CN105039362B - 一种基因突变提高抗氧化性的葡萄糖氧化酶及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种基因突变提高抗氧化性的葡萄糖氧化酶及其方法，该葡萄糖氧化酶由GOD‐M524L‐M528L突变基因构成。方法为：计算机模拟分析葡萄糖氧化酶序列，设计葡萄糖氧化酶编码基因突变体为GOD‐M524L‐M528L；全基因合成该基因序列，通过重叠延伸PCR扩增；克隆到pPIC9K载体上，线性化后电转入毕赤酵母GS115菌株中，再经培养表达、检测筛选，摇瓶发酵，收集发酵上清液，将发酵上清液透析去除盐离子，经层析纯化得到纯酶样品，经过氧化处理3.5h后检测，对照组GOD的残留酶活只有20％，而突变葡萄糖氧化酶GOD‐M524L‐M528L的残留酶活则达到30％，提高了其抗氧化性。

Description

一种基因突变提高抗氧化性的葡萄糖氧化酶及其方法
技术领域
本发明涉及的是分子酶工程技术，特别是一种基因突变提高抗氧化性的葡萄糖氧化酶及其方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶GOD是氧化还原酶(E1.1.3.4)，它能专一性的将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢，根据反应条件的不同，其反应式如下：
在没有过氧化氢酶存在下，每摩尔葡萄糖氧化酶氧化时消耗1摩尔氧气。
C6H12O6+O2→C6H12O7+H2O2
在有过氧化氢酶存在下，每摩尔葡萄糖氧化酶氧化时消耗0.5摩尔氧气。
C6H12O6+1/2O2→C6H12O7
在有乙醇和过氧化氢酶同时存在下，过氧化氢同时被用于乙醇的氧化作用，此时，每摩尔葡萄糖氧化酶氧化时消耗1摩尔氧气。
C6H12O6+C2H5OH+O2→C6H12O7+CH3CHO+H2O
甲硫氨酸(Met)是构成蛋白质必需氨基酸的一种，为蛋白质甲基化和转硫化所必需，甲硫氨酸易被氧化，它易受到过氧化氢、次氯酸盐、羟基自由基的氧化而生成甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸亚砜被进一步氧化可形成甲硫氨酸砜。甲硫氨酸亚砜可以在特定条件下可以还原为甲硫氨酸，而甲硫氨酸被氧化为甲硫氨酸砜在生物学是不可逆的。
H2O2被认为是葡萄糖氧化酶GOD的竞争性抑制剂，其竞争性抑制的米氏常数和氧气对于葡萄糖氧化酶GOD的抑制的米氏常数几乎一样。同时，反应产物H2O2对葡萄糖氧化酶中Met的氧化而使其活性降低或失活。如何提高突变葡萄糖氧化酶抗氧化性，使其在葡萄糖氧化为葡萄糖酸的生产中提高生产率，降低生产成本，具有很大意义。
发明内容
本发明的目的是采用基因突变的方法，定点突变常规葡萄糖氧化酶，提高突变葡萄糖氧化酶抗氧化性，使其在葡萄糖氧化为葡萄糖酸的生产中提高生产率，降低生产成本。
本发明是这样实现的，通过计算机辅助分析设计，定点突变葡萄糖氧化酶(GOD)特定位点甲硫氨酸，将甲硫氨酸替换为亮氨酸，并将其在毕赤酵母中表达，筛选出提高突变葡萄糖氧化酶抗氧化性，使其在葡萄糖氧化为葡萄糖酸的生产中提高生产率，降低生产成本。
所述该基因突变提高抗氧化性的葡萄糖氧化酶由GOD‐M524L‐M528L突变基因构成，即将其基因序列524位和528位的MET氨基酸突变为LEU。
1.计算机模拟分析葡萄糖氧化酶序列及分子对接
通过对葡萄糖氧化酶序列分析(如图1)，本发明涉及的GOD的黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)结合区(下划线标示)对应的氨基酸残基为16‐54、239‐306、529‐553、560‐583，FAD结合扩展区(方框标示)对应的氨基酸残基为Y68、R230、C521，FAD覆盖区(波浪线标示)对应的氨基酸残基为76‐96，黄素附着环(双下划线标示)对应的氨基酸残基为97‐114。本实验后面设计氨基酸定点突变时都尽量避开这些结合位点。
在对葡萄糖氧化酶蛋白序列分析的基础上，设计葡萄糖氧化酶编码基因的三个突变体为GOD‐8，GOD‐M523L‐M524L(见序列表NO2)和GOD‐M524L‐M528L(见序列表NO3)，通过计算机同源建模辅助分析三个突变体结构，将三个突变体分别与底物葡萄糖进行分子对接(基于CDOCKER对接分析软件)，以研究GOD突变后活性的影响。
2.葡萄糖氧化酶及突变体表达载体的构建
通过全基因合成突变体GOD‐8基因序列；并通过重叠延伸PCR扩增GOD‐M523L‐M524L、GOD‐M524L‐M528L突变体基因序列，具体如下：
GOD‐M523L‐M524L通过两轮PCR扩增，突变位点设计引物为GOD‐M1‐F、GOD‐M1‐R、GOD‐F‐EcoRⅠ和GOD‐R‐NotⅠ。
GOD‐M524L‐M528L通过两轮PCR扩增，突变位点设计引物为GOD‐M2‐F、GOD‐M1‐R、GOD‐F‐EcoRⅠ和GOD‐R‐NotⅠ。
3.毕赤酵母中的表达、筛选及纯化
合成突变体基因后，通过分子克隆到pPIC9K载体上，重组表达载体用SalⅠ线性化后电转入毕赤酵母GS115菌株中，28℃培养3～4天，将MD平板上长出来的重组子，同时转接到MD和MM平板上，28℃温箱培养48h。将显色液(将10mL含1％琼脂糖的去离子水加热溶化，待冷却到60℃以下，立即加入2mL18％D‐葡萄糖，200μL1％溶于甲醇的邻联茴香胺溶液和400μL 90U/mL辣根过氧化物酶、混匀，混合物即为显色液)倾倒于待检测平板上，室温静置显色，显色30min后，根据显色圈大小判断GOD在毕赤酵母表达菌株中的表达情况。将筛选得到表达活性较高的菌株于BMGY和BMMY培养基中摇瓶表达，摇瓶120h后，收集发酵上清液。将发酵上清液在0.05mM Tris‐HCL(PH8.0)中透析去除盐离子。经Cellulose DE层析柱纯化得到纯酶样品。
所述的BMGY培养基为：1％酵母抽提物，2％蛋白胨，1.5％琼脂，121℃灭菌20分钟后，加入1.34％YNB，4×10-5％生物素，100mM pH6.0磷酸缓冲液，1％甘油
所述的BMMY培养基为：1％酵母抽提物，2％蛋白胨，1.5％琼脂，121℃灭菌20分钟后，加入1.34％YNB，4×10-5％生物素，100mM pH6.0磷酸缓冲液，0.5％甲醇
4.酶活性及酶蛋白含量的测定
GOD测酶活的原理：在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。
GOD酶活单位定义：在37℃，pH6.0的条件下，1分钟从1μmol的β‐D‐葡萄糖氧化成D‐葡萄糖酸和H2O2所需的酶量为一个葡萄糖氧化酶酶活力单位，以U/g(U/ml)表示。
标准曲线的绘制：
选用葡萄糖氧化酶标准品，配制各种浓度葡萄糖氧化酶标准溶液。用磷酸盐缓冲液稀释成0.8U/mL，1.2U/mL，1.6U/mL，2.0U/mL，2.4U/mL，2.8U/mL。取10ml试管中，加入2.5ml邻联茴香胺，0.3ml葡萄糖溶液，0.1ml过氧化氢酶溶液组成反应体系，反应体系在37℃保温5min后，分别加入各种浓度葡萄糖氧化酶标准溶液0.1mL，反应3min后，加入2M H2SO4(浓硫酸：水v/v＝1:8)2mL，振荡摇匀以终止反应，利用分光光度计540nm波长测定吸光值。
以葡萄糖氧化酶浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。
测定步骤：吸取适当稀释的酶液(根据具体浓度确定稀释倍数)，按上开始操作。利用葡萄糖氧化酶标准曲线计算试验样品中葡萄糖氧化酶的浓度。
试样酶活力的计算：
Y＝[K(AE‐AB)+C0]×D
Y—试样稀释液中的葡萄糖氧化酶活力，U/mL；AE—酶反应液的吸光度；
AB—酶空白样的吸光度；K—标准曲线的斜率；
CO—标准曲线的截距；D—试样的总稀释倍数。
本发明采用Bradford法测蛋白质浓度。标准曲线的绘制：将标准蛋白液稀释成10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml及100μg/ml的蛋白浓度梯度溶液，分别取1ml放入10ml试管中，每管加入5ml考马斯亮蓝试剂，混匀，静止5min，于595nm测定其吸光度，以蛋白浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
可溶蛋白的测定：取1ml待测样品放入10ml试管中，每管加入5ml考马斯亮蓝试剂，混匀，静止5min，于595nm测定其吸光度，通过标准曲线计算出其可溶蛋白的浓度。
5.葡萄糖氧化酶抗氧化性测定
取待测的GOD样品4ml，加入1ml过氧化氢，37℃保温3.5h，每隔0.5h取一次样，立刻加入过量过氧化氢酶(400u/μL)除去多余的过氧化氢，测定残留酶活力。
本发明通过计算机辅助分析设计了葡萄糖氧化酶的三种不同突变体，并通过毕赤酵母表达得到相应的纯酶，性质分析表明其中一种突变体抗氧化性明显提高。此方法避免了随机突变的实验盲目性，可有效提高酶分子改造的效率。此方法亦适用于其他酶分子性质的改造。
附图说明
图1、GOD氨基酸序列及结合位点的推测
图2、GOD和D-葡萄糖相互作用二维平面图
图3、GOD-8和D-葡萄糖相互作用二维平面图
图4、GS115-pPic9K-GOD-8平板检测
图5、GOD-M523L-M524L和底物相互作用二维平面图
图6、GS115-pPic9K-GOD平板筛选
图7、GS115-pPic9K-GOD-M523L-M524L平板筛选
图8、GOD-M524L-M528L和底物相互作用二维平面图
图9、GS115-pPic9K-GOD-M524L-M528L平板筛选
具体实施方式：
实施实例1：GOD及突变体GOD-8数据分析
GOD和底物D‐葡萄糖CDOCKER对接后共有10个pose，其中最优pose的‐CDOCKERenergy为5.07234，CDOCKER interaction energy为26.6475(如图2)。按发明具体实施步骤进行毕赤酵母表达，测得纯化后的GOD酶活为442.755U/ml，可溶蛋白为136.476μg/ml，比活力为3.24U/μg。
GOD‐8和底物D‐葡萄糖CDOCKER对接后共有10个pose，其中最优pose的‐CDOCKERenergy为6.77139，CDOCKER interaction energy为30.6795(如图3)。按发明具体实施步骤进行毕赤酵母表达，通过平板显色筛选，发现突变体GOD‐8没有活性(如图4)。
实施实例2：突变体GOD-M523L-M524L数据分析
GOD‐M523L‐M524L和底物D‐葡萄糖CDOCKER对接后共有10个pose，其中最优pose的‐CDOCKER energy为0.242621，‐CDOCKER interaction energy为25.579(如图5)。按发明具体实施步骤进行毕赤酵母表达，通过平板显色筛选，突变体GOD‐M523L‐M524L活性(如图7)比野生型GOD(如图6)低，突变体GOD‐M523L‐M524L纯化的酶活为1.210U/ml，可溶蛋白为26.476μg/ml，比活力为0.0457U/μg，因为此突变体酶活很低，在被过氧化氢处理后即测不出酶活，所以没有比较其与GOD的抗氧化性。
实施实例3：突变体GOD-M524L-M528L数据分析
GOD‐M524L‐M528L和底物D‐葡萄糖CDOCKER对接后共有10个pose，其中最优pose的CDOCKER energy为0.877411，CDOCKER interaction energy为23.5475(如图8)。按发明具体实施步骤进行毕赤酵母表达，通过平板显色筛选，突变体GOD‐M524L‐M528L(如图9)活性比野生型GOD高。突变体GOD‐M524L‐M528L纯化的酶活为245.843/ml，可溶蛋白为48.476μg/ml，比活力为3.59U/μg。将GOD和GOD‐M524L‐M528L被过氧化氢处理3.5h后，随着葡萄糖氧化酶在过氧化氢孵育的时间的增加，GOD‐M524L‐M528L的抗氧化性一直是高于GOD的，在被过氧化氢处理3.5h后，GOD的残留酶活只有20％，而GOD‐M524L‐M528L的残留酶活则达到30％，说明将524位和528位的MET氨基酸突变为LEU，能提高其抗氧化性。

Claims (1)

1.一种基因突变提高抗氧化性的葡萄糖氧化酶，其特征在于该基因突变提高抗氧化性的葡萄糖氧化酶由GOD-M524L-M528L突变基因构成，即将其基因序列524位和528位的MET氨基酸突变为LEU，其具体序列为序列表NO3：葡萄糖氧化酶突变体GOD-M524L-M528L基因序列。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105463062B (zh) * 2016-01-21 2018-06-29 山东大学 一种快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法
CN106636021A (zh) * 2016-12-14 2017-05-10 曹书华 一种提高葡萄糖氧化酶耐氧化性的方法
CN111349622B (zh) * 2018-12-20 2022-04-08 南京百斯杰生物工程有限公司 一种葡萄糖氧化酶突变体及其在工业化生产中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101348794A (zh) * 2007-07-19 2009-01-21 中国科学院武汉病毒研究所 一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用
CN101955953A (zh) * 2010-09-09 2011-01-26 中国农业科学院生物技术研究所 葡萄糖氧化酶突变基因及其表达和应用
WO2013026575A2 (en) * 2011-08-25 2013-02-28 Roche Diagnostics Gmbh Glucose oxidase
CN103525778A (zh) * 2013-10-18 2014-01-22 江南大学 一种催化活性提高的葡萄糖氧化酶突变体
CN103614350A (zh) * 2013-12-18 2014-03-05 江南大学 一种催化效率提高的葡萄糖氧化酶
CN103981159A (zh) * 2014-06-05 2014-08-13 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用
CN104312989A (zh) * 2014-10-28 2015-01-28 江南大学 一种耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101348795B (zh) * 2007-07-19 2010-09-01 中国科学院武汉病毒研究所 一种葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用
KR101814588B1 (ko) * 2009-12-05 2018-01-04 아마노 엔자임 가부시키가이샤 변이 효소 및 그 용도
EP2796547B1 (en) * 2013-04-24 2016-09-14 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel glucose oxidase variants

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101348794A (zh) * 2007-07-19 2009-01-21 中国科学院武汉病毒研究所 一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用
CN101955953A (zh) * 2010-09-09 2011-01-26 中国农业科学院生物技术研究所 葡萄糖氧化酶突变基因及其表达和应用
WO2013026575A2 (en) * 2011-08-25 2013-02-28 Roche Diagnostics Gmbh Glucose oxidase
CN103525778A (zh) * 2013-10-18 2014-01-22 江南大学 一种催化活性提高的葡萄糖氧化酶突变体
CN103614350A (zh) * 2013-12-18 2014-03-05 江南大学 一种催化效率提高的葡萄糖氧化酶
CN103981159A (zh) * 2014-06-05 2014-08-13 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用
CN104312989A (zh) * 2014-10-28 2015-01-28 江南大学 一种耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Crystal Structure of Glucose Oxidase from Aspergillus niger Refined at 2-3A Reslution;H.J.Hecht et al.;《J.Mol.Biol.》;19931231;第229卷;第153-172页
Glucose oxidase from Penicillium amagasakiense Primary structure and comparison with other glucose-methanol-choline (GMC) oxidoreductases;Michael KIESS et al.;《Eur. J. Biochem.》;19981231;第252卷;第90-99页
Glucose oxidase: natural occurrence, function, properties and industrial applications;Chun Ming Wong et al.;《Appl Microbiol Biotechnol》;20080311;第78卷;第927-938页
葡萄糖氧化酶的生产及应用;邢良英等;《食品科技》;20071231(第6期);第24-26和30页

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