CN116121161A - 一种生产麦角硫因的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种生产麦角硫因的基因工程菌及其构建方法与应用。所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主,异源过表达Microcoleus sp.PCC 7113来源的egtD基因,Methylobacterium pseudosasicola来源的egtB基因,Neurospora crassa来源的egt2基因,Corynebacterium glutamicum的ATP转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisG*;并且过表达hisDBCHAFI基因簇,丝氨酸转乙酰酶突变体CysE(M201R)编码基因,磷酸甘油酸脱氢酶酶突变体SerA(H344A/N364A)编码基因,腺苷蛋氨酸合酶突变体MetK(I303V)编码基因;并且不表达色氨酸酶基因tnaA。该菌株对麦角硫因合成模块、前体物组氨酸、半胱氨酸和腺苷蛋氨酸合成模块进行了系统性改造,实现大肠杆菌中麦角硫因的高效、稳定生产。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种生产麦角硫因的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
麦角硫因(Ergothioneine,EGT)是一种具有广阔应用前景的高附加值氨基酸衍生物,具有独特的生物学功能,特别是作为优良的抗氧化剂引起了人们广泛的关注。麦角硫因可广泛应用于食品保健、化妆品、医药和生物技术等领域。
麦角硫因的制备方法包括天然生物提取法、化学合成法和生物合成法。当前的商业生产麦角硫因的方法主要依赖于从天然生物中提取或化学合成,这两种方法具有成本高、产率低等问题。生物合成法中的微生物发酵法相比于其他方法,具有原料成本低、生产工艺简单、安全环保可持续生产等优势,是大规模工业生产的理想方式。然而,天然合成途径弱,前体物组氨酸,腺苷蛋氨酸和半胱氨酸的协同供应困难等制约了麦角硫因的合成。
为了获得高效的麦角硫因生产菌株,研究者们已做出了诸多尝试。TANAKA等(TANAKA N,KAWANO Y,SATOH Y,et al.Gram-scale fermentative production ofergothioneine driven by overproduction of cysteine in Escherichiacoli.Scientific Reports,2019,9(1):1895.)以大肠杆菌为出发菌,导入重组质粒pQE1a-egtABCDEmsm,p15A-serA*/cysE*,敲除基因metJ,所获得的重组菌株分批补料发酵216h后,麦角硫因产量可以达到1.31g/L。VAN DER HOEK等(VAN DER HOEK S A,DARBANI B,ZUGAJ KE,et al.Engineering the yeast Saccharomyces cerevisiae for the production ofL-(+)-ergothioneine.Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2019,7:262.)在酿酒酵母中整合了粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶NcEgt1和麦角菌来源的麦角硫因合成酶CpEgt2编码基因,所获菌株在1L反应器中分批补料发酵84h后麦角硫因产量达到598mg/L;Van der Hoek SA等在此基础上,进一步利用有毒的组氨酸类似物筛选TRA抗性菌株,基因组整合单拷贝的MET14基因并敲除SPE2基因,所获菌株在1L反应器分批补料发酵160h后,产量提高到了2.39g/L,且无需添加氨基酸前体(VAN DER HOEK S A,RUSNAK M,WANG G,et al.Engineering precursor supply for the high-level production ofergothioneine in Saccharomyces cerevisiae.Metabolic Engineering,2022,70:129-142.)。Chen等(CHEN Z,HE Y,WU X,et al.Toward more efficient ergothioneineproduction using the fungal ergothioneine biosynthetic pathway.Microbial CellFactories,2022,21(1):76.)在大肠杆菌中共表达里氏木霉来源的麦角硫因合成基因tregt1和tregt2,所得菌株通过2L罐分批补料发酵,培养143h后麦角硫因产量达到4.34g/L。康振等(陈佳敏,王阳,堵国成,康振.优化前体供给与细胞膜通透性强化大肠杆菌合成麦角硫因.食品与生物技术学报,2022,41(08):43-52.)在大肠杆菌中通过质粒异源成功表达了耻垢分枝杆菌来源的egtBDCE基因簇与粟酒裂殖酵母来源的egt1基因,同时强化表达了耻垢分枝杆菌的谷氨酰半胱氨酸连接酶EgtA与麦角硫因合成所需前体氨基酸代谢途径中的关键酶,包括天冬氨酸激酶ThrA和磷酸甘油酸脱氢酶SerA,最后通过发酵工艺的优化,所得菌株在3L发酵罐发酵108h,麦角硫因产量可以达到2.01g/L。中国专利申请CN114854660A在大肠杆菌中游离表达外源麦角硫因合成基因RrEgtB和RrEgtC,将hisA,hisF,cysE,nrdH,cysP,metH,mtn,lux,metK,metF的启动子替换为J23100启动子,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因组上yhaM,tnaA,tolC,metJ,mgl,yjeH,yeaS基因;最终所得菌株经摇瓶发酵48h,可以产110mg/L的麦角硫因,通过将补料培养基的流速调节菌株生长的速度,溶氧控制实现了麦角硫因的高效合成,菌株OD600最终达到110,培养77h麦角硫因产量达到了7g/L。
尽管进行了诸多尝试,但是现有麦角硫因生产菌株的性能仍较低,现阶段利用微生物发酵法生产麦角硫因仍存在发酵周期长,产量低,生产强度低的问题,并且需要额外添加大量的氨基酸前体,导致生产成本很高,不能满足大规模工业生产要求。
发明内容
针对现有技术不足,本发明的目的是构建一种生产麦角硫因的大肠杆菌基因工程菌株,该菌株对麦角硫因合成模块、前体物组氨酸、半胱氨酸和腺苷蛋氨酸合成模块进行了系统性改造,实现大肠杆菌中麦角硫因的高效、稳定生产。
为了实现上述目的,本发明采取如下的技术方案:
第一方面,本发明提供了一种基因工程菌,该基因工程菌以大肠杆菌为宿主,异源过表达Microcoleus sp.PCC 7113来源的egtD基因,Methylobacterium pseudosasicola来源的egtB基因,Neurospora crassa来源的egt2基因,Corynebacterium glutamicum的ATP转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisG*;并且过表达hisDBCHAFI基因簇,丝氨酸转乙酰酶突变体CysE(M201R)编码基因,磷酸甘油酸脱氢酶酶突变体SerA(H344A/N364A)编码基因,腺苷蛋氨酸合酶突变体MetK(I303V)编码基因;并且不表达色氨酸酶基因tnaA。
第二方面,本发明提供了如上所述的基因工程菌的构建方法,包括:在宿主大肠杆菌中引入Microcoleus sp.PCC 7113来源的egtD基因,Methylobacterium pseudosasicola来源的egtB基因,Neurospora crassa来源的egt2基因,Corynebacterium glutamicum的ATP转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisG*并过表达;并且过表达hisDBCHAFI基因簇,丝氨酸转乙酰酶突变体CysE(M201R)编码基因,磷酸甘油酸脱氢酶酶突变体SerA(H344A/N364A)编码基因,腺苷蛋氨酸合酶突变体MetK(I303V)编码基因;并且将色氨酸酶基因tnaA敲除或失活。
第三方面,本发明提供了如上所述的基因工程菌在高效生产麦角硫因中的应用。
第四方面,本发明提供了利用如上所述的基因工程菌生产麦角硫因的方法,包括:在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产麦角硫因;以及,从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述麦角硫因。
本发明的有益效果如下:
本发明以大肠杆菌为出发菌株,经过对麦角硫因的合成模块、前体物组氨酸、半胱氨酸和腺苷蛋氨酸合成模块进行系统的代谢工程改造得到一株遗传背景清晰,不携带质粒,能稳定高效生产麦角硫因的基因工程菌株EGT11,该菌株在不用添加L-组氨酸、L-半胱氨酸和L-蛋氨酸的条件下,摇瓶发酵24h可生产麦角硫因350mg/L;在2L发酵罐上进行分批补料发酵,培养60h可生产麦角硫因7.2g/L,未有其它副产物的显著积累。本发明提供的麦角硫因发酵生产方法,麦角硫因产量和生产强度为目前报道的最高水平,并且发酵过程中无需添加L-组氨酸和L-半胱氨酸,可显著降低生产成本。
附图说明
图1:EGT11 2L发酵罐分批补料发酵曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
第一方面,本发明提供了一种基因工程菌,该基因工程菌以大肠杆菌为宿主,异源过表达Microcoleus sp.PCC 7113来源的egtD基因,Methylobacterium pseudosasicola来源的egtB基因,Neurospora crassa来源的egt2基因,Corynebacterium glutamicum的ATP转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisG*;并且过表达hisDBCHAFI基因簇,丝氨酸转乙酰酶突变体CysE(M201R)编码基因,磷酸甘油酸脱氢酶突变体SerA(H344A/N364A)编码基因,腺苷蛋氨酸合酶突变体MetK(I303V)编码基因;并且不表达色氨酸酶基因tnaA。
根据本发明,突变体的标识:采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示蛋白突变体中突变的氨基酸。如CysE(M201R),表示丝氨酸转乙酰酶CysE的氨基酸序列(NCBI-ProteinID:NP_418064.1)第201位的氨基酸由甲硫氨酸(M)替换成精氨酸(R);如SerA(H344A/N364A),表示磷酸甘油酸脱氢酶酶SerA的氨基酸序列(NCBI-ProteinID:NP_417388.1)第344位的氨基酸由组氨酸(H)替换成丙氨酸(A),并且第364位的氨基酸由天冬酰胺(N)替换成丙氨酸(A);如MetK(I303V),表示腺苷蛋氨酸合酶MetK的氨基酸序列(NCBI-ProteinID:NP_417417.1)第303位的氨基酸由异亮氨酸(I)替换成缬氨酸(V)。
根据本发明,Corynebacterium glutamicum的ATP转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisG*的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
根据本发明,用于构建所述基因工程菌的宿主可以是任意的大肠杆菌,例如,本领域常见用作基因工程宿主的E coli MG1655、E coli W3110、E coli BL21、E.coli BW25113等模式菌株,只要可以对其进行基因编辑表达上述需要过表达或异源过表达的基因即可;上述大肠杆菌各基因的选择根据所选宿主进行选择,但均是实现同一功能的基因。
根据本发明一种优选的实施方式,所述宿主是E.coli MG1655。
根据本发明,不表达上述基因的方式可以采取本领域常规手段,例如,通过本领域常规手段使该基因失活或者将该基因敲除。
根据本发明,所述不表达是指该基因表达产物的量显著低于原有水平,例如,显著降低了至少50%、60%、70%、80%、90%、100%。
根据本发明,所述过表达是指该基因表达产物的量显著高于原有水平,例如,提高了150%或更多,200%或更多,300%或更多。
根据本发明,过表达上述基因的方式,可以通过在大肠杆菌基因组中引入和/或增加该基因的拷贝数(例如,通过pET28a、pTrc99a、pSTV28等自主复制质粒增加基因的拷贝数,或者增加大肠杆菌染色体中该基因的拷贝数),或者修饰该基因的表达调控序列(例如,启动子,核糖体结合位点等),或者以上方法的组合。
根据本发明一种优选的实施方式,过表达上述基因的方式是将该基因连接了强启动子并整合在大肠杆菌基因组中,其中基因的整合位点可以根据本领域技术人员常规认知选择一些不会对细菌生长和基础代谢产生明显影响的假基因位点,例如yeeP、ygiP、yghX、ygaY、yjiT、yjiP、ycjV、ycgH、ygaY、yeeL、ilvG、rph等基因位点都是可以选择的;所述强启动子可以选择Ptrc、BBa-J23100、T7中任意一种,优选Ptrc。
第二方面,本发明提供了如上所述的基因工程菌的构建方法,包括:在宿主大肠杆菌中引入Microcoleus sp.PCC 7113来源的egtD基因,Methylobacterium pseudosasicola来源的egtB基因,Neurospora crassa来源的egt2基因,Corynebacterium glutamicum的ATP转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisG*并过表达;并且过表达hisDBCHAFI基因簇,丝氨酸转乙酰酶突变体CysE(M201R)编码基因,磷酸甘油酸脱氢酶酶突变体SerA(H344A/N364A)编码基因,腺苷蛋氨酸合酶突变体MetK(I303V)编码基因;并且将色氨酸酶基因tnaA敲除或失活。
本发明第一方面已经详细介绍了上述各基因的选择、宿主的选择等,此处不再赘述第一方面已经介绍过的内容。
根据本发明一种具体的实施方式,该方法包括:
(1)引入麦角硫因合成途径
将Microcoleus sp.PCC 7113来源的egtD基因,Methylobacteriumpseudosasicola来源的egtB基因和Neurospora crassa来源的egt2基因分别整合在大肠杆菌基因组中,并由启动子Ptrc控制其表达。三个基因的引入构建了麦角硫因的合成途径,可实现大肠杆菌异源合成麦角硫因。
(2)提高L-组氨酸合成途径通量
将核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的ATP转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisG*整合在大肠杆菌基因组中,并由启动子Ptrc控制其表达;并在基因组中双拷贝大肠杆菌自身hisDBCHAFI基因簇,并由启动子Ptrc控制其表达。该步骤强化了前体物L-组氨酸的合成途径通量。
(3)提高L-半胱氨酸合成通量
将丝氨酸转乙酰酶突变体CysE(M201R)编码基因和磷酸甘油酸脱氢酶酶突变体SerA(H344A/N364A)编码基因分别整合在大肠杆菌基因组中,并由启动子Ptrc控制其表达,强化L-半胱氨酸合成途径;敲除色氨酸酶编码基因tnaA,阻断L-半胱氨酸的降解。
(4)增强腺苷蛋氨酸的合成通量
将大肠杆菌来源的腺苷蛋氨酸合酶突变体MetK(I303V)的编码基因整合在大肠杆菌基因组中,并由启动子Ptrc控制其表达。该步可增强腺苷蛋氨酸的合成通量。
第三方面,本发明提供了如上所述的基因工程菌在高效生产麦角硫因中的应用。
第四方面,本发明提供了利用如上所述的基因工程菌生产麦角硫因的方法,包括:在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产麦角硫因;以及,从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述麦角硫因。
根据本发明第四方面,所述基因工程菌的培养可以采用本领域常规方法进行。用于生产麦角硫因的培养基可以是合成的或天然的培养基,例如含有碳源、氮源、硫源、无机离子和需要的其它有机和无机组分的典型培养基。
所述基因工程菌可以在需氧条件下进行培养,持续16至72小时,或20至60小时,或24至48小时;培养温度可以控制在30至45℃,或30至37℃内;且pH可以调节在5.0至8.0之间,或6.0至7.5之间,或6.8至7.2之间。可以通过使用无机或有机酸性或碱性物质,以及氨气调节pH。
培养后,可以通过常规技术(例如离心,膜过滤)从液体培养基中除去固体,如细胞和细胞碎片,然后可以通过常规技术(例如浓缩,离子交换层析,结晶)的任意组合从发酵液回收麦角硫因。
根据本发明一种优选的实施方式,优选的培养基组成如下:葡萄糖10-30g/L,酵母浸粉0.5-3g/L,(NH4)2SO4 3-6g/L,K2HPO4 5-10g/L,MgSO4·7H2O 1-3g/L,柠檬酸钠1-3g/L,蛋氨酸1-5g/L,FeSO4·7H2O 50-200mg/L,MnSO4·7H2O 5-20mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12各2-6mg/L,VH 5-20m g/L,VB6 50-200mg/L,其余为水。
根据本发明另一种优选的实施方式,优选的培养基组成如下:酵母浸粉3-6g/L,蛋白胨3-6g/L,柠檬酸钠1-5g/L,KH2PO4 2g/L,MgSO4·7H2O 2g/L,FeSO4·7H2O 20-40m g/L,MnSO4·7H2O 10-20mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L,V6 10-100mg/L,另外加入2%(v/v)的苯酚红溶液,其余为水。
以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。以下实施例中:
如无特别说明,本发明实施例中所涉及的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行。其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除系统,λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统,奇霉素抗性(工作浓度:100mg/L),32℃培养;pGRB以pUC18为骨架,包括启动子J23100,gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列,氨苄青霉素抗性(工作浓度:100mg/L),37℃培养。该方法通过pGRB质粒和重组DNA片段的转化,筛选阳性菌株后再将质粒消除,实现重组片段的敲除或敲入。其中用于敲除的重组片段由需敲除基因的上下游同源臂组成(上游同源臂-下游同源臂),用于整合的重组片段以整合位点的上下游同源臂及待整合的基因片段组成(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。其他所涉及的分子生物学、基因工程等具体操作手段根据本领域人员容易获得的技术手册、教科书或文献报道均可以实现,不必在此详细描述操作过程。此外,以下实施例中选用了具体的菌株作为宿主,因而根据宿主选择了具体的基因整合位点、目标基因及其引物等,但并不意味着本发明目的仅能通过这些具体的选择得以实现,不能以此限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。
实施例1:大肠杆菌基因工程菌EGT11的构建
1菌株构建过程中用到的引物,如下表所示:
2菌株的构建过程
2.1egtDmva基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其rph基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-rph-S、UP-rph-A)和下游同源臂引物(DN-rph-S、DN-rph-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;将Microcoleus sp.PCC 7113的egtD基因进行密码子优化,并根据密码子优化后egtDmva基因序列(SEQ ID No.1)设计扩增egtDmva片段所需引物egtDmva-S和egtDmva-A,以化学合成的egtDmva基因为模板扩增egtDmva基因;启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和egtDmva基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得egtDmva基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-egtDmva-下游同源臂),构建质粒pGRB-rph使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-rph-S和gRNA-rph-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-rph电转至E.coli MG1655的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株EGT1。阳性菌株通过PCR及电泳验证egtDmva基因整合成功。
2.2egtBmps基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其yeeP基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yeeP-S、UP-yeeP-A)和下游同源臂引物(DN-yeeP-S、DN-yeeP-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;将Methylobacterium pseudosasicola的egtB基因进行密码子优化,并根据密码子优化后egtBmps基因序列(SEQ ID No.2)设计扩增egtBmps片段所需引物egtBmps-S和egtBmps-A,以化学合成的egtBmps基因为模板扩增egtBmps基因;启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和egtBmps基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得egtBmps基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-egtBmps-下游同源臂),构建pGRB-yeeP使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yeeP-S和gRNA-yeeP-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-yeeP电转至EGT1的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株EGT2。阳性菌株通过PCR及电泳验证egtBmps基因整合成功。
2.3egtEncr基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其tehB基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-tehB-S、UP-tehB-A)和下游同源臂引物(DN-tehB-S、DN-tehB-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;将Neurospora crassa的egtEncr基因进行密码子优化,并根据密码子优化后egtEncr基因(SEQ ID No.3)设计扩增egtEncr基因所需引物egtEncr-S和egtEncr-A,以化学合成的egtEncr基因片段为模板,PCR扩增egtEncr基因;启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和egtEncr基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得egtEncr基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-egtEncr-下游同源臂),构建pGRB-tehB使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-tehB-S和gRNA-tehB-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-tehB电转至EGT2的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株EGT3。阳性菌株通过PCR及电泳验证egtEncr基因整合成功。
2.4hisG*基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其tdcD基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-tdcD-S、UP-tdcD-A)和下游同源臂引物(DN-tdcD-S、DN-tdcD-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;根据hisG*基因(SEQ ID No.4)设计扩增hisG*插入片段所需引物hisG*-S和hisG*-A,以化学合成的hisG*基因为模板,PCR扩增hisG*基因片段;启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和hisG*基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得hisG*基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-hisG*-下游同源臂),构建pGRB-tdcD使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-tdcD-S和gRNA-tdcD-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-tdcD电转至EGT3的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株EGT4。阳性菌株通过PCR及电泳验证hisG*基因整合成功。
2.5hisD基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其yghX基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yghX-S、UP-yghX-A)和下游同源臂引物(DN-yghX-S1、DN-yghX-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;根据hisD基因设计扩增hisD插入片段所需引物hisD-S和hisD-A;启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和hisD基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得hisD基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-hisD-下游同源臂),构建pGRB-yghX使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yghX-S和gRNA-yghX-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-yghX电转至EGT4的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株EGT5。阳性菌株通过PCR及电泳验证hisD基因整合成功。
2.6hisB-hisC基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据hisB-hisC及其上游序列设计上游同源臂引物(UP-hisCB-S、UP-hisCB-A),并PCR扩增其上游同源臂片段;以E.coli MG1655基因组为模板,根据其yghX基因的下游序列设计下游同源臂引物(DN-yghX-S2、DN-yghX-A),并PCR扩增其下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合,获得hisB-hisC的整合片段(hisB的上游片段-hisB-hisC-下游同源臂)。构建pGRB-his1使用的含靶序列的DNA片段通过引物his1-gRNA-S和his1-gRNA-S的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-his1电转至EGT5的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株EGT6。阳性菌株通过PCR及电泳验证hisB-hisC基因整合成功。
2.7hisH-hisA-hisF-hisI基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据hisH-hisA-hisF-hisI及其上游序列设计上游同源臂引物(UP-hisHAFI-S、UP-hisHAFI-A),并PCR扩增其上游同源臂片段;以E.coliMG1655基因组为模板,根据其yghX基因的下游序列设计下游同源臂引物(DN-yghX-S3、DN-yghX-A),并PCR扩增其下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合,获得hisH-hisA-hisF-hisI的整合片段(hisH的上游片段-hisH-hisA-hisF-hisI-下游同源臂)。构建pGRB-his2使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-his2-S和gRNA-his2-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-his2电转至EGT6的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株EGT7。阳性菌株通过PCR及电泳验证hisH-hisA-hisF-hisI基因整合成功。
2.8cysEM201R基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其yjiT基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yjiT-S、UP-yjiT-A)和下游同源臂引物(DN-yjiT-S、DN-yjiT-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;根据cysEM201R基因(SEQ ID No.5)设计扩增cysEM201R插入片段所需引物cysE-S、和cysE-A,以化学合成的cysEM201R基因为模板扩增cysEM201R基因片段;启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和cysEM201R基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得cysEM201R基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-cysEM201R-下游同源臂),构建pGRB-yjiT使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yjiT-S和gRNA-yjiT-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-yjiT电转至EGT7的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株EGT8。阳性菌株通过PCR及电泳验证cysEM201R基因整合成功。
2.9serAH344A/N364A基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其yjiP基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yjiP-S、UP-yjiP-A)和下游同源臂引物(DN-yjiP-S、DN-yjiP-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;根据serAH344A/N364A基因(SEQ ID No.6)设计扩增serAH344A/N364A插入片段所需引物serA-S和serA-A,以化学合成的serAH344A/N364A基因为模板,PCR扩增serAH344A/N364A基因片段;启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和serAH344A/N364A基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得serAH344A/N364A基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-serAH344A/N364A-下游同源臂),构建pGRB-yjiP使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yjiP-S和gRNA-yjiP-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-yjiP电转至EGT8的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株EGT9。阳性菌株通过PCR及电泳验证serAH344A /N364A基因整合成功。
2.10tnaA基因的敲除
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其tnaA基因(Gene ID:948221)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-tnaA-S、UP-tnaA-A)和下游同源臂引物(DN-tnaA-S、DN-tnaA-A),并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得tnaA基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-tnaA使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-tnaA-S和gRNA-tnaA-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-tnaA电转至EGT9的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株EGT10。阳性菌株通过PCR及电泳验证tnaA基因敲除成功。
2.11metKI303V基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其yjgX基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yjgX-S、UP-yjgX-A)和下游同源臂引物(DN-yjgX-S、DN-yjgX-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;根据metKI303V基因(SEQ ID No.7)设计扩增metKI303V插入片段所需引物metK-S和metK-A,以化学合成的metKI303V基因为模板,PCR扩增metKI303V基因片段;启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和metKI303V基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得metKI303V基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-metKI303V-下游同源臂),构建pGRB-yjgX使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yjgX-S和gRNA-yjgX-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-yjgX电转至EGT10的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株EGT11。阳性菌株通过PCR及电泳验证metKI303V基因整合成功。
实施例2:基因工程菌EGT11摇瓶发酵生产麦角硫因
斜面活化培养:取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面,37℃培养12h。
种子培养:用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中,九层纱布封口,37℃,200rpm培养8-10h;
发酵培养:按种子培养液体积10-15%的接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL),九层纱布封口,37℃,220r/min振荡培养,发酵过程中按苯酚红指示剂指示,按少量多次的原则补加氨水,控制培养基pH在7.0左右;当培养基中葡萄糖消耗完毕,及时补加1mL 60%(m/v)葡萄糖溶液至发酵结束,发酵周期24h;
活化斜面培养基:葡萄糖1g/L,蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L,酵母浸粉5g/L,NaCl5g/L,琼脂粉25g/L,其余为水。
种子培养基:酵母浸粉5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,其余为水。
摇瓶发酵培养基:酵母浸粉3g/L,蛋白胨4g/L,柠檬酸钠3g/L,KH2PO4 2g/L,MgSO4·7H2O 2g/L,FeSO4·7H2O 40m g/L,MnSO4·7H2O 10mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2mg/L,V6 100mg/L,另外加入2%(v/v)的苯酚红溶液,其余为水。
EGT11通过摇瓶发酵培养24h,可生产麦角硫因350mg/L。
实施例3:基因工程菌EGT11发酵罐发酵生产麦角硫因
斜面活化培养:从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种,均匀涂布于活化斜面,37℃培养12h,转接茄形瓶继续培养12h;
发酵培养:取适量无菌水将茄形瓶中菌体洗下,并将菌悬液接入含0.6L发酵培养基中的2L发酵罐中,开始发酵。发酵过程中控制pH稳定在7.0左右,温度维持在35℃,溶氧在25-35%之间;发酵开始后,即以5mL/h的流速流加补料1;当培养基中的底糖消耗完之后,开始流加补料2,通过补料2流加速率的调整,维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L;
斜面和茄形瓶培养基组成为:葡萄糖1g/L,蛋白胨10g/L,牛肉膏10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 5g/L,琼脂25g/L,其余为水;
发酵培养基组成为:葡萄糖10g/L,酵母浸粉0.5g/L,(NH4)2SO4 5g/L,K2HPO4 7g/L,MgSO4·7H2O 2g/L,柠檬酸钠2g/L,蛋氨酸2g/L,FeSO4·7H2O 100mg/L,MnSO4·7H2O 20mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12各3mg/L,VH 5m g/L,VB6 100mg/L,其余为水。
补料1的组成为:酵母粉10g/L,蛋氨酸15g/L,VB5 0.5g/L,VB6 1g/L,VB12 0.5g/L。
补料2的组成为:葡萄糖700g/L,蛋氨酸15g/L,葡萄糖和蛋氨酸分开灭菌后混合。
基因工程菌EGT11在2L发酵罐中培养60h后,麦角硫因的积累量达到7.2g/L,生产强度为0.12g/L/h,未有其它氨基酸和有机酸等副产物的明显累积,发酵过程曲线见附图1。
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何本领域技术人员,在不脱离本发明的精神和原理的情况下,可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。
Claims (7)
1.一种生产麦角硫因的基因工程菌,其特征在于:所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主,异源过表达Microcoleus sp.PCC 7113来源的egtD基因,Methylobacteriumpseudosasicola来源的egtB基因,Neurospora crassa来源的egt2基因,核苷酸序列如SEQID No.4所示的ATP转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisG*;并且过表达hisDBCHAFI基因簇,丝氨酸转乙酰酶突变体CysE(M201R)编码基因,磷酸甘油酸脱氢酶酶突变体SerA(H344A/N364A)编码基因,腺苷蛋氨酸合酶突变体MetK(I303V)编码基因;并且不表达色氨酸酶基因tnaA。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于:所述基因egtD基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述egtB基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述egt2基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述ATP转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisG*连接有启动子Ptrc;和/或
所述丝氨酸转乙酰酶突变体CysE(M201R)编码基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述磷酸甘油酸脱氢酶酶突变体SerA(H344A/N364A)编码基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述腺苷蛋氨酸合酶突变体MetK(I303V)编码基因连接有启动子Ptrc。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于:所述宿主是E coli MG1655、EcoliW3110、E coli BL21或E.coli BW25113其中一种。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌,其特征在于:所述宿主是E coli MG1655。
5.权利要求1-4任一项所述基因工程菌的构建方法,包括:将Microcoleus sp.PCC7113来源的egtD基因,Methylobacterium pseudosasicola来源的egtB基因和Neurosporacrassa来源的egt2基因分别整合在大肠杆菌基因组中,并由启动子Ptrc控制其表达;
将核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的ATP转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisG*整合在大肠杆菌基因组中,并由启动子Ptrc控制其表达;并在基因组中双拷贝大肠杆菌自身hisDBCHAFI基因簇,并由启动子Ptrc控制其表达;
将丝氨酸转乙酰酶突变体CysE(M201R)编码基因和磷酸甘油酸脱氢酶酶突变体SerA(H344A/N364A)编码基因分别整合在大肠杆菌基因组中,并由启动子Ptrc控制其表达;
敲除色氨酸酶编码基因tnaA;
将大肠杆菌来源的腺苷蛋氨酸合酶突变体MetK(I303V)的编码基因整合在大肠杆菌基因组中,并由启动子Ptrc控制其表达。
6.权利要求1-4任一项所述基因工程菌在发酵生产麦角硫因中的应用。
7.利用权利要求1-4任一项所述基因工程菌生产麦角硫因的方法,包括:在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产麦角硫因;以及,从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述麦角硫因。
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PB01 | Publication | ||
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