CN117778284A - 一种高产乳糖-n-新四糖的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及微生物基因工程技术领域，尤其是涉及一种高产乳糖‑N‑新四糖的工程菌及其构建方法和应用。本申请提供了一种高产乳糖‑N‑新四糖的工程菌，所述工程菌过表达乳糖‑N‑新四糖合成限速酶以及编码外源糖流出转运蛋白CmSET。本申请提供了一种高产乳糖‑N‑新四糖的工程菌，在大肠杆菌的基因组中整合表达了外源糖流出转运蛋白CmSET，并替换了LNnT合成限速酶的天然启动子为强启动子实现LNnT合成限速酶的过表达，能够促进LNnT合成的同时使LNnT能够快速、高效排出胞外，从而提高了LNnT的产量；本申请构建的重组大肠杆菌在5L罐最高LNnT产量90.45g/L，效果十分显著，具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本申请涉及微生物基因工程技术领域，尤其是涉及一种高产乳糖-N-新四糖的工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
乳糖-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose，LNnT)是人乳寡糖中重要的成分之一，具有增强人体免疫力，调节肠道菌群和促进细胞成熟等重要的生物学功能。已被欧洲食品安全局(EFSA)、欧盟(EU)和美国食品药品管理局(FDA)批准可以作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中。目前，LNnT的商业化生产主要包括化学合成和生物合成两种方法，其中生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料，且以较低的环境代价获得高经济产出，因此具有更为广阔的应用前景。
目前LNnT的微生物合成产量仍然较低，无法满足大批量工业生产的需求。根据前期研究发现，质粒型菌株合成LNnT会出现质粒丢失现象，无法稳定高效合成LNnT，且LNnT合成的限速因素没有确定，另外，LNTⅡ的过多残留会影响LNnT的产物纯化，获得的LNnT产量还较低，因此急需一种能够提高LNnT产量的工程菌。
发明内容
本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种高产乳糖-N-新四糖的工程菌及其构建方法和应用。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
第一方面，本申请提供了一种高产乳糖-N-新四糖的工程菌，所述工程菌过表达乳糖-N-新四糖合成限速酶以及编码外源糖流出转运蛋白CmSET；所述乳糖-N-新四糖合成限速酶为pgm、galU、galE、glmS和glmM中的至少一种。
本申请在大肠杆菌的基因组中整合表达了外源糖流出转运蛋白CmSET，并替换了LNnT合成限速酶的天然启动子为强启动子实现LNnT合成限速酶的过表达，能够促进LNnT合成的同时使LNnT能够快速、高效排出胞外，从而提高了LNnT的产量。
本申请通过筛选发现外源糖流出转运蛋白CmSET插入至工程菌的基因组中能够提高LNnT转运至胞外从而提高LNnT的产量，通过实验证明若是不整合CmSET直接将LNnT合成限速酶进行过表达，所得到的工程菌LNnT产量没有显著提升，这说明CmSET的插入能够促进LNnT外排从而提高LNnT产量。
本申请在实验过程中分别对LNnT合成路径中的基因pgm、galU、galE、glmS、glmM和glmU的天然启动子替换为强启动子构建上述单个基因的过表达菌株，将工程菌进行分批补料发酵实验可得pgm、galU、galE、glmS和glmM的过表达均能够提高LNnT的产量。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述乳糖-N-新四糖合成限速酶pgm编码基因如SEQ ID NO.1所示；
所述乳糖-N-新四糖合成限速酶galU编码基因如SEQ ID NO.2所示；
所述乳糖-N-新四糖合成限速酶galE编码基因如SEQ ID NO.3所示；
所述乳糖-N-新四糖合成限速酶glmS编码基因如SEQ ID NO.4所示；
所述乳糖-N-新四糖合成限速酶glmM编码基因如SEQ ID NO.5所示；
所述外源糖流出转运蛋白CmSET编码基因如SEQ ID NO.6所示。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述乳糖-N-新四糖合成限速酶为galU、galE和glmM中的至少一种。在实验过程中发现过表达galU、galE和glmM能够大幅度提高LNnT产量。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述工程菌以大肠杆菌B13AET3为底盘菌株通过将外源糖流出转运蛋白CmSET插入基因组中、以及将乳糖-N-新四糖合成限速酶编码基因的天然启动子替换为强启动子制备得到。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述强启动子为T7启动子、CaMV启动子、SV40启动子和SFFV启动子中的至少一种。强启动子的加入能够提高对应基因的表达量，从而实现该基因的过表达。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述强启动子为T7启动子。
第二方面，本申请提供了上述工程菌的构建方法，包括以下步骤：
S1、利用基因编辑技术在大肠杆菌B13AET3的hlyE位点中插入外源糖流出转运蛋白CmSET，得到工程菌B13AET3C；
S2、将步骤S1所得工程菌B13AET3C中的乳糖-N-新四糖合成限速酶编码基因的天然启动子替换为强启动子，得到高产乳糖-N-新四糖的工程菌；所述乳糖-N-新四糖合成限速酶编码基因为pgm、galU、galE、glmS和glmM中的至少一种。
本申请利用基因编辑技术将插入外源糖流出转运蛋白CmSET的编码基因插入大肠杆菌B13AET3基因组的hlyE位点中，hlyE是大肠杆菌B13AET3的保守基因之一，具有较好的遗传稳定性，CmSET插入hlyE中能够避免细菌传代过程中质粒丢失导致插入的CmSET随之丢失的现象，能够大大提高CmSET的遗传稳定性。
作为本申请所述构建方法的优选实施方式，所述大肠杆菌B13AET3主要由以下步骤制备得到：
A1、通过基因编辑技术敲除大肠杆菌BL21star(DE3)的β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因ushA、葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsA和可拉酸代谢基因wcaC，将galM替换为galETKM基因簇，得到菌株B13；
A2、将含有T7启动子的lgtA和galE的表达盒整合至步骤A1所得菌株B13中，得到菌株B13AE；
A3、将含有T7启动子的β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT的表达盒整合至步骤A2所得菌株B13AE的nagB位点中，得到菌株B13AET；
A4、在多拷贝整合质粒pSPIN-VUQBC上转座β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT得到3个β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT拷贝数的重组质粒，将重组质粒转入步骤A3所得菌株B13AET中，得到能够获得3个β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT拷贝数的菌株B13AET3；所述多拷贝整合质粒pSPIN-VUQBC含有yjiV、ydeU、intQ、caiB和wzxC编码基因。
本申请通过在大肠杆菌基因组中整合表达了来源于Neisseria meningitidisMC58的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA、来自大肠杆菌K12 MG1655的UDP-葡萄糖4差向异构酶GalE、来自Helicobacter pylori的β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT，所构建的工程菌B13AET能够利用乳糖在胞内合成LNnT。LNnT在胞内的生物合成过程如下：胞外乳糖被β-半乳糖苷通透酶LacY转运至胞内，然后和胞内UDP-N-乙酰氨基葡萄糖在异源表达的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶LgtA催化下生成LNT II，LNT II和UDP-半乳糖继续被异源表达的β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB催化生成LNnT。本申请还对工程菌B13AET进行基因编辑技术加强了β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT的拷贝数进一步提高LNnT产量。
第三方面，本申请提供了上述工程菌在生产乳糖-N-新四糖中的应用。
第四方面，本申请提供了一种乳糖-N-新四糖的生产方法，主要由上述工程菌通过补料分批发酵得到。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
本申请提供了一种高产乳糖-N-新四糖的工程菌，在大肠杆菌的基因组中整合表达了外源糖流出转运蛋白CmSET，并替换了LNnT合成限速酶的天然启动子为强启动子实现LNnT合成限速酶的过表达，能够促进LNnT合成的同时使LNnT能够快速、高效排出胞外，从而提高了LNnT的产量；本申请构建的重组大肠杆菌在5L罐最高LNnT产量90.45g/L，效果十分显著，具有较高的应用价值。
具体实施方式
为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在以下实施例中，所采用的基因信息如表1所示。
表1下述实施例中所采用的基因及其信息
下述实施例、对比例中，除特别说明外，所采用的质粒转入感受态细胞方法均为化学转化；所使用的抗性平板为卡那霉素抗性平板；所筛选得到的阳性转化子均经过PCR检测以及克隆片段测序进行鉴定。
下述实施例、对比例中，出特别说明外，所述克隆均指采用非连接酶依赖型的单片段一步法克隆试剂盒进行克隆，按照试剂盒说明书进行操作，非连接酶依赖型的单片段一步法克隆试剂盒由南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供，货号为C112-02。
微量元素溶液主要由25g/L FeCl3·6H2O、2g/L CaCl2·2H2O、2.0g/L ZnCl2、1.9g/L CuSO4·5H2O、0.42g/L MnCl·H2O、2g/L Na2B4O7·10H2O、2g/L Na2MoO4·2H2O组成。
分批补料发酵实验中采用的发酵培养基中包含10g/L初始甘油、4.0g/L(NH4)2SO4、9.2g/L K2HPO4、8.2g/L KH2PO4、0.3g/L柠檬酸、6.0g/L胰蛋白胨、2.0g/L酵母提取物、10mg/L硫胺素、2.0g/L MgSO4·7H2O、0.02g/L CaCl2和10mL/L微量元素溶液。
分批补料发酵实验中采用的进料溶液包括800g/L碳源和5g/L MgSO4·7H2O，所述碳源为葡萄糖和甘油，葡萄糖和甘油的质量比为葡萄糖：甘油＝4:6。
pEcCas载体、pSPIN质粒、pETDuet-1质粒、pBS-HpgalT质粒和pEcgRNA质粒均由addgene提供。
实施例1
本实施例提供了高产乳糖-N-新四糖的底盘菌株B13AET3C及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
1.1利用改良的CRISPR-Cas9技术将lacZ、ugd、ushA、agp、wcaJ、otsA和wcaC基因敲除，galM基因替换为galETKM基因簇，得到菌株B13；所采用的敲除载体为含有Cas9和λ-Red重组酶的pEcCas载体，使用包含sgRNA序列和N20特异序列的pEcgRNA进行靶向基因编辑；
1.2将lacA-N32特异性序列克隆到pSPIN质粒中，得到pSPIN-lacA(N32)质粒，将lgtA-galE的表达盒片段克隆至pSPIN-lacA(N32)质粒中，得到pSPIN-lacA(N32)-lgtA-galE质粒，转化至步骤1.1所得菌株B13中，通过抗性平板筛选得到阳性转化子，所得阳性转化子去除质粒后得到菌株B13AE；
1.3将nagB特异性序列克隆到pSPIN质粒中，得到pSPIN-nagB质粒，将含有T7启动子和hpgalT的表达盒片段克隆至pSPIN-nagB质粒中，得到pSPIN-nagB-T7-hpgalT质粒，转化至步骤1.2所得菌株B13AE中，通过抗性平板筛选得到阳性转化子，所得阳性转化子去除质粒后得到菌株B13AET；
1.4将yjiV、ydeU、intQ、caiB、wzxC的表达盒片段克隆至pSPIN质粒中，得到多拷贝整合pSPIN-VUQBC质粒，将hpgalT表达盒片段插入pSPIN-VUQBC质粒中并转入步骤1.3所得菌株B13AET中，通过抗性平板筛选得到阳性转化子，所得阳性转化子去除质粒后得到菌株B13AET3；
上述步骤所采用的引物序列见表2。
表2构建工程菌B13AET3所采用的引物
实施例2
本实施例提供了一种高产乳糖-N-新四糖工程菌及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
2.1将hylE-N32特异性序列克隆至pSPIN质粒中，得到pSPIN-hlyE(N32)质粒，将含有CmSET的表达盒片段克隆到pSPIN-hlyE(N32)，得到pSPIN-hlyE(N32)-CmSET质粒，将pSPIN-hlyE(N32)-CmSET质粒转入实施例1所得菌株B13AET3中，通过抗性平板筛选得到阳性转化子，所得阳性转化子去除质粒后得到菌株B13AET3C；
2.2以pBS-HpgalT质粒作为模板通过PCR扩增得到含有T7启动子的同源臂，使用T4DNA连接酶将pgm-N20克隆到质粒pEcgRNA中，得到含有pgm靶向序列的pEcgRNA-pgm质粒；
2.3将步骤2.2所得pEcgRNA-pgm质粒和含有T7启动子的同源臂共同转化至实施例1所得菌株B13AET3C中，得到菌株B13AET3C01。
上述步骤中所采用的引物、同源臂见表3。
表3高产LNnT工程菌构建方法中所采用的引物
实施例3-6
实施例3-6分别提供了一种高产乳糖-N-新四糖工程菌及其构建方法，所述构建方法与实施例2相似，不同之处如下：
实施例3中步骤2.2的克隆片段为galU-N20，所得菌株命名为菌株B13AET3C02；
实施例4中步骤2.2的克隆片段为galE-N20，所得菌株命名为菌株B13AET3C03；
实施例5中步骤2.2的克隆片段为glmS-N20，所得菌株命名为菌株B13AET3C04；
实施例6中步骤2.2的克隆片段为glmM-N20，所得菌株命名为菌株B13AET3C05；
其余步骤及参数条件不变；
上述实施例中所采用的引物、同源臂见表3。
实施例7
本实施例提供了一种高产乳糖-N-新四糖工程菌及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
7.1以pBS-HpgalT质粒作为模板通过PCR扩增得到含有T7启动子的同源臂，使用T4DNA连接酶将galE-N20克隆到质粒pEcgRNA中，得到含有galU靶向序列的pEcgRNA-galE质粒；所采用的引物、同源臂与实施例3的相同；
7.2将步骤7.1所得pEcgRNA-galE质粒和含有T7启动子的同源臂共同转化至实施例3所得菌株B13AET3C02中，得到菌株B13AET3C07。
实施例8
本实施例提供了一种高产乳糖-N-新四糖工程菌及其构建方法，所述构建方法与实施例7相似，不同之处为步骤7.1的克隆片段为glmM-N20，所得菌株命名为菌株B13AET3C08，所采用的引物、同源臂与实施例6的相同。
实施例9
本实施例提供了一种高产乳糖-N-新四糖工程菌及其构建方法，所述构建方法与实施例7相似，不同之处为步骤7.1的克隆片段为glmM-N20，步骤7.2的转化菌株为B13AET3C03，所得菌株命名为菌株B13AET3C09，所采用的引物、同源臂与实施例6的相同。
实施例10
本实施例提供了一种高产乳糖-N-新四糖工程菌及其构建方法，所述构建方法与实施例5相似，不同之处为步骤5.1的克隆片段为glmM-N20，步骤7.2的转化菌株为B13AET3C07，所得菌株命名为菌株B13AET3C10，所采用的引物、同源臂与实施例6的相同。
对比例1
本对比例提供了一种生产乳糖-N-新四糖工程菌及其构建方法，所述构建方法与实施例2的构建方法相似，不同之处为步骤2.2的克隆片段为glmU-N20，所得菌株命名为菌株B13AET3C06，所采用的引物、同源臂见表3。
对比例2-7
本对比例分别提供了一组生产乳糖-N-新四糖工程菌及其构建方法，所述工程菌为天然启动子替换为T7启动子：
对比例2中天然启动子替换为T7启动子的基因为pgm，所得菌株命名为工程菌B13AET301；
对比例3中天然启动子替换为T7启动子的基因为galU，所得菌株命名为工程菌B13AET302；
对比例4中天然启动子替换为T7启动子的基因为galE，所得菌株命名为工程菌B13AET303；
对比例5中天然启动子替换为T7启动子的基因为glmS，所得菌株命名为工程菌B13AET304；
对比例6中天然启动子替换为T7启动子的基因为glmM，所得菌株命名为工程菌B13AET305；
对比例7中天然启动子替换为T7启动子的基因为glmU，所得菌株命名为工程菌B13AET306；
构建方法与实施例2的构建方法相似，不同之处为步骤2.1中不在B13AET3的hylE位点插入CmSET，直接采用B13AET3作为转化菌株进行步骤2.2，其余步骤及参数不变，所采用的引物及同源臂与表3中对应基因的相同。
效果例
一、将实施例1-8、对比例1-9的工程菌进行分批补料发酵实验，并通过高效液相色谱检测发酵液中的LNnT和LNTⅡ的产量。
1、分批补料发酵实验
(1)将工程菌在含有150mL LB培养基的1L摇瓶中培养6h，得到种子液；
(2)将150mL步骤(1)所得种子液转入含有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中，自动加入28％(v/v)NH4OH将pH调节至6.8，通过自动控制搅拌速度将溶解氧维持在30-50％，培养温度为37℃，通气速率为2VVM，转速为900rpm；
(3)当发酵培养基中的初始甘油完全耗尽后，以4g/L/h的恒定速率向发酵罐中加入进料溶液，发酵温度调节为29.5℃，发酵4h；
(4)加入异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为0.2mM和70g乳糖，培养12h后再补充70g乳糖使发酵罐中的乳糖含量维持在28g/L以上，继续培养66-78h，得到发酵液。
2、发酵液的后处理及高效液相色谱检测
取发酵液沸水浴5min以杀灭菌株，然后在17800g下离心5min，所得上清液使用0.22μm的过滤器过滤，所得滤液用于检测LNnT和LNTⅡ。
使用Xtimate NH2色谱柱、高效液相色谱仪(LC-16，日本岛津)检测待测样品中的LNnT和LNTⅡ，按照外标法计算待测样品中的LNnT和LNTⅡ含量。色谱条件为流动相70％v/v乙腈和30％v/v水，流速1mL/min，柱温40℃。
取0-2.0g/L梯度浓度的LNnT标准品，以LNnT浓度为横坐标，液相色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线；LNTⅡ标准曲线按照LNnT的方法绘制。
将计算得到不同发酵液中LNnT和LNTⅡ浓度换算为5L发酵罐发酵所得产量，结果见表4。
表4不同工程菌的LNnT和LNTⅡ产量计算结果
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如表1所示，对比例2-7与实施例2-10，LNnT和LNTⅡ产量显著下降，表明未在溶血素编码基因hlyE中插入外源糖流出转运蛋白CmSET的工程菌株即使其过表达LNnT合成限速酶也不能提高LNnT和合成，这表明外源蛋白CmSET的加入能够促进LNnT从细胞内转运至胞外从而提高LNnT的产量。
对比例1与实施例2的B13AET3C相比，LNnT产量略有提升，但是提高幅度不大，这说明pgm、galU、galE、glmS、glmM和glmU中的galU、galE和glmU对细胞合成LNnT的影响较大，确定了galU、galE和glmU是LNnT合成的限速酶编码基因，因此将galU、galE和glmU的天然启动子均替换为T7启动子，所得到的工程菌B13AET310的LNnT产量最高、LNTⅡ产量较低。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种高产乳糖-N-新四糖的工程菌，其特征在于，所述工程菌过表达乳糖-N-新四糖合成限速酶以及编码外源糖流出转运蛋白CmSET；所述乳糖-N-新四糖合成限速酶为pgm、galU、galE、glmS和glmM中的至少一种。
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述乳糖-N-新四糖合成限速酶pgm编码基因如SEQ ID NO.1所示；
所述乳糖-N-新四糖合成限速酶galU编码基因如SEQ ID NO.2所示；
所述乳糖-N-新四糖合成限速酶galE编码基因如SEQ ID NO.3所示；
所述乳糖-N-新四糖合成限速酶glmS编码基因如SEQ ID NO.4所示；
所述乳糖-N-新四糖合成限速酶glmM编码基因如SEQ ID NO.5所示；
所述外源糖流出转运蛋白CmSET编码基因如SEQ ID NO.6所示。
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述乳糖-N-新四糖合成限速酶为galU、galE和glmM中的至少一种。
4.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，以大肠杆菌B13AET3为底盘菌株通过将外源糖流出转运蛋白CmSET插入基因组中、以及将乳糖-N-新四糖合成限速酶编码基因的天然启动子替换为强启动子制备得到。
5.如权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述强启动子为T7启动子、CaMV启动子、SV40启动子和SFFV启动子中的至少一种。
6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述强启动子为T7启动子。
7.如权利要求1-6任一项所述工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、利用基因编辑技术在大肠杆菌B13AET3的hlyE位点中插入外源糖流出转运蛋白CmSET，得到工程菌B13AET3C；
S2、将步骤S1所得工程菌B13AET3C中的乳糖-N-新四糖合成限速酶编码基因的天然启动子替换为强启动子，得到高产乳糖-N-新四糖的工程菌；所述乳糖-N-新四糖合成限速酶编码基因为pgm、galU、galE、glmS和glmM中的至少一种。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌B13AET3主要由以下步骤制备得到：
A1、通过基因编辑技术敲除大肠杆菌BL21star(DE3)的β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因ushA、葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsA和可拉酸代谢基因wcaC，将galM替换为galETKM基因簇，得到菌株B13；
A2、将含有T7启动子的lgtA和galE的表达盒整合至步骤A1所得菌株B13中，得到菌株B13AE；
A3、将含有T7启动子的β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT的表达盒整合至步骤A2所得菌株B13AE的nagB位点中，得到菌株B13AET；
A4、在多拷贝整合质粒pSPIN-VUQBC上转座β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT得到3个β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT拷贝数的重组质粒，将重组质粒转入步骤A3所得菌株B13AET中，得到能够获得3个β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT拷贝数的菌株B13AET3；所述多拷贝整合质粒pSPIN-VUQBC含有yjiV、ydeU、intQ、caiB和wzxC编码基因。
9.如权利要求1-6任一项所述的工程菌在生产乳糖-N-新四糖中的应用。
10.一种乳糖-N-新四糖的生产方法，其特征在于，主要由权利要求1-6任一项所述的工程菌通过分批补料发酵得到。
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