CN104822839A - 用于产生单糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于使用微生物来产生单糖的方法。该微生物具有糖基转移酶和糖苷酶，其一起工作以合成所期望的游离形式的单糖，其中通过使用内源性提供的核苷酸活化的单糖、糖基化适宜的受体底物并通过水解反应释放所期望的单糖。再循环并仅需要催化量的用于反应所需要的受体底物。以游离形式来产生单糖并且获取自所培养的微生物的上清。

Description

用于产生单糖的方法
本发明涉及用于产生单糖、尤其是用于产生L-岩藻糖或其他稀有单糖例如N-乙酰基神经氨酸的方法，借此在该生产方法中使用微生物。
通过在能量储存、结构功能、信号传导、信息存储等中承担关键功能，糖类在所有形式的生命中是必要的。对于此任务，自然界合成了几种主要单糖如葡萄糖、甘露糖、果糖、岩藻糖、核糖、唾液酸等，以及用于更加专门应用的若干次要单糖，如例如D-阿洛糖。
虽然一些单糖可以大量地并以合理的成本获自自然界(例如葡萄糖和果糖)，但大多数单糖是相当稀有的并且仅可以少量存在于自然界中，如例如L-岩藻糖(6-脱氧-L-半乳糖)。
对于单糖的商业化生产，几乎仅有获自自然界的寡糖被用作来源。这些寡糖是酸水解的并且从释放的单糖来纯化单种糖。由于单糖的高化学相似性(彼此之间的差异大部分仅在于个别羟基的取向)，所以以纯形式分离单种单糖是相当费力和昂贵的。
L-岩藻糖代表这样的稀有糖，其目前是经由复杂寡糖的水解而获自藻类或细菌来源。为了从复杂的水解产物来纯化单种单糖，经常必须使用有毒化学物质，如例如乙酸铅和过量的有机溶剂。因此，从寡糖的复杂的水解产物来分离单种单糖具有挑战性(由于释放的单种单糖的高化学相似性)并且是环境有害的(由于过度使用有毒化学物质，如碳酸铅)。此外，在自然界中在某些糖中富含的寡糖的可用性可以是相当受限制的并且也是高度可变的(由于季节变化)。L-岩藻糖代表这样的稀有单糖，其传统上是通过含岩藻糖的多糖的酸水解来获得的。岩藻糖主要源自多糖岩藻多糖，一种岩藻聚糖单硫酸酯，存在于所有常见的棕色海草中，其包括鹿角菜科(Fucaceae)和海带科(Laminariaceae)。今天，L-岩藻糖的大量获得主要是通过采集属于鹿角菜科的棕色海草，其可在全球范围内找到，但大量存在于大西洋的欧洲海岸。从海岸大规模收获棕色海草起环境关注并且受限于某些环保法规。
例如，JP 2000351790公开了用于提取岩藻多糖和用于从提取的岩藻多糖来获得和分离含岩藻糖的寡糖的方法。
除从棕色海草水解岩藻多糖之外，最近，专利出版物表明，还可以经由包含天然存在的L-岩藻糖的细菌多糖的水解来获得L-岩藻糖：WO2012/034996 A1公开了属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的菌株，该菌株能够产生包含L-岩藻糖的胞外多糖。为了生产L-岩藻糖，回收通过上述菌株产生的多糖并对其进行水解，例如通过用硫酸或盐酸加以处理。
除从多或寡糖水解产物提取L-岩藻糖之外，还已经开发了开始于其他单糖如L-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-甘露糖和D-葡萄糖的用于L-岩藻糖的若干合成途径。通常，这些化学合成的产率往往相当差并且涉及若干步骤。除涉及若干合成步骤之外，大量的保护基团化学反应还必须用于L-岩藻糖的化学合成。通常，相比于从自然界提取，还没有证明单糖的大规模化学合成是经济上可行的。
因此，目前，以纯形式制备任何单糖在将其他单糖与目标单糖纯化分开方面需要显著努力，往往涉及大量的有机溶剂和其他有毒化学物质。因此，单一的所期望的单糖如例如L-岩藻糖的排他积累会是非常有用的。大多数微生物在它们能够利用的单糖的种类方面是受限的。此外，在同时可以获得几种单糖作为碳源时，它们对某些单糖经常施加强的偏好。
鉴于上述，本发明的一个目的是提供用于生产游离形式的单一所期望的单糖的新方法，借此，可以快速和有效地，即大规模和成本有效地获得单糖而没有负面的环境影响。
通过用于产生单糖的方法，即大规模地、以游离形式、并利用微生物来实现上述和其他目的，该方法包括以下步骤：
a)提供微生物，其具有用于合成单糖的以下酶活性：i)糖基转移酶，其特异性地能够将单糖从活化的核苷酸单糖转移到受体-底物以形成受体-单糖-底物，以及ii)糖苷酶，其能够从受体-底物释放单糖；其中微生物不能代谢该单糖；
b)在适合生长微生物的培养基中培养微生物，借此产生游离形式的单糖，
c)从培养基回收游离单糖。
此外，通过微生物、优选重组宿主微生物解决该目标，以及它在生产游离形式的单糖中的应用，该微生物包含i)糖基转移酶，其特异性地能够将单糖从活化的核苷酸单糖转移到受体-底物以形成受体-单糖-底物，以及ii)糖苷酶，其能够从受体-底物释放单糖；其中微生物不能代谢单糖。
以这种方式来完全实现本发明的目的。
先前从未描述过申请人的方法，并且使用微生物，该微生物具有两种特定酶活性，即糖基转移酶和糖苷酶，其中糖基转移酶特异性地能够将单糖从活化的核苷酸单糖(其是内源性存在的或外部提供的)转移到受体-底物使得形成受体-单糖-底物。在随后的步骤中，糖苷酶从受体-底物释放单糖使得提供游离单糖。
虽然在本发明中可以采用具有上述酶促特点的未修饰的微生物，但根据本发明的一个方面，微生物是重组微生物，其中重组微生物已被转化以包含以下至少之一：i)编码并不天然存在于微生物中的糖基转移酶的核酸序列，和/或ii)编码并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶的核酸序列。换句话说，可以转化重组微生物以包含编码并不天然存在于微生物中的糖基转移酶的核酸序列，或编码并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶的核酸序列，或可以转化重组微生物以包含两者，即编码并不天然存在于微生物中的糖基转移酶的核酸序列和编码并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶的核酸序列。
借助于新提供的方法和新提供的微生物(重组或未重组的)，首次可以以游离形式并大量地产生所期望的单糖，而不需要化学品或繁复的工艺步骤。根据本发明的方法代表微生物发酵方法，该方法适合用于工业大规模生产稀有或其他单糖，其可以容易地获取自在其中培养微生物的培养基。
通过使用根据本发明的微生物，即表达糖基转移酶的微生物，可以进行内源的或外部提供的受体-底物的有效的岩藻糖基化，并且通过同时表达糖苷酶，可以产生在培养基中大量的游离单糖的前所未有的积累。在存在受体底物的情况下，在游离单糖的合成中，糖基转移酶和糖苷酶一起协同工作，从而仅需要催化量的适宜受体。因此，通过糖基转移酶，所提供的受体底物被岩藻糖基化，并且通过接受糖基转移酶反应的糖基化产物的糖苷酶的作用再循环(recycle)所产生的糖基化产物。
如在本文中所使用的以及如在本发明的领域中通常理解的，表述“单糖”是指糖类(碳水化合物，carbohydrates)的最基本单元。单糖是糖的最简单形式并且通常是无色的、水溶性的、结晶固体。单糖的实例包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖和核糖。单糖是二糖(disaccharides)如蔗糖以及多糖如纤维素和淀粉的结构单元。如在本文中所使用的以及如在现有技术状态中通常理解的，"寡糖"是指包含两个或更多个单糖的糖聚合物。
术语"编码…的核酸序列"通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰RNA或DNA，并且通常表示编码某些多肽或蛋白的基因。该术语包括但不限于单链和双链DNA；为单链和双链区或单链、双链和三链区的混合物的DNA；单链和双链RNA；以及为单链和双链区的混合物的RNA；包含DNA和RNA的杂合分子，其可以是单链的，或更通常地是双链、或三链区，或单链和双链区的混合物。该术语还包括多核苷酸，上述多核苷酸包括单一连续区或不连续区，其编码多肽(例如，由整合的噬菌体或插入序列或剪切(editing)所中断)，连同另外的区，其还可以含有编码和/或非编码序列。
在这种情况下，术语"多肽"是指任何肽或蛋白，其包含通过肽键或修饰肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸。"多肽"是指短链以及长链两者，短链通常被称为肽、寡肽和寡聚物，长链一般被称为蛋白质。多肽可以包含这样的氨基酸，其不同于20种基因编码的氨基酸。"多肽"包括通过天然过程如加工和其他翻译后修饰以及通过化学修饰技术加以修饰的那些。应该理解的是，在给定多肽的若干位点处可以以相同或不同程度存在相同类型的修饰而基本不改变多肽的活性。此外，给定多肽可以包含许多类型的修饰。修饰可发生在多肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。
目前，以及在整个本发明中，术语“糖基转移酶”表明和包括这样的酶，其负责二糖、寡糖和多糖的生物合成，并且它们催化单糖部分从活化的核苷酸单糖/糖("糖基供体”)到糖基受体分子的转移。
根据本发明的一个方面，特别优选的是，糖基转移酶是细菌岩藻糖基转移酶，并且优选是由大肠杆菌:O126的wbgL基因(基因库(genebank)登录号ADN43847)编码的α-1,2-岩藻糖基转移酶。
因此，术语"α-1,2-岩藻糖基转移酶"或"岩藻糖基转移酶"或编码"α-1,2-岩藻糖基转移酶"或"岩藻糖基转移酶"的核酸/多核苷酸是指这样的糖基转移酶，其催化岩藻糖从供体底物例如GDP-岩藻糖到受体分子(在α-1,2-键中)的转移。受体分子可以是糖类、寡糖、蛋白质或糖蛋白、或者脂质或糖脂，并且可以是，例如，N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基乳糖胺、半乳糖、岩藻糖、唾液酸、葡萄糖、乳糖或它们的任何组合。
如在整个本发明中使用的以及如在相关领域中所理解的，“糖苷酶”或“能够从受体-底物释放单糖的糖苷酶”包含任何糖苷(或糖基)水解酶，其催化糖苷键的水解以释放较小的糖，如单糖。
根据本发明的一个方面，特别优选的是，如果糖苷酶是细菌糖苷酶，则优选细菌α-L-岩藻糖苷酶。根据本发明的一种实施方式，使用来自两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的1,2-α-L-岩藻糖苷酶基因afcA(基因库登录号:AY303700)，其中密码子被优化以便于在大肠杆菌中表达。
在本发明的范围内，那些术语还包括在整个本发明中提到的糖基转移酶和糖苷酶的核酸/多核苷酸和多肽多态变体、等位基因、突变体、功能等效片段、以及种间同系物，尤其是这样的那些：其具有氨基酸序列，该氨基酸序列，尤其是，以及例如，相对于由大肠杆菌:O126的wbgL基因(登录号ADN43847)编码的α-1,2-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列或相对于来自两歧双歧杆菌的1,2-α-L-岩藻糖苷酶基因afcA的氨基酸序列，优选在至少约25、50、100、200、500、1000或更多个氨基酸的区域上，具有大于约60％氨基酸序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性。在阅读本发明以后，本领域技术人员将容易认识到可以使用任何其他糖基转移酶或糖苷酶，只要这些酶在微生物中满足它们的酶活性。最终，必须相对于它们待引入的微生物密码子优化糖基转移酶和/或糖苷酶的序列。
在本发明的上下文中，如在本文中所使用的，"功能等效"是指这样的多肽，其能够显示和由上述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因序列编码的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因产物或如上所述的岩藻糖苷酶基因产物基本上类似的体内活性，如通过任何数目的准则判断的，包括但不限于抗原性，即，结合于抗α-1,2-岩藻糖基转移酶或1,2-α-L-岩藻糖苷酶抗体的能力，免疫原性，即，产生能够结合α-1,2-岩藻糖基转移酶或岩藻糖苷酶蛋白或多肽的抗体的能力，以及酶活性。
可以通过重组DNA技术并利用在本领域中众所周知的技术来产生如在整个本发明中提到的糖基转移酶多肽和/或糖苷酶多肽。本领域技术人员众所周知的方法可以用来构建表达载体，其包含，例如，α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或1,2-α-L-岩藻糖苷酶、编码序列和适当的转录翻译控制信号。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。参见，例如，描述于Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中的技术。
目前，以及在整个本发明中，"重组"是指通过将来自一种物种的基因移植或剪接进入不同物种的宿主微生物的细胞所制备的基因工程DNA。这样的DNA变成宿主的基因构成的一部分并且被复制。
“微生物”目前表明和包括任何微小有机体，该微小有机体包括单细胞、细胞簇、或多细胞的相对复杂的有机体，其适合用于根据本发明的方法，并且特别包括细菌和酵母。可以在液体培养基中培养如根据本发明使用的微生物，并且一般需要在培养基中的碳源以生长和复制。
因此，“重组宿主微生物”用来指任何微生物，其包含编码糖基转移酶或糖苷酶、或编码糖基转移酶和糖苷酶的核酸序列，其中编码这些酶的核酸序列是这样的核酸序列，其非重组(宿主)细胞原有(foreign to)/非天然存在于重组(宿主)细胞中以及其中非原有的/非天然地在所述微生物中存在的序列被整合在宿主微生物细胞的基因组中。从而，"非天然存在"是指，核酸序列是非所述宿主微生物细胞原有的，即，相对于微生物宿主细胞，核酸序列是异源的。可以，例如通过转染、转化、或转导将异源序列稳定引入宿主微生物细胞的基因组，其中可以应用的技术将取决于序列待引入的宿主细胞。各种技术是本领域技术人员已知的，并且，例如，公开于Sambrook et al.,1989，同上。因此，其中已引入异源序列的宿主细胞将产生根据本发明的核酸序列编码的异源蛋白。
为了重组生产，可以基因设计宿主细胞以引入表达系统或其部分和本发明的核酸序列。可以通过在许多标准实验室手册，如Davis et al.,BasicMethods in Molecular Biology,(1986),and Sambrook et al.,1989，同上，中描述的方法来将核酸序列引入宿主微生物细胞。
因此，根据本发明的核酸序列可以例如被包含在载体中，其中上述载体将被稳定地转化/转染或以其他方式引入宿主微生物细胞。
各种各样的表达系统可以用来产生本发明的多肽。这样的载体包括(除了别的以外)染色体载体、附加型载体和病毒源性载体，例如，源自细菌质粒的载体、源自噬菌体的载体、源自转座子的载体、源自酵母附加体的载体、源自插入元件的载体、源自酵母染色体元件的载体、源自病毒的载体，以及源自它们的组合的载体，如那些源自质粒和噬菌体基因元件(如粘粒和噬菌粒)的载体。表达系统构建体可以包含控制区，其调节以及引起表达。在这方面，通常，在宿主中适合于维持、增殖或表达多核苷酸以及适合于合成多肽的任何系统或载体可以用于表达。可以通过任何的各种各样的众所周知的和常规的技术，如，例如，在Sambrook et al.，同上中阐述的那些技术将适当的DNA序列插入表达系统。
如在本文中所使用的，术语"回收"是指从微生物培养物分离、收获、纯化、收集或以其他方式分离通过根据本发明的微生物产生的单糖。
在整个本发明中，特别优选的是，待产生的游离单糖是L-岩藻糖或神经氨酸。
L-岩藻糖是己糖脱氧糖，并且除其他岩藻糖基化的寡糖之外，发现它是主要是化工、医药、化妆品和营养应用感兴趣的。除它用于生产岩藻糖基化衍生物(其因它们的抗过敏和乳化性能而众所周知)之外，L-岩藻糖还是人乳寡糖(HMO)的常见成分，如2’-岩藻糖基-乳糖。
根据一种优选的实施方式，受体-底物是所述微生物的内源的或被加入在其中培养微生物的培养基中。内源性受体-底物可以是，例如，存在于微生物中的任何二糖或单糖、糖基化蛋白或脂多糖。
根据本发明的一个方面，将受体-底物外部加入所述微生物或加入在培养基中培养的微生物，以及优选地添加乳糖或乳果糖。
在一种优选的实施方式中，在包含碳源的培养基中培养微生物，上述碳源选自甘油、蔗糖、葡萄糖、果糖、糖蜜、乳糖、木糖、纤维素、合成气或一氧化碳。在这种情况下，应当理解的是，任何其他(优选低成本的)发酵底物可以用作碳源，并且本领域技术人员将容易地能够使用适用于本发明的碳源以生长微生物，从而以大规模地产生所期望的单糖。
根据本发明的一个方面，上述方法是分批或连续发酵方法。
因此，根据本发明的一个方面，即在连续过程中，在微生物(例如重组微生物)的培养步骤期间将碳源持续加入培养基。
通过在培养步骤期间不断添加碳源，完成单糖的持续和有效生产。
根据另一方面，即在分批过程中，上述方法并不包括在发酵过程中外部添加物质的步骤。
根据本发明的另一方面，单糖回收自培养的重组宿主微生物的上清，通过离心培养的宿主微生物以获得上清和宿主微生物沉淀物从而获得上清。
借助于新提供的方法，可以从在其中培养宿主微生物的培养基回收产生的单糖，这是因为在微生物细胞中产生的单糖被转运进入培养基，因而，在已经由培养基分开微生物的细胞以后，可以毫不费力地从上清回收单糖。
根据根据本发明的方法的另一种优选实施方式，在步骤c)中分离单糖以前，将β-半乳糖苷酶加入在其中培养宿主微生物的培养基和/或在微生物中诱导β-半乳糖苷酶的内源性生产。
借助于此特点可以实现的是除所期望的单糖之外其他单糖可以被代谢掉，其中，其他单糖是在所期望的单糖的合成期间在微生物中所产生的，并且其他单糖干扰所期望的单糖的纯化步骤，使得进一步改善和促进所期望的单糖的回收步骤。根据本发明，这可以通过向着过程的结束诱导否则下调(去调节，deregulated)β-半乳糖苷酶来实现；这意味着，在所期望单糖的合成期间，例如通过温度或添加诱导剂，例如四环素(在发酵过程结束时)，下调β-半乳糖苷酶并且可以被诱导。可替换地或另外，在根据本发明的方法结束时，可以将酶β-半乳糖苷酶(或任何其他寡糖或单糖代谢酶)外部加入培养基，当编码β-半乳糖苷酶的内源性基因已被灭活或删除时，其是特别优选的。在这样做时，不需要的寡糖和或单糖不能积累并且不干扰所期望的单糖的回收。在这种情况下，应当理解的是，除β-半乳糖苷酶之外，在微生物中还可以以所提到的方式来调节其他代谢酶以代谢否则干扰性的不需要的寡糖和单糖，并且在阅读本发明以后本领域技术人员将容易认识到用来调节/激活或供给的其他合适的途径或酶，其将取决于待降解的受体。
如在本文中使用的以及如在本发明的领域中通常理解的，“β-半乳糖苷酶”是催化β-半乳糖苷酶到单糖的水解的水解酶。
在关于基因的本上下文中，“调节的”通常被理解为基因可以以受控方式，例如下调或上调方式来调节其表达，即由调节的基因编码的合成蛋白的量是不同(例如下调/下调或上调)于未调节的基因。
通过将酶β-半乳糖苷酶加入培养基和/或上清，可以切割仍然存在于培养基中的受体-底物；在使用乳果糖的情况下，切割乳果糖糖苷键并释放半乳糖和果糖；以及通过使用的大肠杆菌菌株可以有效地代谢产生的单糖。因此，可以从培养基有效地除去提供的二糖，优选乳果糖或乳糖。在这种情况下，通过基因敲除或类似的基因失活，可以灭活最终天然存在于微生物例如如大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶。
此外，根据本发明的另一方面，在从上清回收单糖以前，用β-半乳糖苷酶来处理上清，然后与培养的宿主微生物接触。
根据本发明的一个方面，根据本发明的方法包括以下步骤：
a)在适合生长微生物的培养基中提供重组宿主微生物，其已被转化以包含a)编码并不天然存在于微生物中的糖基转移酶的核酸序列，和/或b)编码并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶的核酸序列，其中微生物不能代谢待产生的单糖，
b)将受体-底物加入在其中培养宿主微生物的培养基，其中受体-底物是二糖，优选乳糖或乳果糖，
c)在所述培养基中培养重组宿主微生物，借此以游离形式产生单糖，
d)从培养基回收游离单糖。
如上所述，以及如已经连同根据本发明的方法一起描述的，本发明还涉及重组宿主微生物，其被转化以能够生长于唯一碳源以及包含a)编码并不天然存在于所述宿主微生物中的糖基转移酶多肽的核酸序列，和b)编码并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶多肽的核酸序列。
上文针对连同上述方法一起的特定术语所使用和阐述的定义也适用于本文介绍的重组微生物。
根据一种优选的实施方式，在根据本发明的方法中使用的以及本文要求保护的微生物选自细菌或酵母，并且更优选地，宿主微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)菌株或酵母属(Saccharomyces sp.)菌株。
细菌大肠杆菌和酵母酵母属具有以下优点：可以在实验室环境下容易且廉价地生长这些微生物，以及已深入研究细菌和酵母超过60年。
因此，在一种优选的实施方式中，在根据本发明的方法中使用的以及本文中另外要求保护的宿主微生物选自由细菌和酵母组成的组，并且优选是大肠杆菌菌株。
在本发明的一种实施方式中，进一步优选的是，重组宿主微生物被进一步转化以缺乏编码β-半乳糖苷酶的基因或包含下调的β-半乳糖苷酶编码基因，以及L-岩藻糖异构酶、L-墨角藻糖激酶和UDP-葡萄糖:十一异戊烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶(UDP-glucose:undecaprenyl phosphateglucose-1-phosphate transferase)。
此实施方式具有以下优点：防止产生的单糖L-岩藻糖的细胞内降解和荚膜异多糖酸(结肠酸，colonic acid)的生产，并且在β-半乳糖苷酶的情况下受体分子不被降解。
在另一种优选实施方式中，重组宿主微生物被进一步转化以包含基因，其使得重组宿主微生物能够生长于蔗糖或甘油(作为唯一碳源)，以及特别优选的是，大肠杆菌W的csc-基因簇(登录号CP0021851)被整合进入宿主微生物的基因组，上述基因簇包含基因蔗糖通透酶、果糖激酶、蔗糖水解酶和转录抑制因子(分别为基因cscB、cscK、cscA和cscR)，其使得转化的微生物能够生长于蔗糖(作为唯一碳源)。
根据本发明的方法或微生物的一种优选的实施方式，以及如上所述，编码糖基转移酶多肽的核酸是2-岩藻糖基转移酶和1,2-α-L-岩藻糖苷酶。对于此酶的定义，见上文。
在这方面，应该注意的是，对于根据本发明的方法列为优选的实施方式均适用于要求保护的微生物(在适用情况下)。
因此，本发明还涉及具有以下酶活性的微生物用于合成单糖的应用：i)糖基转移酶，其特异性地能够将单糖从活化的核苷酸单糖底物转移到受体以形成受体-单糖底物，以及ii)糖苷酶，其能够从受体释放单糖；其中微生物不能代谢单糖，以及本发明进一步涉及根据本发明的重组微生物用于生产单糖，尤其是L-岩藻糖的应用。
应该注意的是，上文为描述根据本发明的方法的某些术语所阐述的定义将适用于微生物(重组的或未修饰的)，如在本文中要求保护的和描述的。
可替换地，用于产生单糖的方法可以适用于无细胞系统，借此，通过在含水反应介质中的混合，来组合根据本发明的酶、一种或多种受体底物和(根据具体情况而定)其他反应混合物成分，包括其他糖基转移酶和辅助酶。可以以在溶液中的游离形式来使用酶，或可以将它们结合或固定于载体如聚合物，并且可以将底物加入载体。可以将载体，例如，填充在柱中。
尤其是，本发明涉及其中重组大肠杆菌菌株用作重组宿主微生物的方法，其中在重组大肠杆菌菌株中L-岩藻糖异构酶基因和L-墨角藻糖激酶基因已被删除，以及其中重组大肠杆菌菌株已被转化以包含a)使得大肠杆菌菌株能够生长于蔗糖或甘油(作为唯一碳源)，上述基因分别编码蔗糖通透酶、果糖激酶、蔗糖水解酶和转录抑制因子，b)编码2-岩藻糖基转移酶的基因，以及c)编码1,2-α-岩藻糖苷酶的基因。
依据实施方式的描述和附图，可以得出另外的优点。
不用说，上述特点以及有待下文解释的特点可以不仅用于分别指定的组合，而且用于其他组合或它们本身，而没有偏离本发明的范围。
在图中说明并在以下描述中更详细地解释本发明的若干实施方式。在图中：
图1示出在本发明中使用的途径/方法的示意图(A)以及根据本发明用于示例性生产L-岩藻糖的途径的必不可少的示意性部分(B)；
图2列出寡核苷酸引物的表，该寡核苷酸引物用来产生用于产生根据本发明的微生物的DNA片段；
图3色谱图(薄层色谱)，示出在根据本发明的微生物的上清中存在示例性实施方式L-岩藻糖，所述微生物生长于蔗糖(A)或甘油(B)；
图4HPLC色谱图，示出由生长于甘油(A)或蔗糖(B)的根据本发明的重组微生物生产L-岩藻糖。保留时间为2.2分钟、4.6分钟和9.8分钟的峰分别对应于L-岩藻糖、乳果糖和麦芽三糖(内部标准)。
图5HPLC色谱图，示出将β-半乳糖苷酶加入发酵培养基的影响，其中图5A示出在β-半乳糖苷酶添加以前发酵培养基的HPLC色谱图，并且其中图5B示出在β-半乳糖苷酶添加以后的HPLC色谱图；以及
图6是获自细菌发酵的经纯化的L-岩藻糖的1H-NMR谱。
实施例
如在图1A在示意性地所示的，根据本发明的方法，以及在上述方法中使用的微生物，利用存在于微生物中的核苷酸激活的单糖，并经由糖基转移酶的酶活性，将单糖部分转移到受体，其可以是内源性地存在于微生物中和/或外部提供的，以形成受体-单糖-底物或复合物。通过糖苷酶(水解酶)的酶活性，单糖释放自受体-单糖-底物并可以以游离形式获取(见图1A)。
作为示例性单糖，在重组大肠杆菌菌株中L-岩藻糖产生自的蔗糖或甘油。图1B示出用于生产L-岩藻糖的示意性途径的一部分。在微生物中，经由从头途径来合成GDP-岩藻糖以及在2-岩藻糖基转移酶催化的反应中乳果糖用作示例性受体底物。通过1,2-α-L-岩藻糖苷酶水解糖苷键释放L-岩藻糖(见图1B)。
开发大肠杆菌L-岩藻糖生产菌株
通过利用如由Ellis et al.,2001描述的错配-寡核苷酸的诱变，首先在大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)中将lacZ失活(见图2A表1)。利用引物605和606(使用的所有引物列于图2B的表2)，自大肠杆菌K12TG1扩增gal-操纵子(galETKM)，然后借助于通过利用红色重组酶辅助质粒pKD46促进的同源重组插入大肠杆菌BL21(DE3)lacZ的galM ybhJ基因座(Datsenkoand Warner,“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645(2000))。接着，通过寡核苷酸诱变来将araA失活。在菌株大肠杆菌BL21(DE3)lacZGal+ araA中删除基因wcaJ。根据Datsenko和Warner((2000)，见上文)的方法来进行基因组缺失。WcaJ可能编码UDP-葡萄糖:十一异戊烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶，其催化在荚膜异多糖酸(colanic acid)合成中的第一步骤(Stevenson et al.,“Organization of the Escherichia coli K-12 gene clusterresponsible for production of the extracellular polysaccharide colonic acid”,J.Bacteriol.178:4885-4893；(1996))；荚膜异多糖酸的生产将与岩藻糖基转移酶反应竞争GDP-岩藻糖。为了防止L-岩藻糖的细胞内降解，已从大肠杆菌菌株BL21(DE3)lacZ Gal+ araA ΔwcaJ的基因组删除编码L-岩藻糖异构酶(fucI)和L-墨角藻糖激酶(fucK)的基因。
利用质粒pINT2-lacY-aadA(附录序列1)作为模板，借助于引物1119和1120来扩增乳糖转运体基因lacY，其最初来自大肠杆菌K12 TG1(登录号ABN72583)，以及前面的启动子Ptet和FRT-位点侧接的链霉素抗性基因。得到的PCR产物在两个位点上携带用于EZ-Tn5转座酶的19-bp MosaicEnd(嵌合末端)识别位点。EZ-Tn5<Ptet-lacY-FRT-aadA-FRT>转座子用来产生具有EZ-Tn5TM转座酶(Epicentre,USA)的EZ-Tn5转座体，借此，转化大肠杆菌BL21(DE3)lacZ Gal+ araA ΔwcaJ ΔfucI ΔfucK的电转感受态细胞。通过编码在质粒pCP20上的FLP重组酶(Datsenko和Warner，见上文)来从耐链霉素克隆消除抗性基因。大肠杆菌W的csc-基因簇(登录号CP002185.1)包含用于蔗糖通透酶、果糖激酶、蔗糖水解酶和转录抑制因子的四种基因(分别为基因cscB、cscK、cscA和cscR)，其使得菌株能够生长于蔗糖作为唯一碳源。利用质粒pEcomar-cscABKR(附录序列2)通过转座将csc-簇整合进入大肠杆菌BL21(DE3)lacY-携带(harbouring)菌株的基因组。由反向末端重复侧接csc-基因，该反向末端重复被水手样(mariner-like)元件Himar1转座酶特异性地识别(Bigot et al.,“Conservationof Palindromic and Mirror Motifs within Inverted Terminal Repeats ofmariner-like Elements”,J.Mol.Biol.351:108-116(2005))，其中上述转座酶被编码在pEcomar上并在ParaB的控制下被转录。对于由水手转座酶介导的转座，在包含100μg/ml氨苄青霉素的2′YT培养基(Sambrook and Russel,2001,Molecular Cloning:a laboratory manual)中生长携带相应质粒的细胞，并且在30℃下用100mM L-阿拉伯糖诱导至少16小时。在包含1％蔗糖的M9-琼脂(Sambrook和Russel，见上文)板上，在插入csc-簇的情况下，或在包含相应抗生素的2′YT琼脂上选择包含转座子盒的克隆。大肠杆菌BL21(DE3)::(Ptet-lacY)(cscBKAR)lacZ Gal+ araA ΔwcaJ ΔfucI ΔfucK能够生长于蔗糖作为唯一碳源。对来自大肠杆菌:O126的2-岩藻糖基转移酶基因wbgL(登录号ADN43847)进行密码子优化用于在大肠杆菌中表达并由GenScript Cooperation(USA)合成制备。利用质粒pINT2-wbgLco-neo(附录序列3)作为模板，借助于引物1119和1120来扩增wbgLco基因以及前面的启动子Ptet和FRT-位点侧接的卡那霉素抗性基因；整合得到的EZ-Tn5<Ptet-wbgLco-FRT-neo-FRT>转座子，通过EZ-Tn5TM转座酶加以介导。
为了增强GDP-岩藻糖的从头合成，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中过度表达来自大肠杆菌K12DH5α的编码磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase)(manB)、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(mannose-1-phosphate guanosyltransferase)(manC)、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)和GDP-L-岩藻糖合酶(wcaG)的基因；操纵子manCB是在Ptet的控制下，操纵子gmd,wcaG转录自PT5启动子。从pEcomar C9-manCB-gmd,wcaG-dhfr(附录序列4)，并通过水手转座酶Himar1的超活性C9-突变体加以介导，插入转座子盒<Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-FRT-dhfr-FRT>(Lampeet al.,“Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:11428-11433(1999))。最后，通过转座并利用pEcomar-afcAco-tet(附录序列5)和水手转座酶，将来自两歧双歧杆菌的1,2-α-L-岩藻糖苷酶基因afcA(密码子优化用于在大肠杆菌中表达，并由GeneScript Coorperation合成)作为<Ptet-afcAco-FRT-tet-FRT>转座子插入菌株。
用于L-岩藻糖生产的培养条件
A：使用蔗糖作为碳源
在3L发酵罐(New Brunswick,Edison,USA)中培养大肠杆菌BL21(DE3)lacZ Gal+ araA ΔwcaJ ΔfucI ΔfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet)，并开始于800mL矿物盐培养基(Samain et al.,“Production of O-acetylated andsulphated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia colistrainsharbouring different combinations of nod genes”,J.Biotech.72:33-47(1999))，其包含3％蔗糖作为碳源和抗生素四环素7.5μg/ml、卡那霉素15μg/ml、以及三甲氧苄二氨嘧啶(甲氧苄氨嘧啶)10μg/ml。培养开始于2.5％(v/v)接种物。分几个步骤添加在岩藻糖基转移酶反应中作为受体的乳果糖至33.75mM的最终浓度。对培养物持续供给蔗糖。细胞在约66小时内生长至141的OD660nm并产生366mM岩藻糖(数据未示出)。
B：使用甘油作为碳源
在3L发酵罐(New Brunswick,Edison,USA)中培养大肠杆菌BL21(DE3)lacZ Gal+ araA ΔwcaJ ΔfucI ΔfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet)，并开始于800mL矿物盐培养基(Samain et al.,见上文)，其包含3％甘油作为碳源和抗生素四环素7.5μg/ml、卡那霉素15μg/ml、以及三甲氧苄二氨嘧啶10μg/ml。培养开始于2.5％(v/v)接种物。分几个步骤添加在岩藻糖基转移酶反应中作为受体的乳果糖至31.5mM的最终浓度。对培养物持续供给甘油。细胞在约64小时内生长至212的OD660nm并产生78mM岩藻糖(数据未示出)。
检测L-岩藻糖
通过薄层色谱法TCL并利用硅胶TLC板(硅胶60)来分析生长细胞的上清。丁醇:丙酮:乙酸:H2O(35/35/7/23(v/v/v/v))的混合物用作流动相。为了检测分开的物质，用麝香草酚试剂(0.5g麝香草酚溶解于95ml乙醇，并添加5ml硫酸)来浸泡TCL并加热。
利用折射率检测器(RID-10A)(Shimadzu，德国)和Luna NH2柱(10μm,250′4.6mm)(Phenomenex,USA)，其连接于HPLC系统(Shimadzu，德国)，来进行高效液相色谱分析。以35℃和3ml/分钟的流动速率，用乙腈:H2O(80/20(v/v))作为洗脱液等度地(isocratically)进行洗脱。将20μl样品施加于柱。L-岩藻糖浓度计算自标准曲线。为此，在它们被过滤(0.22μm孔径)和在离子交换基质(Strata ABW,Phenomenex)上通过固相提取加以清除以前，将10％(v/v)100mM麦芽三糖加入HPLC样品作为内部标准。
在分别生长于蔗糖和甘油中、利用乳果糖作为受体的大肠杆菌BL21(DE3)lacZ Gal+ araA ΔwcaJ ΔfucI ΔfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet)的上清中检测L-岩藻糖，如通过TCL(图3)和HPLC(图4和图5)所示。
图3示出在存在受体-底物乳果糖的情况下，对于生长于甘油(A)或生长于蔗糖(B)的微生物薄层色谱(TLC)的结果：泳道1(两者，图3A和图3B)：在大肠杆菌BL21(DE3)lacZ Gal+ araA ΔwcaJ ΔfucI ΔfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet)的上清中，通过TCL来检测L-岩藻糖，如借助于真实参比物(S:L-岩藻糖(Glycom，丹麦)，乳果糖(Sigma，德国)所证实的。
泳道2(两者，图3A和图3B)：在37℃，酶促水解乳果糖并通过菌株大肠杆菌BL21(DE3)lacZ Gal+ araA ΔwcaJ ΔfucI ΔfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet)来降解产生的单糖。
图4示出如通过HPLC确定的，通过大肠杆菌BL21(DE3)lacZ Gal+araA ΔwcaJ ΔfucI ΔfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet)的岩藻糖生产，其中在图4A中示出生长于甘油的大肠杆菌BL21(DE3)lacZ Gal+ araA ΔwcaJ ΔfucIΔfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet)的上清；在发酵开始后64小时时获取样品。保留时间为1.9、2.1、4.6和9.8分钟的峰分别对应于甘油、L-岩藻糖、乳果糖和麦芽三糖(内部标准)。上文描述了HPLC测量方法。
在图4B中示出对于生长于蔗糖的大肠杆菌BL21(DE3)lacZ Gal+ araAΔwcaJ ΔfucI ΔfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet)的上清的HPLC分析结果；在发酵开始后的66.3小时时获取样品。保留时间为2.2、4.6和9.8分钟的峰分别对应于L-岩藻糖、乳果糖和麦芽三糖(内部标准)。上文描述了HPLC测量方法。
通过β-半乳糖苷酶水解乳果糖并且通过菌株大肠杆菌BL21(DE3) lacZ Gal +  araA ΔwcaJ ΔfucI ΔfucK::(P tet -lacY)(cscBKAR)(P tet -wgbLco-neo) (P tet -manCB-P T5 -gmd,wcaG-dhfr)(P tet -afcAco-tet)降解单糖
通过离心和过滤(0.22μm孔径)来获得来自分别生长于蔗糖和甘油的菌株大肠杆菌BL21(DE3)lacZ Gal+ araA ΔwcaJ ΔfucI ΔfucK ΔnagBΔnagA::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet)的产生L-岩藻糖的培养物的无菌上清。在新鲜的矿物盐培养基中1:10稀释上清。添加β-半乳糖苷酶(购自Sigma Aldrich)至10单位mL-1的浓度并在37℃下进行水解3小时。在37℃下，在包含相应抗生素的2YT富营养培养基中生长菌株大肠杆菌BL21(DE3)lacZGal+ araA ΔwcaJ ΔfucI ΔfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet)至约5的OD660nm。通过离心在无菌条件下收获10mL培养物的细胞并再悬浮于2mL的包含β-半乳糖苷酶的上清中。在37℃、在16小时内活细胞降解单糖，其来自酶促水解。
图5示出通过大肠杆菌BL21(DE3)lacZ Gal+ araA ΔwcaJ ΔfucIΔfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd,wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet)体外酶促水解乳果糖和降解单糖的HPLC分析，其中图5A示出用蔗糖生长培养物的上清(在66.3小时时收获)的结果；在添加β-半乳糖苷酶以前以及在用β-半乳糖苷酶进行处理和降解以后。图5B保留时间为2.1和4.4分钟的峰分别对应于L-岩藻糖和乳果糖。
图6示出通过微生物发酵获得的经纯化的L-岩藻糖的1-H NMR谱。为了测量，将20mg物质溶解于0.7ml氘化DMSO。
呈现的结果表明，借助于示例性微生物菌株可以以游离形式大规模地有效地产生示例性单糖L-岩藻糖。

Claims (20)

1.一种使用微生物生产游离形式的单糖的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供微生物，所述微生物具有用于合成所述单糖的以下酶活性：i)糖基转移酶，所述糖基转移酶特异性地能够将所述单糖从活化的核苷酸单糖转移到受体-底物以形成受体-单糖-底物，以及ii)糖苷酶，所述糖苷酶能够从所述受体-底物释放所述单糖；其中所述微生物不能代谢所述单糖；
b)在适合生长所述微生物的培养基中培养所述微生物，借此产生游离形式的所述单糖，
c)从所述培养基回收所述游离的单糖。
2.根据权利要求1所述的方法，特征在于，使用重组微生物，其中所述重组微生物已被转化以包含以下中的至少一种：i)编码并不天然存在于所述微生物中的糖基转移酶的核酸序列，和/或ii)编码并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶的核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，特征在于，所述受体-底物相对于所述微生物是内源性的或被加入在其中培养所述微生物的所述培养基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，特征在于，所述受体-底物选自二糖、优选乳果糖或乳糖，单糖，多糖，糖基化蛋白或脂多糖。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，特征在于，在包含碳源的培养基中培养所述微生物，所述碳源选自甘油、蔗糖、糖蜜、木糖、纤维素、合成气。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，特征在于，所述方法是分批或连续方法。
7.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，特征在于，从所述培养的微生物的上清回收所述单糖，其中通过离心所述培养的宿主微生物以获得上清和微生物沉淀物来获得上清。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，特征在于，在步骤c)中在回收所述单糖以前，将β-半乳糖苷酶加入在其中培养所述宿主微生物的培养基中，和/或在所述微生物中诱导β-半乳糖苷酶的内源性生产。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，特征在于，在从所述上清回收所述单糖以前，用β-半乳糖苷酶来处理所述上清然后与所述培养的宿主微生物接触。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，特征在于，产生的所述单糖选自L-岩藻糖或神经氨酸。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)在适合生长微生物的培养基中提供重组宿主微生物，所述重组宿主微生物已被转化以包含a)编码在所述微生物中并不天然存在的糖基转移酶的核酸序列，以及b)编码在所述微生物中并不天然存在的糖苷酶的核酸序列，其中所述微生物不能代谢待产生的所述单糖，
b)将受体-底物加入在其中培养所述宿主微生物的所述培养基，其中所述受体-底物是二糖、优选乳糖或乳果糖，
c)在所述培养基中培养所述重组宿主微生物，借此产生游离形式的所述单糖，
d)从所述培养基回收所述游离的单糖。
12.一种重组宿主微生物，所述重组宿主微生物被转化以能够生长于唯一碳源以及包含a)编码并不天然存在于所述宿主微生物中的糖基转移酶多肽的核酸序列，以及b)编码并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶多肽的核酸序列。
13.根据权利要求12所述的重组宿主微生物，特征在于，所述重组宿主微生物被进一步转化以缺乏编码L-岩藻糖异构酶、L-墨角藻糖激酶和UDP-葡萄糖:十一异戊烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶的基因。
14.根据权利要求12或13所述的重组宿主微生物，特征在于，所述重组宿主微生物被进一步转化以包含使所述重组宿主微生物能够生长于蔗糖或甘油的基因。
15.根据权利要求1至11中任一项所述的方法或根据权利要求12至14中任一项所述的重组宿主微生物，特征在于，所述微生物选自细菌和酵母。
16.根据权利要求1至11中任一项所述的方法或根据权利要求12至14中任一项所述的重组宿主微生物，特征在于，所述宿主微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)菌株或酵母属(Saccharomyces sp.)菌株。
17.根据权利要求1至11或15和16中任一项所述的方法，或根据权利要求12至16中任一项所述的重组宿主微生物，特征在于，编码糖基转移酶的所述核酸是细菌岩藻糖基转移酶。
18.根据权利要求1至11和15至17中任一项所述的方法，或根据权利要求12至17中任一项所述的重组宿主微生物，特征在于，编码糖苷酶多肽的所述核酸是细菌1,2-α-L-岩藻糖苷酶。
19.根据权利要求1至11和15至18中任一项所述的方法，特征在于，重组大肠杆菌(Escherichia coli)菌株用作重组宿主微生物，其中在所述重组大肠杆菌菌株中，编码β-半乳糖苷酶、L-岩藻糖异构酶、L-墨角藻糖激酶和UDP-葡萄糖:十一异戊烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶的基因已被删除或下调，并且其中所述重组大肠杆菌菌株已被转化以包含a)使所述大肠杆菌菌株能够生长于作为唯一碳源的蔗糖的基因，所述基因分别编码蔗糖通透酶、果糖激酶、蔗糖水解酶和转录抑制因子，b)编码2-岩藻糖基转移酶的基因，以及c)编码1,2-α-岩藻糖苷酶的基因。
20.具有以下酶活性的微生物用于合成单糖的应用：i)糖基转移酶，所述糖基转移酶特异性地能够将所述单糖从活化的核苷酸单糖底物转移到受体以形成受体-单糖底物，以及ii)糖苷酶，所述糖苷酶能够从所述受体释放所述单糖，其中所述微生物不能代谢所述单糖，或者权利要求12至18中任一项所述的重组宿主微生物在生产单糖、尤其是L-岩藻糖或神经氨酸中的应用。
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