CN113025548A

CN113025548A - 基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用

Info

Publication number: CN113025548A
Application number: CN202110377698.9A
Authority: CN
Inventors: 邹祥; 马巍; 牛松峰
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2021-04-08
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2041-04-08
Also published as: CN113025548B

Abstract

本发明公开了基于kosakonia sp.菌株生产2’‑岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用，重组菌是在kosakonia sp.菌株中敲除wcaj基因阻断GDP‑fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC和过表达乳糖透过酶lacY；kosakonia sp.菌自身具有合成富含岩藻糖组分的岩藻多糖(FucoPol)，且菌株内GDP‑fucose池潜力巨大，为2’‑岩藻糖基乳糖的产生提供了强大的岩藻糖基供体池，成分安全，合成的2’‑岩藻糖基乳糖安全性好，能够用于食品和医药品的原料。

Description

基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，还涉及利用重组菌生产2’-岩藻糖基乳糖的方法和应用。

背景技术

婴儿配方奶粉是除母乳喂养外为婴儿提供或补充营养的最佳选择，为了缩小与母乳之间的营养成分差距，近年来关于母乳寡糖的研究越来越多。人乳中包含了众多的寡糖成分，约50％是岩藻糖基化的寡糖，其中2’-岩藻糖基乳糖((2’-FL))最为丰富。已被美国食品和药物管理局(FDA)批准为GRAS级别的HMOs，可作为高档婴配奶粉的营养补充剂，是目前最具商业价值的一种岩藻糖基乳糖。

而生产2’-岩藻糖基乳糖的方式主要包括了化学合成法、酶法合成、全细胞催化以及生物发酵法。生物发酵法生产2’-岩藻糖基乳糖是未来生产2’-岩藻糖基乳糖的主要方法之一，利用微生物自身代谢途径合成供体GDP-L-Fuc，进一步在α-1,2-岩藻糖基转移酶的作用下催化合成2’-FL。目前，研究人员已在多种工业菌株中，包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等，构建了2’-FL的合成途径。大肠杆菌具有产量高的优点，但是大肠肝会产生毒素，安全性差。且需要在大肠杆菌中同时重组表达多个基因，外源基因表达过多稳定性差且对宿主菌的代谢造成一定负担。因此，急需寻找一种新的宿主作为2’-岩藻糖基乳糖的底盘菌株。

Kosakonia sp.CCTCC M2018092菌株是在中国西南重庆地区的温泉水分离得到，菌株能够高产富含岩藻糖组分的岩藻多糖(FucoPol)，充分说明底盘菌株内GDP-fucose池的巨大潜力，这为2’-岩藻糖基乳糖的产生提供了强大的岩藻糖基供体池。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌；本发明的目的之二在于提供利用kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的方法；本发明的目的之三在于提供所述重组菌在合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，所述工程菌是在kosakonia sp. 菌株中敲除wcaj基因阻断GDP-fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC和过表达乳糖透过酶lacY使代谢流向2’-岩藻糖基乳糖。

优选的，所述岩藻糖基转移酶futC的序列经密码子优化，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9 所示的第1171位至2073位所示。

优选的，所述岩藻糖基转移酶futC的5’端融合有麦芽糖结合蛋白MBP；所述麦芽糖结合蛋白MBP的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的第1～1170位。

优选的，所述乳糖透过酶lacY的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。

优选的，所述敲除wcaj基因的方法是基于CRISPR-Cas9的wcaj基因敲除。

优选的，基于CRISPR-Cas9的wcaj基因敲除具体方法是将含Cas9基因的质粒以及质粒 pCB003-wcaj-LRA转入kosakonia sp.菌中，所述pCB003-wcaj-LRA构建过程如下：分别以SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物对扩增敲除所需的上下游同源臂，并将上下游同源臂以重叠PCR的方法进行连接得到片段记为wcaj-LRA，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，pCB003为模板反向扩增获得pCB003-wcaj-N20，然后通过salⅠ和HindⅢ酶切位点将wcaj-LRA片段连入pCB003-wcaj-N20，得到pCB003-wcaj-LRA。

优选的，异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC和过表达乳糖透过酶lacY的方法，将含有岩藻糖基转移酶futC和乳糖透过酶lacY的表达载体转入kosakonia sp.菌中表达，所述表达载体构建过程如下：将SEQ ID NO.9所示序列通过NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点连入质粒 pet28a-tac，得到质粒pet28a-tac-MBPfutC；再将SEQ ID NO.10所示序列通过EcoRⅠ和SacⅠ酶切位点连入质粒pet28a-tac-MBPfutC，得到含有岩藻糖基转移酶futC和乳糖透过酶lacY的表达载体；所述pet28a-tac质粒为pet28a质粒上T7启动子替换为Tac启动子。

2、利用kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，通过将kosakonia sp.菌株中敲除 wcaj基因阻断GDP-fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC 和过表达乳糖透过酶lacY发酵合成2’-岩藻糖基乳糖，所述岩藻糖基转移酶futC的序列经密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的第1171位至2073位所示；所述乳糖透过酶 lacY的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。

优选的，所述发酵条件如下：在发酵培养基中，通过流加甘油和乳糖，通气量1.5m³/h，将溶氧控制在10％以上，发酵培养；所述发酵培养基各组分质量分数如下：4％甘油，0.8％胰蛋白胨，1.6％酵母浸粉，0.2％磷酸二氢钾，1.3％磷酸氢二钾。

3、所述重组菌在合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，该工程菌是在kosakonia sp.菌株中敲除wcaj基因阻断GDP-fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC和过表达乳糖透过酶lacY；kosakonia sp.菌自身具有合成富含岩藻糖组分的岩藻多糖(FucoPol)，菌株内GDP-fucose池潜力巨大，为2’- 岩藻糖基乳糖的产生提供了强大的岩藻糖基供体池，构建的工程菌稳定性好，合成的2’-岩藻糖基乳糖安全性好，能够用于食品和医药品的原料。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为基于kosakonia sp.菌株的2’-岩藻糖基乳糖合成途径。

图2为wcaj敲除质粒图(A:pCB003-wcaj-N20；B:pCB003-wcaj-LRA)；

图3为wcaj敲除验证图；

图4为异源通路搭建的质粒图谱(A：pet28a-tac-MBPfutC；B：pet28a-tac-MBPfutC-lacY)。

图5为岩藻糖基转移酶的蛋白表达结果。

图6为kosakonia sp.底盘菌株的岩藻糖基乳糖的发酵验证。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、基于kosakonia sp.菌株的2’-岩藻糖基乳糖合成新型底盘设计

Kosakonia sp.CCTCC M2018092菌株内具有完整的GDP-fucose从头合成途径全基因，因此通过敲除wcaj基因从而阻断GDP-fucose流向岩藻多糖途径，并通过异源表达来自幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC，过表达乳糖透过酶lacY以增强乳糖转运，从而生产2’-岩藻糖基乳糖(图1)。

实施利2、基于CRISPR-Cas9的wcaj基因敲除

利用kosakonia sp.CCTCC M2018092基因组为模板，分别以引物wcaj-LA-F/R，wcaj-RA-F/R(附表1)扩增敲除所需的上下游同源臂，并将上下游同源臂以重叠PCR的方法进行连接得到片段记为wcaj-LRA；以引物wcaj-N20-F，sgRNA-R(附表1)反向扩增pCB003(Applied and Environmental Microbiology,2015,2506-2514:81)以突变敲除wcaj所需的N20 序列，构建带有wcaj-N20的质粒记为pCB003-wcaj-N20(图2，A)；将salⅠ，HindⅢ双酶切的质粒pCB003-wcaj-N20与wcaj-LRA片段进行一步克隆重组，得到最终带有敲除wcaj基因所需N20序列以及上下游同源臂的质粒记为pCB003-wcaj-LRA(图2，B)。

表1、wcaj基因敲除引物

将带有Cas9蛋白的质粒pCas(kan*)以及质粒pCB003-wcaj-LRA(spc*)经电转化导入kosakonia sp.CCTCC M2018092菌株中，并以壮观霉素、卡那霉素双抗平板进行转化子筛选。以引物wcaj-yan-F/R(附表对转化子进行验证，与对照条带相比更短说明是成功敲除转化子(图3)，经培养后送测序用于再次敲除验证。

实施例3、基于岩藻糖基转移酶futC以及乳糖转运蛋白lacY的异源通路搭建

通过敲除基因wcaj阻断了GDP-fucose的下游利用途径，通过搭建新的GDP-fucose转化途径可以达到生产岩藻糖基乳糖的目的。选择来自幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC(进行密码子优化后由金唯智公司进行全基因合成)，并融合表达来自大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白 (MBP)以增加异源蛋白的可溶性表达，密码子优化后MBP-futC序列如(SEQ IDNO.9所示，第1～1170位为麦芽糖结合蛋白MBP，第1171位至2073位为岩藻糖基转移酶futC。以引物futC-F/R(表2)扩增MBP-futC，得到的片段与NdeⅠ，EcoRⅠ双酶切的质粒pet28a-tac进行一步克隆连接(pet28a-tac质粒为pet28a质粒上T7启动子替换为Tac启动子，其他序列与pet28a一致)，构建的质粒标记为pet28a-tac-MBPfutC(图4，A)。

为了增强底盘菌株对底物乳糖的摄取能力，通过过表达菌株内源的乳糖转运蛋白lacY (SEQ ID NO.10)，以引物lacY-F/R(表2)从kosakonia sp.基因组上扩增基因lacY片段，将得到的片段与EcoRⅠ，SacⅠ双酶切的质粒pet28a-tac-MBPfutC进行一步克隆连接，得到的最终质粒标记为pet28a-tac-MBPfutC-lacY(图4，B)。

将pet28a-tac-MBPfutC-lacY质粒通过电转化的方法导入kosakonia sp.CCTCCM2018092 菌株内。挑选单菌落于30℃，220rpm过夜培养。第二天以1％的接种量转接到30mLTB培养基中，30℃，220rpm培养至OD600＝0.6左右时，冰上静止10-15min后加入终浓度为0.1mM 的IPTG，置于25℃，220rpm培养条件下，检测基因的蛋白表达水平。SDS-PAGE表明异源表达的岩藻糖基转移酶在底盘宿主中有很好的可溶性表达水平(图5)。

表2、岩藻糖基转移酶futC以及乳糖转运蛋白lacY通路构建引物

实施利4、基于kosakonia sp.CCTCC M2018092菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的发酵验证

挑取上述构建成功的单菌落接种到TB培养基30℃，220rpm过夜培养。以1％接种量接种含有2％甘油以及0.6％乳糖的TB培养基，30℃，220rpm培养培养至OD₆₀₀＝0.6左右，冰上静止10-15min，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导目的基因的表达，在25℃摇床发酵2 d，HPLC检测2’-岩藻糖基乳糖的含量，结果显示kosakonia sp.CCTCC M2018092菌株产生1.2g/L的2’-FL(图6)；5L发酵罐上为以优化的发酵培养基(4％甘油，0.8％胰蛋白胨，1.6％酵母浸粉，0.2％磷酸二氢钾，1.3％磷酸氢二钾)，通过流加甘油和乳糖控制浓度分别为4％和0.6％乳糖，通气量1.5m³/h，通过转速联动自动调节转速在300～550rpm范围将溶氧控制在10％以上，2’-FL发酵产量达到20g/L以上。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此，也适合以GDP-fucose为供体的3’-FL的合成。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<120> 基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用

<110>西南大学

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccctgttatc cctagtcgac ctcctggaac accgttgatg 40

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgttgtacct gcctgtttgc 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaaacaggc aggtacaacg ccgctcaatg aaggtgatgg 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agggtaatag atctaagctt cagcaccgtc atctgcacca 40

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctaggtat aatactagtc cattatgttc gctgggttgg ttttagagct agaaatagc 59

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actagtatta tacctaggac tgagctagct gtcaag 36

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgcttcctg ttcgacgaca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcgcgataa tcaccagcga 20

<210> 9

<211> 2073

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60

ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120

ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180

atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240

accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300

aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360

gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420

aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480

ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540

gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600

aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660

ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720

gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780

ggcgtgctga gtgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840

ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900

ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggtga aagatccgcg tattgccgcc 960

actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020

tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080

gccctgaaag acgcgcagac taattcgagt tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140

aacctcggga tcgagggaag gatttcacat atggcgttta aagtggtgca gatctgcggt 1200

ggtctgggca accagatgtt ccagtacgcc ttcgccaaaa gtctgcagaa gcacagcaac 1260

accccggtgc tgctggatat caccagcttt gattggagcg accgcaagat gcagctggag 1320

ctgttcccga ttgatctgcc gtacgccagc gcgaaggaaa tcgccatcgc gaagatgcag 1380

catctcccaa aactggttcg cgacgcgctg aaatgcatgg gcttcgaccg cgtgagccaa 1440

gaaattgtgt tcgagtacga accgaagctc ctcaaaccga gccgtctgac ctacttcttc 1500

ggttacttcc aagatccacg ctacttcgac gccatcagcc cgctgatcaa acagacgttt 1560

accctcccac cgccgccgga gaataacaag aacaacaaca aaaaagaaga agaataccag 1620

tgcaaactga gtctgattct ggcggccaaa aacagcgtgt tcgtgcacat ccgccgcggc 1680

gactacgttg gtatcggctg ccagctgggc atcgactacc agaaaaaggc cctcgagtac 1740

atggccaaac gcgtgccgaa catggagctg ttcgtgttct gcgaagatct ggagtttacc 1800

cagaacctcg atctgggcta cccattcatg gatatgacca cccgcgataa agaagaagaa 1860

gcgtactggg acatgctgct gatgcagagc tgtcagcacg gcatcatcgc gaatagcacg 1920

tacagctggt gggcggccta cctcattgag aacccggaaa agatcatcat cggcccgaaa 1980

cactggctgt tcggccacga gaacattctg tgcaaggagt gggtgaagat cgagagccat 2040

tttgaagtga aaagtcagaa atacaatgcc taa 2073

<210> 10

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgaaactct ctgaactcgc gccaagagaa cggcataact tcatctactt tatgctgttc 60

tttttcttct actacttcat tatgtcggcc tactttccct ttttcccggt ctggctggcg 120

gaagtaaatc atttaaccaa aacagaaacg gggatcgttt tctcctcgat ctcactgttc 180

gcgattatat ttcagccggt atttggcctg atatcggaca aactggggtt acgcaaacac 240

ctgctgtgga ccattacgat cttgctgatc atgtttgcgc cgttctttat ttttgtgctg 300

tcgccgttat tgcagctgaa tattttcgcc ggtgcgctag cgggcggcat ttatctgggg 360

gtggtcttct ccagcggttc cggggcggta gaggcctata ttgaacgcgt cagccgtgcg 420

aaccgttttg aatacggaaa agtgcgcgtt tccggctgta ttggctgggc actgtgtgcg 480

tccatcaccg gtattttgtt tggcatcgat cccaatatca ccttctggat tgcctcaggt 540

tttgcgctgg tgctgggagt gctgctgtgg atgtcacgcc cggaagggag caacagtgag 600

ctggtaatcg acgcgctggg agccaaccgt aaggccttct cgatgcgcac cgccgcggaa 660

ctattacgca tgccacgctt ctggggattt attgtctacg tagttggcgt cgccagcgta 720

tatgacgtat ttgatcaaca gtttgccaac ttctttaaag gctttttctc cagtccgcag 780

cgcggaacag aagtattcgg cttcgtcacc accggagggg aattacttaa cgcgttgatt 840

atgttctttg ctcctgccat cgtgaaccgg attggcgcga aaaacgctct gatcactgcc 900

ggcattatta tgtcagcgcg tattctgggt tcttcttttg cctcttcagc tatcgaagtg 960

gtgatcttaa aaatgctgca tatgtttgaa ctcccgttct tgctggtggg caccttcaaa 1020

tacatatcat ctgcctttaa cccgaaacta tcagcaacgc tgttcctgat tggttttaac 1080

ttatcgaagc agctttcagg tgttgtactc tccgtatggg tcggaaggat gtatgacacc 1140

gtcggcttcc accaggctta tctcattctg ggcagcatta cgctgagctt taccatcgcc 1200

tccctcttta cgctgaaagg gagtaaaacg ctgctgcagg ccaccgaata taaaagcgca 1260

gcctaa 1266

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacaaggacc atagattcat aatgaaaatc gaagaaggta a 41

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgtcgacgg agctcgaatt cttaggcatt gtatttctga c 41

<210> 13

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaatacaatg cctaagaatt cttcattaaa gaggagaaag gtaccatgaa actctctgaa 60

ctcgc 65

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggccgcaagc ttgtcgacgg agctcttagg ctgcgctttt atattc 46

Claims

1.基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：所述工程菌是在kosakonia sp.菌株中敲除wcaj基因阻断GDP-fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC和过表达乳糖透过酶lacY使代谢流向2’-岩藻糖基乳糖。

2.根据权利要求1所述基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：所述岩藻糖基转移酶futC的序列经密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的第1171位至2073位所示。

3.根据权利要求2所述基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：所述岩藻糖基转移酶futC的5’端融合有麦芽糖结合蛋白MBP；所述麦芽糖结合蛋白MBP的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的第1～1170位。

4.根据权利要求1所述基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：所述乳糖透过酶lacY的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.根据权利要求1所述基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：所述敲除wcaj基因的方法是基于CRISPR-Cas9的wcaj基因敲除。

6.根据权利要求5所述基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：基于CRISPR-Cas9的wcaj基因敲除具体方法是将含Cas9基因的质粒以及质粒pCB003-wcaj-LRA转入kosakonia sp.菌中，所述pCB003-wcaj-LRA构建过程如下：分别以SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物对扩增敲除所需的上下游同源臂，并将上下游同源臂以重叠PCR的方法进行连接得到片段记为wcaj-LRA，以SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6为引物，pCB003为模板反向扩增获得pCB003-wcaj-N20，然后通过salⅠ和HindⅢ酶切位点将wcaj-LRA片段连入pCB003-wcaj-N20，得到pCB003-wcaj-LRA。

7.根据权利要求1所述基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC和过表达乳糖透过酶lacY的方法，将含有岩藻糖基转移酶futC和乳糖透过酶lacY的表达载体转入kosakonia sp.菌中表达，所述表达载体构建过程如下：将SEQ ID NO.9所示序列通过NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点连入质粒pet28a-tac，得到质粒pet28a-tac-MBPfutC；再将SEQ ID NO.10所示序列通过EcoRⅠ和SacⅠ酶切位点连入质粒pet28a-tac-MBPfutC，得到含有岩藻糖基转移酶futC和乳糖透过酶lacY的表达载体；所述pet28a-tac质粒为pet28a质粒上T7启动子替换为Tac启动子。

8.利用kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于：通过将kosakonia sp.菌株中敲除wcaj基因阻断GDP-fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC和过表达乳糖透过酶lacY发酵合成2’-岩藻糖基乳糖，所述岩藻糖基转移酶futC的序列经密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的第1171位至2073位所示；所述乳糖透过酶lacY的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵条件如下：在发酵培养基中，通过流加甘油和乳糖，通气量1.5m³/h，将溶氧控制在10％以上，发酵培养；所述发酵培养基各组分质量分数如下：4％甘油，0.8％胰蛋白胨，1.6％酵母浸粉，0.2％磷酸二氢钾，1.3％磷酸氢二钾。

10.权利要求1～7任一项所述重组菌在合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。