CN113444654B - 一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌。本发明所述工程菌在通过二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途径改造的酿酒酵母基础上，使其原有表达ALDH1的序列为表达突变的ALDH1^H194R或ALDH1^V247F的序列。本发明对路径的关键基因ALDH1进行定点突变以获得选择性更好的基因，使代谢路径更偏好二氢青蒿酸的合成，降低青蒿酸所占比例。两个突变体ALDH1^H194R和ALDH1^V247F在本发明中证明可提高二氢青蒿酸/青蒿酸的比例。在此基础上，将DBR2和ADH1融合表达，同时将突变ALDH1与DBR2融合表达可进一步提高二氢青蒿酸/青蒿酸比例且不牺牲二氢青蒿酸的产量。

Description

一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

本申请为申请日为2019年11月06日，申请号为201911075759.5，发明创造 名称为“一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用”的分 案申请。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一种生产二氢青蒿酸的 酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

青蒿素是一种有效抗疟疾药物，其众多的衍生物都被世界卫生组织于2002 年认定为一线抗疟疾药物。目前，青蒿素的获得方式主要是从植物青蒿中直 接提取。青蒿在世界各地均有分布，但绝大数青蒿中青蒿素含量都很低 (≤1‰)，且提取成本较高。而化学合成法从头合成青蒿素，因青蒿素分子 本身结构复杂，导致合成难度高，成本高，在经济上不可行。而生物半合成 方法获得青蒿素成为最佳的选择，即通过基因工程改造微生物使其生产青蒿 素前体青蒿二烯、青蒿酸或二氢青蒿酸等，再通过几步简单的化学合成方法 合成青蒿素。

其中，二氢青蒿酸是合成青蒿素的最直接的前体物质，所有其他的前体 物质(如青蒿酸等)都需要用化学方法先合成到二氢青蒿酸，才能进一步合 成青蒿素。

如Paddon CJ等人在2013年利用酿酒酵母先异源合成大量青蒿酸，再通过 化学法合成二氢青蒿酸，进而合成青蒿素。但是，这种先用生物法合成青蒿 酸再用化学法转化生成二氢青蒿酸的过程中会产生11-S型的手性二氢青蒿酸 作为副产物，这个副产物不能作为后续合成青蒿素的原料的。

而在利用微生物异源直接合成二氢青蒿酸的技术中则可避免这种情形， 例如二氢青蒿酸可以用酿酒酵母直接异源合成，2008年，Zhang Y等人通过表 达DBR2等关键基因，首次在酿酒酵母内合成二氢青蒿酸；

二氢青蒿酸是一种倍半萜的衍生物，其已构建出来的酿酒酵母异源生物 合成途径如下：酵母利用乙醇为碳源，先将其转化为乙酰-CoA，然后进入甲 羟戊酸(MVA)途径，合成15个碳的法尼基焦磷酸(FPP)，再以FPP为底物， 通过青蒿二烯合成酶(ADS)的催化合成青蒿二烯，随后被P450单氧化酶 CYP71AV1氧化为青蒿醇，CPR1和CYB5可辅助这一步骤的进行，之后青蒿醇 在ADH1催化下合成青蒿醛，青蒿醛在DBR2催化下合成二氢青蒿醛，最后经过ALDH1催化生成二氢青蒿酸，同时青蒿醛又可以直接被ALDH1催化生成副 产物青蒿酸，具体合成途径见图1。在该途径中，酿酒酵母所缺少的关键酶为 ADS、CYP71AV1、CPR1、CYB5、ADH1、DBR2和ALDH1，在不考虑产量 的前提下，将表达这些酶的序列通过基因整合方式或重组质粒方式，导入到 酿酒酵母中，即可生产处二氢青蒿酸。

专利CN201610876830.X以上述代谢途径为基础，将代谢通路所需要的几 个关键酶ADS、CYP71AV1、CPR1、CYB5、ADH1、DBR2和ALDH1通过基 因整合以及质粒导入的方式完成了重组菌株的构建，同时还过表达一些酿酒 酵母内源基因，使酿酒酵母合成二氢青蒿酸的产量可提高到1.17g/L。

虽然利用微生物异源直接合成二氢青蒿酸的技术中，不会出现合成手性 二氢青蒿酸副产物的情况，但是会同时生成青蒿酸作为副产物，现有专利 CN201610876830.X所构建的重组菌株，其二氢青蒿酸/青蒿酸的比例仅为2.53， 这表明青蒿酸在其中所占比例过高，影响目标物质的生成。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程 菌及其构建方法，使所述工程菌能够显著提高二氢青蒿酸/青蒿酸的比例，降 低青蒿酸的产出；

本发明的另外一个目的在于提供一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌 及其构建方法，使所述工程菌能够在保证二氢青蒿酸产量不降低的前提下， 显著提高二氢青蒿酸/青蒿酸的比例，降低青蒿酸的产出；

本发明的另外一个目的在于提供上述工程菌在生产二氢青蒿酸中的应用 以及工程菌中核心基因组件在构建生产二氢青蒿酸工程菌中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种通过二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途径改造的酿酒酵母工程菌，通 过二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途径改造的酿酒酵母底盘菌株，其原有表达ALDH1的序列为表达突变的ALDH1^H194R的序列或表达突变的ALDH1^V247F的 序列。

本发明所述酿酒酵母工程菌建立在通过二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途 径改造的酿酒酵母基础上，对路径的关键基因ALDH1进行定点突变以获得选 择性更好的基因，使代谢路径更偏好二氢青蒿酸的合成，降低青蒿酸所占比 例。其中，ALDH1^H194R，即ALDH1第194位的组氨酸突变为精氨酸； ALDH1^V247F，即ALDH1第247位的缬氨酸突变为苯丙氨酸。

作为优选，通过二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途径改造的酿酒酵母，其 底盘菌株可以选择任意的酿酒酵母菌株，比如本领域常用的CEN.PK2系酿酒 酵母，在本发明具体实施方式中，可选择为CEN.PK2.1C酿酒酵母。

一般的酿酒酵母不能够合成二氢青蒿酸，其缺少ADS、CYP71AV1、 CPR1、CYB5、ADH1、DBR2和ALDH1七个关键的酶，将这些关键酶的编 码基因导入到酿酒酵母中即可生产二氢青蒿酸，例如专利CN201610876830.X 中的SyBE_Sc01130085，对底盘菌株按照二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途径 改造的方法也可参考现有专利CN201610876830.X；

本发明中所述表达突变的ALDH1^H194R的序列既可以是表达ALDH1^H194R的序列，也可以是表达DBR2和ALDH1^H194R的融合蛋白的序列；所述表达突 变的ALDH1^V247F的序列既可以是表达ALDH1^V247F的序列，也可以是表达 DBR2和ALDH1^V247F的融合蛋白的序列。

在上述酿酒酵母工程菌的基础上，将DBR2和ADH1融合表达替换原有 DBR2的表达，即原有表达DBR2的序列为表达DBR2和ADH1的融合蛋白 的序列，可进一步提高二氢青蒿酸/青蒿酸比例且不牺牲二氢青蒿酸的产量。

基于以上的技术效果，本发明提出了所述酿酒酵母工程菌在生产二氢青 蒿酸或以二氢青蒿酸为中间产物的产品中的应用。同时，本发明还提出了 ALDH1^H194R及其编码序列或ALDH1^V247F及其编码序列在构建生产二氢青蒿酸 的酿酒酵母工程菌中的应用；以及DBR2和ALDH1^H194R的融合蛋白及其编码 序列或DBR2和ALDH1^V247F的融合蛋白及其编码序列在构建生产二氢青蒿酸 的酿酒酵母工程菌中的应用。

进一步地，本发明提出了DBR2和ALDH1^H194R的融合蛋白及其编码序列 联合DBR2和ADH1的融合蛋白及其编码序列在构建生产二氢青蒿酸的酿酒 酵母工程菌中的应用；以及DBR2和ALDH1^V247F的融合蛋白及其编码序列联 合DBR2和ADH1的融合蛋白及其编码序列在构建生产二氢青蒿酸的酿酒酵 母工程菌中的应用。

同时，本发明还提供了所述酿酒酵母工程菌的构建方法，包括：

步骤1、以根据二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途径改造的底盘菌株作为出 发菌株，所述底盘菌株通过基因整合和/或质粒导入的方式至少将ADS、 CYP71AV1、CPR1、CYB5、ADH1、DBR2和ALDH1的编码序列转入；

步骤2、若原有表达ALDH1的序列预通过质粒导入的方式转入底盘菌株， 则利用质粒上原有表达ALDH1的序列的两端酶切位点，对表达突变的 ALDH1^H194R的序列或表达突变的ALDH1^V247F的序列进行处理，通过酶切方式 替换掉原有表达ALDH1的序列，然后再将质粒转入底盘菌株；

若原有表达ALDH1的序列是通过基因整合方式转入底盘菌株，则利用原 有表达ALDH1的序列的上、下游序列合成上、下游同源臂，通过OE-PCR和 质粒酶切方式将上、下游同源臂与表达突变的ALDH1^H194R的序列或表达突变 的ALDH1^V247F的序列连接起来，获得上游同源臂+表达ALDH1^H194R的序列/表 达ALDH1^V247F的序列+下游同源臂的片段，通过电转化方式将该片段转入到 酿酒酵母中，通过酿酒酵母同源重组机制，利用同源臂替换掉原有表达ALDH1 的序列。

作为优选，所述ADS、CYP71AV1、DBR2的编码序列通过质粒导入的 方式转入底盘菌株中，所述CPR1、CYB5、ADH1和ALDH1通过基因整合 的方式转入底盘菌株中。在本发明具体实施方式中，本发明选择现有专利 CN201610876830.X中SyBE_Sc01130057菌株作为构建的出发菌株来详细阐 述本发明的构建过程，其与最终的SyBE_Sc01130085菌株仅区别在是否导入 质粒SyBE_Ec01130021(表达ADS,CYP71AV1及DBR2的质粒)，有关 SyBE_Sc01130057和SyBE_Sc01130085菌株的信息已经全部呈现在现有专利 中。

作为优选，本发明所述构建方法还包括：

合成表达DBR2和ADH1的融合蛋白的序列并替换原有表达DBR2的序 列。具体地，若原有表达DBR2的序列预通过质粒导入的方式转入底盘菌株， 则利用质粒上原有表达DBR2的序列的两端酶切位点，对表达DBR2和ADH1 的融合蛋白的序列进行处理，通过酶切方式替换掉原有表达DBR2的序列， 然后再将质粒转入底盘菌株；

若原有表达DBR2的序列是通过基因整合方式转入底盘菌株，则利用原 有表达DBR2的序列的上、下游序列合成上、下游同源臂，通过OE-PCR方 式将上、下游同源臂与表达DBR2和ADH1的融合蛋白的序列连接起来，获 得上游同源臂+表达DBR2和ADH1的融合蛋白的序列+下游同源臂的片段， 通过电转化方式将该片段转入到酿酒酵母中，通过酿酒酵母同源重组机制， 利用同源臂替换掉原有表达DBR2的序列。

此外，本发明还提供了一种生产二氢青蒿酸的方法，以本发明提供的酿 酒酵母工程菌为发酵生产菌种进行发酵生产。

在本发明具体实施方式中，发酵生产中的种子培养基为SC固体培养基 和SM培养基，发酵培养基为SM培养基；其中，SC固体培养基配方为20g/L 葡萄糖，6.7g/L酵母氮源，10ml/L氨基酸溶液，20mg/L腺嘌呤，20g/L琼脂 粉；SM培养基配方为40g/L葡萄糖，8g/LKH₂PO₄，15g/L(NH₄)₂SO₄，9.25g/L MgSO₄·7H₂O，10mL/L金属离子溶液，12mL/L维生素溶液，10ml/L氨基酸溶 液，pH值用NaOH调至5.05；

其中，金属离子溶液含5.75g/L ZnSO₄·7H₂O、0.32g/L MnCl₂·4H₂O、0.47g/LCoCl₂·6H₂O、0.32g/L CuSO₄、0.48g/L Na₂MoO₄·2H₂O、2.9g/L CaCl₂·2H₂O、 2.8g/LFeSO₄·7H₂O和80mL/L 0.5M EDTA；

维生素溶液含0.05g/L生物素、1g/L泛酸钙、1g/L烟酸、25g/L肌醇、1g/L 盐酸硫胺素、1g/L盐酸吡哆醇、0.2g/L对氨基苯甲酸和2g/L硫酸腺嘌呤。氨 基酸溶液包含2g/L甲硫氨酸，6g/L色氨酸，8g/L异亮氨酸，5g/L苯丙氨酸， 10g/L谷氨酸，20g/L苏氨酸，10g/L天冬氨酸，15g/L缬氨酸，40g/L丝氨酸， 2g/L精氨酸。

生产步骤分为种子培养和发酵生产两个环节，种子培养：

将菌株在SC固体培养基上划线分纯，置于30℃培养3天。之后，挑取 单菌落，接入3mLSM培养基中，于30℃培养16-20h，此时OD₆₀₀值为5-8， 以初始OD₆₀₀＝0.05转接至另一个含3mlSM培养基的试管中，置于30℃培养 12-16h。

发酵生产：

将种子培养环节的培养物，以初始OD₆₀₀＝0.5转接到含25mlSM培养基中， 置于30℃摇床培养，摇床转速为200r/min。在24h左右补充625μl/瓶的无水 乙醇，并加入5ml IPM进行萃取发酵，发酵条件依旧时30℃，摇床转速为 200r/min。总共发酵时间为120小时。

由以上技术方案可知，本发明对二氢青蒿酸异源合成路径的关键基因 ALDH1进行定点突变以获得选择性更好的基因，使代谢路径更偏好二氢青蒿 酸的合成，降低青蒿酸所占比例。两个突变体ALDH1^H194R和ALDH1^V247F在本 发明中证明可提高二氢青蒿酸/青蒿酸的比例。在此基础上，将DBR2和ADH1 融合表达，同时将突变ALDH1与DBR2融合表达可进一步提高二氢青蒿酸/青 蒿酸比例且不牺牲二氢青蒿酸的产量。

附图说明

图1所示为本发明实施例中总体构建流程图；

图2所示为模块hphA的构建示意图；

图3所示为模块hphA的导入示意图；

图4和图5所示为模块His3标签(含同源臂1，即以His3标签上游的部 分序列作为同源臂1)+P_GAL7+ALDH1^V247F的编码序列+T_TDH1的构建示意图；

图6所示为模块His3标签(含同源臂1，即以His3标签上游的部分序列 作为同源臂1)+P_GAL7+ALDH1^V247F的编码序列+T_TDH1的导入示意图；

图7和图8所示为模块His3标签(含同源臂1，即以His3标签上游的部 分序列作为同源臂1)+P_GAL7+ALDH1^H194R的编码序列+T_TDH1的构建示意图；

图9所示为模块His3标签(含同源臂1，即以His3标签上游的部分序列 作为同源臂1)+P_GAL7+ALDH1^H194R的编码序列+T_TDH1的导入示意图；

图10和图11所示为模块His3标签(含同源臂1，即以His3标签上游的 部分序列作为同源臂1)+P_GAL7+DBR2-ALDH1^H194R的编码序列+T_TDH1的构建 示意图；

图12所示为模块His3标签(含同源臂1，即以His3标签上游的部分序 列作为同源臂1)+P_GAL7+DBR2-ALDH1^H194R的编码序列+T_TDH1的导入示意图；

图13和图14所示为含P_GAL7+DBR2-ADH1编码序列+T_CYC1的质粒 SyBE_Ec01130067的构建示意图；

图15所示为不同菌株二氢青蒿酸药瓶发酵试验结果；

图16所示为SyBE_Sc01130457发酵罐发酵生产二氢青蒿酸的试验结果。

具体实施方式

本发明公开了一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应 用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要 指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它 们都被视为包括在本发明。本发明所述酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用 已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精 神和范围内对本文所述的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用进行改动或适 当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明构建方法中，针对通过基因整合方式导入的ALDH1和DBR2， 为了确保能够替换掉原有的ALDH1和DBR2，本发明在目标序列替换原有序 列之前，先用带有同源臂的筛选标签1替换掉原有序列，通过筛选标签1对 应的培养基筛选出已经替换掉原有序列的菌株，然后再将带有同源臂的目标 序列替换掉所述筛选标签1。

为了验证带有同源臂的目标序列替换掉所述筛选标签1，一般会在目标序 列的上游或下游附加筛选标签2，所述筛选标签可以选择本领域常规氨基酸筛 选标签或抗性基因筛选标签，例如His3、G418、hphMX(潮霉素B抗性基 因)；

本发明所述表达突变的ALDH1^H194R的序列、表达突变的ALDH1^V247F的 序列、表达DBR2和ALDH1^H194R的融合蛋白的序列、表达DBR2和ALDH1^V247F的融合蛋白的序列、表达DBR2和ADH1的融合蛋白的序列，均可根据实际 需要决定是否添加启动子和终止子。所述实际需要是根据所替换的原有序列 是否保留有启动子和终止子，以及是否使用原有序列的启动子和/或终止子作 为同源臂。在本发明具体实施方式中，所述启动子和终止子可以是例如GAL7 启动子(P_GAL7)、TDH1终止子(T_TDH1)、CYC1终止子(T_CYC1)等本领 域常规启动子和终止子。

本发明中所使用的ALDH1、DBR2和ADH1均优选采用青蒿来源的编码 序列，这些序列均已呈现在现有专利CN201610876830.X中，除此之外的其他 各编码序列也可以在CN201610876830.X中找到或为本领域公知的基因序列， 本领域技术人员也可以根据酿酒酵母的密码子偏好性对相关序列进行优化。

为了方便描述本发明技术方案，在具体实施方式中，本发明采用CN201610876830.X中的SyBE_Sc01130057菌株作为构建的出发菌株，其通 过基因整合方式导入了CPR1、CYB5、ADH1和ALDH1的编码序列，然后 通过质粒方式导入了ADS、CYP71AV1、DBR2的编码序列(质粒 SyBE_Ec01130021)，形成了最终的SyBE_Sc01130085菌株；

同时，本发明所使用的质粒，目的是为了以其为模板扩增出所需要的序 列，其并非必须使用，也可以通过试剂公司进行逐一合成。

在本发明具体实施方式中，实施例中所使用的带有同源臂的筛选标签1 的模块hphA为同源臂1(His3标签上游的部分序列)+hphMX+T_TDH1(即是 终止子也是同源臂，下同)；所使用的表达突变的ALDH1^H194R或ALDH1^V247F的序列的模块为His3标签(含同源臂1，即以His3标签上游的部分序列作为 同源臂1)+P_GAL7+ALDH1^H194R/ALDH1^V247F的编码序列+T_TDH1；所使用的表达 DBR2和ALDH1^H194R/ALDH1^V247F融合蛋白的序列的模块为His3标签(含同 源臂1，即以His3标签上游的部分序列作为同源臂1) +P_GAL7+DBR2-ALDH1^H194R/ALDH1^V247F的编码序列+T_TDH1；所使用的表达 DBR2和ADH1融合蛋白的序列的模块为P_GAL7+DBR2-ADH1编码序列+T_CYC1；上述各模块中使用的启动子、终止子、筛选标签和同源臂均为了适配CN201610876830.X中的SyBE_Sc01130057和SyBE_Sc01130085菌株，在出 发菌株更改后这些可以根据实际情形加以调整，并非用以限制本发明。

在本发明实施例中参与构建的引物和质粒如下表1和表2：

表1

表2

为了形象描述本发明实施例的构建过程，本发明附图1呈现整体构建流 程。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：模块hphA的构建与导入

以质粒SyBE_Ec01130018为模板，以17E0b-hphA-F,17E0b-hphA-R为引 物扩增出片段H0(hphMX编码序列)；以菌株SyBE_Sc01130057的基因组 为模板，以17E0up-F,17E0up-R为引物扩增出Hup(原有ALDH1编码序列上 游His3附近的同源臂1，作为上游同源臂)；以SyBE_Sc01130057的基因组 为模板，以17E0down-F,17E0down-R为引物扩增出Hdown(原有ALDH1编 码序列下游的T_TDH1，作为下游同源臂)；之后将H0,Hup,Hdown三个片段 用OE-PCR的方法，以17E0up-F,17E0down-R为引物扩增出模块hphA，即同 源臂1(His3标签上游的部分序列)+hphMX+T_TDH1。将hphA导入菌株 SyBE_Sc01130057中，经酵母内部同源重组得到菌株SyBE_Sc01130352；构 建示意图将图2，导入示意图见图3。

实施例2：His3标签(含同源臂1，即以His3标签上游的部分序列作为 同源臂1)+P_GAL7+ALDH1^H194R/ALDH1^V247F的编码序列+T_TDH1的模块的构建与 导入

1、His3标签+P_GAL7+ALDH1^V247F的编码序列+T_TDH1的模块的构建与导入

将质粒pSB1C3用EcoRI和PstI处理获得片段Vector-EP；以菌株 SyBE_Sc01130057的基因组为模板，用引物17E1-His3-FE和18E-His3-R通过 PCR扩增出片段E-His3，即His3标签；

以SyBE_Ec01130018为模板，用引物18E-pGAL7-F和18E5cF-R扩增出 片段E-ALDcF-a，即P_GAL7+ALDH1^V247F的上半部分编码序列；用引物 18E5cF-F和17E1-ALDH1-RP，通过PCR扩增出片段E-ALDcF-b，即 ALDH1^V247F的下半部分编码序列；

将片段E-ALDcF-a和片段E-ALDcF-b，通过OE-PCR连接起来，并用引 物18E-pGAL7-F和17E1-ALDH1-RP扩增，获得片段E-ALDcF，即 P_GAL7+ALDH1^V247F的编码序列；

将E-His3用限制性内切酶BsaI和EcoRI处理获得片段E-His3C，将 E-ALDcF用限制性内切酶BsaI和PstI处理获得片段E-ALDcFC。将E-His3C, E-ALDcFC,Vector-EP通过T4连接酶连接，构建含His3标签 +P_GAL7+ALDH1^V247F的编码序列+T_TDH1的质粒SyBE_Ec01130198，构建示意图 见图4和图5；

用限制性内切酶PmeI消化处理质粒SyBE_Ec01130198，释放出模块His3 标签+P_GAL7+ALDH1^V247F的编码序列+T_TDH1；将模块导入菌株 SyBE_Sc01130352中，经酵母内部同源重组得到菌株SyBE_Sc01130413，导 入示意图见图6，菌株SyBE_Sc01130413导入质粒SyBE_Ec01130021形成菌 株SyBE_Sc01130428，其与对照菌株SyBE_Sc01130085的区别仅在于用ALDH1 ^V247F的编码序列替换ALDH1的编码序列；

其中，His3标签+P_GAL7+ALDH1^V247F的编码序列+T_TDH1的序列如SEQ ID NO:1所示，1-305bp为同源臂1，1-896bp为His3标签，897-1623bp为 P_GAL7，1624-3123bp为ALDH1^V247F的编码序列，3124-3614bp为T_TDH1；

2、His3标签+P_GAL7+ALDH1^H194R的编码序列+T_TDH1的模块的构建与导入

将质粒pSB1C3用EcoRI和PstI处理获得片段Vector-EP；以菌株 SyBE_Sc01130057的基因组为模板，用引物17E1-His3-FE和18E-His3-R通过 PCR扩增出片段E-His3，即His3标签；

以SyBE_Ec01130018为模板，用引物18E-pGAL7-F和18E5dR-R扩增出 片段E-ALDdR-a，即P_GAL7+ALDH1^H194R的上半部分编码序列；用引物 18E5dR-F和17E1-ALDH1-RP，通过PCR扩增出片段E-ALDdR-b，即 ALDH1^H194R的下半部分编码序列；

将片段E-ALDdR-a和片段E-ALDdR-b，通过OE-PCR连接起来，并用引 物18E-pGAL7-F和17E1-ALDH1-RP扩增，获得片段E-ALDdR，即 P_GAL7+ALDH1^H194R的编码序列；

将E-His3用限制性内切酶BsaI和EcoRI处理获得片段E-His3C，将 E-ALDdR用限制性内切酶BsaI和PstI处理获得片段E-ALDdRC。将 E-His3C,E-ALDdRC,Vector-EP通过T4连接酶连接，构建含His3标签 +P_GAL7+ALDH1^H194R的编码序列+T_TDH1的质粒SyBE_Ec01130199，构建示意图 见图7和图8；

用限制性内切酶PmeI消化处理质粒SyBE_Ec01130199，释放出模块His3 标签+P_GAL7+ALDH1^H194R的编码序列+T_TDH1；将模块导入菌株 SyBE_Sc01130352中，经酵母内部同源重组得到菌株SyBE_Sc01130414，导 入示意图见图9，菌株SyBE_Sc01130414导入质粒SyBE_Ec01130021形成菌 株SyBE_Sc01130429，其与对照菌株SyBE_Sc01130085的区别仅在于用ALDH1 ^H194R的编码序列替换ALDH1的编码序列。

其中，ALDH1^H194R的编码序列如SEQ ID NO:2所示，其他基因元件序 列参照实施例1。

实施例3：His3标签(含同源臂1，即以His3标签上游的部分序列作为 同源臂1)+P_GAL7+DBR2-ALDH1^H194R的编码序列+T_TDH1的模块的构建与导入

将质粒pSB1C3用EcoRI和PstI处理获得片段Vector-EP；以质粒pRS423 为模板，用引物17E1-His3-FE和17E1-His3-R通过PCR扩增出片段E-His3， 即His3标签；

以SyBE_Ec01130021为模板，用引物17E1-pGAL7-F和17E1z-DBR2-R 扩增出片段E-DBR2，即P_GAL7+DBR2编码序列；

以SyBE_Ec01130018为模板，用引物17E1z-ALDH1-F和18E5dR-R，通 过PCR扩增出片段E-ALD-1，ALDH1^H194R的下半部分编码序列；以 SyBE_Ec01130018为模板，用引物18E5dR-F和17E1-ALDH1-RP，通过PCR 扩增出片段E-ALD-2，ALDH1^H194R的上半部分编码序列；

将片段E-His3和片段E-DBR2，用引物17E-His3-FE和17E1z-DBR2-R， 通过OE-PCR连接起来，获得片段E-a，即同源臂1+His3标签+P_GAL7+DBR2 编码序列；将片段E-ALD-1和片段E-ALD-2，通过OE-PCR连接起来，并用 引物17E1z-ALDH1-F和17E1-ALDH1-RP扩增，获得片段E-b，即ALDH1^H194R的编码序列；

片段E-a用BsaI,EcoRI处理获得片段E-aC；片段E-b用BsaI,PstI处理获 得片段E-bC。将E-aC,E-bC,Vector-EP用T4连接酶连接起来获得质粒 SyBE_Ec01130218，构建示意图见图10和图11；

用限制性内切酶PmeI消化处理质粒SyBE_Ec01130218，释放出模块His3 标签+P_GAL7+DBR2-ALDH1^H194R的编码序列+T_TDH1；将模块导入菌株SyBE_Sc01130352中，经酵母内部同源重组得到菌株SyBE_Sc01130445，导 入示意图见图12。

其中，DBR2-ALDH1^H194R的编码序列如SEQ ID NO:3所示，其他基因元 件序列参照实施例1。

实施例4：P_GAL7+DBR2-ADH1编码序列+T_CYC1的模块的构建与导入

将质粒SyBE_Ec01130021用限制性内切酶PstI和XhoI处理分离出长度 为11071bp的片段，获得片段p2u-PX。

以质粒SyBE_Ec01130016为模板，用引物u-ADH1-R4和u-ADH1-F4通 过PCR扩增获得片段u-ADH1；以质粒SyBE_Ec01130021为模板，用引物 u-CYC1t-F和u-CYC1t-R通过PCR扩增获得片段u-CYC1t。以质粒 SyBE_Ec01130021为模板，用引物u-pGAL7-F和u-DBR-R4通过PCR扩增获 得片段u-DBR2。将片段u-ADH1，u-DBR2，u-CYC1t通过OE-PCR连接，用 引物u-pGAL7-F和u-CYC1t-R扩增获得片段u-DA，构建示意图将图13。

将片段u-DA用限制性内切酶PstI和XhoI处理获得片段u-DA-PX，将 u-DA-PX与片段p2u-PX通过T4连接酶连接，构建出质粒 SyBE_Ec01130067，构建示意图见图14，其与质粒SyBE_Ec01130021区别仅 在于用DBR2-ADH1编码序列替换掉DBR2编码序列。

将质粒SyBE_Ec01130067导入到菌株SyBE_Sc01130445中，获得菌株 SyBE_Sc01130457，其与对照菌株SyBE_Sc01130085的区别仅在于采用 DBR2-ALDH1^H194R的编码序列替换ALDH1的编码序列，以及用DBR2-ADH1 编码序列替换掉DBR2编码序列。

其中，P_GAL7+DBR2-ADH1编码序列+T_CYC1的序列如SEQ ID NO:4所示， 1-727bp为P_GAL7，728-3064bp为DBR2-ADH1编码序列，3065-3565bp为 T_CYC1。

实施例5：二氢青蒿酸摇瓶发酵对比试验

为了表征菌株的优良特性，本实施例将前述实施例改造后的菌株 SyBE_Sc01130457,SyBE_Sc01130428,SyBE_Sc01130429与没有做过路径优 化的产二氢青蒿酸菌株SyBE_Sc01130085通过摇瓶发酵测试，比较二氢青蒿酸 的产量以及二氢青蒿酸/青蒿酸的比例。

(1)培养基配制

发酵测试中所用所有培养基均为SM培养基，其配方如下：

40g/L葡萄糖，8g/L KH₂PO₄，15g/L(NH₄)₂SO₄，9.25g/L MgSO₄·7H₂O， 10mL/L金属离子溶液，12mL/L维生素溶液，10ml/L氨基酸溶液，pH值用NaOH 调至5.05；

其中金属离子溶液含5.75g/L ZnSO₄·7H₂O、0.32g/L MnCl₂·4H₂O、0.47g/LCoCl₂·6H₂O、0.32g/L CuSO₄、0.48g/L Na₂MoO₄·2H₂O、2.9g/L CaCl₂·2H₂O、 2.8g/LFeSO₄·7H₂O和80mL/L 0.5M EDTA；

维生素溶液含0.05g/L生物素、1g/L泛酸钙、1g/L烟酸、25g/L肌醇、1g/L 盐酸硫胺素、1g/L盐酸吡哆醇、0.2g/L对氨基苯甲酸和2g/L硫酸腺嘌呤。氨基 酸溶液包含2g/L甲硫氨酸，6g/L色氨酸，8g/L异亮氨酸，5g/L苯丙氨酸，10g/L 谷氨酸，20g/L苏氨酸，10g/L天冬氨酸，15g/L缬氨酸，40g/L丝氨酸，2g/L精 氨酸。

(2)种子培养

将菌株SyBE_Sc01130085和SyBE_Sc01130457在SC固体培养基(20g/L葡 萄糖，6.7g/L酵母氮源，10ml/L氨基酸溶液，20mg/L腺嘌呤，20g/L琼脂粉) 上划线分纯，置于30℃培养3天。之后，挑取单菌落，接入3mLSM培养基中， 于30℃培养16-20h，此时OD₆₀₀值为5-8，以初始OD₆₀₀＝0.05转接至另一个含 3mlSM培养基的试管中，置于30℃培养12-16h。

(3)摇瓶发酵过程

将上一步的培养物，以初始OD6₀₀＝0.5转接到含25mlSM培养基中，置于 30℃摇床培养，摇床转速为200r/min。在24h左右补充625μl/瓶的无水乙醇，并 加入5ml IPM进行萃取发酵，发酵条件依旧时30℃，摇床转速为200r/min。总 共发酵时间为120小时。

(4)产物提取与测定

从摇瓶中取的样品，12000r/min离心，分离出上层IPM有机相，用甲醇溶 解稀释20倍后进紫外-高效液相色谱进行产物测定。高效液相色谱仪器方法如 下：色谱柱为ThermoC18高效液相色谱柱(4.6mm×150mm×5μm)，柱温25℃ ；进样量为10μL，总流速为1mL/min，流动相A为乙腈+0.1％甲酸，流动相B为65％ 乙腈+0.1％甲酸水溶液，梯度程序如下：0-3min，维持0％A，100％B；3-10min A由 0％均匀上升至100％；10-13min维持100％A；13min-15min A相由100％均匀下 降至0％，并维持0％A,100％B至20min。

(5)结果

由图15可知，其中SyBE_Sc01130085为对照菌株，可生产出二氢青蒿酸 327mg/L,青蒿酸129mg/L，二氢青蒿酸/青蒿酸比值为2.53；突变ALDH1可优 化二氢青蒿酸/青蒿酸比例，SyBE_Sc01130429(含突变体ALDH1^H194R)可产 326mg/L二氢青蒿酸和87.3mg/L青蒿酸，比例上升至3.73；SyBE_Sc01130429( 含突变体ALDH1^V247F)可大幅提高比例至29，几乎不产青蒿酸，但二氢青蒿酸 产量降至213mg/L；菌株SyBE_Sc01130457(将ALDH1^H194R与DBR2融合表达 配合DBR2与ADH1融合表达)可生产出二氢青蒿酸311mg/L，青蒿酸31mg/L， 二氢青蒿酸/青蒿酸比值为10.1，是对照菌株的大约4倍左右，且没有过多损失 二氢青蒿酸的产量。

实施例6：二氢青蒿酸发酵罐发酵试验

将构建好的菌株SyBE_Sc011300457在Sc固体培养基(20g/L葡萄糖， 6.7g/L酵母氮源，10ml/L氨基酸溶液，20g/L琼脂粉)上划线，30℃培养3 天。之后，挑取单菌落，接入3mL种子培养基中，于30℃培养16-24h，待OD600 至5时，取1.2mL培养物分装转接至4瓶50mL种子培养基中，初始OD600 约为0.05，于30℃培养24h以备发酵罐接种使用。种子培养基配方如下：20g/L 葡萄糖，8g/L KH₂PO₄，15g/L(NH₄)₂SO₄，9.25g/L MgSO₄·7H₂O，10mL/L金 属离子溶液，12mL/L维生素溶液,10mL/L氨基酸溶液。其中，金属离子溶液 含5.57g/L ZnSO₄·7H₂O，0.32g/L MnCl₂·4H₂O，0.47g/L CoCl₂·6H₂O，0.32g/L CuSO₄，0.48g/L Na₂MoO₄·2H₂O，2.9g/L CaCl₂·2H₂O，2.8g/L FeSO₄·7H₂O和 80mL/L 0.5M EDTA,pH＝8；维生素溶液含0.05g/L生物素，1g/L泛酸钙，1g/L 烟酸，25g/L肌醇，1g/L盐酸硫胺素，1g/L盐酸吡哆醇，0.2g/L对氨基苯甲酸 和2g/L硫酸腺嘌呤。氨基酸溶液包含2g/L甲硫氨酸，6g/L色氨酸，8g/L 异亮氨酸，5g/L苯丙氨酸，10g/L谷氨酸，20g/L苏氨酸，10g/L天冬氨酸，15g/L 缬氨酸，40g/L丝氨酸，2g/L精氨酸。

将16g KH₂PO₄，30g(NH₄)₂SO₄，12.5g MgSO₄·7H₂O溶解于1596mL蒸馏 水中加入发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟。之后向发酵罐中加入经高压灭 菌的715g/L水合葡萄糖60mL，过滤灭菌过的金属离子溶液20mL，维生素溶 液24mL，氨基酸溶液20mL,及400mL萃取剂IPM(十四酸异丙酯)。最后， 加入200mL种子培养物，开始发酵，总发酵体积为2L，初始OD600约为 0.7。

发酵温度控制在30℃，pH控制在5.05，其中控制pH所用5M NaOH， 通气量为1.5vvm，溶氧与搅拌关联，控制溶氧在40％，搅拌转速最低 300rpm，最高700rpm。在葡萄糖耗尽时开始以流加方式补料，起初补357g/L 水合葡萄糖，待OD600达到50后停止补葡萄糖(大约36h左右),待乙醇耗 尽时开始补95％乙醇，整个补料过程控制培养基内葡萄糖浓度为0，开始补乙 醇后控制乙醇浓度小于20g/L。每24h根据补充的葡萄糖和乙醇的总体积添加 其体积1/10补料盐溶液(80g/L KH₂PO₄，61.5g/L MgSO₄·7H₂O，35g/L K₂SO₄,100mL/L金属离子溶液，120mL/L维生素溶液)，发酵持续150h。

发酵结果如图16所示，二氢青蒿酸(DHAA)最高产量可达到1.74g/L且只 产生175mg/L青蒿酸，两者比例也得到显著提升。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

<130> MP21016770F

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3614

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacagagc agaaagccct agtaaagcgt attacaaatg aaaccaagat tcagattgcg 60

atctctttaa agggtggtcc cctagcgata gagcactcga tcttcccaga aaaagaggca 120

gaagcagtag cagaacaggc cacacaatcg caagtgatta acgtccacac aggtataggg 180

tttctggacc atatgataca tgctctggcc aagcattccg gctggtcgct aatcgttgag 240

tgcattggtg acttacacat agacgaccat cacaccactg aagactgcgg gattgctctc 300

ggtcaagctt ttaaagaggc cctaggggcc gtgcgtggag taaaaaggtt tggatcagga 360

tttgcgcctt tggatgaggc actttccaga gcggtggtag atctttcgaa caggccgtac 420

gcagttgtcg aacttggttt gcaaagggag aaagtaggag atctctcttg cgagatgatc 480

ccgcattttc ttgaaagctt tgcagaggct agcagaatta ccctccacgt tgattgtctg 540

cgaggcaaga atgatcatca ccgtagtgag agtgcgttca aggctcttgc ggttgccata 600

agagaagcca cctcgcccaa tggtaccaac gatgttccct ccaccaaagg tgttcttatg 660

tagtgacacc gattatttaa agctgcagca tacgatatat atacatgtgt atatatgtat 720

acctatgaat gtcagtaagt atgtatacga acagtatgat actgaagatg acaaggtaat 780

gcatcattct atacgtgtca ttctgaacga ggcgcgcttt ccttttttct ttttgctttt 840

tctttttttt tctcttgaac tcgacggatc tatgcggtgt gaaataccgc ctcgaggatt 900

tgccagctta ctatccttct tgaaaatatg cactctatat cttttagttc ttaattgcaa 960

cacatagatt tgctgtataa cgaattttat gctatttttt aaatttggag ttcagtgata 1020

aaagtgtcac agcgaatttc ctcacatgta gggaccgaat tgtttacaag ttctctgtac 1080

caccatggag acatcaaaga ttgaaaatct atggaaagat atggacggta gcaacaagaa 1140

tatagcacga gccgcgaagt tcatttcgtt acttttgata tcgctcacaa ctattgcgaa 1200

gcgcttcagt gaaaaaatca taaggaaaag ttgtaaatat tattggtagt attcgtttgg 1260

taaagtagag ggggtaattt ttccccttta ttttgttcat acattcttaa attgctttgc 1320

ctctcctttt ggaaagctat acttcggagc actgttgagc gaaggctcat tagatatatt 1380

ttctgtcatt ttccttaacc caaaaataag ggaaagggtc caaaaagcgc tcggacaact 1440

gttgaccgtg atccgaagga ctggctatac agtgttcaca aaatagccaa gctgaaaata 1500

atgtgtagct atgttcagtt agtttggcta gcaaagatat aaaagcaggt cggaaatatt 1560

tatgggcatt attatgcaga gcatcaacat gataaaaaaa aacagttgaa tattccctca 1620

aaaatgtctt ctggtgctaa cggttcttct aagtctgctt ctcacaagat caagttcact 1680

aagttgttca tcaacggtga attcgttgac tctatctctg gtaacacttt cgacactatc 1740

aacccagcta ctgaagaagt tttggctact gttgctgaag gtagaaagga agacatcgac 1800

ttggctgtta aggctgctag agaagctttc gacaacggtc catggccaag aatgtctggt 1860

gaagctagaa gaaagatcat gttgaagttc gctgacttga tcgacgaaaa cgctgacgaa 1920

ttgactactt tggaagttat cgacggtggt aagttgttcg gtccagttag acacttcgaa 1980

gttccagttt cttctgacac tttcagatac ttcgctggtg ctgctgacaa gatcagaggt 2040

gctactttga agatgtcttc taacatccaa gcttacactt tgagagaacc aatcggtgtt 2100

gttggtcaca tcatcccatg gaacggtcca gctttcatgt tcgctactaa ggttgctcca 2160

gctttggctg ctggttgtac tatggttatc aagccagctg aacacactcc attgactgtt 2220

ttgttcttgg ctcacttgtc taagttggct ggtgttccag acggtgttat caacgttgtt 2280

aacggtttcg gtaagactgc tggtgctgct gtttcttctc acatggacat cgacatggtt 2340

actttcactg gttctactga atttggtaga actgttatgc aagctgctgc tttgtctaac 2400

ttgaagccag tttctttgga attgggtggt aagtctccat tgatcgtttt cgacgacgct 2460

gacgttgaca aggctgctga attcgctatc ttgggtaact tcactaacaa gggtgaaatg 2520

tgtgttgctg gttctagagt tttcgttcaa gaaggtatcc acgacgtttt cgttaagaag 2580

ttggaaggtg ctgttaaggc ttgggctact agagacccat tcgacttggc tactagacac 2640

ggtccacaaa acaacaagca acaatacgac aaggttttgt cttgtatcaa ccacggtaag 2700

aaggaaggtg ctactttggt tactggtggt aagccattcg gtaagaaggg ttactacatc 2760

gaaccaactt tgttcactaa cgttactgac gacatgacta tcgctaagga agaaatcttc 2820

ggtccagtta tctctgtttt gaagttcaag actgttgaag aagttatcaa gagagctaac 2880

gctactaagt acggtttggc ttctggtgtt ttcactaaga acatcgacgt tgttaacact 2940

gtttctagat ctttgagagc tggtgctgtt tgggttaact gttacttggc tttggacaga 3000

gacgctccac acggtggtta caatatgtct ggtttcggta gagaacaagg tttggaagct 3060

ttggaacact acttgcaaat caagactgtt gctactccaa tctacgactc tccatggttg 3120

taaataaagc aatcttgatg aggataatga tttttttttg aatatacata aatactaccg 3180

tttttctgct agattttgtg aagacgtaaa taagtacata ttacttttta agccaagaca 3240

agattaagca ttaactttac ccttttctct tctaagtttc aatactagtt atcactgttt 3300

aaaagttatg gcgagaacgt cggcggttaa aatatattac cctgaacgtg gtgaattgaa 3360

gttctaggat ggtttaaaga tttttccttt ttgggaaata agtaaacaat atattgctgc 3420

ctttgcaaaa cgcacatacc cacaatatgt gactattggc aaagaacgca ttatcctttg 3480

aagaggtgga tactgatact aagagagtct ctattccggc tccactttta gtccagagat 3540

tacttgtctt cttacgtatc agaacaagaa agcatttcca aagtaattgc atttgccctt 3600

gagcagtata tata 3614

<210> 2

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtcttctg gtgctaacgg ttcttctaag tctgcttatc acaagatcaa gttcactaag 60

ttgttcatca acggtgaatt cgttgactct atctctggta acactttcga cactatcaac 120

ccagctactg aagaagtttt ggctactgtt gctgaaggta gaaaggaaga catcgacttg 180

gctgttaagg ctgctagaga agctttcgac aacggtccat ggccaagaat gtctggtgaa 240

gctagaagaa agatcatgtt gaagttcgct gacttgatcg acgaaaacgc tgacgaattg 300

actactttgg aagttatcga cggtggtaag ttgttcggtc cagttagaca cttcgaagtt 360

ccagtttctt ctgacacttt cagatacttc gctggtgctg ctgacaagat cagaggtgct 420

actttgaaga tgtcttctaa catccaagct tacactttga gagaaccaat cggtgttgtt 480

ggtcacatca tcccatggaa cggtccagct ttcatgttcg ctactaaggt tgctccagct 540

ttggctgctg gttgtactat ggttatcaag ccagctgaaa gaactccatt gactgttttg 600

ttcttggctc acttgtctaa gttggctggt gttccagacg gtgttatcaa cgttgttaac 660

ggtttcggta agactgctgg tgctgctgtt tcttctcaca tggacatcga catggttact 720

ttcactggtt ctactgaagt tggtagaact gttatgcaag ctgctgcttt gtctaacttg 780

aagccagttt ctttggaatt gggtggtaag tctccattga tcgttttcga cgacgctgac 840

gttgacaagg ctgctgaatt cgctatcttg ggtaacttca ctaacaaggg tgaaatgtgt 900

gttgctggtt ctagagtttt cgttcaagaa ggtatccacg acgttttcgt taagaagttg 960

gaaggtgctg ttaaggcttg ggctactaga gacccattcg acttggctac tagacacggt 1020

ccacaaaaca acaagcaaca atacgacaag gttttgtctt gtatcaacca cggtaagaag 1080

gaaggtgcta ctttggttac tggtggtaag ccattcggta agaagggtta ctacatcgaa 1140

ccaactttgt tcactaacgt tactgacgac atgactatcg ctaaggaaga aatcttcggt 1200

ccagttatct ctgttttgaa gttcaagact gttgaagaag ttatcaagag agctaacgct 1260

actaagtacg gtttggcttc tggtgttttc actaagaaca tcgacgttgt taacactgtt 1320

tctagatctt tgagagctgg tgctgtttgg gttaactgtt acttggcttt ggacagagac 1380

gctccacacg gtggttacaa gatgtctggt ttcggtagag aacaaggttt ggaagctttg 1440

gaacactact tgcaaatcaa gactgttgct actccaatct acgactctcc atggttgtaa 1500

<210> 3

<211> 2700

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtctgaaa agccaacctt gttctctgct tacaagatgg gtaacttcaa cttgtctcac 60

agagttgttt tggctccaat gaccagatgt agagctatca acgctatccc aaacgaagct 120

ttggttgaat actacagaca aagatctacc gctggtggtt tcttgatcac cgaaggtacc 180

atgatctctc catcttctgc tggtttccca cacgttccag gtatcttcac caaggaacaa 240

gttgaaggtt ggaagaaggt tgttgacgct gctcacaagg aaggtgctgt tatcttctgt 300

caattgtggc acgttggtag agcttctcac aaggtttacc aaccaggtgg tgctgctcca 360

atctcttcta cctctaagcc aatctctaag aagtgggaaa tcttgttgcc agacgctacc 420

tacggtacct acccagaacc aagaccattg gctgctaacg aaatcttgga agttgttgaa 480

gactacagag ttgctgctat caacgctatc gaagctggtt tcgacggtat cgaaatccac 540

ggtgctcacg gttacttgtt ggaccaattc atgaaggacg gtatcaacga cagaaccgac 600

gaatacggtg gttctttgga aaacagatgt aagttcatct tgcaagttgt tcaagctgtt 660

tctgctgcta tcggtaccga cagagttggt atcagaatct ctccagctat cgaccacacc 720

gacgctatgg actctgaccc aagatctttg ggtttggctg ttatcgaaag attgaacaag 780

ttgcaattca agttgggttc tagattggct tacttgcacg ttacccaacc aagatacacc 840

gctgacggtc acggtcaaac cgaagctggt gctaacggtt ctgaccacga agaagaagtt 900

gctcaattga tgaagacctg gagaggtgct tacgttggta ccttcatctg ttgtggtggt 960

tacaccagag aattgggttt gcaagctgtt gctcaaggtg acgctgactt ggttgctttc 1020

ggtagatact tcatctctaa cccagacttg gttttgagat tgaagttgaa cgctccattg 1080

aacagatacg acagagctac cttctacacc cacgacccag ttgttggtta caccgactac 1140

ccatctttgg accaaggttc tttgttggca gaagccgctg caaaagaagc ggctgctaaa 1200

gcttcttctg gtgctaacgg ttcttctaag tctgcttctc acaagatcaa gttcactaag 1260

ttgttcatca acggtgaatt cgttgactct atctctggta acactttcga cactatcaac 1320

ccagctactg aagaagtttt ggctactgtt gctgaaggta gaaaggaaga catcgacttg 1380

gctgttaagg ctgctagaga agctttcgac aacggtccat ggccaagaat gtctggtgaa 1440

gctagaagaa agatcatgtt gaagttcgct gacttgatcg acgaaaacgc tgacgaattg 1500

actactttgg aagttatcga cggtggtaag ttgttcggtc cagttagaca cttcgaagtt 1560

ccagtttctt ctgacacttt cagatacttc gctggtgctg ctgacaagat cagaggtgct 1620

actttgaaga tgtcttctaa catccaagct tacactttga gagaaccaat cggtgttgtt 1680

ggtcacatca tcccatggaa cggtccagct ttcatgttcg ctactaaggt tgctccagct 1740

ttggctgctg gttgtactat ggttatcaag ccagctgaaa gaactccatt gactgttttg 1800

ttcttggctc acttgtctaa gttggctggt gttccagacg gtgttatcaa cgttgttaac 1860

ggtttcggta agactgctgg tgctgctgtt tcttctcaca tggacatcga catggttact 1920

ttcactggtt ctactgaagt tggtagaact gttatgcaag ctgctgcttt gtctaacttg 1980

aagccagttt ctttggaatt gggtggtaag tctccattga tcgttttcga cgacgctgac 2040

gttgacaagg ctgctgaatt cgctatcttg ggtaacttca ctaacaaggg tgaaatgtgt 2100

gttgctggtt ctagagtttt cgttcaagaa ggtatccacg acgttttcgt taagaagttg 2160

gaaggtgctg ttaaggcttg ggctactaga gacccattcg acttggctac tagacacggt 2220

ccacaaaaca acaagcaaca atacgacaag gttttgtctt gtatcaacca cggtaagaag 2280

gaaggtgcta ctttggttac tggtggtaag ccattcggta agaagggtta ctacatcgaa 2340

ccaactttgt tcactaacgt tactgacgac atgactatcg ctaaggaaga aatcttcggt 2400

ccagttatct ctgttttgaa gttcaagact gttgaagaag ttatcaagag agctaacgct 2460

actaagtacg gtttggcttc tggtgttttc actaagaaca tcgacgttgt taacactgtt 2520

tctagatctt tgagagctgg tgctgtttgg gttaactgtt acttggcttt ggacagagac 2580

gctccacacg gtggttacaa gatgtctggt ttcggtagag aacaaggttt ggaagctttg 2640

gaacactact tgcaaatcaa gactgttgct actccaatct acgactctcc atggttgtaa 2700

<210> 4

<211> 3565

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatttgccag cttactatcc ttcttgaaaa tatgcactct atatctttta gttcttaatt 60

gcaacacata gatttgctgt ataacgaatt ttatgctatt ttttaaattt ggagttcagt 120

gataaaagtg tcacagcgaa tttcctcaca tgtagggacc gaattgttta caagttctct 180

gtaccaccat ggagacatca aagattgaaa atctatggaa agatatggac ggtagcaaca 240

agaatatagc acgagccgcg aagttcattt cgttactttt gatatcgctc acaactattg 300

cgaagcgctt cagtgaaaaa atcataagga aaagttgtaa atattattgg tagtattcgt 360

ttggtaaagt agagggggta atttttcccc tttattttgt tcatacattc ttaaattgct 420

ttgcctctcc ttttggaaag ctatacttcg gagcactgtt gagcgaaggc tcattagata 480

tattttctgt cattttcctt aacccaaaaa taagggaaag ggtccaaaaa gcgctcggac 540

aactgttgac cgtgatccga aggactggct atacagtgtt cacaaaatag ccaagctgaa 600

aataatgtgt agctatgttc agttagtttg gctagcaaag atataaaagc aggtcggaaa 660

tatttatggg cattattatg cagagcatca acatgataaa aaaaaacagt tgaatattcc 720

ctcaaaaatg tctgaaaagc caaccttgtt ctctgcttac aagatgggta acttcaactt 780

gtctcacaga gttgttttgg ctccaatgac cagatgtaga gctatcaacg ctatcccaaa 840

cgaagctttg gttgaatact acagacaaag atctaccgct ggtggtttct tgatcaccga 900

aggtaccatg atctctccat cttctgctgg tttcccacac gttccaggta tcttcaccaa 960

ggaacaagtt gaaggttgga agaaggttgt tgacgctgct cacaaggaag gtgctgttat 1020

cttctgtcaa ttgtggcacg ttggtagagc ttctcacaag gtttaccaac caggtggtgc 1080

tgctccaatc tcttctacct ctaagccaat ctctaagaag tgggaaatct tgttgccaga 1140

cgctacctac ggtacctacc cagaaccaag accattggct gctaacgaaa tcttggaagt 1200

tgttgaagac tacagagttg ctgctatcaa cgctatcgaa gctggtttcg acggtatcga 1260

aatccacggt gctcacggtt acttgttgga ccaattcatg aaggacggta tcaacgacag 1320

aaccgacgaa tacggtggtt ctttggaaaa cagatgtaag ttcatcttgc aagttgttca 1380

agctgtttct gctgctatcg gtaccgacag agttggtatc agaatctctc cagctatcga 1440

ccacaccgac gctatggact ctgacccaag atctttgggt ttggctgtta tcgaaagatt 1500

gaacaagttg caattcaagt tgggttctag attggcttac ttgcacgtta cccaaccaag 1560

atacaccgct gacggtcacg gtcaaaccga agctggtgct aacggttctg accacgaaga 1620

agaagttgct caattgatga agacctggag aggtgcttac gttggtacct tcatctgttg 1680

tggtggttac accagagaat tgggtttgca agctgttgct caaggtgacg ctgacttggt 1740

tgctttcggt agatacttca tctctaaccc agacttggtt ttgagattga agttgaacgc 1800

tccattgaac agatacgaca gagctacctt ctacacccac gacccagttg ttggttacac 1860

cgactaccca tctttggacc aaggttcttt gttggcagaa gccgctgcaa aagaagcggc 1920

tgctaaagct gctcaaaagg ctccaggtgt tatcacttgt aaggctgctg ttgtttggga 1980

atcttctggt ccagttgttt tggaagaaat cagagttgac ccaccaaagg cttctgaagt 2040

tagaatcaag atgttgtgtg cttctttgtg tcacactgac gttttgtgta ctaagggttt 2100

cccaatccca ttgttcccaa gaatcccagg tcacgaaggt gttggtgtta tcgaatctat 2160

cggtaaggac gctaagggtt tgaagccagg tgacatcgtt atgccattgt acttgggtga 2220

atgtggtcaa tgtttgaact gtaagactgg taagactaac ttgtgtcacg tttacccacc 2280

atctttctct ggtttgatga acgacggtac ttctagaatg tctatcgcta gaactggtga 2340

atctatctac cacttcgctt cttgttctac ttggactgaa tacgctgttg ctgactgtaa 2400

ctacgttttg aagatcaacc caaagatctc ttacccacac gcttctttct tgtcttgtgg 2460

tttcactact ggtttcggtg ctacttggag agaaactcaa gtttctaagg gttcttctgt 2520

tgctgttttc ggtatcggta ctgttggttt gggtgttatc aagggtgctc aattgcaagg 2580

tgcttctaag atcatcggtg ttgacgttaa ccaatacaag gctgctaagg gtaaggtttt 2640

cggtatgact gacttcatca acccaaagga ccacccagac aagtctgttt ctgaattggt 2700

taaggaattg actcacggtt tgggtgttga ccactgtttc gaatgtactg gtgttccatc 2760

tttgttgaac gaagctttgg aagcttctaa gatcggtatc ggtactgttg ttccaatcgg 2820

tgctggtggt gaagcttctg ttgctatcaa ctctttgatc ttgttctctg gtagaacttt 2880

gaagttcact gctttcggtg gtgttagaac tcaatctgac ttgccagtta tcatcgacaa 2940

gtgtttgaac aaggaaatcc aattggacga attgttgact cacgaaatcc acttggacaa 3000

catccaagaa gctttcgaaa tcttgaagaa gccagactgt gttaagatct tgatcaagtt 3060

ctaaacaggc cccttttcct ttgtcgatat catgtaatta gttatgtcac gcttacattc 3120

acgccctccc cccacatccg ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta 3180

ggtccctatt tattttttta tagttatgtt agtattaaga acgttattta tatttcaaat 3240

ttttcttttt tttctgtaca aacgcgtgta cgcatgtaac attatactga aaaccttgct 3300

tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt aatttgcaag cttcgcagtt tacactctca 3360

tcgtcgctct catcatcgct tccgttgttg ttttccttag tagcgtctgc ttccagagag 3420

tatttatctc ttattacctc taaaggttct gcttgatttc tgactttgtt cgcctcatgt 3480

gcatattttt cttggttctt ttgggacaaa atatgcgtaa aggacttttg ttgttccctc 3540

acattccagt ttagttgtcg acctg 3565

Claims (12)

1.一种提高二氢青蒿酸/青蒿酸比例的酿酒酵母工程菌，其特征在于，通过二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途径改造的酿酒酵母底盘菌株，其原有表达ALDH1的序列为表达突变的ALDH1^V247F的序列；其中，原有ALDH1的序列为GI号为422034338的蛋白序列，ALDH1^V247F即ALDH1第247位的缬氨酸突变为苯丙氨酸。

2.根据权利要求1所述酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母底盘菌株为市售CEN.PK2系酿酒酵母。

3.根据权利要求1所述酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述表达突变的ALDH1^V247F的序列为表达ALDH1^V247F的序列或表达DBR2和ALDH1^V247F的融合蛋白的序列。

4.根据权利要求1-3任意一项所述酿酒酵母工程菌，其特征在于，还包括，原有表达DBR2的序列为表达DBR2和ADH1的融合蛋白的序列。

5.权利要求1-4任意一项所述酿酒酵母工程菌在生产二氢青蒿酸或以二氢青蒿酸为中间产物的产品中的应用。

6.ALDH1^V247F及其编码序列在构建生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌中的应用。

7.DBR2和ALDH1^V247F的融合蛋白及其编码序列在构建生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌中的应用。

8.权利要求1所述酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括：

步骤1、以根据二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途径改造的底盘菌株作为出发菌株，所述底盘菌株通过基因整合和/或质粒导入的方式至少将ADS、CYP71AV1、CPR1、CYB5、 ADH1、DBR2和ALDH1的编码序列转入；

步骤2、若原有表达ALDH1的序列预通过质粒导入的方式转入底盘菌株，则利用质粒上原有表达ALDH1的序列的两端酶切位点，对表达突变的ALDH1^V247F的序列进行处理，通过酶切方式替换掉原有表达ALDH1的序列，然后再将质粒转入底盘菌株；

若原有表达ALDH1的序列是通过基因整合方式转入底盘菌株，则利用原有表达ALDH1的序列的上、下游序列合成上、下游同源臂，通过OE-PCR和质粒酶切方式将上、下游同源臂与表达突变的ALDH1^V247F的序列连接起来，获得上游同源臂+表达ALDH1^V247F的序列+下游同源臂的片段，通过电转化方式将该片段转入到酿酒酵母中，通过酿酒酵母同源重组机制，利用同源臂替换掉原有表达ALDH1的序列。

9.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述ADS、CYP71AV1、DBR2的编码序列通过质粒导入的方式转入底盘菌株中，所述CPR1、CYB5、 ADH1和ALDH1通过基因整合的方式转入底盘菌株中。

10.根据权利要求8或9所述构建方法，其特征在于，还包括：

合成表达DBR2和ADH1的融合蛋白的序列并替换原有表达DBR2的序列。

11.根据权利要求 10所述构建方法，其特征在于，若原有表达DBR2的序列预通过质粒导入的方式转入底盘菌株，则利用质粒上原有表达DBR2的序列的两端酶切位点，对表达DBR2和ADH1的融合蛋白的序列进行处理，通过酶切方式替换掉原有表达DBR2的序列，然后再将质粒转入底盘菌株；

若原有表达DBR2的序列是通过基因整合方式转入底盘菌株，则利用原有表达DBR2的序列的上、下游序列合成上、下游同源臂，通过OE-PCR方式将上、下游同源臂与表达DBR2和ADH1的融合蛋白的序列连接起来，获得上游同源臂+表达DBR2和ADH1的融合蛋白的序列+下游同源臂的片段，通过电转化方式将该片段转入到酿酒酵母中，通过酿酒酵母同源重组机制，利用同源臂替换掉原有表达DBR2的序列。

12.一种提高二氢蒿酸/青蒿酸比例的方法，其特征在于，采用权利要求1-4任意一项所述酿酒酵母工程菌进行发酵生产。

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