CN114369562B - 一种提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法 - Google Patents

一种提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高5‑氨基乙酰丙酸表达量的方法。所述方法包括以下步骤：在谷氨酸棒状杆菌过表达ALA合成酶基因hemA和吡哆醛激酶的编码基因pykA。本发明通过优化hemA序列，提升了ALA合成水平；同时优化ALA合成酶所需辅因子的合成途径中关键基因pykA的序列并进行了过表达，筛选到有助于ALA合成水平显著提高的pykA序列。

Description

一种提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，5-ALA)是一种广泛存在于动植物和微生物细胞中的非蛋白质氨基酸，是多种化合物（叶绿素、血红素、卟啉和维生素Ｂ12等）的前体。5-ALA在多个领域有重要应用，具有广阔的应用和市场开发前景。如在饲料行业，其可作为动物饲料添加剂，促进动物健康和生长；在农业领域，作为生物肥料添加剂，促进作物的抗病和增产；在医药行业，被应用于肿瘤定位和多种癌症的光动力诊断治疗等。
随着生物技术发展，尤其是基因编辑技术和合成生物学理念的涌现，理性改造微生物以大幅度提高标的物质产量是现在和将来发展的必然趋势。目前，5-ALA合成已由过去化学合成转向绿色健康的微生物发酵。微生物合成5-ALA的途径分为两种：C4途径和C5途径，C4途径由于合成步骤短和需要的辅因子种类少而被广泛应用。在C4途径中，通常是将含有强启动子（如Ptrc、Ptac）调控ALA合成酶基因hemA表达的质粒导入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，同时在发酵过程中向发酵液中补加一定量的甘氨酸；在ALA合成酶催化下，甘氨酸和TCA途径合成的琥珀酰CoA发生缩合反应形成5-ALA。
在5-ALA合成途径中，5-ALA合成酶表达水平与5-ALA合成水平密切关联。辅因子（如NAD +、NADP +、FMN和FAD）为诸多酶发挥生物学功能必需。5’-磷酸吡哆醛（5’-pyridoxalphosphate, PLP）是生物体内140多种酶蛋白的辅因子，在细胞代谢过程中其重要作用。代谢过程中关键酶的丰度和辅因子量需要适宜平衡，在酶蛋白过表达时辅因子合成量亦需提高；但辅因子浓度过高时引发宿主细胞代谢流失衡，反而会降低目标产物的合成水平（吕雪芹，生物工程学报, 2021, 37(5): 1619-1636）。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法。
根据本发明的提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法，包括以下步骤：删除谷氨酸棒状杆菌的谷氨酸脱氢酶基因gdhA，在谷氨酸棒状杆菌过表达控ALA合成酶基因hemA和吡哆醛激酶的编码基因pykA。
根据本发明的提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法，其中，ALA合成酶基因hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
根据本发明的提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法，其中，所示ALA合成酶基因hemA的序列为优化序列，优化基因hemA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2，优化基因hemA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
根据本发明的提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法，其中，所述吡哆醛激酶基因pykA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
根据本发明的提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法，其中，所述吡哆醛激酶基因pykA被优化，优化的吡哆醛激酶基因pykA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，优化的吡哆醛激酶基因pykA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明通过优化hemA序列，提升了ALA合成水平；同时优化ALA合成酶所需辅因子的合成途径中关键基因pykA的序列并进行了过表达，筛选到有助于ALA合成水平显著提高的pykA序列。
附图说明
图1显示不同菌株染色体为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析，其中，M：DNAMarker；1：C. glutamicum ATCC 13032，2：C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA，3：C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA::pyk，4：C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA::pyk1，5：C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA::pyk2；
图2显示不同菌株发酵上清中ALA含量，其中，A：C. glutamicum 13032ΔgdhA/pEC-xk99E-hemA，B：C. glutamicum 13032ΔgdhA/pEC-xk99E-hemA1，C：C. glutamicum13032ΔgdhA/pEC-xk99E-hemA2；
图3显示不同菌株发酵液中ALA含量，A：C. glutamicum 13032ΔgdhA /pEC-xk99E-hem2，B：C. glutamicum 13032ΔgdhA::pyk/pEC-xk99E-hemA2，C：C. glutamicum13032ΔgdhA::pyk1/pEC-xk99E-hemA2，D：C. glutamicum 13032ΔgdhA::pyk2/pEC-xk99E- hemA2。
具体实施方式
1、菌株和质粒
谷氨酸棒状杆菌C. glutamicum ATCC 13032购自公司，质粒pEC-xk99E（Chen etal., 2020, Biotechnol Biofuels, 13: 41），DNA无缝重组试剂盒。
2、培养基
LB 培养基 (g/L)： 酵母粉 5、蛋白胨 10、NaCl 10；
牛脑心山梨醇(BHIS) 培养基(g/L)：牛脑心浸粉 37、山梨醇 91、pH 7.0；
发酵培养基（g/L）（王丽君，生物工程学报，2021, 37，4314-4328）：葡萄糖60、硫酸铵20，磷酸二氢钾2.5、七水合硫酸镁0.6、玉米浆30、七水合硫酸亚铁0.025、一水合硫酸锰0.025、尿素1、糖蜜 2，pH 6.5。培养基在121℃下高温灭菌20min，配制固体培养基时需加入琼脂粉至终浓度为1.5%–2.0%。
实施例1
1. pykA过表达的质粒构建
1.1pykA密码子优化
优化pykA序列，筛选到pykA的2条新序列，分别命名为pykA1、pykA2，并合成。
1.2 pykA过表达元件的构建
以C. glutamicum ATCC 13032染色体为模板、2对引物（P tuf -F：5-GTTCCTGGGCTTT GAGCATGGCCGTTACCCTGCGA-3和P tuf -R：5- TGCTTAATTAATGCTGAGATGTTTAAACCATTGTATGTCCTCCTGGACTTC-3、T sod -F： 5- GTTTAAACATCTCAGCATTAATTAAGCATTTTTAGTACGTGCAATAACC-3和T sod -R： 5- GCCCATCCGTAAATTCTCGCTTGCCACAGCTGGCCT-3分别扩增强启动子P tuf 、终止子T sod ，PCR产物分别命名为P tuf 、T sod 。以P tuf -F 和T sod -R为引物，通过Overlap-PCR将PCR产物P tuf 、T sod 进行融合，从而得到外源基因过表达的表达盒P tuf /T sod 。
2. gdhA删除质粒的构建
TCA循环中α- 酮戊二酸经α-酮戊二酸脱氢酶生成琥珀酰辅酶A，琥珀酰辅酶A和甘氨酸在ALA合成酶作用下生成5-ALA；另一方面α- 酮戊二酸亦可经谷氨酸脱氢酶GdhA催化形成谷氨酸。删除gdhA可使TCA循环中的α- 酮戊二酸倾向于合成琥珀酰辅酶A，从而提升ALA的合成。
以C. glutamicum ATCC 13032染色体为模板，通过引物（gdhA-LF：5-TGATGGGTCTTGTTGTTGGCAAATGCCCGCAGTGAGTTAAGT-3和gdhA-LR： 5-GGCGCGCCTGCTCAAAGCCCAGGAACTTC-3、gdhA-RF：5- TTTGAGCAGGCGCGCCTTCCGTGAGCGCGACATC-3和gdhA-RR：5-AGTATCTTCCTGGCATCTTCCAGGAGAATTTACGGATGGGCAATC-3）扩增谷氨酸脱氢酶基因gdhA的左端和右端同源臂，PCR产物命名为gdhA-L和gdhA-R。以gdhA-LF和gdhA-RR为引物，通过Overlap-PCR将gdhA-L和gdhA-R融合，得到DNA片段gdhA-LR。
以质粒pYJ1为模板，通过引物（pA15-F：5-CTGGAAGATGCCAGGAAGAT ACT-3、gdhA/crRNA-R：5-TCGGTCATGAAGGACTGGCAATCTACAACAGTAGAAATTCGGATCCATTATACCTAGGA-3、gdhA/crRNA-R1：5- TCTCATCCGCCAAAACAGCCCTCGGTCATGAAGGACTGGCA-3）扩增包括pA15 ori和gdhA/crRNA的DNA片段（命名为ori-crRNA）。
用内切酶ApaI和AarI酶切处理质粒pYJ1，回收大片段DNA。应用DNA无缝重组试剂盒将收回的DNA片段、gdhA-LR、ori-crRNA重组。将重组产物转化E. coli Top10感受态，以含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基筛选转化子，并提取阳性转化子中质粒，将其命名为pYJ1-gdhA。
3. gdhA删除和pykA、pykA1和pykA2过表达质粒的构建
回收经内切酶AscI处理的质粒pYJ1-gdhA，将其与P tuf /T sod 重组，得到质粒pYJ1-gdhA-P tuf /T sod 。
以C. glutamicum ATCC 13032染色体DNA为模板，利用引物（pyk-F: 5- ATCAAGT TTAAACAAAGGACATAAGGATGCCGTCGGCAGGCGA-3和pyk-R: 5- CAGACTTAATTAACTAAAGCGCTTTGGTCTGCAG-3）扩增基因pykA。PCR产物经Pme I和Pac I后与经相同酶切的质粒pYJ1-gdhA-P tuf /T sod 连接，从而构建质粒pYJ1-gdhA-pykA。该质粒导入C. glutamicum ATCC 13032后可实现gdhA删除和pykA过表达。
同样，基因pykA1和pykA2经Pme I和Pac I酶切后与经相同酶切的质粒pYJ1-gdhA-P tuf /T sod 连接，从而构建质粒pYJ1-gdhA-pykA1和pYJ1-gdhA-pykA2。
4. gdhA删除和pykA、pykA1和pykA2过表达重组菌株的构建
将质粒pYJ1-gdhA、pYJ1-gdhA-pykA、pYJ1-gdhA-pykA1和pYJ1-gdhA-pykA2分别通过电击方式导入C. glutamicum ATCC 13032感受态细胞，于30°C下在含有25 μg/ml卡那霉素的固体BHIS培养基筛选转化子。从培养基上挑取转化子接种于含有25μg/ml卡那霉素的液体BHI培养基中，于30°C培养至浑浊。以引物（Gdh-VF：5-CGTTTTGGCGATACAAAATTGA-3、Gdh-VR：5-CGGTCTGGAACCATCACCATC-3）进行验证，挑选gdhA删除、gdhA删除和pykA过表达、gdhA删除和pykA1过表达和gdhA删除和pykA2过表达的谷氨酸棒杆菌重组菌株C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA、C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA::pykA、C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA::pykA1和C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA::pykA2。重组菌株培养物以1%比例接种至液体BHIS培养基中，于37°C培养至浑浊；梯度稀释培养物后，将稀释物涂布于液体BHIS培养基上，于37°C培养至菌落出现。将菌落分别挑选至含有25μg/ml卡那霉素的固体BHIS培养基和不含抗生素的固体BHIS培养基上，于30°C培养48h。选取在含有卡那霉素培养基上不生长而无抗生素的培养基上生长菌株，其即为质粒消除的菌株C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA、C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA::pykA、C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA::pykA1和C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA::pykA2。
提取重组菌株C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA、C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA::pykA、C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA::pykA1和C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA::pykA2的染色体（同时以野生菌株C. glutamicum ATCC 13032的染色体为对照），以验证引物Gdh-VF：5-CGTTTTGGCGATACAAAATTGA-3和
Gdh-VR：5-CGGTCTGGAACCATCACCATC-3进行PCR扩增。理论上，野生菌株染色体为模板时，PCR产物约2.2 kb；C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA染色体为模板时，PCR产物约1.5 kb；C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA::pykA、C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA::pykA1和C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA::pykA2染色体为模板时，PCR产物约2.8 kb。琼脂糖凝胶电泳结果表明，PCR产物大小与预期结果一致（图1），亦即获得了预期菌株。
5. ALA合成酶基因过表达菌株的构建
由于ALA合成酶是ALA合成途径中关键酶蛋白，其表达水平与ALA合成密切相关，优化了R. palustris染色体上hemA (Genebank：AY489557 .1)，得到基因hemA1和hemA2，并合成序列。
hemA、hemA1和hemA2经内切酶EcoR I和Xba I处理后与经相同内切酶切割的载体pEC-xk99E重组，得到质粒pEC-xk99E -hemA、pEC-xk99E -hemA1和pEC-xk99E -hemA2。
将构建的质粒pEC-xk99E -hemA、pEC-xk99E -hemA1和pEC-xk99E -hemA2经电击转化分别导入重组菌株C. glutamicum ATCC 13032 ΔgdhA中，于30°C下在含有25μg/ml卡那霉素的固体BHIS培养基筛选转化子。转化子用引物（pEC/seq-F: 5-TCATAACGGTTCTGGCAAATATTC-3和pEC/seq-R: 5-AGGCAAATTCTGTTTTATCAGACC-3）进行验证，并筛选阳性转化子，分别命名为C. glutamicum 13032ΔgdhA/pEC-xk99E-hemA、C. glutamicum 13032ΔgdhA/pEC-xk99E- hemA1和C. glutamicum 13032ΔgdhA/pEC-xk99E-hemA2。
ALA合成酶是ALA合成途径中最后一步的酶蛋白，其高效表达是提高ALA合成的关键。为了实现hemA的高效表达，将hemA的脱氧核糖核苷酸序列进行优化，得到基因hemA1和hemA2，并构建了hemA、hemA1和hemA2过表达的重组菌株 C. glutamicum 13032ΔgdhA/pEC-xk99E-hemA、C. glutamicum 13032ΔgdhA/pEC-xk99E- hemA1和C. glutamicum13032ΔgdhA/pEC-xk99E- hemA2。
6.重组菌株摇瓶发酵
挑取菌落接种于20 ml含有25μg/ml卡那霉素的液体BHIS培养基中，于30°C振荡培养36 h。以10%接种量将培养物接种于100 ml发酵培养基中，于30°C振荡培养4 h后，加入IPTG至终浓度为0.1 mM和甘氨酸至终浓度为8 g/L。发酵72 h后，测定发酵中5-ALA含量。
取300 μL经适当稀释后发酵液上清，加入至400 μL乙酸钠缓冲液（向82g 无水醋酸钠加入57 mL冰乙酸，用超纯水定容至1L），然后加入35 μL乙酰丙酮，混匀后于沸水中煮沸15min。冷却至室温后，加735 μL Ehrlich’s试剂（1g对二甲氨基苯甲醛加入8 mL的70％的高氯酸，用冰乙酸定容至50mL），显色10 min后于554nm波长下测吸光度。根据标准曲线计算ALA含量，并折算出发酵液中ALA含量。
如图2所示，在摇瓶实验中，C. glutamicum 13032ΔgdhA/pEC-xk99E-hemA发酵液上清中ALA含量为3.12 g/L，C. glutamicum 13032ΔgdhA/pEC-xk99E- hemA1发酵液上清中ALA含量为3.87 g/L，相较于未优化的基因提升了23.9%；C. glutamicum 13032ΔgdhA/pEC-xk99E- hemA2，发酵液上清中ALA含量为4.36 g/L，相较于未优化的基因提升了近40%。实验结果表明，通过优化ALA合成途径中关键酶蛋白基因hemA2序列，可以有效提升ALA产量。
7. ALA合成酶基因和吡哆醛激酶基因共同过表达菌株的构建
鉴于过表达hemA2时，ALA产量最高，因而用过表达hemA2的质粒pEC-xk99E-hemA2进行了进一步研究。将质粒pEC-xk99E-hemA2导入重组菌株C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA::pykA、C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA::pykA1和C. glutamicum ATCC 13032ΔgdhA::pykA2，获得重组菌株C. glutamicum 13032ΔgdhA::pykA/pEC-xk99E-hemA2、C. glutamicum 13032ΔgdhA::pykA1/pEC-xk99E- hemA2和C. glutamicum 13032ΔgdhA::pykA2/pEC-xk99E- hemA2。
8.重组菌株摇瓶发酵
挑取菌落接种于20 ml含有25μg/ml卡那霉素的液体BHIS培养基中，于30°C振荡培养36 h。以10%接种量将培养物接种于100 ml发酵培养基中，于30°C振荡培养4 h后，加入IPTG至终浓度为0.1 mM和甘氨酸至终浓度为8 g/L。发酵72 h后，测定发酵中5-ALA含量。
取300 μL经适当稀释后发酵液上清，加入至400 μL乙酸钠缓冲液（向82g 无水醋酸钠加入57 mL冰乙酸，用超纯水定容至1L），然后加入35 μL乙酰丙酮，混匀后于沸水中煮沸15min。冷却至室温后，加735 μL Ehrlich’s试剂（1g对二甲氨基苯甲醛加入8 mL的70％的高氯酸，用冰乙酸定容至50mL），显色10 min后于554nm波长下测吸光度。根据标准曲线计算ALA含量，并折算出发酵液中ALA含量。
如图3所示： C. glutamicum 13032ΔgdhA::pykA/pEC-xk99E-hemA2发酵液中ALA含量为5.23 g/L，较未过表达pykA的对照菌株C. glutamicum 13032 ΔgdhA /pEC-xk99E-hemA2提高了20％；
C. glutamicum 13032ΔgdhA::pykA1/pEC-xk99E-hemA2发酵液中ALA含量为6.08g/L，较对照菌株C. glutamicum 13032ΔgdhA /pEC-xk99E-hemA2提高了39.5％；
C. glutamicum 13032ΔgdhA::pykA2/pEC-xk99E-hemA2发酵液中ALA含量为5.68g/L，较对照菌株C. glutamicum 13032ΔgdhA /pEC-xk99E-hemA2提高了30％。
实验结果表明，通过提升细胞中5-ALA合成酶的辅因子PLP合成途径中关键基因pykA的表达强度，合成较多的PLP可以提升5-ALA合成酶的活性，进而促进5-ALA合成；其中吡哆醛激酶基因为pykA1时，ALA有最高产量。在合成生物学中，除了通过基因编辑技术改变宿主的代谢流之外，通过增加重要酶蛋白的表达丰度提高产物产量；此外，过表达辅因子合成途径中酶基因，从而提升酶蛋白的活力亦是提高产物产量的有益途径。
以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1263
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaattca aaggaggttg tcatggatta caccaagttc ttcgcagacg cgcttgaccg 60
tttgcatgct gagcgccgct atcgcgtttt tgccgatctg gaacgcgtcg cgggccggtt 120
cccccacgcc acctggcact ccccgagcgg cgaacgcgac gtcgtgatct ggtgctcgaa 180
tgattatctc ggcatgggcc agcacccgaa ggtggtcggc gcgatggtcg agaccgcgac 240
gcggctcggc actggtgccg gtggcacccg caacatcgcc ggcacgcacc atccgctggt 300
gatgcttgag agggaactgg cagatctgca cggcaaggaa gccgcgctgc tgttcacctc 360
gggctacgtc tcgaaccaga ccggcatttc gacgctcgct aagctgatcc cgaactgtct 420
gatcctgtcg gacgcgctca accacaactc gatgatcgaa ggcatccgcc agtcgggctg 480
cgagcgcatc gtctggcgcc acaacgacac cgcgcatctc gaagagctgc tgcgcgccgt 540
tgagccgggc cgtccggtgc tgatcgcgtt cgaaagcttg tattcgatgg acggcgacgt 600
cgcgccgatg gcgaagatct gcgatctcgc cgaaaagtac ggcgccatga cctattgcga 660
cgaagtgcat gcggtcggca tgtacggcgc ccgcggcgcc ggcgttgccg agcgtgatgg 720
tgtgatgcac cgcatcgaca tcatcgaagc gacgctggcc aaggcgttcg gctgcctcgg 780
cggctacatc tccggcaaga aggacgtgat cgacgccgtg cgctcctatg cgccgggctt 840
catcttcacg accgcgctgc cgccgccgat ctgcgccgct gcgaccgccg cgatccgcca 900
cctcaagacc tcgacctggg agcgtgaacg ccaccaggac cgcgccgcgc gcctcaaggc 960
cgtgctcaac accgccggcc tgccggtgat gccgaccgac acccacatcg ttccggtgtt 1020
cgtgggcgat gccgagcgct gcaagaaggc cagcgatctc ttgctggaaa agcacggcat 1080
ctacatccag ccgatcaact atccgaccgt tgccaagggc aaggagcggc tgcgcatcac 1140
cccgtcgccg tatcatgacg acgatctgat ggatcggctg gccgaagcgc tggtcgacgt 1200
ctgggagacg ctggaactgc cgctcggcgc caagccgctc gctgcggaat aatctagagt 1260
cga 1263
<210> 2
<211> 1263
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaattca aaggaggttg tcatggacta tacaaagttc tttgcggacg cgctcgatcg 60
cctccacgct gaacgccgct accgcgtgtt cgcagatctg gagcgtgttg cgggccgttt 120
tccgcacgcc acatggcact ccccctccgg tgaacgcgat gtcgtaattt ggtgttccaa 180
cgactacctg ggcatgggcc agcaccccaa ggtggttggc gctatggttg aaaccgctac 240
tcgcctgggt accggcgccg gcggcacacg taacattgcg ggcacccacc acccactggt 300
tatgctggaa cgcgagctcg ccgatttgca tggaaaggaa gctgcactct tgtttaccag 360
cggctacgta tccaaccaga ccggaatctc aaccttggct aagcttattc ccaattgcct 420
catcctttct gacgccttga atcacaattc catgattgaa ggtatccgac agtccggttg 480
cgagcgtatc gtctggcgcc ataacgacac cgcacacctc gaagagctgc ttcgagcagt 540
ggaaccagga cgcccggttc tcatcgcatt cgagtccctc tactccatgg acggcgatgt 600
ggcgcctatg gccaagatct gcgatctggc cgaaaaatat ggcgccatga catactgcga 660
tgaggttcac gcagttggca tgtacggagc ccgcggcgcg ggtgtggctg aacgcgatgg 720
tgtgatgcac cgtatcgata tcatcgaggc aaccctcgct aaggcattcg gctgccttgg 780
cggttacatc agcggcaaga aggacgtgat cgacgcggta cgctcttacg cgccaggctt 840
tatttttacc accgcacttc ccccaccgat ctgcgcagcc gctaccgcgg caatccgcca 900
tttgaagacc tcaacgtggg aacgtgaacg tcaccaggac cgtgccgcac gtctgaaggc 960
tgtcttgaat acagctggac tgcccgtgat gccgacggat acgcacattg tgccagtgtt 1020
cgtgggcgat gcagagcgct gcaagaaagc cagcgacctc ctgctggaga aacacggtat 1080
ctacatccag ccaatcaatt acccaacggt agcaaaaggc aaggaacgcc tgcgcatcac 1140
cccatccccc taccatgatg acgatctgat ggatcgcctg gcagaggcgc tcgtggatgt 1200
gtgggagacc cttgaactgc ctttgggtgc gaagcccctc gcagctgaat aatctagagt 1260
cga 1263
<210> 3
<211> 1263
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaattca aaggaggttg tcatggacta caccaagttc ttcgcagacg ccctcgaccg 60
cttgcatgcg gagcgtcgct accgcgtgtt tgctgacctt gaacgtgtgg ctggtcgctt 120
cccgcatgca acctggcact ccccgagcgg ggaacgtgat gttgtcatct ggtgctccaa 180
tgattatctt ggcatgggcc aacaccctaa agtagtaggt gccatggtgg aaaccgcaac 240
ccgtttggga accggtgcgg gcggcacgcg caacatcgct ggcacccacc accccctcgt 300
tatgctggaa cgcgaattgg ctgatcttca cggcaaagaa gccgctttgc tctttacatc 360
aggctacgtt agcaatcaga ccggcatttc tacgctggcc aagctcatcc ccaactgcct 420
gattctcagc gatgcgttaa accataattc gatgattgaa ggcatccgcc agtcgggttg 480
cgagaggatt gtttggcgtc ataacgacac cgcacattta gaagagctgt tgcgagccgt 540
tgagccagga agacctgtct tgatcgcgtt tgaatccctg tactctatgg acggtgacgt 600
ggctcccatg gccaagatct gtgacctcgc cgagaaatac ggtgcgatga cctactgcga 660
tgaagtccac gccgtcggaa tgtatggcgc ccgtggagca ggggttgctg aacgcgatgg 720
cgtgatgcac agaatcgata tcattgaggc aactctggct aaggcattcg gttgtctggg 780
gggatacatt tccggtaaga aggatgttat cgacgcagtc cgctcatatg ctccaggctt 840
cattttcacc accgcgctgc cacccccgat ctgtgcagca gcaactgctg caatacggca 900
cttgaagacg tctacatggg aacgggagcg ccaccaggac cgtgcagccc ggctcaaggc 960
ggtgttgaac accgcgggtc tgccagtcat gccgactgat actcacatcg taccagtgtt 1020
tgtgggcgat gctgaacgct gcaaaaaagc cagtgaccta ctgctcgaga agcacggaat 1080
ttatatccaa cctattaact accctacggt cgcaaaaggt aaagagcgac tccgcatcac 1140
cccatcccct taccacgacg atgatttgat ggatcgcctg gcggaggcac tggtcgatgt 1200
gtgggagaca ctagaacttc cacttggcgc gaagccactt gcagccgaat aatctagagt 1260
cga 1263
<210> 4
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcaagttta aacaaaggac ataaggatgc cgtcggcagg cgaggagatt ttagagcagc 60
gcgcacagct ggagtttgat cagcgccgcg ccgatgtggt gatgatcggc agccaggtgg 120
tttatggttc cgtggggctc agtgctgcca ttccggtgat gcacaacgaa ggcctccgcg 180
tggtcgctgt ccccaccgtg gtgttaagtt ccatgccgcg ttatgcaagt tctcaccgcc 240
agccgatgtc ggaccaatgg ctcgccgacg cgctgcaaga cctggtggat ctggggatta 300
tcgatgaggt ttccaccatt tccaccggct attttacctc cgcttctcag gtgcgtgtgg 360
tcgctgcgtg gctgcagaaa atccgcgaaa cccatccgca tgtgcgcatc gtggtggatc 420
ccatcatggg ggacagtgac gtgggaattt atgtcgccga cgagatcgca accgccatct 480
gccaggactt atgccctctg gctaccggaa tcattcccaa tgctttcgag ctctcccaca 540
tggttggctc cggcgatccg cgctcgctgc tcggcccgtt tggcgagtgg atcatcatca 600
ccagcgccac tgaaactgtg ggcaccaccg tcacccgcat cgtcacccgt gacagcgtcc 660
aggaaatcgc ctccgccacc gtcgatacca cggccaaagg ggcaggcgac gtctacgccg 720
cagcattaat cgccgccctg cataaagatt tttcgcttat cgacgccgcc agccacgcat 780
ccaacaccgt ctgcgccggc ctgcagacca aagcgcttta gttaattaag tctg 834
<210> 5
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcaagttta aacaaaggac ataaggatgc catcggctgg cgaagagatc ttggagcagc 60
gtgctcagct ggaatttgat caacgccgtg cggacgtggt catgatcggc agccaggttg 120
tttatggctc cgtaggactc tcagcagcga ttcccgtgat gcacaacgaa ggtctacgag 180
tcgtagccgt cccaacggtc gtattgtctt cgatgccccg ctacgcgtca agccacaggc 240
agccgatgtc cgatcagtgg ttagccgatg ccttgcagga cctcgttgat cttggaatca 300
ttgatgaggt ttcgaccatt tccaccggct acttcacctc cgccagtcaa gtgcgtgttg 360
ttgctgcatg gctgcagaag atccgcgaga cccaccctca tgtgcgcatc gtcgtcgatc 420
caatcatggg tgactctgac gtcggcattt atgtggctga tgaaattgca actgcgatct 480
gccaagatct gtgcccgctc gctacgggaa ttattccaaa cgcatttgag ctctcccaca 540
tggtggggag tggtgaccct cggtcacttc ttggtccttt cggcgaatgg atcatcatca 600
ccagcgccac cgaaacagtt ggtaccaccg tgactagaat cgtcacccgc gattctgtcc 660
aagaaatcgc ctccgcaaca gtggacacca ctgctaaagg agcaggcgat gtgtacgctg 720
cggcactgat tgcggccctg cacaaagact tctccctcat cgacgccgcg tctcatgcca 780
gcaatacagt gtgtgcaggc ctgcaaacga aggctttgta attaattaag tctg 834
<210> 6
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcaagttta aacaaaggac ataaggatgc catctgctgg agaggaaatc ctggaacagc 60
gagctcaact tgagttcgat cagcgtcgcg cagatgtggt gatgatcggt tcccaagttg 120
tgtacggttc agtgggcctc tcagcagcta tcccggttat gcacaacgaa ggtttgcgcg 180
tagtagcagt cccaactgtg gtgctctcct ccatgccacg ctatgcgagc tcccatcgtc 240
agcctatgtc cgatcagtgg ctggctgacg cactccagga tttggtggac ctgggcatca 300
tcgatgaagt gagcaccatc tccactggat actttaccag cgcatcacaa gttcgcgttg 360
tggcagcctg gctgcaaaag atccgcgaaa cccacccaca tgtgcgcatc gtggtggatc 420
cgattatggg tgattctgac gtgggcatct acgttgcaga cgaaatcgcc accgccatct 480
gccaggatct gtgtccactc gccactggta ttatcccaaa tgcattcgaa ttgtctcaca 540
tggttggttc cggcgatcca cgatcccttt tgggtccatt tggtgaatgg attatcatca 600
cgtctgctac agagactgtc ggcacaaccg ttactcgcat cgtcactcgc gactccgtgc 660
aagagatcgc atcagcaaca gttgacacca ccgcaaaggg tgcaggtgat gtgtacgctg 720
ccgccctgat tgcggctctg cacaaggact tttctctgat tgacgccgca agccacgcat 780
ccaacaccgt ctgtgctggt ttgcagacta aggctctgta gttaattaag tctg 834

Claims (6)

1.一种提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
删除谷氨酸棒状杆菌（C. glutamicum）的谷氨酸脱氢酶基因gdhA；
在谷氨酸棒状杆菌过表达控ALA合成酶基因hemA和吡哆醛激酶基因pykA。
2.根据权利要求1所述的提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法，其特征在于，所述ALA合成酶基因hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法，其特征在于，所述ALA合成酶基因hemA被优化，经优化的ALA合成酶基因hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3所示。
4.根据权利要求1所述的提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法，其特征在于，所述吡哆醛激酶基因pykA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.根据权利要求1所述的提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法，其特征在于，所述吡哆醛激酶的编码基因pykA被优化，经优化的吡哆醛激酶基因pykA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。
6.根据权利要求1所述的提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌（C. glutamicum）为谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 13032。
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