CN115851570A - 一种高产乳酰-n-新四糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物基因工程技术领域，公开了一种高产乳酰‑N‑新四糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用。本发明的高产乳酰‑N‑新四糖的大肠杆菌工程菌株过表达重组基因，所述重组基因包括β‑1,3‑N‑乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA、UDP葡萄糖4差向异构酶基因galE、β1,4半乳糖基转移酶基因，通过质粒组合优化、蛋白标签共同表达、相关基因敲除以及基因组整合等手段从而提高LNnT产量。本发明选出大肠杆菌工程菌株在摇瓶发酵中LNnT的产量由0.67g/L提高至2.66g/L，5L罐发酵最高LNnT产量达17.26g/L。
Description
技术领域
本发明涉及微生物基因工程技术领域，具体涉及一种高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用。
背景技术
乳酰-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose，LNnT)是人乳寡糖中重要的成分之一，具有增强人体免疫力，调节肠道菌群和促进细胞成熟等重要的生物学功能，可以作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中。目前，LNnT的商业化生产主要包括化学合成和生物合成两种方法，其中生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料，且以较低的环境代价获得高经济产出，因此具有更为广阔的应用前景。
现有技术中，多采用在微生物内LNnT的合成前体包括胞内自身合成的核苷酸UDP-GlcNAc、UDP-Gal以及外源添加的乳糖。其合成过程是，首先胞外乳糖被β-半乳糖苷通透酶LacY转运至胞内，然后和胞内UDP-GlcNAc在异源表达的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶LgtA催化下生成LNTII。LNTII和UDP-Gal继续被异源表达的β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB催化生成LNnT。2002年，Bernard Priem等人首次在重组的Escherichia coli JM109中合成了LNnT及岩藻糖化的LNnT。该重组菌株敲除lacZ基因以及过度表达lgtA基因，在甘油为碳源的2-L罐上获得大约6g/L的LNTII。继续在此基础上过度表达lgtB基因，以葡萄糖为碳源，通过高细胞密度培养获得了超过5g/L的LNnT和乳糖-N-新六糖(LNnH)的混合物。该菌株JM109(pCWlgtA，pBBlgtB)不能在甘油培养基上生长，可能是由于两个lgtAB基因的过度表达引起的毒性问题，并通过用葡萄糖培养细胞以及在降低培养温度至28℃来克服。2019年，董晓敏等以Bacillussubtilis168菌株为初始宿主，通过共表达LacY、LgtA和LgtB构建了LNnT的从头合成途径。通过各种代谢调节最终菌株在摇瓶和3L生物反应器中LNnT的产量分别达到2.30g/L和5.41g/L。2022年，朱莺莺等筛选出一种高效的β 1,4半乳糖基转移酶，并通过强化前体UDP半乳糖的供应等手段在摇瓶和3L生物反应器中LNnT的产量分别达到0.91g/L和12.14g/L。然而，目前LNnT的微生物合成产量仍然较低，无法满足大批量工业生产的需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株，所述大肠杆菌工程菌株敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj、gdp-甘露糖甘露糖水解酶基因nudD；所述大肠杆菌工程菌株过表达重组基因，所述重组基因包括β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA、UDP葡萄糖4差向异构酶基因galE、β1,4半乳糖基转移酶基因；所述β 1,4半乳糖基转移酶基因为lgtB、lgtB-2、hpgalT-1、hpgalT-2、lex-1、lex-2、lex-3、lex-4、lex-5中的任意一种。
本发明筛选了不同来源的β1,4半乳糖基转移酶合成LNnT，并成功筛选出一种来源于Helicobacter pylori的β1,4半乳糖基转移酶可以高效的将LNTⅡ和UDP-半乳糖合成LNnT，显著提升了LNnT的产量。
作为本发明所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株的优选实施方式，所述重组基因的表达载体采用pBluescript II SK(+)、pCDFDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1中的至少一种。
本发明进一步使用不同拷贝数的载体pBluescript II SK(+)、pCDFDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1对β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA、UDP葡萄糖4差向异构酶GalE和β 1,4半乳糖基转移酶Hp-GalT进行质粒组合优化，获得一种组合进一步提高了LNnT的产量。
优选的，所述β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA和UDP葡萄糖4差向异构酶基因galE的表达载体为pRSFDuet-1。
优选的，所述β1,4半乳糖基转移酶基因hpgalT-1的表达载体为pETDuet-1。
作为本发明所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株的优选实施方式，所述β 1,4半乳糖基转移酶基因hpgalT-1的N端插入有融合标签；所述融合标签为MBP、SUMO、TrxA、Fh8、hisProp中的至少一种。
本发明进一步选取5个融合标签MBP、SUMO、TrxA、Fh8、hisProp对β-1,4-半乳糖基转移酶Hp-GalT进行共同表达，其中Fh8连接的β-1,4-半乳糖基转移酶Hp-GalT可以更好的提升LNnT的产量。
作为本发明所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株的优选实施方式，所述大肠杆菌工程菌株还敲除葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsA、UDP葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、生物膜PGA合成酶基因pgaCD、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB、UDP-N-乙酰氨基葡糖十一烷基磷酸N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶基因wecA、UDP-N-乙酰葡糖胺2-二聚体酶基因wecB、甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA、NADP+依赖性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf。
本发明进一步在基因组中敲除了葡萄糖-1-磷酸酶Agp、海藻糖-6-磷酸合成酶OtsA、UDP葡萄糖6-脱氢酶Ugd、生物膜PGA合成酶PgaCD、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶NagB、UDP-N-乙酰氨基葡糖十一烷基磷酸N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶WecA、UDP-N-乙酰葡糖胺2-二聚体酶WecB、甘露糖-6-磷酸异构酶ManA、NADP+依赖性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Zwf进一步加强了LNnT合成。
作为本发明所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株的优选实施方式，所述大肠杆菌工程菌株的基因组在galM位点整合有galETKM基因簇，在敲除的lacZ位点整合有lacZΔm15基因。
本发明进一步在大肠杆菌基因组中插入UDP葡萄糖4-差向酶GalE、半乳糖-1-磷酸尿苷基转移酶GalT、半乳糖激酶的GalK和半乳糖-1-差向异构酶GalM并回补缺陷型β 半乳糖苷酶LacZΔm15，使得UDP-半乳糖的积累增加从而LNnT的产量。
第二方面，本发明提供了所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建所述重组基因的重组表达载体；
(2)采用CRISPER方法敲除所述β-半乳糖苷酶基因lacZ、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj、gdp-甘露糖甘露糖水解酶基因nudD，得基因敲除大肠杆菌；
(3)将所述重组表达载体转染所述基因敲除大肠杆菌，发酵，得所述大肠杆菌工程菌株。
第三方面，本发明将所述大肠杆菌工程菌株在生产乳酰-N-新四糖中应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述生产包括发酵罐或摇瓶发酵培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明选出一种高效的来源于Helicobacter pylori的β1,4 半乳糖基转移酶所构建的工程菌可以更好的合成LNnT，并通过质粒组合优化、蛋白标签共同表达等手段进一步提升LNnT产量；更进一步的，通过部分相关基因敲除以及基因组整合加强了UDP-半乳糖的合成从而提高LNnT产量。本发明所构建的工程菌株在摇瓶发酵中LNnT的产量由0.67g/L提高至2.66g/L，5L罐发酵最高LNnT产量达17.26g/L。本发明效果十分显著，打破了LNnT的合成瓶颈，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为含有不同β1,4半乳糖基转移酶的工程大肠杆菌的LNnT和LNTII的产量统计图；
图2为含有不同组合质粒的工程大肠杆菌的LNnT和LNTII的产量统计图；
图3为含不同蛋白标签的工程大肠菌株的LNnT和LNTII的产量统计图；
图4为不同基因编辑的大肠杆菌的LNnT和LNTII的产量统计图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中采用高效液相色谱检测LNnT和LNTⅡ的产量。
实施例中摇瓶发酵的培养基为：30g/L甘油、12g/L葡萄糖、2g/L酵母粉、10g/L胰蛋白胨、14.3g/L Na2HPO4·12H2O、3.1g/L KH2PO4、2.0g/L NH4Cl、1.0g/L(NH4)2HPO4、1.7g/L柠檬酸、15mg/LCaCl2和2.2g/L C6H5Na·2H2O、2g/L MgSO4·7H2O、10mg/L维生素B1和10mL/L微量元素(25g/L FeCl3·6H2O、2g/L CaCl2·2H2O、2.0g/L ZnCl2、1.9g/LCuSO4·5H2O、0.42g/L MnCl·H2O、2g/L Na2B4O7·10H2O和2g/L Na2MoO4·2H2O)37℃培养，28℃、0.2mM IPTG诱导发酵。5L罐培养基同上。
实施例中质粒克隆引物对见表1。
表1质粒克隆引物对
实施例中基因编辑引物对见表2。
表2基因编辑引物对
实施例1：LNnT生物合成大肠杆菌菌株的构建
(1)选择来自Neisseria meningitidis MC58的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA(Genbank：NP_274923)和来自大肠杆菌K12 MG1655的UDP葡萄糖4差向异构酶GalE(Genbank：NP_415280.3)克隆到pCDFDuet-1后命名为pCDF-lgtA-galE，用来合成LNTⅡ，选择来自Neisseria meningitidis MC58的β 1,4半乳糖基转移酶lgtB(Genbank：CAX50884.1)克隆到pBluescript II SK(+)后命名为pBS-lgtB，用来合成LNnT。
(2)敲除大肠杆菌BL21(DE3)的β-半乳糖苷酶基因lacZ、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj、gdp-甘露糖甘露糖水解酶基因nudD，得菌株BL21(DE3)ΔLWD(BL21(DE3)ΔlacZΔwcajΔnudD)。
(3)将质粒pCDF-lgtA-galE和pBS-lgtB转化至实验室构建的菌株BL21(DE3)ΔLWD(BL21(DE3)ΔlacZΔwcajΔnudD)后命名为L1006。
对菌株L1006进行摇瓶发酵实验，菌株在48h产量为0.67g/L LNnT和3.3g/L LNTⅡ。
实施例2：筛选高效的β1,4半乳糖基转移酶合成LNnT
(1)选取不同来源的β1,4半乳糖基转移酶，从NCBI中获取基因序列，来源于Neisseria meningitidis 8013的lgtB-2(Genbank：CAX50884.1)、Helicobacter pylori的hpgalT-1(Genbank：BAA88524.1)、Helicobacter pylori 26695的hpgalT-2(Genbank：AAD07876.1)、Aggregatibacter aphrophilus W10433的lex-1(Genbank：AKU62975.1)、Aggregatibacter actinomycetemcomitans NUM4039的lex-2(Genbank：BAS48030.1)、Aggregatibacter aphrophilus W10433的lex-3(Genbank：AKU62973.1)、Aggregatibacteraphrophilus ATCC 19415的lex-4(Genbank：OBY55126.1)、Aggregatibacter aphrophilusNJ8700的lex-5(Genbank：ACS98560.1)，密码子优化后由公司合成，设计引物将上述基因克隆到pBluescript II SK(+)中，分别命名为pBS-lgtB-2、pBS-hpgalT-1、pBS-hpgalT-2、pBS-lex-1、pBS-lex-2、pBS-lex-3、pBS-lex-4、pBS-lex-5。
(2)将实施例1制备的质粒pCDF-lgtA-galE同上述质粒pBS-lgtB-2、pBS-hpgalT-1、pBS-hpgalT-2、pBS-lex-1、pBS-lex-2、pBS-lex-3、pBS-lex-4、pBS-lex-5分别转化到菌株BL21(DE3)ΔLWD中，分别命名为L1007、L1008、L1009、L1010、L1011、L1012、L1013、L1014。
对菌株L1006、L1007、L1008、L1009、L1010、L1011、L1012、L1013、L1014进行摇瓶发酵48h(见图1)，L1008产量最高为0.96g/L LNnT和1.92g/L LNTⅡ。确定来自Helicobacterpylori的hpgalT-1可以更高效的生产LNnT。
实施例3：质粒组合优化LNnT的合成
(1)使用具备不同拷贝数的载体pBluescript II SK(+)、pCDFDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1对β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA(Genbank：NP_274923)、UDP葡萄糖4差向异构酶GalE(Genbank：NP_415280.3)和β 1,4 半乳糖基转移酶Hp-GalT-1(Genbank：BAA88524.1)进行质粒组合优化，在pCDFDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1中克隆LgtA和GalE分别获得质粒pCDF-lgtA-galE、pET-lgtA-galE、pRSF-lgtA-galE，在pBluescript II SK(+)、pETDuet-1、pRSFDuet-1中克隆Hp-GalT-1分别获得质粒pBS-hpgalT1、pET-hpgalT1、pRSF-hpgalT1。
(2)将质粒组合pCDF-lgtA-galE+pET-hpgalT1、pCDF-lgtA-galE+pRSF-hpgalT1、pET-lgtA-galE+pRSF-hpgalT1、pRSF-lgtA-galE+pBS-hpgalT1、pRSF-lgtA-galE+pET-hpgalT1分别转化到菌株BL21(DE3)ΔLWD中，分别命名为L1015、L1016、L1017、L1018、L1019。
对菌株L1008、L1015、L1016、L1017、L1018、L1019进行摇瓶发酵48h(见图2)，L1019产量最高为1.51g/L LNnT和0.49g/L LNTⅡ。确定质粒组合pRSF-lgtA-galE+pET-hpgalT1可以更高效的生产LNnT。
实施例4：筛选高效的β 1,4半乳糖基转移酶合成LNnT
(1)将融合标签MBP、SUMO、TrxA、Fh8、hisProp分别克隆入实施例3中所制备pET-hpgalT1载体中hpgalT1基因的N端表达，分别获得质粒pET-MBP-hpgalT1、pET-SUMO-hpgalT1、pET-TrxA-hpgalT1、pET-Fh8-hpgalT1、pET-hisProp-hpgalT1。
(2)将实施例3所制备的质粒pRSF-lgtA-galE和上述质粒分别转化入菌株BL21(DE3)ΔLWD中，分别命名为L1020、L1021、L1022、L1023、L1024。
对菌株L1019、L1020、L1021、L1022、L1023、L1024进行摇瓶发酵48h(见图3)，L1023产量最高为1.97g/L LNnT和1.09g/L LNTⅡ。确定Fh8融合标签可以更好的促进β 1,4半乳糖基转移酶Hp-GalT-1将LNTⅡ转化为LNnT，获得更高的LNnT产量。
实施例5：基因敲除菌株的构建及其生产LNnT
(1)采用CRISPER方法敲除目的基因，设计引物将葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsA、UDP葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、生物膜PGA合成酶基因pgaCD、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB、UDP-N-乙酰氨基葡糖十一烷基磷酸N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶基因wecA、UDP-N-乙酰葡糖胺2-二聚体酶基因wecB、甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA、NADP+依赖性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf敲除，获得菌株BL21(DE3)ΔLWDΔagpΔotsAΔugdΔpgaCDΔnagBΔwecAΔwecBΔmanAΔzwf，将其命名为BL21(DE3)ΔLWD10。
(2)在BL21(DE3)ΔLWD10中转化实施例3中所制备的发酵质粒pRSF-lgtA-galE和实施例4中所制备的pET-Fh8-hpgalT1，获得菌株L10025。
对菌株L1025进行摇瓶发酵48h(见图4)，L1025产量为2.3g/L LNnT和2.32g/L LNTⅡ。比原始菌株L1023高16.8％。
实施例6：基因整合菌株的构建及其生产LNnT
(1)采用CRISPER-转座的方法将基因整合入基因组，将galETKM基因簇(从大肠杆菌K12 MG1655中获得)整合入基因组galM位点；将lacZΔm15基因(从大肠杆菌K12 MG1655中获得)整合入敲除的lacZ位点，设计引物送公司合成。
(2)在BL21(DE3)ΔLWD10中转座插入galETKM后命名为BL21(DE3)ΔLWD11，继续在BL21(DE3)ΔLWD11转座插入lacZΔm15基因后命名为BL21(DE3)ΔLWD12。
(3)在BL21(DE3)ΔLWD12中转化实施例3中所制备的发酵质粒pRSF-lgtA-galE和实施例4中所制备的pET-Fh8-hpgalT1获得菌株L1226。
对菌株L1226进行摇瓶发酵48h(见图4)，L1226产量为2.66g/L LNnT和1.69g/LLNTⅡ。比原始菌株L1025高15.7％。
对L1226进行5L罐发酵，最终获得的产量为17.26g/L LNnT和20.19g/L LNTⅡ。
本发明筛选出一种高效的来源于Helicobacter pylori的β 1,4半乳糖基转移酶可以更好的合成LNnT，并通过质粒组合优化、蛋白标签共同表达等手段进一步提升LNnT产量；更进一步的，通过部分相关基因敲除以及基因组整合加强了UDP-半乳糖的合成从而提高LNnT产量；构建的工程菌株在摇瓶中最高LNnT产量2.66g/L，5L罐最高LNnT产量17.26g/L。本发明效果十分显著，打破了LNnT的合成瓶颈，具有较高的应用价值。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj、gdp-甘露糖甘露糖水解酶基因nudD；所述大肠杆菌工程菌株过表达重组基因，所述重组基因包括β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA、UDP 葡萄糖4差向异构酶基因galE、β 1,4半乳糖基转移酶基因；所述β 1,4半乳糖基转移酶基因为lgtB、lgtB-2、hpgalT-1、hpgalT-2、lex-1、lex-2、lex-3、lex-4、lex-5中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述重组基因的表达载体采用pBluescript II SK(+)、pCDFDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA和UDP葡萄糖4差向异构酶基因galE的表达载体为pRSFDuet-1。
4.根据权利要求2所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述β1,4半乳糖基转移酶基因hpgalT-1的表达载体为pETDuet-1。
5.根据权利要求1所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述β1,4半乳糖基转移酶基因hpgalT-1的N端插入有融合标签；所述融合标签为MBP、SUMO、TrxA、Fh8、hisProp中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株还敲除葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsA、UDP葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、生物膜PGA合成酶基因pgaCD、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB、UDP-N-乙酰氨基葡糖十一烷基磷酸N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶基因wecA、UDP-N-乙酰葡糖胺2-二聚体酶基因wecB、甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA、NADP+依赖性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf。
7.根据权利要求1所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株的基因组在galM位点整合有galETKM基因簇，在敲除的lacZ位点整合有lacZΔm15基因。
8.一种权利要求1～7任一项权利要求所述的高产乳酰-N-新四糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建所述重组基因的重组表达载体；
(2)采用CRISPER方法敲除所述β-半乳糖苷酶基因lacZ、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj、gdp-甘露糖甘露糖水解酶基因nudD，得基因敲除大肠杆菌；
(3)将所述重组表达载体转染所述基因敲除大肠杆菌，得所述大肠杆菌工程菌株。
9.权利要求1～7任一项权利要求所述的大肠杆菌工程菌株在生产乳酰-N-新四糖中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生产包括发酵罐或摇瓶发酵培养。
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