发明概述
令人惊讶和出乎意料地,本发明人发现如Zhu等人(2006;2007)中描述的GOx双重突变体T30V;I94V(下文缩写为GOx-T30V;I94V),适合作为进一步的特异性氨基酸置换的基础,以获得氧不依赖性GOx变体,其具有显著降低的氧化酶活性和伴随的显著增加的脱氢酶活性,同时保留对于底物葡萄糖的特异性。进一步地,本发明人发现依照本发明的GOx变体另外或单独对于除氧外的电子介质显示出显著增加的介质活性。在这点上,本发明人还发现依照本发明的GOx变体接受除氧外的某些电子介质用于电子转移。因此,依照本发明的GOx变体适合于改善的葡萄糖测量,特别是改善的血糖测量。
在本公开内容的上下文中,表达“接受除氧外的某些电子介质用于电子转移”指示:本文提供的GOx变体与选自下述的介质相互作用且因此接受所述介质用于介导电子转移的能力:亚硝基苯胺及其衍生物、偶氮化合物、吩嗪及其衍生物、吩噻嗪及其衍生物、吩噁嗪及其衍生物、二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、Ru-和Os-络合物、醌及其衍生物、吲哚酚、紫精、四硫富瓦烯及其衍生物和酞菁。
本发明涉及衍生自黑曲霉的GOx变体,除根据SEQ ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其另外具有在选自S53;A137;A173;A332;F414;和V560的六个位置中的至少一个氨基酸置换。
在另一个方面,本发明涉及衍生自黑曲霉的GOx变体,除根据SEQ
ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其另外具有在选自A173;A332;F414;和V560的四个位置中的至少一个氨基酸置换。
在进一步方面,本发明涉及GOx变体,其具有在选自根据SEQ ID NO: 1的GOx的S53;A137;A173;A332;F414;和V560的六个位置中的至少两个、或三个、或四个、或五个或甚至六个协同且因此不同的氨基酸置换,导致耗氧率中的显著减少。
进一步地,本发明涉及GOx变体,其具有在选自根据SEQ ID NO: 1的GOx的S53;A137;A173;A332;F414;和V560的六个位置中的至少两个、或三个、或四个、或五个或甚至六个协同且因此不同的氨基酸置换,导致显著减少的耗氧率和/或对于除氧外的某些电子介质显著增加的介质活性。
因此,本发明的发明人已能够提供GOx变体,与GOx-WT和根据SEQ ID NO: 1的GOx-
T30V;I94V相比较,其氧化酶活性显著降低,同时与GOx-WT和GOx- T30V;I94V相比较,该酶的脱氢酶活性显著增加。
在这点上,进一步出乎意料和令人惊讶的发现是:当在如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定中,与GOx-WT和GOx-T30V;I94V相比较时,在位置F414和V560中的特异性氨基酸置换显著降低本文提供的GOx变体的耗氧率。用于所述置换的合适氨基酸是所有剩余19种蛋白源氨基酸。特别地,合适的氨基酸是用于位置F414的Arg、Asn、Asp、Cys、Gly、His、Met、Ile、Leu、Ser、Thr、Tyr和Val,以及用于位置V560的Ala、Ile、Leu、Met、Pro、Tyr、Thr和Val。
作为另一个出乎意料和令人惊讶的发现:当与GOx-T30V;I94V相比较时,除本文提供的GOx变体的两个置换T30V和I94V之外,对组合的两个位置F414和V560的特异性氨基酸置换显著增加对于除氧外的电子介质的介质活性。用于所述置换的合适氨基酸是所有剩余19种蛋白源氨基酸。特别地,合适的氨基酸是用于位置F414的Arg、Asn、Asp、Cys、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Tyr和Val,以及用于位置V560的F414和Ala、Ile、Leu、Met、Pro、Thr、Tyr和Val。
作为进一步发现,本发明揭示当与GOx-WT和GOx-T30V;I94V相比较时,除本文提供的GOx变体的两个置换T30V和I94V之外,位置A173和A332各自一般导致GOx活性中的增加。用于所述置换的合适氨基酸是所有剩余19种蛋白源氨基酸。特别地,合适的氨基酸是用于位置A173的Ile、Thr和Val,以及用于位置A332的Ser和Asn。
因此,本发明允许本领域技术人员获得具有显著降低的耗氧率的GOx变体。
另外,本发明允许本领域技术人员获得GOx变体,其经由特异性氨基酸置换个别地或对于组合的两个特点,具有显著降低的耗氧率和/或对于除氧外的某些电子介质增加的介质活性。
发明详述
糖尿病患者需要在其日常生活期间的准确的血糖测量。如科学背景部分中概述的,现有酶促测量系统基于氧依赖性GOx和对于葡萄糖非特异性的GDH。
在来自黑曲霉的GOx-WT中,氧化酶活性比其脱氢酶活性高约三至四倍。相应地,当溶解氧存在于血糖测定系统中时,在底物葡萄糖氧化期间生成的电子也将转移至氧。因此,在电子介质的存在下测量的酶活性可以受溶解氧浓度影响。然而,来自黑曲霉的GOx-WT对于葡萄糖特异性且显示出足够的温度稳定性。
相比之下,GDH对血样中的溶解氧抗性,但对于葡萄糖不够特异性,并且因此也可以受血样中存在的其他糖类型影响,所述其他糖类型例如麦芽糖、半乳糖、木糖和麦芽三糖。
本发明的目的是消除在基于GOx的血糖测量期间的溶解氧的效应,同时保存且进一步增加其有利特性。
因此,本发明的发明人已能够提供GOx变体,与GOx-WT和根据SEQ ID NO: 1的GOx-
T30V;I94V相比较,其氧化酶活性显著降低,同时与GOx-WT和GOx- T30V;I94V相比较,该酶的脱氢酶活性显著增加。
如本文使用的,“氧化酶活性”是本文提供的GOx变体催化葡萄糖氧化以生成葡糖酸内酯的酶促活性,其中利用氧作为电子受体。“氧化酶活性”可以通过本领域已知的任何方法通过测量生成的H2O2量进行评价。例如,“氧化酶活性”可以通过用于H2O2检测的试剂例如4AA/TODB/POD(4-氨基安替比林(N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基丙氨酸二钠盐/辣根过氧化物酶)或铂电极进行测定。
如本文在相对或定量活性的上下文中使用的,氧化酶活性特别限定为通过在10mM PPB,pH 7.0、1.5 mM TODB、2 U/mL辣根过氧化物酶(POD)、和1.5 mM 4-氨基安替比林(4AA)中,在25℃下生成的H2O2量测量的氧化底物(葡萄糖)的摩尔量/单位时间。醌亚胺染料的形成可以在546
nm处进行分光光度计测量。
如本文使用的,“脱氢酶活性”是通过利用除氧外的电子介质作为电子受体,本文提供的GOx变体催化葡萄糖氧化以生成葡糖酸内酯的酶促活性。“脱氢酶活性”可以通过测量转移至所使用的除氧外的介质的电子量进行测定。
如本文在相对或定量活性的上下文中使用的,“脱氢酶活性”特别限定为通过在10 mM PPB(pH 7.0),0.6 mM methoxy
PMS(mPMS)中,在25℃下转移至除氧外的介质的电子量测量的氧化底物(葡萄糖)的摩尔量/单位时间。
在本公开内容的上下文中,表达“一种或多种电子介质”和“除氧外的一种或多种介质”指示能够以氧化和还原形式两者存在,并且快速反应以贡献或接受电子的小有机或无机化学制品。特别地,表达“一种或多种电子介质”和“除氧外的一种或多种介质”指示其为葡萄糖的电子受体且从而从氧化形式转换成还原形式的小有机或无机化学制品。根据这点,所述介质将还原形式的电子递送至工作电极用于电化学葡萄糖测量,或递送至指示剂分子用于血糖测定系统中的比色测量。某些电子受体自身充当指示剂分子,并且可以直接用于葡萄糖的比色测量(参见例如EP 8
313 27)。
在本发明的特定方面,电子介质或除氧外的介质选自亚硝基苯胺及其衍生物、偶氮化合物、吩嗪及其衍生物、吩噻嗪及其衍生物、吩噁嗪及其衍生物、二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、Ru-和Os-络合物、醌及其衍生物、吲哚酚、紫精、四硫富瓦烯及其衍生物和酞菁。
在本发明的另一个更特定的方面,电子介质或除氧外的介质选自醌类,例如菲醌、1,4二氨基蒽醌和菲醌的金属络合物,以及亚硝基苯胺,例如N,N-双(2-羟乙基)-4-亚硝基苯胺或N,N-双(2-羟乙基)-2-甲氧基-4-亚硝基苯胺。后面两种亚硝基苯胺中的任一种在下文将被称为“亚硝基苯胺介质”。
如上所述的此类电子介质已例如在US 5,393,615;US 5,498,542;US 5,520,786;WO 2009/129108;US 2009/0095642;WO 93/25898;JP 57-128678;EP 0
441 222以及Prevoteau , A. 等人, Electrochemistry
Communications ( 2010 ), 12 ( 2 ), 213-215 ; Berchmans , S. 等人, Materials
Chemistry and Physics ( 2003 ), 77 ( 2 ), 390-396中充分描述。
尤其适合于本公开内容的主题的是通过FADH2快速还原但通过抗坏血酸缓慢还原或不还原的电子介质;此类介质是例如2-[4-(二甲基氨基)苯基]-二氮烯甲酰胺的衍生物。
本文描述的方法的另一种用途是生成定制的“氧依赖性GOx变体”,以使各自的GOx变体适应固定的介质。
在这点上,术语“定制的”意指本发明的各自GOx变体的多肽序列允许GOx与某些固定的介质相互作用,并且因此接受来自某些固定的介质的电子。
表达“某些固定的介质”指示选自下述的除氧外的一种或多种电子介质:亚硝基苯胺及其衍生物、偶氮化合物、吩嗪及其衍生物、吩噻嗪及其衍生物、吩噁嗪及其衍生物、二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、Ru-和Os-络合物、醌及其衍生物、吲哚酚、紫精、四硫富瓦烯及其衍生物和酞菁。
在本公开内容的另一个非常特定的方面,来自亚硝基苯胺特别是对亚硝基苯胺或其衍生物的介质,且特别是亚硝基苯胺介质或其衍生物优选作为依照本发明的电子介质。一般而言,来自亚硝基苯胺的介质例如在测试条上与葡萄糖和GOx原位反应,以形成充当电子介质的种类。在葡萄糖测量和介质活性上下文中的亚硝基苯胺在Hönes , J. , M ü ller , P. 和 Surridge , N. ( 2008 ) . The
Technology Behind Glucose Meters: Test Strips. Diabetes Technology &
Therapeutics 10 , 10-26 ;和 EP 0 354 441中详细描述。
上文列表不应限于依照本发明除氧外的介质,因为本领域技术人员已知的另外其他商购可得的电子介质完全由本公开内容包含。
在本公开内容的另一个非常特定的方面,当通过如条目ff)下的材料与方法中概述的介质测定进行测定时,与根据SEQ
ID NO: 1的GOx-T30V;I94V的各自介质活性相比较,根据序列SEQ ID NO: 2至SEQ
ID NO: 9的GOx变体显示出对于介质N,N-双(2-羟乙基)-4-亚硝基苯胺至少150%的介质活性。
在本公开内容的另一个非常特定的方面,当通过如条目ff)下的材料与方法中概述的介质测定进行测定时,与根据SEQ
ID NO: 1的GOx-T30V;I94V的各自介质活性相比较,除根据SEQ ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,还具有下述另外的氨基酸置换的GOx变体显示出对于介质N,N-双(2-羟乙基)-2-甲氧基-4-亚硝基苯胺至少150%的介质活性:
• A173V;A332S;F414Y;和V560A或
• A173V;A332S;和F414Y。
除根据SEQ ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,上述置换
• A173V;A332S;F414Y;和V560A或
• A173V;A332S;和F414Y。
反映本文提供的GOx变体的另一个特征,即接受除氧外的某些电子介质(在这种情况下,N,N-双(2-羟乙基)-2-甲氧基-4-亚硝基苯胺介质)用于电子转移的能力。
在该上下文中,表达“除氧外的某些电子介质”指示选自下述的除氧外的一种或多种电子介质:亚硝基苯胺及其衍生物、偶氮化合物、吩嗪及其衍生物、吩噻嗪及其衍生物、吩噁嗪及其衍生物、二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、Ru-和Os-络合物、醌及其衍生物、吲哚酚、紫精、四硫富瓦烯及其衍生物和酞菁。
在第一个方面,本发明涉及选自下述的根据SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的主题:
a)根据SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶,除两个氨基酸置换T30V和I94V之外,还具有在选自所述SEQ ID NO: 1中的S53;A137;A173;A332;F414;和V560的六个位置中的至少一个另外的氨基酸置换;或
b)显示出与根据a)的葡萄糖氧化酶至少70%,特别是至少80%或> 90%的氨基酸序列同一性的葡萄糖氧化酶,条件是除两个氨基酸置换T30V和I94V之外,还具有在选自根据SEQ ID NO: 1的S53;A137;A173;A332;F414;和V560的六个位置中的至少一个另外的氨基酸置换,
并且条件是根据b)的葡萄糖氧化酶显示出根据a)的葡萄糖氧化酶至少70%,特别是至少80%或> 90%的酶活性,并且显示出根据a)的葡萄糖氧化酶至少70%,特别是至少80%或> 90%的对于葡萄糖的酶特异性,
并且条件是根据b)的葡萄糖氧化酶显示出根据SEQ ID
NO: 1的葡萄糖氧化酶对于作为电子受体的氧降低至少5倍的活性,或显示出根据SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶对于除氧外的电子介质增加至少1.5倍的活性,或两者;或
c)根据a)或b)的葡萄糖氧化酶的活性片段,条件是当与根据a)或b)的葡萄糖氧化酶相比较时,根据c)的活性片段具有如在a)或b)下概述的氨基酸置换,
并且条件是根据c)的葡萄糖氧化酶显示出根据a)的葡萄糖氧化酶至少70%,特别是至少80%或> 90%的酶活性,并且显示出根据a)的葡萄糖氧化酶至少70%,特别是至少80%或> 90%的对于葡萄糖的酶特异性,
并且条件是根据c)的葡萄糖氧化酶显示出根据SEQ
ID NO: 1的葡萄糖氧化酶对于作为电子受体的氧降低至少5倍的活性,或显示出根据SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶对于除氧外的电子介质增加至少1.5倍的活性,或两者。
在本说明书的上下文中,表达“在氨基酸序列中的一种或多种另外的修饰”和“一种或多种另外的氨基酸置换”指示:在根据SEQ
ID NO: 1的位置S53;A137;A173;A332;F414;和V560的,至少一种氨基酸由剩余19种蛋白源氨基酸中任一种的置换。进一步地,上述表达还包含由剩余19种蛋白源氨基酸中任一种或其化学等价物的协同氨基酸置换,条件是在选自根据SEQ ID NO: 1的位置S53;A137;A173;A332;F414;和V560中置换至少两个、或三个、或四个、或五个或甚至六个位置。
与本发明的GOx变体有关的术语“酶活性”指定蛋白质,其催化β-D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸-1,5-内酯(D-葡萄糖+ O2 → 葡糖酸内酯 + H2O2),其随后可以水解为葡糖酸。
在第二个方面,本发明涉及下述实施方案的主题,其指定本发明的第一个方面:
在一个方面,本发明的主题是根据本发明的第一个方面的GOx变体,其中
• 通过ABTS测定来测定对于作为电子受体的氧的所述活性,其包括下述步骤:
a)将75 µL样品酶溶液转移至含有100
µL磷酸盐缓冲液(pH 7)的96孔平底微孔板
b)将20 µL反应混合物加入每个孔,导致下述浓度:0.91
U/mL HRP(辣根过氧化物酶);2.3 mM ABTS(2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))
c)通过添加25 µL葡萄糖底物溶液,且随后将板以1000
rpm振荡共30秒来起始反应
d)使用微孔板阅读器在414 nm处动态测定ABTS的氧化
• 通过介质测定来测定对于除氧外的电子介质的所述活性,其包括下述步骤:
a)将75 µL酶溶液样品转移至96孔平底微孔板
b)加入100 µL介质溶液(19.05
mM N,N-双(2-羟乙基)-4-亚硝基苯胺);5%(w/w)聚乙烯吡咯烷酮,pH 7和20 µL 25 mM磷钼酸
c)通过添加25 µL葡萄糖底物溶液,且随后将板以1000
rpm振荡共1分钟来起始反应
d)使用微孔板阅读器在700 nm处监控磷钼酸还原的动力学。
在涉及上述方面的另一个方面,除氧外的电子介质选自亚硝基苯胺及其衍生物、偶氮化合物、吩嗪及其衍生物、吩噻嗪及其衍生物、吩噁嗪及其衍生物、二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、Ru-和Os-络合物、醌及其衍生物、吲哚酚、紫精、四硫富瓦烯及其衍生物和酞菁。
在涉及上述方面的另一个方面,本发明的主题是GOx变体,除根据SEQ
ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其还具有在选自根据SEQ ID NO: 1的S53;A137;A173;A332;F414;和V560的六个位置中的另外两个、或三个、或四个、或五个或六个氨基酸置换。
在涉及上述方面的另一个方面,本发明提供了GOx变体,其中关于所述一个或多个另外置换的氨基酸选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val,条件是取代氨基酸是如根据SEQ ID NO: 1的各自位置中存在的其他氨基酸。
在涉及上述方面中任一个的另一个方面,本发明提供了GOx变体,其中关于一个或多个另外置换的氨基酸选自Ala、Ile、Thr、Tyr、Val、Ser、Asn、Arg、Asp、Cys、Gly、His、Met、Leu、Phe、Met和Pro,条件是取代氨基酸是如根据SEQ ID NO: 1的各自位置中存在的其他氨基酸。
在涉及上述方面中任一个的另一个方面,本发明提供了GOx变体,其中关于一个或多个另外置换的氨基酸选自:
用于位置S53的Phe;和/或
用于位置A137的Ser、Leu;和/或
用于位置A173的Ile、Thr、Val;和/或
用于位置A332的Ser、Asn、Val;和/或
用于位置F414的Arg、Asn、Asp、Cys、Gly、His、Ile、Met、Ser、Thr、Tyr、Val;和/或
用于位置V560的Ala、Ile、Leu、Met、Pro、Thr、Tyr和Val。
在涉及上述方面中任一个的另一个方面,本发明提供了GOx变体,其中除根据SEQ
ID NO: 1的置换T30V和I94V之外,位置F414和/或V560中的至少一个另外置换的氨基酸置换与位置A137和/或A173和/或A332中的至少一个氨基酸置换组合。
在涉及上述方面中任一个的另一个方面,本发明提供了根据SEQ ID NO: 4的GOx变体,除根据SEQ ID NO: 1的置换T30V和I94V之外,还具有另外的氨基酸置换A173I;A332S;和F414L。
在涉及上述方面中任一个的另一个方面,本发明提供了根据SEQ ID NO: 3的GOx变体,除根据SEQ ID NO: 1的置换T30V和I94V之外,还具有另外的氨基酸置换A173V;A332S;F414I;和V560T 。
在涉及上述方面中任一个的另一个方面,本发明提供了根据SEQ ID NO: 6的GOx变体,除根据SEQ ID NO: 1的置换T30V和I94V之外,还具有另外的氨基酸置换A173V;A332N;F414V;和V560L 。
在涉及上述方面中任一个的另一个方面,本发明提供了GOx变体,当借助于ABTS测定与黑曲霉的野生型GOx相比较和/或根据SEQ ID NO: 1的GOx相比较时,对于作为电子受体的氧具有降低至少5倍的活性,所述ABTS测定包括下述步骤:
a.)将75 µL样品酶溶液转移至含有100
µL磷酸盐缓冲液(pH 7)的96孔平底微孔板
b.)将20 µL反应混合物加入每个孔,导致下述浓度:0.91
U/mL HRP(辣根过氧化物酶);2.3 mM ABTS(2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))
c.)通过添加25 µL葡萄糖底物溶液,且随后将板以1000
rpm振荡共30秒来起始反应
d.)使用微孔板阅读器在414 nm处动态测定ABTS的氧化。
在涉及上述方面中任一个的另一个方面,本发明提供了GOx变体,由此当通过介质测定进行测定时,与根据SEQ
ID NO: 1的GOx相比较时,所述GOx变体显示出对于除氧外的介质增加至少1.5倍的活性,所述介质测定包括下述步骤:
a.)将75 µL酶溶液样品转移至96孔平底微孔板
b.)加入100 µL介质溶液(19.05
mM N,N-双(2-羟乙基)-4-亚硝基苯胺);5%(w/w)聚乙烯吡咯烷酮,pH 7和20 µL 25 mM磷钼酸
c.)通过添加25 µL葡萄糖底物溶液,且随后将板以1000
rpm振荡共1分钟来起始反应
d.)使用微孔板阅读器在700 nm处监控磷钼酸还原的动力学。
在涉及上述方面中任一个的另一个方面,本发明提供了GOx变体,当通过介质测定进行测定时,所述GOx变体显示出至少99.9%的葡萄糖特异性,和/或< 4%的半乳糖特异性,和/或< 0.3%的麦芽糖特异性,和/或< 6%的木糖特异性,和/或< 0.1%的麦芽三糖特异性,所述介质测定包括下述步骤:
a.)将75 µL酶溶液样品转移至96孔平底微孔板
b.)加入100 µL介质溶液(19.05
mM N,N-双(2-羟乙基)-4-亚硝基苯胺);5%(w/w)聚乙烯吡咯烷酮,pH 7和20 µL 25 mM磷钼酸
c.)通过添加25 µL各自的糖底物溶液,且随后将板以1000
rpm振荡共1分钟来起始反应
d.)使用微孔板阅读器在700 nm处监控磷钼酸还原的动力学。
在本公开内容的上下文中,表达“对于葡萄糖特异性或对于底物葡萄糖特异性”指示:当通过如下文材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时,本文提供的GOx对于底物葡萄糖100%的活性。言下之意,当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时,本文提供的GOx对于除葡萄糖外的糖例如半乳糖、麦芽糖、木糖和麦芽三糖的残留活性<
6%。
在涉及上述方面中任一个的另一个方面,本发明提供了GOx变体,当借助于介质测定与根据SEQ
ID NO: 1的GOx的亚硝基苯胺介质活性相比较时,所述GOx变体显示出对于用于电子转移的亚硝基苯胺介质> 400%、或>
500%、或> 600%的活性,所述介质测定包括下述步骤:
a.)将75 µL酶溶液样品转移至96孔平底微孔板
b.)加入100 µL介质溶液(19.05
mM N,N-双(2-羟乙基)-4-亚硝基苯胺);5%(w/w)聚乙烯吡咯烷酮,pH 7和20 µL 25 mM磷钼酸
c.)通过添加25 µL葡萄糖底物溶液,且随后将板以1000
rpm振荡共1分钟来起始反应
d.)使用微孔板阅读器在700 nm处监控磷钼酸还原的动力学。
和当借助于ABTS测定与根据SEQ ID NO: 1的GOx的氧活性相比较时,≤ 30%、或< 25%、或< 20%,且特别是< 15%、或≤ 10%的氧活性,所述ABTS测定包括下述步骤:
a.)将75 µL样品酶溶液转移至含有100
µL磷酸盐缓冲液(pH 7)的96孔平底微孔板
b.)将20 µL反应混合物加入每个孔,导致下述浓度:0.91
U/mL HRP(辣根过氧化物酶);2.3 mM ABTS(2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))
c.)通过添加25 µL葡萄糖底物溶液,且随后将板以1000
rpm振荡共30秒来起始反应
d.)使用微孔板阅读器在414 nm处动态测定ABTS的氧化。
在另一个方面,本发明的主题涉及经分离的多核苷酸,其编码根据上述方面中任一个的GOx变体或其活性片段。
在另一个方面,本发明提供了根据本发明的GOx变体的活性(功能)等价物/片段。
术语“其一种或多种活性等价物/一个或多个片段”或同义词“其一种或多种功能等价物/一个或多个片段”指依照本发明的任何经修饰的和因此优化的GOx变体,由此如在根据SEQ
ID NO: 1的相应序列中,至少一个氨基酸缺失或由另一个氨基酸置换,前提是此类一种或多种等价物/一个或多个片段仍显示出关于酶活性、酶特异性和显著降低的耗氧率和/或对于除氧外的特定介质显著增加的活性的基本特性,通过具有根据SEQ
ID NO: 1的至少置换T30V和I94V的存在,并且进一步具有在选自根据SEQ ID NO: 1的S53;A137;A173;A332;F414;和V560的位置中的至少一个另外的氨基酸置换。
在本发明的特定方面,根据本发明的GOx变体的一种或多种功能等价物/一个或多个片段包含一种或多种氨基酸序列,其与根据SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 9的序列至少70%同源,特别是至少80%同源或> 90%同源。
在另一个方面,本发明的主题涉及通过根据本发明的GOx变体或其活性片段来检测、测定或测量先体外后体内样品中的葡萄糖的方法;所述检测、测定或测量包括使先体外后体内样品与所述GOx或其活性片段接触。
在涉及上述方面的另一个方面,所述葡萄糖检测、测定或测量使用传感器或测试条装置执行。
本发明还涉及用于生产本发明的GOx变体的方法,编码所述酶的核酸,载体,宿主细胞以及使用所述酶检测、测定或测量样品中的葡萄糖的方法,以及同样包含所述酶的装置。
在特定方面,本发明提供了用于测定样品中的葡萄糖的装置,其包含本发明的GOx变体中的至少一种和除氧外的电子介质。
在本发明的另一个特定方面,除氧外的一种或多种电子介质选自亚硝基苯胺及其衍生物、偶氮化合物、吩嗪及其衍生物、吩噻嗪及其衍生物、吩噁嗪及其衍生物、二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、Ru-和Os-络合物、醌及其衍生物。
涉及上述方面中任一个的主题的本发明的另一个特定方面是GOx变体,除根据SEQ
ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其还具有在选自SEQ ID NO: 1的A173;A332;F414;和V560的四个位置中的至少一个另外的氨基酸置换。
由本发明预期的本文提供的GOx变体的主要应用之一是其在测试条中的用途,以监控糖尿病患者的先体外后体内样品中的血糖水平。当然,可以研究许多种类的样品。特别地,体液如血液、血清和血浆是此类样品的来源。
因此,在另一个方面,本发明提供了具有本发明的GOx变体中的至少一种的酶电极,其固定在所述电极上。
在另一个方面,本发明提供了用于测定葡萄糖的酶传感器,其包括本发明的酶电极作为工作电极,且因此具有本发明的GOx变体中的至少一种。
在另外一个方面,本发明提供了用于测定样品中的葡萄糖的试剂盒,其包括根据本发明的至少一种GOx变体和除氧外的电子介质。
用于测量葡萄糖的试剂盒可以使用本发明的至少一种GOx变体进行构建。除本发明的GOx变体之外,试剂盒含有测量必需的缓冲液,除氧的适当电子介质特别是亚硝基苯胺介质,和需要时的酶例如过氧化物酶,以及用于制备校准曲线的葡萄糖标准溶液和使用说明书。
样品中的葡萄糖浓度可以通过测量由酶反应生成的电子量进行测定。多种传感器系统是本领域已知的,包括碳电极、金属电极和铂电极。将本发明的GOx变体固定到电极上。用于固定的方法的例子包括交联、封装到大分子基质内、用透析膜包被、光学交联聚合物、导电聚合物、氧化还原聚合物及其任何组合。
测定装置可以具有与用于监控血糖水平,常规商购可得的安培测量生物传感器测试条中的任一种相似的结构。此类装置的一个例子具有置于绝缘基材上的两个电极(工作电极和参考或对电极)、试剂端口和样品接收器。试剂端口含有本发明的GOx变体和除氧外的介质。当样品例如血样加入样品接收器时,样品中含有的葡萄糖将与GOx变体反应,从而电子转移指示样品中的葡萄糖量。例如根据WO 2004/113900和US 5,997,817,适合测定酶底物的电化学传感器的典型例子是已知的。作为电化学传感器的替代物,可以使用光学检测技术。通常,此类光学装置基于试剂系统中发生的变色,所述试剂系统包含酶、电子介质和指示剂。变色可以使用荧光、吸收或减轻(remission)测量进行定量。例如根据US 7,008,799;US
6,036,919和US 5,334,508,适合测定酶底物的光学装置的典型例子是已知的。
在另一个方面,本发明提供了含有经分离的多核苷酸的表达载体,所述经分离的多核苷酸编码根据本发明的GOx变体或其活性片段。
在另一个方面,本发明提供了包含含有经分离的多核苷酸的表达载体的宿主细胞,在本文中也称为转化体,所述经分离的多核苷酸编码根据本发明的GOx变体或其活性片段。
在另一个方面,本发明提供了用于生产根据本发明的GOx变体或其活性片段的方法,该方法包括培养上述转化体。
在另一个方面,本发明提供了可通过上述方法获得的根据本发明的GOx变体或其活性片段。
在另一个特定方面,本文提供的表达载体优选包含编码本发明的GOx变体的DNA序列之一的全部或一部分。
含有本文提供的GOx变体的编码和控制序列的合适表达载体可以使用本领域已知的标准DNA技术进行构建,所述标准DNA技术中的许多在Sambrook等人,in “Molecular
Cloning: A Laboratory Manual”(1989),Cold Spring Habor,NY
Cold Spring Habor Laboratory Press中描述。
合适的宿主细胞包括例如可得自Promega(2800
Woods Hollow Road,Madison,WI,USA)的大肠杆菌(E.coli)HB101(ATCC33694),可得自Stratagene(11011 North Torrey Pine Road,La Jolla,CA,USA)的XL1-Blue MRF’等。合适的毕赤酵母属(Pichia)宿主细胞包括例如,可得自Invitrogen(5791 Van Allan Way,Carlsbad,CA 92008,USA)的巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)X33或巴斯德毕赤酵母KM71H。
根据本发明的GOx变体的重组生产可以在本领域已知的宿主中进行。合适的宿主可以选自丝状真菌菌株,例如黑曲霉、酱油曲霉(Aspergillus
sojae)和米曲霉(Aspergillus oryyzae)。合适的宿主可以选自酵母菌株,如例如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母和多形汉逊酵母(Hansenula
polymorpha)。
在另一个特定方面,通过在酵母特别是酿酒酵母中表达编码所述GOx变体的多核苷酸,可获得根据本发明的GOx变体或其功能等价物。
表达载体可以通过本领域已知的多种方法引入宿主细胞内。例如,通过聚乙二醇介导的原生质体转化方法(Sambrook等人1989,同上),可以进行用表达载体转化宿主细胞。然而,还可以采用用于将表达载体引入宿主细胞内的其他方法,例如电穿孔、弹道DNA注射或原生质体融合。
一旦含有根据本发明的GOx变体的表达载体已引入适当宿主细胞内,宿主细胞就可以在允许根据本发明的所需GOx变体表达的条件下进行培养。通过例如抗生素选择或营养突变体的互补和从最小培养基中选择,可以容易地鉴定含有所需表达载体(且因此具有编码根据本发明的GOx变体的DNA序列)的宿主细胞[J. Sambrook , D. W. Russell: “ Molecular
Cloning: a laboratory manual ”,第 3 版, Cold Spring Harbor , New
York ( 2001 ) ]。本文提供的GOx变体的表达可以通过本领域技术人员已知的不同方法进行鉴定,如测量GOx mRNA转录物的生产,免疫检测基因产物或检测基因产物的酶促活性。特别地,酶促测定应如条目ff)下的材料与方法部分中的介质测定下概述的应用。另外,当如条目gg)下所述的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时,通过如依照本发明显著降低的耗氧率,可以鉴定本文提供的GOx变体。
在本发明的另一个方面,通过在表达编码本发明的GOx变体之一的DNA序列的宿主细胞中生产,可获得本文描述的用于本发明的GOx变体的多肽。通过由编码本发明的GOx变体之一的DNA序列编码的mRNA的体外翻译,还可以获得本发明的多肽。例如,DNA序列可以插入合适的表达载体内,所述表达载体依次又可以用于体外转录/翻译系统中。
包含如上定义和描述的经分离的多核苷酸的表达载体代表本发明的另一个特定方面,所述经分离的多核苷酸可操作地连接至能够促进其在无细胞的肽合成系统中的表达的启动子序列。
例如通过如上所述的操作产生的多肽随后可以使用多种常规蛋白质纯化技术进行分离且纯化。例如,可以采用层析操作例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析。
在另一个方面,本发明提供了药物组合物,其包含根据本发明的至少一种GOx变体或其活性片段。
在另一个方面,根据本发明的GOx变体保留其对于底物葡萄糖特异性的固有特性,但当通过如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时,由于除根据SEQ ID NO: 1的置换T30V和I94V之外,氨基酸序列中的特定位置中的至少一个另外的氨基酸置换,最大限度的残留氧活性降低至≤ 30%。伴随地,当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时,本文提供的GOx变体显示出对于除氧外的电子介质> 400%、或>
500%、或> 600%的酶活性。
考虑到上文,本发明在本文提供的GOx变体中组合
i)GOx的葡萄糖特异性特性
ii)与GDH的氧不依赖性酶活性特性
经由从氧化酶活性朝向脱氢酶活性的转变
iii)和任选对于除氧外的某些电子介质增加的活性,
用于实现准确的葡萄糖测量,特别是准确的血糖测量。
在根据本发明的GOx变体的上下文中,表达“从氧化酶活性朝向脱氢酶活性的转变”指示
• 当通过如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时,根据本发明的GOx变体的氧活性从作为参考的GOx-T30V;I94V的1.0开始朝向≤ 0.3、或< 0.25、或< 0.2,特别是< 0.15、或≤ 0.1残留氧活性的减少,和
• 当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时,根据本发明的GOx变体的脱氢酶活性从作为参考的GOx-T30V;I94V的介质活性1.0开始朝向至少1.5介质活性的伴随增加。
上述值代表在氧活性和介质活性方面本发明的GOx变体的酶活性,以及作为参考的GOx-T30V;I94V的各自酶活性之间的比例(商数)。当通过如条目ee)下的材料与方法部分中概述的ELISA进行测定时,比例(商数)基于两种GOx活性(以[U/mg]表示的氧活性和介质活性)。
根据本发明,根据序列SEQ ID NO: 11至SEQ
ID NO: 17的核酸分子各自编码经修饰的多肽或其片段,其衍生自编码根据SEQ ID NO: 1的多肽的SEQ ID NO: 10(GOx-T30V;I94V)。
如本文使用的,术语“GOx-T30V;I94V”指示基于根据SEQ ID NO: 2的黑曲霉野生型(WT)序列的GOx,其进一步具有在其多肽序列即SEQ ID NO: 1中的两个置换T30V和I94V。
如本文使用的,术语“GOx双重突变体”相等地指示基于根据SEQ ID NO: 2的黑曲霉WT序列的GOx,其进一步具有在其多肽序列即SEQ ID NO: 1中的两个置换T30V和I94V。所述GOx双重突变体衍生自Zhu等人(2006;2007)。
根据本发明,对应于SEQ ID NO: 1的核酸分子(即SEQ
ID NO: 10)用于进一步改善根据本发明的GOx酶的动力学特性,特征在于从氧化酶活性朝向脱氢酶活性的转变。这通过本发明人经由特异性核苷酸序列修饰来实现,导致在位置S53;A137;A173;A332;F414;和V560的至少一个中的氨基酸置换,而两个置换T30V和I94V根据SEQ ID NO: 1已经存在。
在另一个方面,本发明提供了GOx变体,除根据SEQ ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其还具有在选自SEQ ID NO: 1的S53;A137;A173;A332;F414;和V560的六个位置中的另外两个、或三个、或四个、或五个或六个氨基酸置换,从而显示出对GOx酶活性的协同作用。
在本发明的上下文中,表达“对GOx酶活性的协同作用”指示除根据SEQ ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,在位置S53;A137;A173;A332;F414;和V560中的至少两个另外的氨基酸置换,具有在减少GOx耗氧率方面对GOx酶活性的作用。
进一步地,在本发明的上下文中,“对GOx酶活性的协同作用”指示除根据SEQ
ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,在位置S53;A137;A173;A332;F414;和V560中的至少两个另外的氨基酸置换,具有在减少GOx耗氧率和/或增加对于除氧外的电子介质的GOx介质活性方面对GOx酶活性的作用。
另外,在本发明的上下文中,“对GOx酶活性的协同作用”指示除根据SEQ ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,在位置S53;A137;A173;A332;F414;和V560中的至少两个另外的氨基酸置换,具有在接受除氧外的某些电子介质用于电子转移方面对GOx酶活性的作用。在特定方面,本发明提供了GOx变体,除根据SEQ
ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其还具有在F414和V560位置中由剩余19种蛋白源氨基酸中任一种的另外的氨基酸置换,与在位置A137;A173;和A332中由剩余19种蛋白源氨基酸中任一种的氨基酸置换组合。
在特定方面,本发明提供了GOx变体,除根据SEQ ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其还具有在F414和V560位置中由剩余19种蛋白源氨基酸中任一种的另外的组合氨基酸置换。
本发明的另一个特定方面涉及上述方面,并且提供了GOx变体,除根据SEQ
ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其还具有另外的组合氨基酸置换F414M或F414V和V560P或V560L。
在进一步的特定方面,本发明提供了GOx变体,除根据SEQ
ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其还具有另外的氨基酸置换F414M或F414V,与一个或多个氨基酸置换V560P或V560L和/或A137L和/或A173I或A173V和/或A332S或A332V或A332T组合。
在进一步的特定方面,本发明提供了GOx变体,除根据SEQ
ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其还具有另外的氨基酸置换F414M或F414V,与一个或多个氨基酸置换V560P或V560L和/或A137L和/或A173I或A173V和/或A332S或A332V或A332T组合。
本发明的另一个特定方面涉及上述方面,并且提供了GOx变体,除根据SEQ
ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其还具有选自上述置换中任一个的至少两个组合的氨基酸置换。
对于除氧外的电子介质的GOx特异性可以通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进行测定。
在另一个特定方面,本发明提供了GOx变体,当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时,其对于电子介质N,N-双(2-羟乙基)-4-亚硝基苯胺具有> 400%、或> 450%、或> 500%、或> 550%、或甚至> 600%的介质活性。
在另一个特定方面,本发明提供了GOx变体,当借助于如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定,与GOx-WT相比较或与根据SEQ ID NO: 1的GOx-T30V;I94V相比较时,对于作为电子受体的氧具有降低至少5倍的活性,或对于作为电子受体的氧具有降低至少6倍的活性,或对于作为电子受体的氧具有降低至少7倍的活性。
在另一个特定方面,本发明提供了GOx变体,当通过如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时,其具有GOx WT氧化酶活性或根据SEQ ID NO: 1的GOx-T30V;I94V氧化酶活性的≤ 30%剩余氧化酶活性,或特别具有GOx WT氧化酶活性或根据SEQ
ID NO: 1的GOx-T30V;I94V氧化酶活性的< 20%或< 15%剩余氧化酶活性,或甚至更特别具有GOx WT氧化酶活性或根据SEQ
ID NO: 1的GOx-T30V;I94V氧化酶活性的< 10%剩余氧化酶活性。
在本发明的另外特定方面,如SEQ ID NO: 11至SEQ
ID NO: 17中给出的核酸分子的功能等价物/片段是相应的RNA分子,其由所述DNA序列或与SEQ ID NO: 11至SEQ ID NO: 17的序列基本上互补的序列编码。
在本发明的上下文中,术语“RNA分子”意指核糖核苷酸分子的线性聚合物,其是单链的,且充当根据SEQ
ID NO: 3至SEQ ID NO: 9的本文提供的GOx变体的蛋白质合成模板。
在本发明的进一步特定方面,同源性程度或百分比是与SEQ ID NO: 3至SEQ ID NO: 9 至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%、或至少99%或100%,条件是它们显示出与说明书自始至终概述的相同的置换,并且进一步显示出如根据本发明的GOx变体相同的特性,所述必需特性是酶活性、对于葡萄糖的酶特异性和显著降低的耗氧率和/或对于除氧外的特定介质显著增加的活性。
序列同一性可以通过BLAST算法,基本局部比对搜索工具(BLAST)[Altschul , S.F. 等人 1990. J. Mol. Biol. 215:403 ; Altschul , S.F. 等人 1997. Nucleic Acid Res. 25:3389-3402]进行测定。本文提及的氨基酸序列同一性百分比指通过所述BLAST算法测定序列同一性,其中在其上测定同源性的区域是本发明的GOx变体的整个序列。序列同一性可以通过本领域技术人员已知的用于序列比对和比较目的的任何其他方法进行测定。
本领域技术人员应当理解本文提供的GOx变体可以具有或不具有不同于上述置换的进一步修饰,而不改变所述GOx变体的必需特性,即如在本发明的意义中的对于葡萄糖的特异性、显著降低的耗氧率和/或对于除氧外的特定介质显著增加的活性。
本发明的另一个特定方面是经分离的多核苷酸,其编码根据本发明的GOx变体或其活性等价物/片段。经分离的多核苷酸可以是编码如部分 - 序列表中明确列出的下述序列(即SEQ
ID NO: 11至SEQ ID NO: 17)的DNA或RNA分子或其相应基因。
在另一个特定方面,当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时,通过在30℃至47℃范围内具有至少70%特别是至少80%的残留酶活性,由本发明提供的GOx变体显示出温度稳定性。
在另一个特定方面,当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时,通过在48℃至60℃范围内具有至少10%的残留酶活性,由本发明提供的GOx变体显示出温度稳定性。
本发明的GOx变体可以以多种形式提供,例如作为冷冻干燥试剂或适当的贮存溶液中的溶液。
本文提供的GOx变体占优势地预期用于在更准确的糖尿病血糖测试装置中应用。具体地,仅通过显著降低的耗氧率,本发明的氧不依赖性GOx变体利用氧用于电子转移,这意指当通过如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时,对于氧的残留GOx活性是≤ 30%、或< 25%、或< 20%,特别是< 15%、或≤ 10%。相应地,显著量的葡萄糖在用于更准确的血糖测量的介质相关反应中反应,而与血样中的溶解氧含量的反应显著降低。当动脉、静脉或毛细血管血液是用于测量的来源,或在超过海平面的不同高度测量血糖浓度的情况下时,这对于糖尿病患者是有利的。
在另一个方面,本发明提供了GOx变体,其显示出显著降低的耗氧率和/或对于除氧外的电子介质显著增加的介质活性,这也导致糖尿病患者由其获益的更准确的血糖测量。
定义
在本说明书的上下文中,表达“氧依赖性的”和“氧依赖性”指示:当通过如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时,特征在于残留氧活性>
30%的GOx活性。
相比之下,表达“氧不依赖性的”和“氧不依赖性”指示:当通过如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时,特征在于残留氧活性≤ 30%、或<
25%、或< 20%,特别是<
15%、或< 10%的GOx活性。
在本说明书的上下文中,表达“对于葡萄糖非特异性”指示:当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时,对于底物葡萄糖<
100%、或< 99.9%、或<
99.5%的GOx活性。言下之意,当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时,“对于葡萄糖非特异性的”GOx显示出对于除葡萄糖外的糖(例如半乳糖、麦芽糖、木糖和麦芽三糖)> 6%的GOx活性。
与本发明的GOx变体有关的术语“经修饰的”或“修饰”指GOx蛋白质,除根据SEQ ID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外,其含有在根据SEQ ID NO: 1的多肽序列中,在位置S53;A137;A173;A332;F414;和V560中的至少一个另外的氨基酸置换。该术语还指示编码此类“经修饰的”GOx变体的各自多核苷酸或其序列保守变化。
多核苷酸序列的“序列保守变化”是其中给定密码子位置中的一个或多个核苷酸的变化导致在该位置处编码的氨基酸不改变。
术语“GOx变体”指示根据本发明的葡萄糖氧化酶具有根据SEQ
ID NO: 1的两个氨基酸置换T30V和I94V,以及在根据SEQ ID NO: 1的多肽序列中,在位置S53;A137;A173;A332;F414;和V560中的至少一个另外的氨基酸置换,特征在于显示出对于底物葡萄糖的酶特异性,以及显著降低的耗氧率和/或对于除氧外的特定介质显著增加的活性。
应当理解本说明书自始至终的氨基酸序列的编号在初始S(Ser、丝氨酸)处以“1”开始,如根据SEQ ID NO: 1的成熟GOx-T30V;I94V蛋白质中。
依照本发明的术语“酶”意指整个或大部分由蛋白质或多肽组成的任何物质,其或多或少特异性地催化或促进一种或多种化学或生物化学反应。术语“酶”还可以指催化多核苷酸(例如RNA或DNA)。
术语“氧化反应”在一般术语中意指涉及对底物添加氧的化学或生物化学反应,以形成加氧或氧化底物或产物。氧化反应通常伴随还原反应(因此,术语“氧化还原”反应包含氧化和还原两者)。当化合物接受氧或丧失电子时,它是“氧化的”。 当化合物丧失氧或获得电子时,它是“还原的”。GOx通常催化伯醇基团氧化为醛。
如说明书自始至终使用的,术语“葡萄糖氧化酶”指定蛋白质,其催化β-D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸-1,5-内酯(D-葡萄糖+ O2 → 葡糖酸内酯 + H2O2),其随后可以水解为葡糖酸。相应地,葡萄糖氧化酶是酶。进一步地,术语“具有葡萄糖氧化酶活性的多肽”指具有上述活性的多肽。葡萄糖氧化酶可以缩写为“GOx”或“E.C. 1.1.3.4”。如说明书自始至终使用的,术语“GOx-WT或WT”指示真菌黑曲霉的野生型GOx。术语“GOx-T30V;I94V;或T30VI94V;或双重突变体;或亲本突变体”指示具有根据SEQ
ID NO: 1的两个置换T30V和I94V的GOx变体,如Zhu等人(2006;2007)中所述。
根据本发明的GOx变体的确均具有共同的根据SEQ ID NO: 1的两个置换T30V和I94V,以及在位置S53;A137;A173;A332;F414;和V560的由根据本发明适合替换的剩余19种蛋白源氨基酸中任一种的至少一个另外的氨基酸置换。说明书正文自始至终,分别的“EZ”编号可以缩写根据本发明的GOx变体。“EZ”代表酶。
酶“葡萄糖氧化酶”因此是葡萄糖氧化酶类别的成员,其通过将氧从来源或供体添加、插入、促成或转移至底物,来催化氧化反应。此类酶也称为氧化还原酶(oxidoreductases)或氧化还原酶(redox enzymes),并且包含氧合酶、氢化酶或还原酶、氧化酶和过氧化物酶。
在这点上,术语“氧供体”、“氧化试剂”和“氧化剂”意指物质、分子或化合物,其在氧化反应中将氧贡献给底物。通常,氧供体被还原(接受电子)。示例性氧供体包括例如分子氧或双氧(O2),并且过氧化物包括例如烷基过氧化物例如叔丁基过氧化物,且最优选过氧化氢(H2O2)。“过氧化物”是具有彼此结合的两个氧原子的任何化合物。
如所述的,葡萄糖氧化酶或如本文使用的GOx变体的“活性”或“酶活性”涉及其催化氧化反应D-葡萄糖+O2 → 葡糖酸内酯+H2O2的能力的量度,并且可以表示为反应产物在其下产生的速率。例如,葡萄糖氧化酶活性可以表示为每单位时间产生的产物(葡糖酸内酯和/或H2O2)量,或每单位(例如浓度或重量)葡萄糖氧化酶。
一般而言,本发明的多肽在本文中也可以被称为“突变体”、“突变蛋白”或“变体”或“经修饰的GOx”或“修饰”,意指它已由黑曲霉GOx-WT自身以及根据SEQ
ID NO: 1的GOx-T30V;I94V制备、改变、衍生或以某一方式不同或变化。
黑曲霉的GOx-WT蛋白质包含根据SEQ ID NO: 2的氨基酸的天然序列。相应地,“亲本突变体”或“双重突变体”是使用本文描述的任何方法、工具或技术,本文提供的任何其他GOx多肽由其衍生或制备的GOx多肽。依照本发明,“亲本突变体”或“双重突变体”是根据SEQ
ID NO: 1的多肽。
因此,“亲本多核苷酸”是编码亲本多肽的那种,即根据SEQ ID NO: 10的多核苷酸。
术语“突变”或“变化”或“修饰”意指遗传材料例如DNA或RNA中的任何可检测的变化,或此类变化的任何过程、机制或结果。这包括其中基因的结构(例如DNA或RNA序列)改变的基因突变,起于任何突变过程的任何基因或DNA或RNA,以及由经修饰的基因或DNA序列表达的任何表达产物(例如蛋白质或多核苷酸)。此类变化还包括启动子、核糖体结合位点等中的变化。
在本说明书的上下文中,表达“除氧外的某些介质”、“除氧外的某些电子介质”、“某些固定的介质”和“除氧外的某些电子受体”指示选自下述的介质/电子介质:亚硝基苯胺及其衍生物、偶氮化合物、吩嗪及其衍生物、吩噻嗪及其衍生物、吩噁嗪及其衍生物、二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、Ru-和Os-络合物、醌及其衍生物、吲哚酚、紫精、四硫富瓦烯及其衍生物和酞菁。
相应地,依照本发明的表达“除氧外的某些介质”、“除氧外的某些电子介质”、“某些固定的介质”和“除氧外的某些电子受体”还指示电子介质,其通过FADH2快速还原但通过抗坏血酸缓慢还原或不还原,例如2-[4-(二甲基氨基)苯基]-二氮烯甲酰胺的衍生物。
缩写
AA – 氨基安替比林
HRP – 辣根过氧化物酶
GOx – 葡萄糖氧化酶
GOx-WT或WT - 真菌黑曲霉的野生型GOx
GDH – 葡萄糖脱氢酶
ABTS – 2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)
PMO –磷钼酸。
实施例
本发明将通过下文实施例详细举例说明,尽管本发明不应限于这些具体实施例。
本发明的核心在于出乎意料和令人惊讶的特定GOx变体的发现,所述特定GOx变体显示出超过血糖测量领域中的已知GOx的改善特性,即维持其对于底物葡萄糖的特异性,并且经由从氧化酶活性朝向脱氢酶活性的转变而显著降低耗氧率和/或对于除氧外的特定电子介质具有增加的活性。
为了证明依照本发明的GOx变体的GOx特性,本发明人不依赖于大多数指示分子氧还原为过氧化氢的可用活性测定。具体地,对于介导的电子转移,Zhu等人(2006;2007)建立了基于产物的GOx检测测定(下文GODA)[Zhu , Z. , Momeu , C. , Zakhartsev , M. 和 Schwaneberg , U. ( 2006 ) .
Making glucose oxidase fit for biofuel cell applications by directed protein
evolution. Biosensors and Bioelectronics 21 , 2046-2051 ; Zhu , Z. , Wang , M. , Gautam , A. , Nazor , J. , Momeu , C. , R , P. , and U , S. ( 2007 ) . Directed evolution of glucose oxidase from Aspergillus
niger for ferrocenemethanol-mediated electron transfer. Biotechnology Journal 2 , 241-248]。该测定事实上允许葡糖酸内酯的氧不依赖性检测,但在氧的存在下,仍然不能特异性检测通过除氧外的介质介导的电子转移,这在实时血糖分析装置的情况下是高度相关的。
在下述实施例中,本发明人因此测试了本发明的特定GOx变体,分别对于其介导的电子转移、通过氧的电子转移及其葡萄糖特异性,以证明本发明的核心。进一步地,还测试了在热稳定性方面的特性。
因此,本发明人使用众所周知的ABTS测定[Sun , L. , Bulter , T. , Alcalde , M. , Petrounia , I.P. 和 Arnold , F.H. ( 2002 ) . Modification of galactose oxidase to introduce glucose
6-oxidase activity. Chembiochem 3 , 781-783],以检测GOx变体对氧的活性。图1显示了对氧的活性测定的原理。
GOx变体的测试
为了在葡萄糖特异性、降低的耗氧率和/或对于除氧外的特定介质增加的活性方面,就其对GOx特性的改善测试适当的氨基酸置换,测试本发明的特定GOx变体。
(i)对于其耗氧率,即酶促活性,在比色ABTS测定中使用氧作为电子受体,和
(ii)对于通过亚硝基苯胺介质作为示例性介质介导的电子转移,
(iii)在不同糖作为底物的存在下(即葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、木糖和麦芽三糖),对于通过亚硝基苯胺介质作为示例性介质介导的电子转移。
对于所述介导的电子转移,使用对亚硝基苯胺化合物[Becker , O. ( 2005 ) . Die
Glucose-Dye-Oxidoreduktase in der klinischen Diagnostik. DISSERTATION thesis , Technische
Universität Kaiserslautern , Kaiserslautern]。图2显示了介质测定,即PMO(磷钼酸)测定的原理,其中应用亚硝基苯胺介质N,N-双(2-羟乙基)-4-亚硝基苯胺。
在上述测定中,来自介质反应的两个电子转移至PMO。PMO随后变得被还原。通过在700 nm处的吸收,来监控从氧化PMO的淡黄色到还原PMO的深蓝色的变色。
为了证明依照本发明的特定GOx变体,上述介质测定修改为酵母细胞上清液中的低GOx活性,其显示在磷酸钾缓冲液(0.2 M,pH
7.0)中从0.65 U/L到22
U/L的广泛线性检测范围。在所述条件下达到在96孔板上10.2%的标准差。对于标准差的计算,通过扣除阴性对照的值考虑本底(真标准差)。
葡萄糖氧化酶变体
依照本发明,选择Zhu等人(2006;2007)中所述的双重突变体作为用于本文提供的特异性氨基酸置换的原材料。这种双重突变体具有固有地存在的两个置换T30V和I94V(SEQ ID NO:1)。GOx-T30V;I94V显示改善的热稳定性、改善的pH稳定性以及增加的kcat值(69.5/s至137.7/s)[Zhu , Z. , Wang , M. , Gautam , A. , Nazor , J. , Momeu , C. , R , P. , and U , S. ( 2007 ) .
Directed evolution of glucose oxidase from Aspergillus niger for
ferrocenemethanol-mediated electron transfer. Biotechnology Jounal 2 , 241-248]。
选择高糖基化的酿酒酵母菌株作为表达宿主[Lehle , L. , Eiden , A. , Lehnert , K. , Haselbeck , A. 和 Kopetzki , E. ( 1995 ) . Glycoprotein biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae:
ngd29 , an N-glycosylation mutant allelic to
och1 having a defect in the initiation of outer chain formation. FEBS Lett 370 , 41-45]。
在具有依照本发明的特定氨基酸置换的细胞克隆培养后,平行应用介质测定和ABTS测定。选择显示增加的介质活性、降低的氧活性或两者的克隆用于进一步研究。因此,将所选克隆和对照培养且筛选12次。随后,将依照本发明的改善变体的GOx基因分离且测序。其后,所选变体的所述基因充当用于进一步的特定氨基酸置换的模板。
氨基酸位置的表征
本发明人进一步表征了本文提供的GOx变体的特定氨基酸位置,即S53;A137;A173;A332;F414;和V560。这些位置在图3中描述。
预表征
为了进一步研究特定GOx变体,本发明人考虑下述特性进行预表征:
1)耗氧量
2)对于作为底物的葡萄糖的特异性
3)米曼二氏动力学(介质活性/葡萄糖亲和力)和
4)热稳定性。
相应的细胞克隆的培养在常规摇瓶中发生。将上清液浓缩且在0.2 M磷酸钾,pH 7中缓冲。
1) 耗氧率
如下文材料与方法部分中的条目gg)下概述的,通过生色底物ABTS的氧化间接测定耗氧量。为了证明该数据,使用光学氧探针直接测量耗氧量。GOx变体在反应方法中标准至2 U/L。
2) 特异性
如上文已概述的,GOx对于底物葡萄糖的特异性在酶促葡萄糖测定中起主要作用,因为存在紧靠葡萄糖在临床上相关的糖,例如四种糖:半乳糖、麦芽糖、木糖和麦芽三糖。因此,为了证明本文提供的GOx变体的特异性,选择所述糖且与葡萄糖相比较。对于这些研究,使用介质测定,应用181.8 mM每种糖。
3) 介质活性/葡萄糖亲和力
关于介质活性的更详细研究和葡萄糖亲和力的测定,本发明人应用本文公开的变体关于米曼二氏动力学的测试。
4) 热稳定性
应用如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定,分析本发明的所选GOx变体的热稳定性。作为另外的对照,还分析在黑曲霉中表达的高糖基化的GOx和去糖基化的GOx-WT。
GOx变体GOx-EZ07的最终表征
对于最终表征,各自的GOx-EZ07表达酿酒酵母菌株在10 L发酵罐中进行培养,随后纯化所获得的GOx-EZ07。最终酶制剂的纯度在50 mM磷酸钾缓冲液pH 7中高于90%。如预表征时期中,研究耗氧量、特异性、活性和葡萄糖亲和力。对于GOx浓度的特异性测定,应用ELISA(参见条目ee下的材料与方法部分)。
变体GOx-EZ07也在下述方面进行标准:
1a)耗氧量
2a)对于作为底物的葡萄糖的特异性
3a)米曼二氏动力学(介质活性/葡萄糖亲和力)和
4a)热稳定性。
1a) GOx-EZ07的耗氧量
如1)中所述实现测量。如条目dd)下的材料与方法部分中概述的标准方案,纯化所有测试的酶(GOx-WT;GOx-T30V;I94V和GOx-EZ07),且调整至5 µg/mL的蛋白质浓度。
检测到下述耗氧率[%/分钟]:GOx-WT: 17.44;GOx-
T30V;I94V: 24.22和本发明的GOx-EZ07:3.86。GOx-EZ07的残留氧活性与GOx-T30V;I94V相比较为15.9%,并且与GOx-WT相比较为22.13%。
2a) GOx-EZ07的特异性
如2)中所述实现测量。
3a) GOx-EZ07的米曼二氏动力学
如3)中所述实现测量。
4a) 热稳定性
如4)中所述实现测量。
结果
本发明人发现六个不同的氨基酸位置S53;A137;A173;A332;F414;和V560负责降低的耗氧率和/或对于除氧外的电子介质增加的介质活性。进一步地,本发明人发现在六个氨基酸位置中的协同效应,其允许本领域技术人员在葡萄糖特异性、显著降低的耗氧率和/或对于除氧外的介质增加的活性方面设计GOx变体。
特别地,本发明人发现单独或组合的位置V560和F414负责显著降低的耗氧率和/或负责对于显著增加的介质活性。另外,发现位置A173和A332负责组合的两者,即本文提供的GOx变体的介质活性中的显著增加和伴随的耗氧率中的显著降低。发现位置S53和A137负责对于除氧外的特定介质显著增加的介质活性。
进一步地,本发明人发现适合由本发明提供的GOx变体的特定氨基酸。
表1显示了用于位置173、332、414和560的合适氨基酸集合和相应的简并密码子。
残基 |
还原的氨基酸集合 |
简并密码子 |
173 |
AITV |
RYT |
332 |
SN |
ART |
414 |
RNDCGHILFSTV |
NDT |
560 |
AILMPTV |
VYK |
根据本发明测试的GOx变体的比活性通过各自的EZ编号显示于表2中。该表是根据本发明测试的GOx变体在经由介质测定的介质活性和经由ABTS测定的耗氧量特性方面的比较。
结果以根据本发明的GOx变体和作为原材料的亲本突变体即GOx-T30V;I94V之间的比例(商数)的形式显示。不同微量滴定板的结果是可比较的。该比例基于通过常规ELISA技术测定的比活性[U/mg],如条目ee)下的材料与方法部分中概述的。该表还显示了依照本发明测试的氨基酸位置的确切置换。
表2:就介质活性和(残留)氧活性测试的具有EZ数字代码的本发明的特定GOx变体。
结果显示不同特定变体(EZ03、EZ05、EZ12、EZ06、EZ07、EZ08、EZ10、EZ11、EZ15)具有根据本发明的必需特性,即降低的氧亲和力,导致与亲本突变体GOx-T30V;I94V相比较,显著降低的耗氧率和/或增加的介质活性。变体EZ03、EZ05、EZ07、EZ08和EZ10经历进一步研究。
例如,本发明人发现与亲本突变体相比较,GOx-EZ07和EZ10显示对于增加的介质活性以及氧测定中的显著减少的两种显著改善。
特别地,本发明人发现变体EZ07是依照本发明显著改善的GOx变体,而对所述变体的相应特定氨基酸置换没有任何限制。EZ07显示在介质测定中与亲本突变体相比较的4.4倍增加,和在ABTS测定中亲本突变体的氧活性仅0.1倍的氧活性。相比之下,与亲本突变体相比较,GOx变体EZ12和EZ15显示对于介质和氧活性两者的伴随增加。与亲本突变体相比较,EZ12携带在位置S53上的另外置换(参见表2)。进一步地,发现由于氨基酸置换A137L,EZ15具有介质活性中的6倍增加。
氨基酸位置的表征
位置A173和A332远离活性位点。A173是表面位置;A332定位接近于底物增强通道。对氧活性具有影响的两个位置F414和V560定位接近于活性位点。F414在葡萄糖结合位点上方,并且V560紧靠葡萄糖和FAD。两个活性位置A137和S53均为接近FAD的表面位置。
预表征
所选预表征的变体的结果如下:
1) 耗氧率
图4显示了根据时间(a)和耗氧率/分钟(b),在反应混合物中的氧含量的进展。作为对照,还分析GOx-T30V;I94V、GOx-WT和阴性对照菌株的上清液。
GOx-WT和GOx-T30V;I94V显示相似的行为。因此,此处测试的所有GOx变体(EZ03、EZ05、EZ07、EZ08、EZ10)均具有显著降低的耗氧率。此外,作为本发明的令人惊讶和出乎意料的发现,所测试的变体不能明确与阴性对照区分,这指示各自的氧活性在所选条件下甚至低于测定的检测范围。
2) 特异性
表3显示参考葡萄糖的残留GOx酶活性。
表3:本发明的GOx变体对于不同糖的残留活性。对于残留活性的测定,应用用于表征的介质测定。底物浓度为各自反应混合物中181.8 mM。GOx-WT和GOx-T30V;I94V活性充当参考。
与GOx-WT和根据SEQ ID NO: 1的亲本突变体GOx-T30V;I94V相比较,本发明的GOx变体无一显示被麦芽糖或麦芽三糖的显著干扰。EZ07和EZ10对于所有测试的糖具有最佳结果。
3) 介质活性/葡萄糖亲和力
米曼二氏动力学在图5中描绘。表4显示Vmax和KM的计算值。
表4:不同GOx变体的酶参数。应用Microsoft Excel中的最小二乘法,根据米曼二氏动力学来计算参数。
表4显示EZ07一方面具有与亲本突变体GOx-T30V;I94V相比较高大约7.5倍的Vmax值,但另一方面具有高几乎两倍的KM值。然而,高KM值是高Vmax值的结果。在图5中,明确可见GOx-EZ07在低底物浓度下的表现可与WT和亲本突变体T30V、I94V相比较。GOx-EZ10达到相似结果,但更低的Vmax值。
4) 热稳定性
在图6中,对于八个不同温度图解残留活性。
根据本发明测试的GOx变体、GOx-WT和GOx-T30V;I94V亲本突变体显示相似结果。对于去糖基化的GOx-WT可以观察到热稳定性中的显著下降;然而,高糖基化的分子显示更高的热稳定性。
结论
在所有预表征研究期间的特定测试1)至4)的结论中,GOx-EZ07和GOx-EZ10变体显示最显著的结果。根据预表征结果实现氧活性中的显著下降和介质活性中的显著增加。GOx-EZ07和GOx-EZ10的特异性几乎未改变,仅检测到对木糖的轻微活性变化。因为EZ07的活性比EZ10的活性高大约1.7倍,所以选择GOx-EZ07用于最终表征。
应强调的是上述结果使用本发明的未纯化的GOx变体生成。相应地,本领域技术人员认识到在使用相似的纯化的GOx变体后,结果可以改变。另外,在应用ELISA的细胞上清液中的特定蛋白质测定可以受杂质影响。
变体GOx-EZ07的最终表征
对于最终表征,选择纯化的GOx-EZ07变体。
1a) GOx-EZ07的耗氧量
GOx-WT、GOx-T30V;I94V和GOx-EZ07的相对耗氧量在图7中描绘。
在所选条件下,与GOx-WT相比较,GOx-EZ07的耗氧率降低超过10倍,这确认预表征研究的数据。
2a) GOx EZ07的特异性
图8显示了GOx-WT、GOx-T30V;I94V和GOx-EZ07参考葡萄糖(100%)的残留活性。图8显示了与GOx-T30V;I94V和GOx-WT相比较,在GOx-EZ07的特异性中无显著变化。
3a) GOx变体EZ07的米曼二氏动力学
图9比较了GOx-WT、GOx-T30V;I94V和GOx-EZ07在介质测定中的动力学。
根据图9,与GOx-WT相比较,GOx变体EZ07显示在介质测定中641.5%的残留活性和在ABTS中17.5%的残留活性,导致降低37倍的氧化酶活性。
4a) GOx-EZ07的热稳定性
图10指示了当与GOx-WT和GOx-T30V;I94V相比较时,GOx-EZ07的热稳定性通过各自置换得到维持。
GOx变体的概括
在亲本突变体GOx-T30V、I94V中鉴定了六个氨基酸位置,其显示对本文提供的GOx变体的葡萄糖特异性、介导的电子转移的酶活性和氧活性的作用。所有位置均个别地饱和。为了研究协同效应,使在活性位点周围聚簇的位置(S53;A137;A173;A332;F414;V560)同时饱和。选择与亲本突变体特性相比较改善的介质活性和/或降低的耗氧率的最显著变体用于预表征。事实证明变体GOx-EZ07(具有另外的置换A173V;A332S;F414I;和V560T)显示在本发明的意义中,对于所测试的特性葡萄糖特异性、介质活性和耗氧率的最显著结果。
因此,GOx- EZ07就其介质活性、氧化酶活性、葡萄糖特异性以及其热稳定性特性进行深入研究。该变体显示在对于介导的电子转移的比活性中的6.4倍增加(GOx-WT: 7.4;GOx-EZ07:
47.5 U/mg)和ABTS测定中5.7倍的活性降低(GOx-WT: 451.1 U/mg;GOx-EZ07:
78.86 U/mg),导致降低36.5倍的氧化酶活性。GOx-EZ07没有热稳定性或特异性中的显著变化。
材料与方法
所有化学制品均为分析级别且购自Sigma-Aldrich(Taufkirchen,德国)、Applichem(Darmstadt,德国)或Carl Roth(Karlsruhe,德国)。所有酶均购自New England
Biolabs(UK)和Sigma-Aldrich(Taufkirchen,德国)。pYES2穿梭载体和大肠杆菌菌株DH5 á购自Invitrogen(Karlsruhe,德国)。酿酒酵母菌株7087(ngd29mnn1)由Roche diagnostics提供[Lehle , L. , Eiden , A. , Lehnert , K. , Haselbeck , A. 和 Kopetzki , E. ( 1995 ) . Glycoprotein biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae:
ngd29 , an N-glycosylation mutant allelic to
och1 having a defect in the initiation of outer chain formation. FEBS Lett 370 , 41-45]。使用NanoDrop光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,USA)定量DNA。测序和寡核苷酸合成通过Eurofins MWG
Operon(Ebersberg,德国)完成。使用的引物在表5(支持信息)中提及。
aa) 多重和单一位点饱和诱变
对于多重位点饱和诱变,应用Omnichange方案[Dennig , A. , Shivange , A.V. , Marienhagen , J. 和 Schwaneberg , U. ( 2011 ) .
OmniChange: The Sequence Independent Method for Simultaneous Site-Saturation of
Five Codons. PLoS ONE 6 , e26222]。400 µl PCR反应混合物含有1
ng/µl质粒模板、1x Phusion缓冲液(New
England Biolabs,Frankfurt,德国)、1 U Phusion聚合酶和200
µM dNTP。将反应混合物分成四个相等体积,并且加入250 nM靶向特异性位点的正向引物和反向引物用于片段扩增。在用于载体主链扩增的混合物中,加入另外的dNTP以达到300 µM的最终浓度。对于片段1,将靶向A173的引物P7和P8加入主混合物中。同时对于A332饱和,使用P9和P10。通过使用P11和P12靶向F414位点。将V560位点包括在载体主链中,因为它通过P13和P14进行扩增。用于片段扩增的PCR程序为98℃45秒(1个循环);98℃15秒;65℃30秒;72℃30秒(20个循环);72℃5分钟(1个循环)。对于载体主链扩增,应用4分钟的延伸时间。将所有片段进行柱纯化,并且在NanoDrop光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,USA)上测量浓度。随后对PCR产物实施过夜DpnI消化(各5 U)。
片段的消化和连接:将插入片段的浓度调整至0.06 pmol/µl。同时,将载体主链浓度调整至0.02 pmol/µl(还考虑用DpnI消化的稀释因子)。将1 µl切割溶液(50%(500 mM Tris pH 9.0、30%(100mM碘的乙醇溶液)和20% dH2O)加入4 µl每种片段。反应随后在70℃下温育5分钟。将切割的片段混合在一起,并且在转化化学感受态大肠杆菌DH5á用于文库扩增前,在室温下(RT)温育5分钟。对于酵母转化,使用质粒分离试剂盒“NucleoSpin® Plasmid”(MACHERY-NAGEL,Düren,德国),从大肠杆菌DH5á中分离基因文库。
对于个别位点饱和诱变(SSM),已遵循两步PCR方案[Sambrook , J. 和 Russel , D. ( 2001 ) .
Molecular cloning: a laboratory manual ,第 2 卷( Cold Spring Harbor Laboratory Press ) ]。50 µl PCR反应混合物含有1 ng/µl质粒模板、1x Phusion缓冲液(New England Biolabs,Frankfurt,德国)、1 U Phusion聚合酶和300
µM dNTP。将反应混合物分成两个相等体积,并且将400 nM靶向位点的正向引物和反向引物加入分开的反应混合物中。PCR程序为98℃45秒(1个循环);98℃15秒;65℃30秒;72℃30秒(5个循环);72℃5分钟(1个循环)。在第一步后,将两个反应合并,并进行相同程序且对于扩增循环多15次重复。使用下述引物:P15/P16用于位置173,P17/P18用于位置332,P19/P20用于位置414和P21/22用于位置560。将所有PCR产物进行柱纯化,并且随后实施DpnI消化。
bb) 基因克隆和酵母细胞转化
根据重组介导的无连接酶方法[Oldenburg , K.R. , Vo , K.T. , Michaelis , S. 和 Paddon , C. ( 1997 ) . Recombination-mediated PCR-directed plasmid
construction in vivo in yeast. Nucleic Acids Research 25 , 451-452],执行突变的GOx基因克隆到pYES2载体主链内。首先,2 µg pYES2-GOx
T30V、I94V双重突变体通过SalI/BamHI消化(10 U/µg DNA,6小时,37℃)进行线性化,并且随后通过采用NucleoSpin®
Extract II – 试剂盒(MACHERY-NAGEL,Düren,德国)的凝胶提取进行纯化。用于文库扩增的引物以这样的方式进行设计,使得整个引物序列与线性化的载体主链互补。
其次,将线性化的pYES2载体和扩增的基因文库以1:3(250 ng/750 ng)的比例混合。这种DNA混合物用于采用乙酸锂方法的酿酒酵母7087的转化[Gietz , R.D. 和 Schiestl , R.H. ( 2007 ) . High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS
carrier DNA/PEG method. Nature Protocols 2 , 31-34]。转化体在含有2%葡萄糖的SC-U选择性平板上生长。对于环状质粒的转化,使用300 ng DNA。
cc) 在96孔板中的培养和表达
使用牙签,将在含有2%葡萄糖的SC-U选择性琼脂平板上生长的单一菌落转移到每孔含有100 µL SC-U培养基(1%葡萄糖)的96孔微量滴定板(PS-F形底,greiner bio-one)内。预培养物的培养在板振荡器(Infors GmbH,Eisenach,德国)中在下述条件下发生:900 rpm,30℃,70%湿度,24小时。将一定量的预培养物从每个孔转移到深孔板(riplate-矩形,ritter)中的500 µL SC-U自身诱导培养基(0.5% 葡萄糖 / 2% 半乳糖)。主要培养物在与预培养物相同的条件下进行培养,但共72小时。板在4000
rpm和RT下离心20分钟。所得的上清液用于活性测定。
dd) 重组GOx的生产和纯化
预培养:使用Sc7087/pYES2-GOx的过夜培养物,将500 mL SynY培养基(2%葡萄糖)接种至OD 600 = 0.2,培养在5L摇瓶中在30℃和250 rpm下发生12小时。主要培养:用500 mL预培养物接种10 L SynY培养基(1%葡萄糖)。对于培养,使用10 L发酵罐,应用下述条件:温度:30℃;搅拌器:400 rpm;气流:1 vvm;时间:48小时。
细胞分离和缓冲液更换:通过微量过滤回收含GOx的上清液。为此,使用具有一个滤器盒(SARTOCON
Slice,Hydrosart 0.45 µm,Sartorius Stedim Biotech GmbH,Göttingen,德国)的交叉流过滤单元SartoJet(Sartorius Stedim Biotech GmbH,Göttingen,德国)。进料压力调整至2.0巴,并且截留液压力调整至1.0巴。在下述条件下应用超滤盒(SARTOCON Slice,Hydrosart 10 kDa,Sartorius
Stedim Biotech GmbH,Göttingen,德国),相同过滤系统用于缓冲液更换和样品浓度:缓冲液50 mM NaH2PO4,pH 6;缓冲液更换体积:7;进料压力:2.0巴;截留液压力:1.0巴;最终体积0.5 L。
对于酶纯化,使用ÄKTA pilot系统和FinLine
Pilot 35柱(GE Healthcare,Munich,德国),应用阴离子交换层析。使柱充满220
mL树脂(Fractogel TSK DEAE-650s Merck),选择62.5 cm/h的流速。平衡:440 mL 50 mM磷酸钠缓冲液pH6;样品负荷:0.5 L截留液;洗涤:440 mL 50 mM磷酸钠缓冲液pH6;洗脱:95% 50 mM磷酸钠缓冲液pH6 / 5% 1M NaCl(不连续梯度)。将含有GOx的级分合并,随后发生针对50 mM磷酸钾缓冲液pH 7的最终缓冲液更换(Amicon®
Ultracel-30k Millipore,Cork,爱尔兰)。
ee) 蛋白质浓度的标准化
酶联免疫吸附测定法(ELISA)用于GOx浓度的特定测定。链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(Roche - 材料编号11643673001)的每个孔填充有100 µL一抗溶液(2 µg/mL;Rabbit PAK GOD-Biotin Acris R1083B),使板在室温下温育1小时。在后续洗涤步骤(4次350 µL 9 g/L NaCl_0.1% Tween 20)后,将100 mL酶样品吸取到孔内,随后为第二温育步骤。重复洗涤步骤,并且使板填充有100
µL二抗溶液(10 µg/mL;Rabbit
PAK GOD-HRP Acris R1083HRP)。在第三温育和洗涤步骤后,使板填充有100
µL ABTS/H2O2溶液(11684302001
Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)。在测定在405 nm处的吸收之前,使板在室温下温育30分钟。来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶用作内部标准(G7141-50KU SIGMA-ALDRICH)。
ff) 介质测定
对于液体处理,使用来自(Transferpette S-8)和Eppendorf(Research pro)的多通道移液管。将75 µL样品(制备的上清液/酶溶液)转移至96孔平底微孔板(greiner bio-one)。加入100 µL介质溶液(19.05 mM N,N-双(2-羟乙基)-4-亚硝基苯胺[Becker , O. ( 2005 ) . Die
Glucose-Dye-Oxidoreduktase in der klinischen Diagnostik. DISSERTATION thesis , Technische Universität Kaiserslautern , Kaiserslautern] ,Roche - 材料编号100088314;5%(w/w)聚乙烯吡咯烷酮,Roche – 10003476964;pH 7)和20 µL 25 mM磷钼酸(Roche,Genisys-nr.:
11889893001)。通过添加25 µL底物溶液且随后将板以1000
rpm振荡1分钟,来起始反应。使用微孔板阅读器Tecan
Sunrise(Tecan Trading AG,瑞士),在700 nm处监控磷钼酸还原的动力学。对于动力学分析,由根据底物浓度标绘的初速度数据测定Vmax和KM值,其中线性关联系数>0.99。
gg) ABTS测定
对于液体处理,使用来自(Transferpette S-8)和Eppendorf(Research pro)的多通道移液管。将75 µL样品(制备的上清液/酶溶液)转移至含有100 µL磷酸盐缓冲液(pH 7)的96孔平底微孔板(greiner bio-one)。将20 µL反应混合物加入每个孔,导致下述浓度:0.91
U/mL HRP;2.3 mM ABTS。通过添加25 µL底物溶液且随后将板以1000 rpm振荡30秒,来起始反应。使用微孔板阅读器FLUOstar
Omega(BMG LABTECH),在414 nm处动态测定ABTS的氧化。对于动力学分析,由根据底物浓度标绘的初速度数据测定Vmax 和KM值,其中线性关联系数>0.99。
hh) 耗氧量测定
对于耗氧量的直接测定,使用光学氧探针“Fibox3 – Minisensor Oxygen Meter”(Precision
Sensing GmbH,Regensburg,德国)。1540
µL反应混合物由840 µL磷酸盐缓冲液(0.2 M
/ pH 7)、175 µL底物溶液和525
µL GOx溶液组成。动态测定耗氧量(%/分钟)。
ii) 热稳定性
使100 µL酶溶液在相应温度下温育15分钟,且随后在冰上冷却5分钟。75 µL用于活性测定。研究下述温度:30-、35-、40-、45-、50-、55-、60-和65℃。
表5:在实验部分中使用的引物
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
<120> 衍生自黑曲霉的新型葡萄糖氧化酶
<130> R75001WO
<150> 13152935.6
<151> 2013-01-28
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 583
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 1
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu
Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile
Ala Gly Gly Gly Leu Val Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu
Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser
Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe
Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn
Asn Gln Thr Ala Leu Val Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr
Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp
Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val
Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys
Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn
Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro
Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr
Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro
Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp
Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln
Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala
Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr
Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr
Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu
Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp
Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly
Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp
Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp
Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu
Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val
Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp
Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp
Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu
Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg
Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr
Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr
Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr
Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala
Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro
Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala
Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 2
<211> 583
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 2
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu
Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile
Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu
Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser
Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe
Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn
Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr
Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp
Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val
Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys
Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn
Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro
Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr
Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro
Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp
Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln
Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala
Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr
Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr
Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu
Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp
Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly
Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp
Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp
Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu
Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val
Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp
Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp
Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu
Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg
Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr
Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr
Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr
Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala
Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro
Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala
Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 3
<211> 583
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 3
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu
Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile
Ala Gly Gly Gly Leu Val Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu
Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser
Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe
Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn
Asn Gln Thr Ala Leu Val Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr
Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp
Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val
Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys
Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn
Gly Thr Val His Val Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro
Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr
Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro
Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp
Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln
Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala
Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr
Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr
Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu
Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp
Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly
Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp
Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp
Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu
Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val
Ala Tyr Ser Glu Leu Ile Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp
Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp
Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu
Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg
Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr
Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr
Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr
Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala
Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro
Pro Thr Gln Met Ser Ser His Thr
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala
Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 4
<211> 583
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 4
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu
Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile
Ala Gly Gly Gly Leu Val Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu
Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser
Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe
Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn
Asn Gln Thr Ala Leu Val Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr
Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp
Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val
Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys
Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn
Gly Thr Val His Ile Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro
Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr
Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro
Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp
Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln
Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala
Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr
Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr
Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu
Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp
Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly
Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp
Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp
Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu
Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val
Ala Tyr Ser Glu Leu Leu Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp
Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp
Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu
Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg
Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr
Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr
Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr
Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala
Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro
Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala
Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu
565 570 575
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580
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<211> 583
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 5
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Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile
Ala Gly Gly Gly Leu Val Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu
Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser
Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe
Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn
Asn Gln Thr Ala Leu Val Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr
Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp
Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115
120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val
Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys
Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn
Gly Thr Val His Val Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro
Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr
Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro
Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp
Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln
Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala
Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr
Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr
Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu
Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp
Gln Thr Thr Asn Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly
Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp
Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp
Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu
Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val
Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp
Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp
Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu
Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg
Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr
Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr
Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
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Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala
Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
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545 550 555 560
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Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu
565 570 575
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580
<210> 6
<211> 583
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 6
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1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe
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Asn Gln Thr Ala Leu Val Arg Ser
85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys
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145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn
Gly Thr Val His Val Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro
Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr
Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro
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210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp
Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
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Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln
Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala
Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr
Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr
Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly
Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp
Gln Thr Thr Asn Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly
Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp
Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp
Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu
Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val
Ala Tyr Ser Glu Leu Val Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp
Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp
Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu
Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
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Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr
Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr
Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr
Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala
Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
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Pro Thr Gln Met Ser Ser His Leu
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Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala
Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 7
<211> 583
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 7
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Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile
Ala Gly Gly Gly Leu Val Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu
Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser
Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe
Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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115
120 125
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145 150 155 160
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<211> 583
<212> PRT
<213> 黑曲霉
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<213> 黑曲霉
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tattccgaaa aggcacacga gctgctcaac
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ttccgtccta actaccatgg cgtgggtact 1560
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atgacggtgt tctatgccat ggcgctaaaa
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tccatgcag
1749
<210> 11
<211> 1749
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<213> 黑曲霉
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tccatgcag
1749
<210> 14
<211> 1704
<212> DNA
<213> 黑曲霉
<400> 14
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