３、１６、１９、５９、６０又は６１のアミノ酸配列からなる変異酵素。
  21. 請求項２０に記載の変異酵素をコードする遺伝子。
  22. 配列番号２８、３１、３４、６２、６３又は６４の塩基配列からなる、請求項２１に記載の遺伝子。
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