CN117736955A - 一种整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents
一种整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117736955A CN117736955A CN202311795643.5A CN202311795643A CN117736955A CN 117736955 A CN117736955 A CN 117736955A CN 202311795643 A CN202311795643 A CN 202311795643A CN 117736955 A CN117736955 A CN 117736955A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- escherichia coli
- gene
- recombinant escherichia
- recombinant
- lactose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 62
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 6
- 108010046068 N-Acetyllactosamine Synthase Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102100021436 UDP-glucose 4-epimerase Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 101100264107 Escherichia coli (strain K12) wzxC gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101150117383 caiB gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101150073660 glmM gene Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 101100126176 Escherichia coli (strain K12) intQ gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101100266905 Escherichia coli (strain K12) ydeU gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101100160181 Escherichia coli (strain K12) yjiV gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101150002054 galE gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 101100515784 Bacillus subtilis (strain 168) nagZ gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100121991 Chlamydia pneumoniae glmM gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100156619 Escherichia coli (strain K12) wcaC gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100156625 Escherichia coli (strain K12) wcaJ gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100375693 Escherichia coli (strain K12) ybbD gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101710179023 Glucose-1-phosphatase Proteins 0.000 claims description 4
- 101150049837 PGM gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 claims description 4
- 101100157012 Thermoanaerobacterium saccharolyticum (strain DSM 8691 / JW/SL-YS485) xynB gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108030001662 UDP-glucose 6-dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 101150117187 glmS gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150111330 glmU gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150084612 gpmA gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150104722 gpmI gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 4
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150034999 otsA gene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- 108010020589 trehalose-6-phosphate synthase Proteins 0.000 claims description 4
- VAIOGRPEROWKJX-UHFFFAOYSA-N undecyl dihydrogen phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCOP(O)(O)=O VAIOGRPEROWKJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101150047507 ushA gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150110790 xylB gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100487753 Escherichia coli (strain K12) ybeQ gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100432422 Escherichia coli (strain K12) yjgX gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150041770 hlyE gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150070589 nagB gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 3
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 claims description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 101150054547 galM gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 10
- IEQCXFNWPAHHQR-UHFFFAOYSA-N lacto-N-neotetraose Natural products OCC1OC(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)C(NC(=O)C)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O IEQCXFNWPAHHQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 5
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 abstract description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 abstract description 2
- IEQCXFNWPAHHQR-YKLSGRGUSA-N beta-D-Gal-(1->4)-beta-D-GlcNAc-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-Glc Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H]([C@@H](O[C@@H]1CO)O[C@@H]1[C@H]([C@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@H](CO)[C@@H]1O)O)NC(=O)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O IEQCXFNWPAHHQR-YKLSGRGUSA-N 0.000 abstract 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- AXQLFFDZXPOFPO-UHFFFAOYSA-N UNPD216 Natural products O1C(CO)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(=O)C)C1OC(C1O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)OC1CO AXQLFFDZXPOFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- AXQLFFDZXPOFPO-FSGZUBPKSA-N beta-D-Gal-(1->3)-beta-D-GlcNAc-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-Glc Chemical compound O([C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]([C@H]1O)O[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O1)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)C)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]1CO AXQLFFDZXPOFPO-FSGZUBPKSA-N 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 2
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-glucosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 2
- LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N UNPD164450 Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(NC(=O)C)C1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AXQLFFDZXPOFPO-UNTPKZLMSA-N beta-D-Galp-(1->3)-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-Glcp Chemical compound O([C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]([C@H]1O)O[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O1)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)C)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO AXQLFFDZXPOFPO-UNTPKZLMSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- USIPEGYTBGEPJN-UHFFFAOYSA-N lacto-N-tetraose Natural products O1C(CO)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(=O)C)C1OC1C(O)C(CO)OC(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)C1O USIPEGYTBGEPJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940062780 lacto-n-neotetraose Drugs 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- RBMYDHMFFAVMMM-PLQWBNBWSA-N neolactotetraose Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H]([C@@H](O[C@@H]1CO)O[C@@H]1[C@H]([C@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@H](CO)[C@@H]1O)O)NC(=O)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RBMYDHMFFAVMMM-PLQWBNBWSA-N 0.000 description 2
- 101100325906 Bacillus subtilis (strain 168) ganA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010037637 E coli beta-galactoside permease Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101100111413 Thermoanaerobacter pseudethanolicus (strain ATCC 33223 / 39E) lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 235000021393 food security Nutrition 0.000 description 1
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150086432 lacA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- -1 nucleoside diphosphate Chemical class 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本申请涉及微生物基因工程技术领域,尤其是涉及一种整合表达低产乳糖‑N‑三糖且高产乳糖‑N‑新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。本申请在大肠杆菌的基因组中整合表达了β‑1,3‑N‑乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA、UDP‑葡萄糖4差向异构酶GalE和β‑1,4‑半乳糖基转移酶HpgalT,构成的重组大肠杆菌可以合成LNnT,LNnT产量较高。本申请优化LNnT合成的限速酶来高产LNnT的同时平衡LNTⅡ的生成,提高了LNTⅡ的胞内利用率,减少了LNTⅡ过多残留,避免了资源浪费。
Description
技术领域
本申请涉及微生物基因工程技术领域,尤其是涉及一种整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。
背景技术
乳糖-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose,LNnT)是人乳寡糖中重要的成分之一,具有增强人体免疫力,调节肠道菌群和促进细胞成熟等重要的生物学功能。已被欧洲食品安全局(EFSA)、欧盟(EU)和美国食品药品管理局(FDA)批准可以作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中。目前,LNnT的商业化生产主要包括化学合成和生物合成两种方法,其中生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料,且以较低的环境代价获得高经济产出,因此具有更为广阔的应用前景。
目前在微生物内LNnT的合成前体包括胞内自身合成的核苷酸UDP-GlcNAc、UDP-Gal以及外源添加的乳糖。其合成过程是,首先胞外乳糖被β-半乳糖苷通透酶LacY转运至胞内,然后和胞内UDP-GlcNAc在异源表达的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶LgtA催化下生成LNT II。LNT II和UDP-Gal继续被异源表达的β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB催化生成LNnT。但目前LNnT的微生物合成产量仍然较低,无法满足大批量工业生产的需求。根据前期研究发现,质粒型菌株合成LNnT会出现质粒丢失现象,无法稳定高效合成LNnT,且LNnT合成的限速因素没有确定,另外,LNTⅡ的过多残留会影响LNnT的产物纯化,获得的LNnT产量还较低。
发明内容
本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。
为实现上述目的,本申请采取的技术方案为:
第一方面,本申请提供了一种整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌,所述重组大肠杆菌过表达重组基因,所述重组基因包括β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE和β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT;
所述重组大肠杆菌中基因pgm、galU、galE、glmS、glmM、glmU中的启动子至少一种为强启动子T7。
在一些实施例中,β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA来源于Neisseriameningitidis MC58。UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE来自大肠杆菌K12 MG1655。β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT来自Helicobacter pylori。
本申请在大肠杆菌的基因组中整合表达了β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE和β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT,构成的重组大肠杆菌可以合成LNnT,LNnT产量较高。
本申请优化LNnT合成的限速酶等发酵优化条件来高产LNnT的同时平衡LNTⅡ的生成,提高了LNTⅡ的胞内利用率,减少了LNTⅡ过多残留,避免了资源浪费。
作为本申请所述整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式,所述重组大肠杆菌敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因ushA、葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsA和可拉酸代谢基因wcaC。
作为本申请所述整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式,所述重组大肠杆菌的基因组在galM位点整合有galETKM基因簇;所述重组大肠杆菌的基因组在nagB位点整合有β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT基因。
作为本申请所述整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式,所述β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT基因的插入位点包括yjiV、xylB、ydeU、intQ、caiB、wzxC、ybbD和nupG中的至少一个。
本申请在yjiV、xylB、ydeU、intQ、caiB、wzxC、ybbD和nupG等不同位点整合表达β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT基因,获得多拷贝数的产LNnT重组大肠杆菌菌株,进一步提高了LNnT的产量。
作为本申请所述整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式,所述β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT含有2~6个拷贝数,优选地,所述β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT含有3个拷贝数。
所述重组大肠杆菌的基因组中β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT含有多个拷贝数,可以更好地提高了LNnT的产量,其中β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT的拷贝数为3个时,提升LNnT产量最佳。
作为本申请所述整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式,所述重组大肠杆菌的基因组在hlyE位点整合有外源转运蛋白。
在重组大肠杆菌的基因组中插入表达LNnT从胞内到胞外的转运蛋白后,再次进行LNnT合成路径中的限速酶进行筛选工作,成功鉴定出限速酶并进行组合优化,进一步加强了LNnT合成,同时平衡LNTⅡ的生成。
作为本申请所述整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式,所述重组大肠杆菌的基因组在yjgX或ybeQ位点整合有lgtA基因。
第二方面,本申请提供了上述重组大肠杆菌的构建方法,包括以下步骤:
S1、构建所述重组基因的重组表达载体;
S2、采用CRISPER方法敲除所述β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因ushA、葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsA和可拉酸代谢基因wcaC,得基因敲除大肠杆菌;
S3、将所述重组表达载体转化所述基因敲除大肠杆菌,得所述重组大肠杆菌。
第三方面,本申请提供了上述重组大肠杆菌在生产乳糖-N-三糖和乳糖-N-新四糖中的应用。
本申请的重组大肠杆菌生产乳糖-N-三糖的含量较少,且生产乳糖-N-新四糖的含量较高。
与现有技术相比,本申请具有以下有益效果:
本申请提供了一种无质粒的整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌,本申请通过β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT的拷贝数进一步提升了LNnT产量;将LNnT排除到胞外后成功鉴定了LNnT合成的限速酶并进行组合优化从而提高LNnT产量;本申请构建的重组大肠杆菌在5L罐最高LNnT产量90.45g/L,效果十分显著,具有较高的应用价值。
具体实施方式
为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明。
在以下实施例中,所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
在以下实施例中,β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA来源于Neisseriameningitidis MC58。UDP-葡萄糖4差向异构酶GalE来自大肠杆菌K12 MG1655。β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT来自Helicobacter pylori。
菌株B13(BL21star(DE3)ΔlacZΔgalM::galETKMΔugdΔushAΔagpΔwcaJΔotsAΔwcaC)来源于Metabolic engineering of Escherichia coli for high-levelproduction of lacto-N-neotetraose and lacto-N-tetraose。
实施例1、LNnT生物合成重组大肠杆菌的构建
根据pRSF-AE设计引物,PCR获得含有T7启动子的lgtA和galE的表达盒整合(使用INTEGRATE系统用于基因组整合)到菌株B13(BL21star(DE3)ΔlacZΔgalM::galETKMΔugdΔushAΔagpΔwcaJΔotsAΔwcaC)基因组的lacA位点中获得菌株B13AE,具体为:首先使用T4 DNA连接酶克隆了含有lacA-N32特异性序列的pSPIN质粒,获得pSPIN-lacA。随后,将含有lgtA-galE的表达盒片段克隆到pSPIN-lacA中,获得质粒pSPIN-lacA-lgtA-galE,转化到B13中,在卡那霉素的LB琼脂上进行阳性转化子选择。对正确测序的细菌克隆进行传代,去除质粒,得到菌株B13AE。
根据pET-HpgalT设计引物,PCR获得含有T7启动子的hpgalT的表达盒采用上述相似方法整合(使用INTEGRATE系统用于基因组整合)到B13AE基因组的nagB位点获得菌株B13AET,用来合成LNnT。(pRSF-AE和pET-HpgalT来自文献Metabolic engineering ofEscherichia coli for high-level production of lacto-N-neotetraose and lacto-N-tetraose)。
pRSF-AE设计引物和pET-HpgalT设计引物具体信息如表1所示。
表1
将上述获得的菌株B13AET进行常规摇瓶发酵实验,菌株B13AET在90h产量为0.78g/L LNnT和2.95g/L LNTⅡ。
将上述获得的菌株B13AET进行5L罐分批补料发酵实验,具体实验步骤包括:
在5L生物反应器中进行饲料批量发酵,预先加入2.5L定义培养基,其中包含10g/L初始甘油、4.0g/L(NH4)2SO4、9.2g/L K2HPO4、8.2g/L KH2PO4、0.3g/L柠檬酸、6.0g/L胰蛋白胨、2.0g/L酵母提取物、10mg/L硫胺素、2.0g/LMgSO4·7H2O、0.02g/L CaCl2和10mL/L微量元素溶液。微量元素溶液与摇瓶中的相同。种子培养物的制备方法是将0.15mL在含有150mLLB培养基的1L摇瓶中培养6小时的培养液转移到生物反应器中。在整个培养过程中,通过自动加入28%(v/v)NH4OH将发酵液的pH值调至6.8,并通过自动控制搅拌速度将溶解氧维持在30%至50%之间。在预发酵阶段,培养液的温度保持在37℃,通气速率为2VVM,转速为900转/分。当初始甘油完全耗尽后,以4克/升/小时的恒定速率向生物反应器中加入含有800克/升碳源(葡萄糖与甘油的质量比为4:6)和5克/升MgSO4·7H2O的进料溶液。温度同时升至29.5℃。再培养4小时后,向培养物中加入异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(最终浓度为0.2mM)和70克乳糖。再培养12小时后,加入70克乳糖。
菌株B13AET在66h产量为23.55g/L LNnT和20.88g/L LNTⅡ。
实施例2、多拷贝HpgalT的重组大肠杆菌
在菌株B13AET的基础上,选取yjiV,xylB,ydeU,intQ,caiB,wzxC,ybbD和nupG这八个不同的位点插入单个hpgalT,获得菌株B13AET2V、B13AET2X、B13AET2U、B13AET2Q、B13AET2B、B13AET2C、B13AET2D、B13AET2G;
1、对上述菌株进行常规的摇瓶发酵实验,其中分别在yjiV,ydeU,intQ,caiB和wzxC位点插入hpgalT的菌株产生1.17g/L-1.22g/L的LNnT。
2、在菌株B13AET的基础上,选取在yjiV,ydeU,intQ,caiB和wzxC这5个位点插入多个hpgalT,构建多拷贝整合质粒pSPIN-VUQBC。
3、在B13AET菌株的基础上使用pSPIN-VUQBC进行转座,分别获得2、3、4、5、6个HpgalT拷贝数的菌株B13AET2V、B13AET3、B13AET4、B13AET5、B13AET6。
4、将上述菌株B13AET2V、B13AET3、B13AET4、B13AET5、B13AET6进行摇瓶发酵实验,有3个HpgalT拷贝的B13AET3表现出最高的LNnT产量,在摇瓶培养中达到1.55g/L。
5、对菌株B13AET3进行5L罐分批补料发酵实验,菌株在66h产量为39.48g/L LNnT和30.25g/L LNTⅡ。
实施例3、LNnT合成过程中限速酶的鉴定
1、在菌株B13AET3的基础上,分别对LNnT合成路径中的基因pgm、galU、galE、glmS、glmM、glmU的天然启动子替换为强启动子T7,获得菌株B13AET301、B13AET302、B13AET303、B13AET304、B13AET305、B13AET306。
2、对菌株B13AET301、B13AET302、B13AET303、B13AET304、B13AET305、B13AET306进行5L罐分批补料发酵实验,除了B13AET306菌株产量有所下降,其他菌株LNnT也未见明显提升,未探究出影响LNnT合成的关键限速酶。
3、在菌株B13AET3的基础上,对LNnT合成路径中的基因galU、galE、glmM的天然启动子替换为强启动子T7,获得菌株B13AET307。LNnT也未见明显提升,未探究出影响LNnT合成的关键限速酶。
实施例4、LNnT转运蛋白的基础上再次进行限速酶的鉴定
1、在菌株B13AET3的基础上,在基因组中的hlyE位点插入外源转运蛋白CmSET(WP_024910347.1)获得菌株B13AET3C。
2、对菌株B13AET3C进行5L罐分批补料发酵实验,菌株B13AET3C在78h产量为58.65g/L LNnT和18.13g/L LNTⅡ。
3、在菌株B13AET3C的基础上,分别对LNnT合成路径中的基因pgm、galU、galE、glmS、glmM、glmU的天然启动子替换为强启动子T7,获得菌株B13AET3C01、B13AET3C02、B13AET3C03、B13AET3C04、B13AET3C05、B13AET3C06。
4、对菌株B13AET3C01、B13AET3C02、B13AET3C03、B13AET3C04、B13AET3C05、B13AET3C06进行5L罐分批补料发酵实验。
B13AET3C01菌株在78h产量为62.12g/L LNnT和13.22g/L LNTⅡ;
B13AET3C02菌株在78h产量为72.28g/L LNnT和15.9g/L LNTⅡ;
B13AET3C03菌株在78h产量为74.52g/L LNnT和14.59g/L LNTⅡ;
B13AET3C04菌株在78h产量为63.43g/L LNnT和17.88g/L LNTⅡ;
B13AET3C05菌株在78h产量为70.12g/L LNnT和22.56g/L LNTⅡ;
B13AET3C06菌株在78h产量为18.67g/L LNnT和14.65g/L LNTⅡ。
本申请成功鉴定出基因galU、galE、glmM对LNnT合成影响较大,为LNnT合成的限速酶基因。
5、为了进一步加强了LNnT合成,对限速酶进行组合优化。在菌株B13AET3C02的基础上,分别对galE、glmM的天然启动子替换为强启动子T7,获得菌株B13AET3C07和B13AET3C08。
在菌株B13AET3C03和菌株B13AET3C07的基础上,分别对glmM的天然启动子替换为强启动子T7,获得菌株B13AET3C09和B13AET3C10。
6、对菌株B13AET3C07、B13AET3C08、B13AET3C09、B13AET3C10进行5L罐分批补料发酵实验,菌株B13AET3C07在78h产量为85.34g/L LNnT和8.22g/L LNTⅡ;菌株B13AET3C08在78h产量为73.13g/L LNnT和16.13g/L LNTⅡ;菌株B13AET3C09在78h产量为74.18g/L LNnT和18.56g/L LNTⅡ;菌株B13AET3C10在78h产量为90.45g/L LNnT和10.55g/L LNTⅡ。
实施例5、进一步优化关键转移酶的表达强化LNnT的生成
在上述菌株B13AET3C10的yjgX位点插入lgtA获得菌株B13A2ET3C10,在菌株B13A2ET3C10的ybeQ位点插入lgtA获得菌株B13A3ET3C10。在菌株B13A2ET3C10的caiB位点插入hpgalT获得菌株B13A2ET4C10,在菌株B13A2ET4C10的wzxC位点插入hpgalT获得菌株B13A2ET5C10。在菌株B13A3ET3C10的caiB位点插入hpgalT获得菌株B13A3ET4C10,在菌株B13A3ET4C10的wzxC位点插入hpgalT获得菌株B13A3ET5C10。
对B13AET3C10、B13A2ET3C10、B13A3ET3C10、B13A2ET4C10、B13A2ET5C10、B13A3ET4C10、B13A3ET5C10菌株进行5L罐分批补料发酵实验,在90h时,B13A2ET3C10产量为105.37g/L LNnT和17.12g/L,B13A3ET3C10产量为110.93g/L LNnT和25.61g/L,B13A2ET4C10产量为126.88g/L LNnT和3.92g/L,B13A2ET5C10产量为116.93g/L LNnT和12.37g/L,B13A3ET4C10产量为114.28g/L LNnT和18.28g/L,B13A3ET5C10产量为120.39g/LLNnT和16.18g/L。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本申请技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌,其特征在于,所述重组大肠杆菌过表达重组基因,所述重组基因包括β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA、UDP-葡萄糖4差向异构酶GalE和β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT;
所述重组大肠杆菌中基因pgm、galU、galE、glmS、glmM、glmU中的启动子至少一种为强启动子T7。
2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述重组大肠杆菌敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因ushA、葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsA和可拉酸代谢基因wcaC。
3.如权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述重组大肠杆菌的基因组在galM位点整合有galETKM基因簇;所述重组大肠杆菌的基因组在nagB位点整合有β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT基因。
4.如权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT基因的插入位点包括yjiV、xylB、ydeU、intQ、caiB、wzxC、ybbD和nupG中的至少一个。
5.如权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT含有2~6个拷贝数。
6.如权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT含有3个拷贝数。
7.如权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述重组大肠杆菌的基因组在hlyE位点整合有外源转运蛋白。
8.如权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述重组大肠杆菌的基因组在yjgX或ybeQ位点整合有lgtA基因。
9.一种如权利要求1~8任一项所述的重组大肠杆菌的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、构建所述重组基因的重组表达载体;
S2、采用CRISPER方法敲除所述β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因ushA、葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsA和可拉酸代谢基因wcaC,得基因敲除大肠杆菌;
S3、将所述重组表达载体转化所述基因敲除大肠杆菌,得所述重组大肠杆菌。
10.如权利要求1~8任一项所述的重组大肠杆菌在生产乳糖-N-三糖和乳糖-N-新四糖中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311795643.5A CN117736955A (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 一种整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311795643.5A CN117736955A (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 一种整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117736955A true CN117736955A (zh) | 2024-03-22 |
Family
ID=90252538
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311795643.5A Pending CN117736955A (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 一种整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117736955A (zh) |
-
2023
- 2023-12-25 CN CN202311795643.5A patent/CN117736955A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112342176A (zh) | 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用 | |
CN109790559A (zh) | 改良的用于产生岩藻糖基化寡糖的方法 | |
CN114480240B (zh) | 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法 | |
CN104822839A (zh) | 用于产生单糖的方法 | |
CN114774343A (zh) | 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用 | |
US20240035057A1 (en) | Construction Method and Application of Microorganism Capable of Realizing High Production of Lacto-N-tetrose | |
CN112662604B (zh) | 一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法 | |
WO2022243312A1 (en) | IDENTIFICATION OF AN α-1,2-FUCOSYLTRANSFERASE FOR THE IN VIVO PRODUCTION OF PURE LNFP-I | |
CN117736955A (zh) | 一种整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 | |
CN116676243A (zh) | 产2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及其应用 | |
CN114806991B (zh) | 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法 | |
JP2024516207A (ja) | インベルターゼ/スクロースヒドロラーゼを発現する微生物株 | |
CN116333953A (zh) | 一种高产胞嘧啶核苷的基因工程菌及其应用 | |
US20200131538A1 (en) | Microorganism with stabilized copy number of functional dna sequence and associated methods | |
CN115851570A (zh) | 一种高产乳酰-n-新四糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用 | |
CN117778284A (zh) | 一种高产乳糖-n-新四糖的工程菌及其构建方法和应用 | |
KR102577779B1 (ko) | 배양 배지 조성 및 배양 방식 변화에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산성 증대 방법 | |
CN117736954A (zh) | 一种高效转运乳糖-n-新四糖的大肠杆菌及其构建方法和应用 | |
DK181442B1 (en) | Cells capable of producing one or more human milk oligosaccharides (hmos) comprising expression of an invertase, method comprising said cells for biosynthetic production and use of said cells for biosynthetic production; use of an invertase in a biosynthetic production | |
JP7331278B1 (ja) | 3’slのインビボ合成のための新規なシアリルトランスフェラーゼ | |
DK181497B1 (en) | ENHANCING FORMATION OF THE HMOS LNT AND/OR LNnT BY MODIFYING LACTOSE IMPORT IN THE CELL | |
CN117844883A (zh) | 一种促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法 | |
CN116731941A (zh) | 一种改善2′-岩藻糖基乳糖生产性能的自主动态调控方法 | |
CN116478894A (zh) | 一种提高唾液酸乳糖产量的基因工程菌及其生产方法 | |
CN117737028A (zh) | 一种β-1,3-半乳糖基转移酶突变体及利用该突变体制备乳糖-N-四糖的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |