CN112301009B

CN112301009B - 热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体god及其基因和应用

Info

Publication number: CN112301009B
Application number: CN201910835766.4A
Authority: CN
Inventors: 姚斌; 涂涛; 蒋肖; 罗会颖; 苏小运; 黄火清; 王亚茹; 柏映国; 王苑; 师霞; 张�杰
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2039-09-03
Also published as: CN112301009A; WO2021017292A9; US20230193215A1; EP4006149A1; WO2021017292A1; EP4006149A4

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD及其基因和应用。本发明的葡萄糖氧化酶突变体经野生型定点依次突变后，得到热稳定性和催化效率明显提高的多个突变体。本发明的葡萄糖氧化酶突变体具有良好的酶学性质，可以应用于饲料、食品、医药、纺织等行业。

Description

热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD及其基因和应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶(GOD；E.C.1.1.3.4.)是一类重要的氧化酶类，属于glucose/methanol/choline(GMC)氧化还原酶家族。GOD专一性的催化β-D-葡萄糖，产生葡萄糖酸和过氧化氢，催化过程需要氧气的参与。葡萄糖氧化的作用机制为：葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶组成一个氧化还原酶系统。葡萄糖氧化酶在分子氧存在下，以FAD为辅因子能氧化葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。过氧化氢酶能够将过氧化氢分解生成水和氧，然后水又与葡萄糖内酯结合产生葡萄糖酸。GOD是一种同型二聚体酶，由两个80KD的单体聚合在一起组成，每个单体含有两个区域：一个与FAD以非共价形式结合，另一个与底物β-D葡萄糖结合。GOD广泛分布于动植物和微生物体内，由于微生物具有生长繁殖速度快、种类繁多的特点，因此是生产GOD的主要来源，主要的生产菌株为黑曲霉和青酶。

葡萄糖氧化酶在食品、医学、饲料、生物传感器等行业中有广泛应用。饲料行业中葡萄糖氧化酶作为饲料添加剂，在饲料中添加GOD可以抑制好养微生物的生长，杀死有害肠道微生物，并且产生的葡萄糖酸可以改善肠道的pH，利于营养的吸收。GOD在食品行业中的应用也非常的广泛，酿酒过程中添加葡萄糖氧化酶可以抗啤酒氧化、保持啤酒的风味，使啤酒长期保存，这是因为葡萄糖氧化酶催化过程中会消耗氧。在面包生产中，面粉中添加葡萄糖氧化酶，可以对面粉品质改良达到最佳效果，面包的比容和质量均有很大改善，它对面包抗老化性能效果较好。基于GOD本身的性质，它的应用领域在不断的扩展，国内外市场需求量急剧增加，但是产量低、酶活性低等缺陷限制了它的工业化发展。专利CN 108893453 A中，以来源于Aspergillus niger的葡萄糖氧化酶GOD作为母本，经过多次突变后获得热稳定提高的突变体GOD-M5，但是其仍不能满足工业要求。

发明内容

本发明的目的是提供葡萄糖氧化酶突变体GOD-M6、GOD-M7、GOD-M8、GOD-M9、GOD-M10。

本发明的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶突变体的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备葡萄糖氧化酶突变体的方法。

本发明的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶突变体的应用。

根据本发明的具体实施方式，葡萄糖氧化酶突变体GOD-M5的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，其中，将葡萄糖氧化酶GOD-M5氨基酸序列的第68位Asp突变为Lys，获得葡萄糖氧化酶突变体GOD-M6；将突变体GOD-M6的第274位Thr突变为Phe，278位的Tyr突变为Thr,获得突变体GOD-M7；将突变体GOD-M7的第94位Ser突变为Ala，获得突变体GOD-M8；将突变体GOD-M8的第31位Thr突变为Val，获得突变体GOD-M9；将突变体GOD-M9的第88位Gln突变为Arg，获得突变GOD-M10。

根据本发明的具体实施方式，葡萄糖氧化酶突变体GOD-M6的氨基酸序列SEQ IDNO.2所示，葡萄糖氧化酶突变体GOD-M7的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，葡萄糖氧化酶突变体GOD-M8的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，葡萄糖氧化酶突变体GOD-M9的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，葡萄糖氧化酶突变体GOD-M10的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明提供了编码上述葡萄糖氧化酶GOD突变体的基因。

根据本发明的具体实施方式，将葡萄糖氧化酶基因god-m5序列的第202位GAC变为AAA，获得葡萄糖氧化酶突变体基因god-m6；将god-m6序列820位的ACC和832位的TTA分别变为TTT和ACC，获得葡萄糖氧化酶突变体基因god-m7；将god-m7序列280位的TCC变为GCT，获得葡萄糖氧化酶突变体基因god-m8；将god-m8序列90位的ACT变为GTT，获得葡萄糖氧化酶突变体基因god-m9；将god-m9序列262位的AGA变为CAA，获得葡萄糖氧化酶突变体基因god-m10。

根据本发明的具体实施方式，葡萄糖氧化酶突变体god-m5的基因序列如SEQ IDNO.7所示，葡萄糖氧化酶突变体god-m6的基因序列如SEQ ID NO.8所示，葡萄糖氧化酶突变体god-m7的基因序列如SEQ ID NO.9所示，葡萄糖氧化酶突变体god-m8的基因序列如SEQID NO.10所示，葡萄糖氧化酶突变体god-m9的基因序列如SEQ ID NO.11所示，葡萄糖氧化酶突变体god-m10的基因序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明提供了包含上述化葡萄糖氧化酶GOD突变体基因的重组载体。

本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶GOD突变体基因的重组菌株，优选的菌株为毕赤酵母GS115，含葡萄糖氧化酶突变体基因的重组菌株分别为重组赤酵母GS115/GODM5，GS115/GOD-M6，GS115/GOD-M7，GS115/GOD-M8，GS115/GOD-M9,GS115/GOD-M10。

根据本发明的具体实施方式，制备葡萄糖氧化酶GOD突变体的方法如下所述：

(1)用含有葡萄糖氧化酶GOD突变体基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶GOD突变体表达；

(3)回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶GOD突变体。

本发明的有益效果：

在70℃下处理10min后，葡萄糖氧化酶GOD-M5的相对剩余酶活为55％，改造后的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M6、GOD-M7、GOD-M8、GOD-M9、GOD-M10的剩余酶活分别为60％、71％、75％、99％、100％。因此，葡萄糖氧化酶突变体的热稳定获得明显提高。

在80℃下处理2min后，葡萄糖氧化酶GOD-M5的相对剩余酶活为35％，改造后的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M6、GOD-M7、GOD-M8、GOD-M9、GOD-M10的剩余酶活分别为40％、55％、60％，72％、80％。因此，葡萄糖氧化酶突变体的热稳定获得明显提高，80℃热处理2min后，GOD-M10相较GOD-M5相对剩余酶活提高了2.2倍左右。

本发明提供了多个葡萄糖氧化酶突变体，具有催化效率高、热稳定性好的优良性质，打破了GOD酶活性低、稳定性差的壁垒，能够完全满足工业应用需求，可以很好的应用于食品、医药、纺织及饲料行业中，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1显示葡萄糖氧化酶突变体GOD-M5至GOD-M10在70℃热稳定性分析结果；

图2显示葡萄糖氧化酶突变体GOD-M5至GOD-M10在80℃热稳定性分析结果；

图3显示葡萄糖氧化酶突变体GOD-M5至GOD-M10的最适温度的分析结果。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)、毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115。

2、酶类及其它生化试剂：连接酶购自Invitrogen公司，定点突变试剂盒购自全式金公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％NaCl，pH7.O)。

(2)BMGY培养基；1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。

(3)BMMY培养基：以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1葡萄糖氧化酶的定点突变

葡萄糖氧化酶基因godm5为克隆于黑曲霉的野生型god的第五代突变体，突变过程为：

以来源于Aspergillus niger的葡萄糖氧化酶GOD作为母本，将野生型葡萄糖氧化酶GOD的第82位Glu突变为Cys，获得突变体GOD-M1；将突变体GOD-M1的第418位Val突变成Glu，获得突变体GOD-M2；将突变体GOD-M2的第508位Asn突变成His，获得突变体GOD-M3；将突变体GOD-M3的第32位Thr突变成Val，获得突变体GOD-M4；将突变体GOD-M4的第313位Asp突变成Lys，获得突变体GOD-M5，GOD-M5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

以GOD-M5的重组质粒pPIC9-godm5序列为模板，根据毕赤酵母优化密码子表，将第68位Asp突变为Lys，获得葡萄糖氧化酶突变体GOD-M6；再以pPIC9-godm6为模板，将突变体GOD-M6的第274位Thr突变为Phe，将278位的Tyr突变为Thr，获得突变体GOD-M7；依次将突变体GOD-M7的第94位Ser突变为Ala,获得突变体GOD-M8；将突变体GOD-M8的第31位Thr突变为Val，获得突变体GOD-M9；将突变体GOD-M9的第88位Gln突变为Arg,获得突变体GOD-M10。每轮定点突变的引物如下表所示：

表1本发明所需的引物

实施例2葡萄糖氧化酶工程菌株的构建

(1)表达载体的构建及在酵母中的表达

以葡萄糖氧化酶重组质粒pPIC9-godm5为模板，利用定点突变试剂扩增突变体。经核酸胶验证后，将PCR产物中加入1μL DMT酶，混匀后于37℃孵育1h。取2-5μL DMT酶消化的PCR产物，热击转化至感受态细胞DMT。挑取阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶Bgl II进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。然后通过MM平板的显色反应筛选葡萄糖氧化酶阳性克隆子菌株，依次为：GS115/GOD-M5、GOD-M6、GOD-M7、GOD-M8、GOD-M9、GOD-M10。

实施例3重组葡萄糖氧化酶的制备

(1)葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出热稳定性好、酶活性较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；4500rpm离心5min，弃上清，再向菌体加入200mL含有0.5％甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养48h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；12000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

(2)重组葡萄糖氧化酶的纯化

收集摇瓶发酵培养的重组葡萄糖氧化酶上清液，利用10kDa膜包进行发酵液的浓缩，同时用pH 6.5 10mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液置换其中的培养基，然后通过阴离子交换柱来进行纯化。

实施例4测定纯化的葡萄糖氧化酶突变体的酶学性质

采用邻联茴香胺法对葡萄糖氧化酶GOD酶活性进行测定，具体方法如下：在pH 6.0的条件下，3mL的反应体系包括2.5mL邻联茴香胺缓冲液(0.2mL的1％邻联茴香胺加入25m的0.1M磷酸缓冲液中)，300μL 18％葡萄糖溶液，100μL 0.03％辣根过氧化物酶，100μL适当的稀释酶液。在30℃下反应3min后，用2mL 2M H₂SO₄终止反应，并在540nm下测定吸光值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，单位时间内生成1μmol葡萄糖酸和过氧化氢所需的酶量。

测定葡萄糖氧化酶GODM5突变体及本发明的各个突变体的酶活性和热稳定性：

1、测定葡萄糖氧化酶GOD M5突变体及本发明的各个突变体的酶活性。将实施例3纯化的葡萄糖氧化酶突变体GOD M5及本发明的各个突变体在pH 6.0、30℃下进行酶促反应以测定其酶活性。

葡萄糖氧化酶GOD-M5的比活为366U/mg，葡萄糖氧化酶突变体GOD-M6、GOD-M7、GOD-M8、GOD-M9、GOD-M10的酶活力分别为301.1U/mg、299.3U/mg、197.9U/mg、454U/mg、445.3U/mg，从GOD-M5到GOD-M10的整体比活数据来看，GOD-M10的比活较GOD-M5提高1.2倍。

2、测定葡萄糖氧化酶突变体GOD M5及本发明的各个突变体在70℃及80℃下的稳定性：

在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)缓冲液体系中，葡萄糖氧化酶GOD突变体GODM5-GODM10分别于70℃下处理0、2、5、10、20、30min，80℃下处理0、1、2、5、10min，再在30℃下测定相对剩余酶活。

如图1所示，在70℃下处理10min后，葡萄糖氧化酶突变体GOD-M5的相对剩余酶活为55％，改造后的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M6、GOD-M7、GOD-M8、GOD-M9、GOD-M10的剩余酶活分别为60％、71％、75％、99％、100％。

如图2所示，在80℃下处理2min后，葡萄糖氧化酶突变体GOD-M5的剩余酶活为35％，改造后的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M6、GOD-M7、GOD-M8、GOD-M9、GOD-M10的剩余酶活分别为40％、55％、60％、72％、80％。从GOD-M5到GOD-M10，相对剩余酶活提高了2倍左右。

3.测定葡萄糖氧化酶突变体GOD-M5及本发明的各个突变体的最适温度：

葡萄糖氧化酶GOD突变体GOD-M5至GOD-M10分别在0、20、30、40、50、60、70、80℃，pH6.0的条件下测定其酶活性。如图3所示，葡萄糖氧化酶突变体GOD-M5至GOD-M10的最适温度都为40℃，在20℃-70℃范围内都可以维持50％以上的相对剩余酶活。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD及其基因和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 581

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Glu Val Ala Gly Arg

1 5 10 15

Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Val

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Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asp Ile Thr Val Leu Val Ile Glu

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530 535 540

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545 550 555 560

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Tyr Ala Ser Met Gln

580

<210> 2

<211> 581

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 2

Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Glu Val Ala Gly Arg

1 5 10 15

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Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asp Ile Thr Val Leu Val Ile Glu

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Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala

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145 150 155 160

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Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu

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580

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<211> 581

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<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

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caataa 1746

<210> 11

<211> 1746

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 11

ggtattgagg cttccttgtt gactgaccca aaggaggtcg ccggtagaac tgttgactac 60

atcattgctg gtggtggatt gactggtttg gttgtcgctg ccagattgac tgagaaccca 120

gacatcaccg ttttggtcat tgagtccggt tcttacgaat ctgatagagg tcctatcatt 180

gaagacttga acgcttacgg taaaatcttc ggatcttccg ttgaccacgc ttacgagact 240

gtctgccttg ccactaacaa tcaaaccgct ttgattagag ctggtaacgg tttgggtggt 300

tctactttgg ttaacggagg tacttggacc agaccacaca aggctcaagt tgactcttgg 360

gagaccgtct tcggtaacga aggttggaat tgggattctg tcgcagctta ctccttgcag 420

gccgagagag cccgtgctcc aaacgctaag caaatcgccg caggtcacta cttcaacgcc 480

tcctgtcacg gtattaacgg aactgttcac gctggtccaa gagacaccgg tgacgattac 540

tctcctatcg tcaaggcctt gatgtccgct gttgaagaca gaggtgtccc aactaagaag 600

gacttgggtt gcggagaccc acatggtgtt tctatgttcc ctaacacctt gcacgaggac 660

caagtcagat ccgatgctgc ccgtgaatgg ttgcttccaa actaccaaag acctaacttg 720

caggttttga ccggtcaata cgttggtaag gtccttttgt ctcaaaacgc cactacccca 780

agagctgttg gtgtcgagtt cggaactcac aagggtaact ttcacaatgt taccgctaaa 840

cacgaagtcc ttttggcagc tggttccgct gtttctccaa ctatcttgga gtactctggt 900

atcggaatga agtccatttt ggaaccactt ggtattaaga ccgtcgttga cttgcctgtt 960

ggtctgaact tgcaagacca gactacctct actgtcagat cccgtattac ctccgccggt 1020

gctggacagg gtcaggctgc ctggtttgct actttcaacg agaccttcgg tgactacact 1080

gagaaggctc acgaattgct taacaccaaa ttggaacaat gggctgagga agccgttgct 1140

agaggtggtt tccacaacac taccgctctt ttgatccaat acgagaacta cagagactgg 1200

attgttaagg ataacgtcgc ttactctgaa ttgttcttgg acactgccgg tgaggcttcc 1260

ttcgacgtct gggacttgct gccattcact agaggatacg ttcacatctt ggacaaggac 1320

ccatacttga gacacttcgc ttacgatcct caatacttct tgaacgagtt ggacttgctt 1380

ggtcaggctg ccgctactca attggctaga aacatctcta actccggtgc catgcaaact 1440

tactttgctg gtgaaaccat tccaggtgac aacttggcct acgatgctga cttgagagct 1500

tgggttgaat acattccata ccacttcaga cctaactacc atggtgtcgg aacctgttct 1560

atgatgccaa aggagatggg tggtgtcgtt gacaacgccg ctagagttta cggtgtccag 1620

ggattgagag ttatcgacgg ttctatccca cctactcaaa tgtcctctca cgttatgacc 1680

gtcttctacg ctatggcttt gaagatcgca gacgctgttt tggctgacta cgcctccatg 1740

caataa 1746

<210> 12

<211> 1746

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 12

ggtattgagg cttccttgtt gactgaccca aaggaggtcg ccggtagaac tgttgactac 60

atcattgctg gtggtggatt gactggtttg gttgtcgctg ccagattgac tgagaaccca 120

gacatcaccg ttttggtcat tgagtccggt tcttacgaat ctgatagagg tcctatcatt 180

gaagacttga acgcttacgg taaaatcttc ggatcttccg ttgaccacgc ttacgagact 240

gtctgccttg ccactaacaa tagaaccgct ttgattagag ctggtaacgg tttgggtggt 300

tctactttgg ttaacggagg tacttggacc agaccacaca aggctcaagt tgactcttgg 360

gagaccgtct tcggtaacga aggttggaat tgggattctg tcgcagctta ctccttgcag 420

gccgagagag cccgtgctcc aaacgctaag caaatcgccg caggtcacta cttcaacgcc 480

tcctgtcacg gtattaacgg aactgttcac gctggtccaa gagacaccgg tgacgattac 540

tctcctatcg tcaaggcctt gatgtccgct gttgaagaca gaggtgtccc aactaagaag 600

gacttgggtt gcggagaccc acatggtgtt tctatgttcc ctaacacctt gcacgaggac 660

caagtcagat ccgatgctgc ccgtgaatgg ttgcttccaa actaccaaag acctaacttg 720

caggttttga ccggtcaata cgttggtaag gtccttttgt ctcaaaacgc cactacccca 780

agagctgttg gtgtcgagtt cggaactcac aagggtaact ttcacaatgt taccgctaaa 840

cacgaagtcc ttttggcagc tggttccgct gtttctccaa ctatcttgga gtactctggt 900

atcggaatga agtccatttt ggaaccactt ggtattaaga ccgtcgttga cttgcctgtt 960

ggtctgaact tgcaagacca gactacctct actgtcagat cccgtattac ctccgccggt 1020

gctggacagg gtcaggctgc ctggtttgct actttcaacg agaccttcgg tgactacact 1080

gagaaggctc acgaattgct taacaccaaa ttggaacaat gggctgagga agccgttgct 1140

agaggtggtt tccacaacac taccgctctt ttgatccaat acgagaacta cagagactgg 1200

attgttaagg ataacgtcgc ttactctgaa ttgttcttgg acactgccgg tgaggcttcc 1260

ttcgacgtct gggacttgct gccattcact agaggatacg ttcacatctt ggacaaggac 1320

ccatacttga gacacttcgc ttacgatcct caatacttct tgaacgagtt ggacttgctt 1380

ggtcaggctg ccgctactca attggctaga aacatctcta actccggtgc catgcaaact 1440

tactttgctg gtgaaaccat tccaggtgac aacttggcct acgatgctga cttgagagct 1500

tgggttgaat acattccata ccacttcaga cctaactacc atggtgtcgg aacctgttct 1560

atgatgccaa aggagatggg tggtgtcgtt gacaacgccg ctagagttta cggtgtccag 1620

ggattgagag ttatcgacgg ttctatccca cctactcaaa tgtcctctca cgttatgacc 1680

gtcttctacg ctatggcttt gaagatcgca gacgctgttt tggctgacta cgcctccatg 1740

caataa 1746

Claims

1.热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，其为将葡萄糖氧化酶GOD-M5的氨基酸序列的第68位碱基由Asp突变为Lys、第274碱基由Thr突变为Phe、且第278位碱基由Tyr突变为Thr得到，其中，葡萄糖氧化酶GOD-M5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，其为将葡萄糖氧化酶GOD-M5的氨基酸序列的第68位碱基由Asp突变为Lys、第274碱基由Thr突变为Phe、第278位碱基由Tyr突变为Thr、且第94位碱基由Ser突变为Ala得到，其中，葡萄糖氧化酶GOD-M5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，其为将葡萄糖氧化酶GOD-M5的氨基酸序列的第68位碱基由Asp突变为Lys、第274碱基由Thr突变为Phe、第278位碱基由Tyr突变为Thr、第94位碱基由Ser突变为Ala、且第31位碱基由Thr突变为Val得到，其中，葡萄糖氧化酶GOD-M5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，其为将葡萄糖氧化酶GOD-M5的氨基酸序列的第68位碱基由Asp突变为Lys、第274碱基由Thr突变为Phe、第278位碱基由Tyr突变为Thr、第94位碱基由Ser突变为Ala、第31位碱基由Thr突变为Val、且第88位碱基由Gln突变为Arg得到，其中，葡萄糖氧化酶GOD-M5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.葡萄糖氧化酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1～4任一项所述的热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体。

6.包含权利要求5所述的葡萄糖氧化酶突变体基因的重组载体。

7.包含权利要求5所述的葡萄糖氧化酶突变体基因的重组菌株。

8.制备权利要求1～4任一项所述的热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用包含编码权利要求1～4任一项所述的热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体的基因的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导表达葡萄糖氧化酶突变体；

(3)回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶突变体。

9.权利要求1～4任一项所述的热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体在食品或饲料领域中的应用。