KR101123213B1 - 미생물 전자전달계 및 탄소원 대사경로가 재설계된 재조합 대장균 생촉매 - Google Patents

미생물 전자전달계 및 탄소원 대사경로가 재설계된 재조합 대장균 생촉매 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물 전자전달계 및 탄소원 대사경로가 재설계된 재조합 대장균 생촉매 및 이를 이용한 광학활성 스티렌옥사이드 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미생물 전자전달계 내 NAD(P)H 탈수소효소의 유전자를 변형 또는 결실시켜 NAD(P)H의 전자전달계로의 유입을 막거나; 탄소원 대사경로의 재설계를 통해 각종 유기산의 생성을 막고 NAD(P)H의 생성속도와 탄소원 소모 대비 NAD(P)H의 생산 수율을 향상시킴으로써 NAD(P)H의 세포 내 연속적 재생이 필요한 산화반응의 속도와 수율을 증대시키는 재조합 대장균 생촉매에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 생촉매에 스티렌 산화효소와 샤페론 단백질이 동시 발현되고 더 나아가 스티렌을 세포내로 전달하는 단백질이 과발현되어, 스티렌 옥사이드의 생성활성이 획기적으로 증가되도록 한 스티렌 산화효소 발현 재조합 대장균 생촉매에 관한 것이다.
대장균 생촉매, 전자전달계, 탄소원 대사경로 재설계, NAD(P)H, 스티렌 산화효소, 샤페론 단백질

Description

미생물 전자전달계 및 탄소원 대사경로가 재설계된 재조합 대장균 생촉매{Recombinant E.coli. biocatalyst having mutations in electron transport chain and re-designed carbon metabolic pathways}
본 발명은 NAD(P)H의 세포 내 연속적 재생이 필요한 산화반응의 속도와 수율을 증대시키기 위하여 미생물 전자전달계 및 탄소원 대사경로가 재설계된 재조합 대장균 생촉매 및 이를 이용한 광학활성 스티렌옥사이드 생산방법에 관한 것이다.
최근 많은 화학 반응에 효소나 전세포 생촉매 이용이 크게 증가하고 있다. 일반적으로 생촉매는 화학촉매에 비해 반응속도가 떨어지는 단점이 있지만 상온 상압의 온화한 조건에서 반응을 진행시키고 반응특이성이 우수하다는 장점이 있다.
특히 효소의 경우 사용의 편리함과 높은 효율성 때문에 광학활성을 갖는 화합물의 유기합성에 많이 사용된다. 하지만 효소정제에 많은 비용이 소요되고 정제과정이나 반응 중 활성이 안정하지 못하다는 단점이 있다. 이에 비해 전세포 생촉매는 정제 비용이 필요 없고, 반응 중 촉매 활성이 비교적 안정적으로 유지된다는 장점이 있다. 또한 조효소가 필요하거나 여러 단계의 반응을 수반하는 공정의 경우에는 전세포를 사용하는 것이 거의 필수적인 것으로 알려져 있다.
산화효소 전세포 생촉매는 공업적으로 특히 중요하다. 산화효소는 탄소-탄소 이중결합에 특이적으로 산소를 도입하여 광학활성 에폭사이드(chiral epoxide)를 만든다. 에폭사이드는 환형구조의 불안정성과 산소 원자의 전기음성도에 기인한 극성 때문에 반응성이 대단히 우수하여 친전자성반응, 친핵성반응, 산염기반응, 산화환원반응 등 다양한 반응을 유도할 수 있다.
이에 따라 광학 활성 에폭사이드는 광학활성 의약품, 농약, 기능성 식품 합성 중간체 등으로 널리 사용된다. 이러한 광학활성 에폭사이드는 산화효소 이외에 에폭사이드 하이드롤라제 (epoxide hydrolase)로도 제조할 수도 있다. 이 경우 에폭사이드의 라세믹 혼합물을 기질로 사용하며 가수분해 속도가 느린 이성질체를 최종 제품으로 얻게 된다.
산화효소와 비교할 때 효소반응 자체는 간단하지만 원료 대비 최종 제품의 수율이 50 % 이하로 낮고 또한 최종 제품의 순도도 떨어진다는 단점이 있다.
여러 산화 효소 중 스티렌 산화효소(styrene monooxygenase, SMO)는 스티렌을 광학활성 스티렌옥사이드로 전환하는 효소이다. 광학활성 스티렌옥사이드는 네마토시드(nematocide), 레바미솔(levamisole) 등 항암제나 β-차단제인 고혈압 치료제와 같은 의약품, 그리고 다양한 고부가가치 정밀화학제품의 중간체 생산의 원료로 사용될 수 있다.
스티렌 산화반응은 다른 산화효소 반응과 마찬가지로 산소와 기질, 그리고 복합 효소가 관여하는 복잡한 반응이다. 또한 NADH와 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide; FAD)와 같은 조효소가 필수적으로 요구된다. 따 라서 SMO의 경우 정제된 효소 생촉매를 사용하는 것보다 전세포 생촉매를 사용하는 것이 더 유리하다.
스티렌 산화효소는 StyA 및 StyB 두 개의 단위체로 구성되어 있다. 이 두 단위체는 안정적이면서 활성이 있는 형태로, 그리고 이상적인 비율로 발현되어야 하기 때문에 발현의 최적화가 매우 어렵다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 멀티시스트론(multicistronic) 발현 벡터를 이용하거나 프로모터공학이나 단백질공학 등이 필요하다.
그리고 발현된 단백질의 재접힘 능력을 향상시켜서 활성이 있는 상태로 단백질을 축적하거나 분비 발현이 가능하도록 하는 재조합 균주의 개발이 시도되고 있는데 그 대표적인 사례가 샤페론 단백질의 도입이다.
샤페론 단백질은 단백질이 입체적 구조를 갖도록 도와주는 단백질을 말한다. 샤페론 단백질은 접힘이 되어있지 않거나 부분적으로만 접힘이 되어 있는 단백질과 결합하여 재접힘 시킴으로써 단백질의 활성이 감소되는 것을 막아주는 역할을 한다. 그리고 고온이나 심한 스트레스와 같은 환경에서 과잉 발현되어 세포를 보호하는 역할을 한다고도 알려져 있다.
단백질의 정확한 접힘은 단백질의 안정성과 생물학적 기능을 결정하고 분비경로에서 어긋나지 않도록 하기 때문에 단백질의 운명결정에 있어 중요한 문제이다. 따라서 특정 단백질의 대량생산에 샤페론을 응용하는 사례가 증가하고 있으며 스티렌 산화효소 전세포 생촉매에 적용 가능함이 입증되었다.
스티렌 산화효소에 의한 스티렌옥사이드 생성반응은 산소와 NADH의 신속한 공급을 위해 호기적인 조건에서 포도당과 같은 탄소원이 다량 공급되는 상태로 진행된다. 따라서 포도당이 해당과정과 TCA 회로를 통해 빠른 속도로 분해되며, NADH 또한 빠른 속도로 생산된다.
그러나 이렇게 생산된 NADH는 SMO 반응에 쓰이기보다는 대부분 전자전달계를 통해 산화되면서 ATP를 생합성하게 된다. 일반적으로 세포의 성장이 활발히 일어날 때는 이러한 ATP 합성이 필수적이다.
그러나 스티렌 산화반응이 목적일 때는 다량의 ATP가 필요치 않으며 전자전달계를 통한 NADH의 과도한 산화는 포도당, 산소 등의 수율을 떨어뜨릴 뿐이다. 특히 산소의 이용 효율은 반응기의 생산성과 밀접한 관계를 가진다. 왜냐하면 산소는 물에 대한 용해도와 기-액 전달 속도가 낮아 반응기 부피 생산성을 결정하기 때문이다.
따라서 NADH의 전자전달계 유입속도를 적절히 조절함으로써 포도당의 이용 효율은 물론 산소 이용효율도 증가시키는 것이 필요하다.
포도당 이용 효율도 SMO 반응의 최적화에 중요한 요소이다. 앞서 언급한대로 이 효율은 NADH의 생성, 전자전달계를 통한 NADH의 산화에 밀접한 관계가 있다. 뿐만 아니라 탄소 대사 경로와도 밀접한 관계를 갖는다. 즉 젖산이나 숙신산, 에탄올, 초산 등이 생성되면 포도당 소모 대비 스티렌 옥사이드의 생성효율이 감소하게 된다.
대장균의 탄소 대사 과정에서 에탄올이나 각종 유기산의 생성은 반응액 내 용존산소의 농도를 높게 유지해 줌으로써 어느 정도 방지할 수 있다. 그러나 포도 당의 세포 내 이송속도가 TCA 회로의 최대 허용 운전 속도보다 더 크게 되면 소위 말하는 과유량 대사(overflow metabolism)가 일어나고 초산 등의 생성은 필연적으로 뒤따르게 된다. 이 경우 젖산이나 초산을 생성하는 경로를 끊어 줌으로써 완전하지는 않지만 이를 부분적으로 해결할 수 있다고 알려진다.
NADH 대사는 전세포 산화 효소 반응의 포도당 및 산소 이용 효율에 영향을 미칠 뿐 아니라 반응속도(reaction kinetics) 측면에서 전세포의 SMO 활성에도 많은 영향을 미친다.
NADH는 스티렌 산화 반응의 기질로 작용하므로 세포 내 NADH 농도는 스티렌, FAD, 산소 등과 함께 반응속도에 직접 영향을 주게 된다. 따라서 NADH 생산 속도를 증가시키거나 이의 전자전달계 유입 속도를 낮추어 줌으로써 세포내 NADH 농도를 증가시킬 경우 전세포 촉매활성도 증가할 수 있다.
NADH의 세포내 농도는 앞서 언급한 NADH의 전자전달계 유입을 차단하거나 포도당의 분해가 펜토오스포스페이트(PP) 경로를 통해 일어나게 함으로써 가능하다. 특히 NADH의 전자 전달계 유입 방지조작은 포도당 대비 스티렌 옥사이드 생성 수율, 산소 이용 효율 등을 향상시킬 뿐 아니라 전세포 내 SMO 활성을 증가시킬 수 있을 것이 예상된다.
전세포 SMO 활성에 영향을 주는 또 한 가지 중요한 인자는 기질인 스티렌의 세포 내 유입속도이다. 일반적으로 산화 효소의 기질로 이용되는 작은 소수성 물질들은 확산에 의해 빠르게 세포막으로 전달된다. 그러나 분자의 크기가 크거나 전하를 띠는 물질들은 세포내로 쉽게 들어올 수 없기 때문에 기질의 업테이크(uptake) 는 생촉매 반응에 있어 속도결정 단계가 된다.
최근 스티렌을 탄소원으로 이용하는 미생물에 있어서 스티렌 산화 오페론은 스티렌 산화에 관여하는 styABCD 유전자와 함께 스티렌의 세포막 전달 단백질을 코딩하는 styE 유전자를 포함한다는 연구 결과가 보고된 바 있다.
또한 styE를 과발현시킬 경우 스티렌의 업테이크(uptake) 속도가 증가하고 스티렌 농도에 의해 조절되는 슈도모나스(Pseudomnas) 균주의 스티렌 산화 효소 오페론의 발현이 증가된다는 보고가 있었다. 대장균에도 세포막에 물질이동을 촉진하는 여러 단백질이 존재하는데 이중 긴사슬 지방산을 세포내로 전달하는 단백질로 밝혀진 대장균의 FadL 단백질은 StyE와 매우 유사한 유전자 및 아미노산 서열을 가지고 있다.
따라서 StyE나 FadL을 과발현시킴으로써 스티렌 업테이크(uptake) 속도를 증대시키고 이를 통해 전세포 SMO의 활성증대를 기대해 볼 수 있다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 목적은 고활성 스티렌 산화효소를 고효율로 발현시킬 수 있는 재조합 대장균 생촉매를 제공하는 데에 있다. 특히, 스티렌 산화효소(SMO), 샤페론(GroEL-GroES, DnaK-DnaJ-GrpE) 및 스티렌 전달 단백질(StyE 또는 FadL)이 과발현되며, 전자전달계와 탄소원 대사경로가 재설계된 재조합 대장균 생촉매를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 대장균 생촉매를 이용한 광학활성 스티렌옥사이드의 생산방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균 유전자 중 NAD(P)H 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 변형 또는 결실시켜 NAD(P)H의 전자전달계로의 유입을 차단시킨 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 생촉매를 제공한다.
상기 NAD(P)H 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 nuoG 또는 ndh이며, 상기 유전자가 결실된 재조합 대장균 생촉매는 E.coli BL21△nuoG, E.coli BL21△ndh 또는 E.coli BL21△nuoG△ndh이다.
또한, 본 발명은 NAD(P)H 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 변형 또는 결실시킨 상기 재조합 대장균 생촉매에서 탄소원 대사경로에 관여하는 젖산 탈수소효소를 코딩하는 유전자 또는 아세트산 생성효소를 코딩하는 유전자 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 변형 또는 결실시켜 탄소의 불필요한 소모를 막는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 생촉매를 제공한다.
상기 젖산 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 ldhA이고, 아세트산 생성효소를 코딩하는 유전자는 ack-pta이며, 상기 유전자가 결실된 재조합 대장균 생촉매는 E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 대장균 생촉매에서 스티렌 산화효소를 코딩하는 유전자, 샤페론을 코딩하는 유전자 또는 스티렌 세포전달 단백질을 코딩하는 유전자 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현 또는 발현시킨 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 생촉매를 제공한다.
상기 재조합 대장균 생촉매는 스티렌 산화효소(StyAB), 샤페론(GroEL-GroES, DnaK-DnaJ-GrpE) 및 스티렌 전달 단백질(StyE 또는 FadL)을 동시 발현한다.
상기 재조합 대장균 생촉매는 E. coli . BL21△nuoG△ldhA△ack - pta/pRSF_ABF;pGKJE8(수탁번호: KFCC11428P)이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 대장균 생촉매를 이용한 광학활성 스티렌옥사이드의 생산방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 상기 재조합 대장균 생촉매를 이용하여 균체를 성장시키는 단계; 상기 균체에 스티렌을 포함한 유기용매를 첨가하여 반응액을 제조하는 단계; 및 상기 반응액을 교반한 후, 유기용매층을 분리하는 단계를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 광학활성 스티렌옥사이드의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 전자전달계와 탄소원 대사경로 재설계, 샤페론과 기질 전달 단백 질의 과발현으로 특징지어지는 재조합 대장균 생촉매, 특히 고활성 및 고효율의 스티렌 산화효소 생산용 재조합 대장균 생촉매를 제공하며, 상기 재조합 대장균 생촉매를 이용하여 고활성의 광학활성 스티렌 옥사이드를 효율적으로 생산할 수 있다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 전자전달계 및 탄소원 대사경로가 재설계된 재조합 대장균 생촉매의 제작
특정 유전자가 결실된 대장균은 문헌에 보고된 방법(PNAS, 97: 12, 6640-6645, 2000)을 참고하여 제작하였다.
대장균 내의 전자전달계 복합체 I, 즉 NADH 탈수소효소를 코딩하는 nuoG 유전자의 제거를 위하여, 염색체 상의 nuoG 유전자와 pKD4 플라스미드 상의 항생제 단위(FRT-kan-FRT)와 각각 상보적인 혼합 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머는 표 1에 표시된 nuoGp1(서열번호 1)과 nuoGp2(서열번호 2)이었고, 표 2의 조건에서 PCR을 수행하였다.
프라이머 유전자형
nuoGp1 GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
nuoGp2 CATATGAATATCCTCCTTAG
ndhp1 GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
ndhp2 CATATGAATATCCTCCTTAG
ldhAp1 GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
ldhAp2 CATATGAATATCCTCCTTAG
ack-ptap1 GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
ack-ptap2 CATATGAATATCCTCCTTAG
styABp1 GGATCCATGAAAAAGCGTATC
styABp2 AAGCTTTCAATTCAGTGGCAA
styEp1 CATATGATGTTCTGCGCCT
styEp2 CTCGAGTCAGAAATTATGG
fadLp1 CATATGATGGTCATGAGC
fadLp2 CTCGAGTCAGAACGCGTA
조성 농도
주형 DNA 20 ng
정방향 프라이머 100 pmol
역방향 프라이머 100 pmol
dNTP 혼합물 400 pmol
Ultra pfu 1 unit
Ultra pfu 완충액 X1
반응 전체 용량 50 ㎕
PCR 산물은 정제한 후에 DpnI 제한효소로 처리하고 다시 정제하였다. 이후 이 최종산물을 미리 플라스미드 pKD46을 도입시켜 놓은 BL21(DE3)에 전기천공법(2.5kV, 25 mF, 2000Ω)을 이용하여 넣어 주었다. 그리고 얻어진 대장균을 즉시 LB배지(1 ml)로 옮겨 2시간 동안 배양함으로써 pKD46 플라스미드를 제거(curing)하였다.
제거(Curing)가 끝난 후, 약 1/3에 해당하는 양을 30 μg/ml 농도의 카나마이신이 포함되어 있는 고형 LB배지에 도말하였다. 항생제 내성을 가지고 있는 균주를 선발한 후 nuoG 부위에 대한 PCR을 수행하여 유전자 크기 변환 여부를 확인하였다.
최종적으로 카나마이신 유전자는 온도에 민감한 플라스미드 pCP20을 사용하여 제거하였다. 이렇게 제작된 균주는 카나마이신과 암피실린에 대한 저항성을 상실하였다. 카나마이신 유전자의 제거 여부는 앞서 사용한 것과 동일한 프라이머를 사용하여 nuoG 유전자의 크기가 줄어든 것으로 확인하였다.
따라서, 최종 E. coli BL21(DE3)△nuoG 변형대장균 숙주세포를 구축하였다.
유사한 방법으로, 또 다른 NADH 탈수소효소 유전자인 ndh, 젖산 탈수소 효소 유전자인 ldhA, 초산 생성효소 유전자인 ack-pta 를 개별적으로 또는 추가적으로 제거하였다.
사용된 프라이머는 표 1에 제시되어 있으며, 이때 유전자 증폭에 사용된 PCR 조건은 앞선 nuoG 유전자 제거의 경우와 동일하게 표 2에 나타내었다. 따라서 최종적으로 구축된 변형대장균 숙주세포는 표 3에 기재된 E.coli BL21(DE3)△nuoG, E.coli BL21(DE3)△ndh, E.coli BL21(DE3)△nuoG△ndh, E.coli BL21(DE3)△nuoG△ldhA△ack-pta 등 총 4종이었다.
유전자형
숙주 균주
E.coli BL21 Control
E.coli BL21△nuoG nuoG-
E.coli BL21△ndh ndh-
E.coli BL21△nuoG△ndh nuoG-,ndh-
E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta nuoG-,ldhA-,ack-pta-
플라스미드
pETAB2 T7p styAB ;pET31b(+)derivative; Apr
pGKJE8 Chaperone(DnaK-DnaJ-GrpE,GroEL-GroES)
pRSF_AB T7p styAB ;RSFDuet-1derivative; Kmr
pRSF_ABE T7p styAB, styE ;RSFDuet-1derivative; Kmr
pRSF_ABF T7p styAB, fadL ;RSFDuet-1derivative; Kmr
재조합 대장균 변이주
Group 1
1.1 E.coli BL21 /pETAB2
1.2 E.coli BL21△nuoG /pETAB2
1.3 E.coli BL21△ndh /pETAB2
1.4 E.coli BL21△nuoG△ndh /pETAB2
1.5 E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta /pETAB2
Group2
2.1 E.coli BL21/pETAB2;pGKJE8
2.2 E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta /pETAB2 ;pGKJE8
Group3
3.1 E.coli BL21/pRSF_AB
3.2 E.coli BL21/pRSF_ABE
3.3 E.coli BL21/pRSF_ABF
3.4 E.coli BL21△nuoG /pRSF_ABE
3.5 E.coli BL21△nuoG /pRSF_ABF
3.6 E.coli BL21△nuoG /pRSF_ABE ;pGKJE8
3.7 E.coli BL21△nuoG /pRSF_ABF ;pGKJE8
3.8 E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta /pRSF_ABE
3.9 E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta /pRSF_ABF
3.10 E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta /pRSF_ABE ;pGKJE8
3.11 E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta /pRSF_ABF ;pGKJE8
<실시예 2> 스티렌 산화효소(SMO)를 갖는 각종 유전자 재조합 균주의 개발
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 스티렌 산화효소(SMO)를 가지는 각종 유전자 재조합 대장균 18 종을 제작하였다. 이들은 3가지 그룹으로 분류할 수 있는데, 첫 번째 그룹은 탄소 대사경로 및 전자전달계의 경로 변경이 SMO 전세포 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 제작된 5 가지 균주이고, 두 번째 그룹은 첫 번째 그룹에 샤페론 영향을 조사하기 위해 제작된 2 가지 균주이며, 마지막으로 세 번째 그룹은 탄소 대사경로 및 전자전달계의 경로 변경, 샤페론 영향, 스티렌 세포막 전달 단백질 등의 영향을 동시에 살펴보기 위해 제작된 11 종의 균주이다.
첫 번째 그룹의 제작에는 중간 복제수(mid-copy number)를 갖는 pETAB2 벡터가 사용되었고 styAB 유전자는 T7 프로모터에 의해 발현되도록 제작되었다.
두 번째 그룹은 첫 번째 그룹 중 2 균주를 선발하여 샤페론을 과발현하는 pGKJE8를 추가로 삽입함으로 제작하였다. pGKJE8에서 GroEL-GroES 샤페론은 아라비노즈(arabinose)에 의해서, 그리고 DnaK-DnaJ-GrpE 샤페론은 테트라사이클린에 의해 발현되도록 제작되었다.
세 번째 그룹의 유전자 재조합 균주의 제작을 위해서는 2개의 클로닝 사이트를 가진 pRSFDuet-1 벡터(Novagen, USA)가 사용되었다. StyAB 및 세포 전달단백질 두 종류(StyE 혹은 FadL)를 각각의 클로닝 사이트에 삽입하였다. pRSFDuet-1 벡터 내에서 이들 유전자는 모두 T7 프로모터에 의해 발현되도록 제작되었다.
도 2는 본 발명의 재조합 플라스미드 pRSF_ABE와 pRSF_ABF의 유전자 지도이다.
먼저 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) SN1의 유전자를 주형 DNA로 하여, 스티렌 산화효소를 암호화하는 유전자 서열(styAB)로부터 제작한 프라이머(표 1 참조; 서열번호 9 및 10)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
이와 같은 방법으로 얻어진 DNA를 제한효소 BamHI과 HindIII 으로 절단한 후, 1 % 아가로즈 겔에서 전기영동하여 약 1.8 kb 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 동일한 제한효소로 절단한 플라스미드 pRSFDuet-1의 첫 번째 클로닝 사이트에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pRSFDuet-1::styAB를 제작하였다.
그 다음 다시 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) SN1의 유전자를 주형 DNA로 하여, 스티렌 세포 전달단백질을 암호화하는 유전자 서열(styE)로부터 제작한 프라이머(표 1 참조; 서열번호 11 및 12)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
이와 같은 방법으로 얻어진 DNA를 제한효소 NdeI과 XhoI 으로 절단한 후, 1 % 아가로즈 겔에서 전기영동하여 약 1.3 kb 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 동일한 제한효소로 절단한 플라스미드 pRSFDuet-1::styAB의 두 번째 클로닝 사이트에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pRSFDuet-1::styAB::styE(RSF_ABE)를 제작하였다.
이와 유사한 방법으로 대장균의 긴사슬 지방산 세포 전달단백질을 암호화 하는 유전자 서열(fadL)로부터 제작한 프라이머(표 1 참조; 서열번호 13 및 14)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
또한 얻어진 fadL DNA를 pRSFDuet-1::styAB의 두 번째 클로닝 사이트에 클로닝 하여 재조합 플라스미드 pRSFDuet-1::styAB ::fadL(RSF_ABF)를 제작하였다. 구축된 벡터 pRSF_ABE와 pRSF_ABF는 항생제인 카나마이신이 30 μg/ml의 농도로 포함된 LB 평판 배지에서 선별되었다.
새롭게 구축된 소수성 기질 운반단백질과 스티렌 산화 효소의 동시발현 벡터는 앞서 기술한 전기천공법에 따라 실시예 1 및 실시예 2에서 구축한 탄소 대사경로 및 전자전달계의 경로를 변경한 여러 대장균 숙주세포에 도입하였다.
이어서 새롭게 구축된 재조합 대장균에 세포 내 자기엉김 현상에 의한 불활성화를 방지하기 위해 샤페론 단백질(pGKJE8: GroEL-ES, DanK-DnaJ-GrpE)을 추가로 도입하였다.
<실시예 3> 탄소 대사경로 및 전자전달계의 경로를 변경한 재조합 대장균의 스티렌 산화효소의 활성능 조사
탄소 대사경로 및 전자전달계를 변경하고 pETAB2 벡터를 갖는 그룹 1에 속하는 재조합 변형대장균 5종(표 3)을 각각 100 μg/ml 엠피실린과 20 μg/ml 클로람페니콜을 첨가한 LB 배지를 이용하여 37℃에서 12시간 배양하였다.
이후, 이 배양액 1 ml을 취해 0.5 g/l 포도당과 0.1 g/l 티아민, 1.0 g/l 이스트 추출물, 그리고 100 μg/ml 엠피실린과 20μg/ml 클로람페니콜을 첨가한 50 ml의 최소배지를 넣은 500 ml 플라스크에 접종하여 30 ℃의 온도에서 200 rpm의 속도로 교반하며 배양하였다.
세 시간 동안 배양 후 스티렌 산화 효소의 유도를 위해 0.1 mM IPTG를 첨가 하였다. IPTG 첨가 후 4시간 동안 더 배양하고 이 후 배양액을 취하여 원심분리를 이용하여 균체를 수확하였다.
활성능을 측정하기 위해 수확된 균체는 인산화 칼륨 완충용액(50 mM, pH 7.0)에 현탁시켰고 스티렌을 2 μl 첨가하여 30℃, 200 rpm의 속도로 교반하면서 스티렌 옥사이드의 생성량은 시간에 따라 조사하였다.
그룹 2에 속하는 2 종류의 재조합 대장균도 그룹 1에 속하는 재조합 대장균과 동일한 방법으로 배양하였다. 다만 최소 배지에서 배양할 때 샤페론의 유도를 위해 0.5 g/l L-아라비노즈와 5 ug/l 테트라사이클린을 초기부터 배지에 넣어 주었다는 것이 차이점이다.
도 3a 및 도 3b는 그룹 1 및 그룹 2에 속하는 재조합 변형대장균의 비활성도를 나타내는 그래프이다. 스티렌 산화 효소의 비활성도는 단위세포중량당 활성유닛(U/g cell)으로 나타내었는데 1 U은 1 분의 반응 시간동안 1 μmol의 스티렌 옥사이드를 생성할 수 있는 활성을 의미한다.
도 3a에서 확인할 수 있듯이 탄소 대사경로 및 전자전달계의 경로를 변경한 숙주세포에서 전세포 스티렌 산화효소 활성이 증가하였다. 특히 nuoG 와 nuoG, ldh, ack-pta 유전자를 모두 결실한 두 변이주에서 전세포 스티렌 산화효소 활성이 각각 260, 230U/g-cell로 유전자를 결실하지 않은 숙주세포에 비해 250% 가까이 크게 증가하였다.
도 3b는 세포내 자기엉김 현상을 방지하는 샤페론(pGKJE8: GroEL-ES, DnaK-DnaJ-GrpE)을 도입한 그룹 2에 속하는 균주의 활성을 보여준다. 샤페론 단백질을 동시에 발현한 변이주(E.coli BL21/pETAB2;pGKJE8)의 전세포 스티렌 산화효소 활성이 180 U/g-cell로, 샤페론을 동시발현시키지 않은 변이주(E.coli BL21/pETAB2)에 비해 100% 가까이 크게 증가하였음을 확인하였다.
더 나아가 nuoG, ldhA, ack-pta 유전자를 제거한 숙주세포에 샤페론을 동시발현시킬 경우, 즉 E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta/pETAB2;pGKJE8의 경우, 스티렌 산화 효소 활성이 390 U/g-cell로 증가하였다. 이는 샤페론을 동시발현시키지 않은 변이주(E.coli BL21/pETAB2)에 비해 그 활성이 300% 가까이 획기적으로 증가한 결과이다.
이로써 본 발명에서 개발한 변형대장균이 스티렌 전세포 생촉매의 훌륭한 숙주세포가 되며, 이를 이용한 전세포 생촉매는 우수한 성능을 갖는 것으로 확인되었다.
<실시예 4> 소수성 기질 운반단백질과 스티렌 산화 효소의 동시발현 대장균 변이주의 스티렌 산화효소 활성능 측정
실시예 2에서 제조된 그룹 3에 속하는 소수성 기질 운반 단백질과 스티렌 산화 효소의 동시발현 재조합 균주 7종을 30 μg/ml 카나마이신과 20 μg/ml 클로람페니콜을 첨가한 LB 배지를 이용하여 37 ℃에서 12시간 배양하였다.
이후, 이 배양액 1 ml을 취해 0.5 g/l 포도당과 0.1 g/l 티아민, 1.0 g/l 이스트 추출물, 그리고 100 μg/ml 카나마이신과 20μg/ml 클로람페니콜을 첨가한 50 ml의 최소배지(500 ml 플라스크)에 접종하고, 이를 30 ℃에서 200 rpm의 속도로 교반하면서 배양하였다.
세 시간 동안 배양 후 스티렌 산화 효소(SMO)와 소수성 기질의 운반 단백질(styE 및 fadL)의 유도를 위해 0.1 mM IPTG를 첨가하였다. IPTG 첨가 후 4시간 더 배양한 후 원심분리를 이용하여 균체를 수확하였다. 샤페론의 유도가 필요한 경우 0.5 g/l L 아라비노즈와 5 ug/l 테트라사이클린을 최소 배지를 만든 후 미생물 접종 시 동시에 넣어 주었다.
그룹 3에 속하는 유전자 재조합 균주의 SMO 활성은 실시예 3에서 설명한 것과 동일한 방법으로 측정하였다.
도 4는 그룹 3에 속하는 재조합 대장균의 비활성도를 나타내는 그래프이다. Duet 벡터에 단순히 styAB를 클로닝한 E. coli BL21/pRSF_AB 균주의 경우 E. coli BL21/pETAB2와 유사한 100 U/g cell의 활성을 나타내었다. E. coli BL21/pRSF_AB에 기질 운반단백질인 styE와 fadL을 추가로 클로닝하여 발현시킨 E. coli BL21/pRSF_ABE 및 E. coli BL21/pRSF_ABF의 경우 활성이 각각 199 U/g cell 및 254 U/g cell로 나타났다.
이는 E. coli BL21/pRSF_AB 균주의 활성에 비해 각각 2 배 및 2.5 배 향상된 값으로, 기질 전달 속도의 증가에 의해 전세포 활성이 크게 증가함을 보여 주는 것이다. StyE 에 비해 FadL이 더 좋은 결과를 보여준 것은 후자가 대장균 유래 유전자이기 때문으로 추정된다.
NADH 탈수소효소의 결실 효과, 그리고 샤페론 동시 발현의 효과를 StyE 및 FadL 과발현의 효과와 동시에 조사하였다. pRSF_ABE와 pRSF_ABF를 각각 NADH 탈수소효소가 결실된 숙주 세포에 삽입한 경우, 380 U/g cell 및 420 U/g cell의 활성이 얻어졌다.
이는 E. coli BL21/pRSF_AB 균주의 활성에 비해 각각 3.8 배 및 4.2배 증가한 값이다. 또한 스티렌 기질 전달 단백질 과발현의 효과가 NADH 탈수소효소 제거에 의한 효과에 더 하여져서 나타남을 보여주는 결과이다.
마지막으로 기질 전달 단백질(FadL 및 StyE), NADH 탈수소효소 제거, 그리고 샤페론 과발현의 효과를 동시에 조사하였다. StyE가 사용된 E. coli BL21△nuoG/pRSF_ABE;pGKJE8의 경우 512 U/g-cell, 그리고 FadL이 사용된 E. coli BL21△nuoG/pRSF_ABF;pGKJE8의 경우 560 U/g-cell의 높은 활성이 얻어졌다.
이는 본 발명에서 고안한 모든 방법들이 모두 전세포 활성을 높이는데 기여하고 있음을 보여주는 결과이다. 최종적으로 얻어진 활성은 비교 대상 균주인 E.coli BL21/pETAB의 활성 100 U/g-cell에 비해 무려 5.6배 가까이 증가한 값이다.
<실시예 5> Shaking-flask에서의 광학활성 스티렌옥사이드의 생산
실시예 2에서 제작된 균주 중 E. coli BL21/pETAB2;pGKJE8, E. coli BL21△nuoG△ldhA△ack - pta/pETAB2;pGKJE8, E. coli BL21△nuoG△ldhA△ack - pta/pRSF_ABF, E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack - pta/pRSF_ABF;pGKJE8 등 4 가지 균주를 대상으로 실제 발효생산 조건에서 광학활성 스티렌 옥사이드 생성 성능을 조사하였다. Shaking-flask에서의 실험은 크게 2 단계로 진행 되었다.
첫 번째 단계는 균체 성장단계로 이에 사용된 배지 조성, 샤페론과 스티렌 산화효소의 유도조건, 그리고 기타 균체 배양조건은 실시예 2 및 실시예 4에서와 동일하였다. 성장을 마친 균체는 원심분리로 수확한 후, 0.2 %(w/v)의 포도당과 0.4 %(w/v)의 효모추출물이 포함된 새로운 최소배지 25 ml에 현탁하여 250 ml 플라스크에 옮겼다. 세포 초기농도는 0.3 g/L로 모든 균주에 대하여 동일하게 하고 기체 상을 모두 순수한 산소로 교체하였다.
또한, 2단계 생성 반응동안 세포의 성장과 SMO의 생합성이 지속적으로 일어날 것에 대비하여 IPTG 0.1 mM, arabinose 0.5 g/L, 테트라사이클린 5 μg/L를 추가하여 주었다.
두 번째 단계는 광학활성 스티렌옥사이드 생산 단계로 수용상-유기상 이상계에서 실시되었다. 반응을 개시하기 위해 앞서 언급한 균체 현탁액 25 ml에 2 %(v/v), 174 mM의 스티렌을 포함하는 유기용매(bis(2-ethylhexyl)phthalate, BEHP) 15 ml을 첨가하여 총 40 ml의 반응액이 되도록 하였다.
반응이 진행되는 동안 유기용매의 휘발이나 스티렌, 산소 등의 유출을 막기 위해 플라스크 입구를 테프론 재질의 워셔를 갖는 나사형 마개를 사용하여 밀봉하였다. 이상계 생성 반응은 30℃의 온도에서 200 rpm의 속도로 교반하며 18시간 동안 진행하였다.
한 시간 간격으로 샘플링을 하여 원심분리를 통해 유기용매 층을 분리하였다. 분리된 유기용매는 같은 양의 사이클로헥산을 첨가하여 스티렌과 생성된 광학활성 스티렌옥사이드를 추출하여 가스크로마토그래피로 분석하였다.
도 5는 수용상-유기상의 이상계 반응에서 시간에 따른 광학활성 스티렌옥사이드의 생산을 보여주는 그래프이다. 샤페론을 갖는 재조합 대장균(E. coli BL21/pETAB2;pGKJE8)은 이상계 반응에서 초기 8시간 기간 동안 170 U/g-cell의 구간 평균 활성을 보여주었으며, 이 균주에 탄소 대사경로 및 전자전달계의 경로를 변경한 재조합 대장균(E. coli BL21△nuoG△ldhA△ack - pta/pETAB2;pGKJE8)은 이상계 반응초기 8시간 기간에서 300 U/g-cell의 높은 구간 평균 활성을 보여주었다.
한편 기질 전달 단백질(FadL), NADH 탈수소효소 제거, 그리고 샤페론 과발현이 모두 조합된 유전자 재조합 대장균(E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta/pRSF_ABF;pGKJE8)의 경우 이상계 반응에서 초기 6시간 기간에서 550 U/g-cell의 구간 평균 활성을 보여주었다.
이러한 결과는 앞서 실시예 3과 실시예 4에서 측정한 전세포의 고활성이 플라스크를 이용하는 실제 광학활성 옥사이드 생산반응에서도 그대로 유지된다는 것을 증명하고 있다.
따라서 본 실시예를 통하여 탄소 대사경로 및 전자전달계의 경로를 변경한 숙주세포가 상업적으로 중요한 이상계 반응에서 스티렌 산화효소 전세포 생촉매의 우수한 활성을 장기간 유지 시켜줌으로써 본 발명이 상업적으로 매우 매력적임을 증명하였다.
<실시예 6> 광학활성 스티렌옥사이드 생성을 위한 이상계 반응에서 물질 수지식
탄소 대사경로 및 전자 전달계의 경로, 그리고 샤페론 및 스티렌 전달 단백질이 클로닝된 각종 유전자 재조합 균주에 대하여 세포가 자라지 않는 조건에서 12 시간 동안 2 상계 반응을 행하고 물질 수지를 조사하였다.
세포의 배양, 2단계 반응 조건 등은 실시예 5와 동일하게 하였다. 다만 2단계 반응기간 동안 세포의 성장을 막기 위해 이스트 추출물을 넣지 않았고 또한 세포 농도를 낮게 유지하여 12시간 반응기간 동안 기질인 스티렌, 산소 등이 고갈되지 않도록 하였다.
이상계 반응이 진행되는 동안 유기상 및 수용액상 그리고 기상의 샘플을 주기적으로 취하여 기질, 대사 반응물, 생성물 등을 가스크로마토그래피, HPLC, LC-MS 등으로 측정하였다. 표 4에서 표시한 바와 같이 균주의 종류에 상관없이 1 mol의 스티렌으로부터 거의 1 mol의 스티렌 옥사이드가 생산되었다. 이는 생성된 옥사이드가 더 이상 산화되지 않는다는 것을 의미한다.
또한 스티렌 옥사이드 생성과정에서 포도당 사용량이 균주에 따라 많은 차이가 났다. 탄소원 대사경로를 변화시키지 않은 숙주세포를 사용한 경우, 즉 E. coli BL21나 E. coli BL21(DE3)△nuoG의 경우 플라스미드 종류에 관계없이 아세트산, 에탄올, 젖산 등이 배지에 축적되었고 그 양도 매우 유사하였다.
반면, 탄소 대사경로에서 이들 유기산이나 에탄올 생성하는 유전자를 결실시킨 숙주세포(E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta)의 경우는 아세트산, 젖산, 에탄올 등이 전혀 검출되지 않았다. 따라서 소모되는 포도당은 모두 이산화탄소로 전환되었고, 포도당의 수율이 증가하는 결과를 가져왔다.
일반적으로 대장균의 포도당 대사에서 유기산이나 에탄올은 주로 혐기 조건에서 많이 생성되는데 표 4의 결과는 이상계 반응 동안 대장균 내 혐기 대사 관련 활성을 높아진다는 것을 의미한다.
스티렌 + a 산소 + b 글루코오스 -----> c 스티렌옥사이드 + d 이산화탄소 + e 아세트산 + f 에탄올 + g 젖산
균주 a b c d e f g 탄소
회수율
E. coli BL21/
pETAB2;pGKJE8		 1.66 0.63 0.99 1.74 0.82 0.10 0.067 100.0%
E. coli BL21
△nuoG/pETAB2		 1.32 0.48 0.99 1.32 0.62 0.078 0.052 99.7%
E. coli BL21
△nuoG△ldhA
△ack-pta/pETAB2		 1.33 0.20 0.98 1.33 0.0 0.0 0.0 98.0%
E. coli BL21/
pETAB2;pGKJE8		 1.65 0.62 0.99 1.71 0.81 0.08 0.061 98.7%
E. coli BL21/pRSF_ABF 1.67 0.64 0.99 1.73 0.80 0.11 0.065 97.5%
E. coli BL21
△nuoG△ldhA
△ack-pta/pRSF_ABF		 1.31 0.22 0.99 1.30 0.0 0.0 0.0 98.5%
E. coli BL21
△nuoG△ldhA△ack- pta/pRSF_ABF;pGKJE8		 1.32 0.21 0.99 1.25 0.0 0.0 0.0 99.2%
1. 탄소 회수율은 소모된 포도당을 대상으로 측정함
표 5에서는 표 4의 결과를 바탕으로 스티렌옥사이드 생성에 필요한 산소, 포도당, 그리고 NADH 양을 계산하였다. 이때 포도당의 완전 산화로 얻어지는 NADH 양을 포도당 1 mol 당 10.0 mol로 가정하였다. 미생물이 1 mol의 스티렌옥사이드를 생산하는데 필요한 산소의 양은 nuoG를 제거하였을 때 약 20% 감소하였다. 포도당 필요량은 nuoG를 제거하였을 때 약 24% 감소하였고, 유기산 및 에탄올 경로를 추가적으로 차단하였을 때 거의 65%가 감소하였다.
한편 포도당 소모에 따른 NADH 생성량은 혐기 발효 경로의 차단 여부에 따라 큰 차이가 났다. 마지막으로 스티렌 옥사이드 생성에 필요한 NADH의 양(YNADH / SO)은 단지 nuoG 유전자의 결실 여부에 따라 결정되었으며, nuoG가 결실되었을 때 약 27% 감소하는 결과가 얻어졌다.
균주 YSO/S YO2/SO Yglu/SO YNADH/glu YNADH/SO
E. coli BL21/pETAB2;pGKJE8 0.99 1.68 0.64 4.76 3
E. coli BL21△nuoG/pETAB2 0.99 1.33 0.48 4.58 2.3
E. coli BL21
△nuoG△ldhA△ack-pta/pETAB2		 0.99 1.36 0.20 9.82 2.1
E. coli BL21/pETAB2;pGKJE8 0.99 1.67 0.63 4.57 2.8
E. coli BL21/pRSF_ABF 0.99 1.69 0.65 4.77 3.1
E. coli BL21△nuoG
△ldhA△ack-pta/pRSF_ABF		 0.99 1.32 0.22 9.97 2.2
E. coli BL21△nuoG△ldhA
△ack-pta/pRSF_ABF;pGKJE8		 0.99 1.33 0.21 9.78 1.9
1. 수율은 모두 mol/mol로 계산됨.
2. 첨자약어: SO, styrene oxide; S, styrene; glu, glucose
3. 포도당이 완전히 산화될 때 최대 NADH 수율을 10.0 mol/mol 글루코오스로 가정함.
이 결과는 혐기 경로를 차단함으로써 포도당 이용효율이 올라간다는 것을 증명해준다. 또한 nuoG가 결실될 때 일어나는 산소 수율 및 NADH 수율의 향상은 NADH가 전자전달계를 통하여 산화되는 것을 방지한 결과임을 입증한다.
따라서 본 발명에서 개발된 유전자 재조합 균주는 높은 SMO 활성을 가지고 있을 뿐 아니라, 탄소 대사경로 및 전자전달계의 변경을 통해 포도당 및 산소 수율도 기존의 생촉매에 비해 획기적으로 증가하였음을 알 수 있다. 따라서 본 발명이 제공하는 균주는 스티렌 산화 반응을 효율적으로 수행할 수 있는 이상적인 전세포 생촉매라고 할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백한 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
도 1은 스티렌 산화효소의 반응공정에 관한 개요도이고,
도 2는 재조합 플라스미드 pRSF_ABE, pRSF_ABF의 유전자 지도 및 제조과정을 나타낸 개념도이고,
도 3a는 전자전달계의 경로를 변경한 재조합 대장균(표 3의 그룹1)의 전세포 스티렌 산화효소의 활성능을 조사한 것이고,
도 3b는 전자전달계의 경로를 변경한 재조합 대장균에 샤페론 단백질을 도입한 균주(표 3의 그룹2)의 전세포 스티렌 산화효소의 활성능을 조사한 것이고,
도 4는 전자전달계의 경로를 변경한 재조합 대장균에 기질 전달 단백질 및 샤페론 과발현이 모두 조합된 유전자 재조합 대장균(표 3의 그룹3)의 전세포 스티렌 산화효소의 활성능을 조사한 것이고,
도 5는 이상계 반응에서의 광학활성 스티렌옥사이드의 생산을 나타낸 것이다(그래프의 아래부터 위로 Black, Red, Blue 및 Green을 표시한 것으로, Black; E.coli BL21/pETAB2;pGKJE8, Red; E. coli BL21△nuoG△ldhA△ack -pta/pETAB2;pGKJE8, Blue; E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta/pRSF_ABF, Green;E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack - pta/pRSF_ABF;pGKJE8).
<110> INSTITUTE FOR RESEARCH AND INDUSTRY COOPERATION, PNU <120> Recombinant E.coli. biocatalyst having mutations in electron transport chain and re-designed carbon metabolic pathways <130> DP-2008-0117 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuoGp1 <400> 1 gtgtaggctg gagctgcttc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuoGp2 <400> 2 catatgaata tcctccttag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ndhp1 <400> 3 gtgtaggctg gagctgcttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ndhp2 <400> 4 catatgaata tcctccttag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldhAp1 <400> 5 gtgtaggctg gagctgcttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldhAp2 <400> 6 catatgaata tcctccttag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ack-ptap1 <400> 7 gtgtaggctg gagctgcttc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ack-ptap2 <400> 8 catatgaata tcctccttag 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> styABp1 <400> 9 ggatccatga aaaagcgtat c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> styABp2 <400> 10 aagctttcaa ttcagtggca a 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> styEp1 <400> 11 catatgatgt tctgcgcct 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> styEp2 <400> 12 ctcgagtcag aaattatgg 19 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadLp1 <400> 13 catatgatgg tcatgagc 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadLp2 <400> 14 ctcgagtcag aacgcgta 18

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. NAD(P)H 탈수소효소를 코딩하는 유전자, 젖산 탈수소효소를 코딩하는 유전자 및 아세트산 생성효소를 코딩하는 유전자를 변형 또는 결실시킨 것을 특징으로 하는, 스티렌으로부터 광학활성 스티렌옥사이드를 생산하기 위한 재조합 대장균 생촉매.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 NAD(P)H 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 nuoG 또는 ndh인 것을 특징으로 하는, 스티렌으로부터 광학활성 스티렌옥사이드를 생산하기 위한 재조합 대장균 생촉매.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 재조합 대장균 생촉매는 스티렌 산화효소, 샤페론 및 스티렌 세포전달 단백질이 동시 발현된 것을 특징으로 하는, 스티렌으로부터 광학활성 스티렌옥사이드를 생산하기 위한 재조합 대장균 생촉매.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 대장균 생촉매는 수탁번호가 KFCC11428P로 표시되는 E.coli BL21△nuoG△ldhA△ack-pta/pRSF_ABF;pGKJE8인 것을 특징으로 하는, 스티렌으로부터 광학활성 스티렌옥사이드를 생산하기 위한 재조합 대장균 생촉매.
  7. 제 5항 또는 제 6항 중 어느 한 항의 재조합 대장균 생촉매를 이용하여 균체를 성장시키는 단계;
    상기 균체에 스티렌을 포함한 유기용매를 첨가하여 반응액을 제조하는 단계; 및
    상기 반응액을 교반한 후, 유기용매층을 분리하는 단계
    를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 광학활성 스티렌옥사이드 생산방법.
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