CN113913355A

CN113913355A - 一种产辅酶q10的基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN113913355A
Application number: CN202011205278.4A
Authority: CN
Inventors: 靳旭; 戈梅; 陶婷; 郝雪莲; 饶敏; 吴伟燕; 王孟园; 金文翔; 夏兴; 朱丽; 赵梦凡
Original assignee: Shanghai Laiyi Center For Biopharmaceutical R&d Co ltd
Current assignee: Shanghai Laiyi Center For Biopharmaceutical R&d Co ltd
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-11-02
Publication date: 2022-01-11

Abstract

本发明提供了一种产辅酶Q10的基因工程菌(Rhodobacter sphaeroides)，其保藏编号为CGMCC NO.19600。本发明还提供了所述产辅酶Q10的基因工程菌CGMCC NO.19600用于发酵生产辅酶Q10的应用。本发明构建的产辅酶Q10的基因工程菌能大幅提高辅酶Q10的产量，具有广泛的工业应用前景。

Description

一种产辅酶Q10的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种产辅酶Q10的基因工程菌及其应用。

背景技术

细胞膜是细胞外层的一种半透膜，能够将细胞与外界环境分隔开来，既能维持胞内环境的相对稳定，又能选择性调节物质的进出。真核细胞除了细胞膜外，还有分隔各种细胞器的膜系统，包括线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜、核膜等。这些细胞器膜和细胞膜都属于生物膜，是细胞的保护性屏障，能够减少外源性物质、温度、pH、渗透压等外界因素对细胞的影响。

生物膜主要由脂质、蛋白质、糖类等物质组成，其中甘油磷脂是细胞膜脂质的主要成分，构成了生物膜的基本骨架。甘油磷脂的合成过程为：脂酰CoA和甘油-3-磷酸在甘油-3-磷酸酰基转移酶的作用下生成1-单酰甘油-3-磷酸，然后在1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的作用下生成1，2-二酰基甘油-3-磷酸(磷脂酸)，磷脂酸再在各种酶的进一步催化下合成各种类型的磷脂。如在细菌等原核生物中，磷脂酸在磷脂酸胞苷转移酶的作用下生成CDP-二脂酰甘油，然后再在磷脂酰甘油磷酸合酶、磷脂酰甘油磷酸酶的作用下合成磷脂酰甘油，磷脂酰甘油是生物膜磷脂的重要组成成分。通过过表达磷脂合成基因来提高细胞耐受性在植物转基因领域有较多的报道，如在番茄中过表达甘油-3-磷酸酰基转移酶基因LeGPAT能够提高番茄的耐寒性(Na Sui，Meng Li，ShiJie Zhao，et al.Overexpression ofglycerol-3-phosphate acyltransferase gene improves chilling tolerance intomato[J].Planta,2007,226(5):1097-1108.)，过表达沙冬青的甘油-3-磷酸酰基转移酶基因AmGPAT能够提高拟南介的抗寒性、抗冻性以及抗氧化应激反应(Min Xue，Ting Guo，Meiyan Ren，et al.Constitutive expression of chloroplast glycerol-3-phosphateacyltransferase from Ammopiptanthus mongolicus enhances unsaturation ofchloroplast lipids and tolerance to chilling,freezing and oxidative stress intransgenic Arabidopsis[J].Plant Physiology and Biochemistry,2019,143:375-387.)，过表达拟南介的甘油-3-磷酸酰基转移酶基因能够提高水稻的抗寒性，增强水稻低温条件下的光合作用效率(Yokoi S，Higashi S I，Kishitani S，et al.Introduction ofthe cDNA for shape Arabidopsis glycerol-3-phosphate acyltransferase(GPAT)confers unsaturation of fatty acids and chilling tolerance of photosynthesison rice[J].Molecular Breeding,1998,4(3):269-275.)。

辅酶Q10为脂溶性醌类化合物，由醌环母核与十聚异戊二烯侧链组成，存在于原核生物细胞膜和真核生物线粒体内膜中，负责电子传递，参与能量代谢及蛋白二硫键的形成，同时还具有抗氧化功能，保护细胞脂质膜免受化学损伤。辅酶Q10在化妆品、功能性食品及医药领域应用广泛，可以通过动植物组织提取、化学合成、微生物发酵等手段获得，但受制于动植物原材料来源有限、化学合成过程复杂等原因，微生物发酵是目前辅酶Q10商业化生产的重要方式。

目前针对辅酶Q10产生菌的研究主要集中在两方面，一是筛选辅酶Q10原产菌并对其进行改造或者发酵优化来提高辅酶Q10的产量，已报道的辅酶Q10原产菌包括类球红细菌Rhodobacter sphaeroides、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens、锁掷酵母Sporidiobolus johnsonii、裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe、粉红掷孢酵母Sporobolomyces roseus、放射型根瘤菌Rhizobium radiobacter、鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.ZUTEO3等；二是在非原产菌中重构辅酶Q10的生物合成途径，如大肠杆菌本身合成辅酶Q8，其侧链为八聚异戊二烯，通过引入异源的癸异戊二烯焦磷酸合酶基因可以赋予大肠杆菌合成辅酶Q10的能力。目前在非原产菌中重构途径所得突变株的辅酶Q10产量仍相对较低，不能满足商业化生产的需求。

获得优良菌株提高辅酶Q10产量是实现辅酶Q10高效发酵生产的关键。类球红细菌是辅酶Q10的天然产生菌，具有辅酶Q10含量高、易培养等优点，目前针对类球红细菌的改造主要采用随机诱变、基因工程等手段。如CN101333509公开了一株通过空间诱变获得的类球红细菌，其辅酶Q10产量较原始菌株提高1.3倍，达到0.8g/L。专利CN103509728通过敲除bchG基因使辅酶Q10的产量达到2.85g/L较出发菌株提高15％。专利CN103509816通过对辅酶Q10合成过程中的ubiG基因进行过表达，使辅酶Q10的产量提高到2.95g/L。目前针对类球红细菌的基因工程改造多集中于辅酶Q10及其前体的合成过程，通过过表达细胞膜磷脂合成基因来提高辅酶Q10产量尚未见报道。

发明内容

本申请的发明人采用基因工程方法，在类球红细菌中过表达磷脂合成过程中的甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶，然后在此基础上进行诱变育种，最终获得辅酶Q10高产的类球红细菌突变株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.19600。因此，本发明的第一个目的是提供一种产辅酶Q10的基因工程菌。本发明的第二个目的是提供一种产辅酶Q10的基因工程菌的应用。

为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种产辅酶Q10的基因工程菌(Rhodobactersphaeroides)，其保藏编号为CGMCC NO.19600。

根据本发明，所述产辅酶Q10的基因工程菌CGMCC NO.19600，其是在类球红细菌中过表达磷脂合成过程中甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶，再进行诱变育种获得。

根据本发明，所述类球红细菌为类球红细菌HCCB20619。

作为本发明的第二个方面，一种如上述所述的产辅酶Q10的基因工程菌CGMCCNO.19600用于发酵生产辅酶Q10的应用。

作为本发明的第三个方面，磷脂合成酶编码基因在构建生产辅酶Q10的基因工程菌中的应用，所述磷脂合成酶为甘油-3-磷酸酰基转移酶，所述甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明，生产辅酶Q10的基因工程菌是以类球红细菌为出发菌株，过表达甘油-3-磷酸酰基转移酶构建获得产辅酶Q10的基因工程菌。

进一步的，所述类球红细菌为类球红细菌HCCB20619。

作为本发明的第四个方面，磷脂合成酶编码基因在构建生产辅酶Q10的基因工程菌中的应用，所述磷脂合成酶为甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶，所述甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因序列如SEQID NO.3所示，所述1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码基因序列如SEQ ID NO.5所示。

根据本发明，生产辅酶Q10的基因工程菌是以类球红细菌为出发菌株，过表达磷脂合成过程中甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的编码基因构建获得基因工程菌LYPBC，再进行诱变育种获得。

进一步的，所述类球红细菌为类球红细菌HCCB20619。

作为本发明的第五个方面，基因工程菌LYPB的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、以类球红细菌的基因组为模板，扩增pG启动子及甘油-3-磷酸酰基转移酶的编码基因；

步骤二、将pG启动子与甘油-3-磷酸酰基转移酶编码基因插入类球红细菌载体pBBR1MCS-2，构建甘油-3-磷酸酰基转移酶过表达重组质粒pBMC-PB；

步骤三、将重组质粒pBMC-PBC转化进入大肠杆菌S17-1；

步骤四、通过接合转移将重组质粒pBMC-PBC导入类球红细菌HCCB20619，获得甘油-3-磷酸酰基转移酶过表达的基因工程菌LYPB；

其中，pG启动子如SEQ ID NO.1所示，甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。

作为本发明的第六个方面，基因工程菌LYPBC的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、以类球红细菌的基因组为模板，扩增pG启动子及甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的编码基因；

步骤二、将pG启动子与甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的编码基因相连并插入类球红细菌载体pBBR1MCS-2，构建甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的过表达重组质粒pBMC-PBC；

步骤三、将重组质粒pBMC-PBC转化进入大肠杆菌S17-1；

步骤四、通过接合转移将重组质粒pBMC-PBC导入类球红细菌HCCB20619，获得甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶过表达的基因工程菌LYPBC；

其中，pG启动子如SEQ ID NO.1所示，甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，编码基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码基因序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的有益效果：通过基因工程技术在类球红细菌中过表达磷脂合成过程中甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的编码基因，使得辅酶Q10的产量提高38.5％，达到3.2g/L，对基因工程菌进行随机诱变，获得类球红细菌CGMCC NO.19600，辅酶Q10产量达到3.92g/L，是辅酶Q10高产的优良菌株，具有广阔的工业应用前景。

附图说明

图1为重组质粒pMBC-PB图谱。

图2为重组质粒pBMC-PBC图谱。

图3为重组质粒pMBC-CDSA图谱。

图4为重组质粒pMBC-PGSP图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。

1、以下实施例中涉及的菌株和质粒来源如下：

(1)类球红细菌，编号HCCB20619，上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司实验室保藏菌株。

(2)大肠杆菌S17-1，Simon R,Priefer U,Pühler,A.A Broad Host RangeMobilization System for In Vivo Genetic Engineering:Transposon Mutagenesis inGram Negative Bacteria[J].nature biotechnology,1983,1(9):784-791.

(3)pMD19-T simple载体，购自TAKARA公司。

(4)pBBR1MCS-2，广宿主型质粒，Kovach M E,Elzer P H,Hill D S,et al.Fournew derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carryingdifferent antibiotic-resistance cassettes[J].Gene,1995,166(1):0-176。

(5)pG启动子序列见SEQ ID NO.1。

(6)甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。

(7)甘油-3-磷酸酰基转移酶的编码基因序列见SEQ ID NO.3。

(8)1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.4。

(9)1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的编码基因序列见SEQ ID NO.5。

(10)磷脂酸胞苷转移酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.6。

(11)磷脂酸胞苷转移酶的编码基因序列见SEQ ID NO.7。

(12)磷脂酰甘油磷酸合酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.8。

(13)磷脂酰甘油磷酸合酶的编码基因序列见SEQ ID NO.9。

(14)磷脂酰甘油磷酸酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.10。

(15)磷脂酰甘油磷酸酶的编码基因序列见SEQ ID NO.11。

(16)辅酶Q10高产菌株HCCB20743，分类命名为类球红细菌Rhodobactersphaeroides，菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.19600，保藏日期为2020年04月22日。

2、辅酶Q10高产类球红细菌HCCB20743用于辅酶Q10生产的培养基

(1)种子培养基：葡萄糖0.4％，酵母粉0.1％，谷氨酸钠0.05％，玉米浆粉0.03％，MgSO₄ 0.2％，NaCl 0.2％，FeSO₄ 0.01％，CaCO₃ 0.8％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，核黄素0.00002％，硫胺素0.002％。

(2)发酵培养基：葡萄糖6.5％，酵母粉0.5％，谷氨酸钠1.2％，MgSO₄ 1.9％，(NH₄)₂SO₄ 1％，FeSO₄ 0.17％，KH₂PO₄ 0.5％，K₂HPO₄ 0.5％，核黄素0.00004％，硫胺素0.004％。

3、以下实施例中涉及的引物序列信息如表1所示。

表1引物序列

引物名称	序列	SEQ ID
			GP-F	AAGCTTCATCCTCACCGCCCTCCCTTAAC	NO.12
GP-R	AAAGGCCGCTTTCGATGGCCGGCATAGAGCTCTCCCACAATGGGC	NO.13
			PB-F	ATTGTGGGAGAGCTCTATGCCGGCCATCGAAAGCGGCCTT	NO.14
PB-R	GGTACCGAGAATTCTTACTTCTTCCCGATCCGCG	NO.15
			PC-F	GAATTCCATCAACGGAGGTACTACCATGCGCACCGCGCTGCAATG	NO.16
PC-R	GGTACCTTCGGCTTCAATTCCGCCAT	NO.17
			GCS-R	CCTTCGGCTTCCCGGACTTGCTCATAGAGCTCTCCCACAATGGGC	NO.18
CDA-F	GCCCATTGTGGGAGAGCTCTATGAGCAAGTCCGGGAAGCCG	NO.19
			CDA-R	GGTACCTCAGTTCCCCATAGCCGGCAG	NO.20
GPS-R	GAATATTCGGGATCGACCAGTTCATAGAGCTCTCCCACAATGGGC	NO.21
			PGS-F	CGCCCATTGTGGGAGAGCTCTATGAACTGGTCGATCCCGAAT	NO.22
PGS-R	AGTGCAGATCGCGCGGGTGAGCCTCATTTCTCGTCCTTGAGGT	NO.23
			PGP-F	TTCCCTACCTCAAGGACGAGAAATGAGGCTCACCCGCGCGATC	NO.24
PGP-R	GGTACCTCACATCAGCACCCCGTGCG	NO.25

实施例1甘油-3-磷酸酰基转移酶过表达工程菌的构建

甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.2，该酶能够催化脂酰CoA和甘油-3-磷酸生成1-单酰甘油-3-磷酸。

1.1重组质粒pBMC-PB构建

甘油-3-磷酸酰基转移酶过表达重组质粒pBMC-PB图谱如图1所示，其构建过程为以类球红细菌HCCB20619的染色体为模板，利用引物GP-F/R扩增pG启动子(序列见SEQ IDNO.1)，利用引物PB-F/R扩增甘油-3-磷酸酰基转移酶编码基因plsB(序列见SEQ ID NO.3)，回收两者PCR产物并以此为模板，利用引物GP-F、PB-R扩增PB片段，然后克隆至pMD19-Tsimple载体，获得重组质粒pMD-PB。pMD-PB以HindⅢ-KpnⅠ酶切，回收PB片段并克隆至经HindⅢ-KpnⅠ酶切的pBBR1MCS-2中，获得甘油-3-磷酸酰基转移酶过表达重组质粒pBMC-PB。

1.2重组质粒pBMC-PB电转导入大肠杆菌S17-1

1)活化大肠杆菌S17-1，挑取单菌落接种于LB培养基中(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％)，37℃、220rpm培养过夜。

2)取200μL过夜培养液接种至20mL新鲜LB培养基中，37℃、220rpm培养3-4h至OD600＝0.4左右。

3)将培养液转移至离心管中，4℃、4000rpm离心5min。

4)去上清，加入20mL预冷的10％甘油重悬菌体。

5)4℃、4000rpm离心5min。

6)去上清，加入10mL预冷的10％甘油重悬菌体。

7)4℃、4000rpm离心5min，去上清，加入200μL 10％甘油重悬菌体。

8)取50μL感受态细胞与适量的重组质粒混匀后转入预冷的0.1cm电转杯中，电击。电击条件为1800V、200Ω、25μF，电击时间为5.0ms左右。

9)脉冲结束后立即加入800μL预冷的LB培养基，37℃、150rpm振荡培养50min。然后取100μL涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。

1.3接合转移

1)活化类球红细菌及含重组质粒的大肠杆菌S17-1，挑取单菌落接种于LB中培养过夜，大肠杆菌37℃培养，类球红细菌32℃培养。

2)以1％接种量转种于10mL LB，培养3-7h至OD600＝0.4-0.6。

3)4000rpm离心5min，去上清，用10mL新鲜LB培养基洗涤菌体两次，并用10mL LB重悬菌体。

4)类球红细菌HCCB20619与大肠杆菌以10：1比例混合，将混合液滴在LB平板的滤纸上，32℃培养24h。

5)接滤纸转至新鲜LB培养基中，反复冲洗，收集菌体，涂布于含碲酸钠及卡那霉素的LB平板，32℃培养。

1.4鉴定

挑取接合转移后的单菌落至含卡那霉素的LB平板，32℃培养2天，挑取少许菌落接种至3mLLB，32℃振荡培养24h，收集菌体，提取基因组(参考上海莱枫生物科技有限公司细菌基因组抽提试剂盒说明书操作)。然后利用引物GP-F及PB-R进行验证，阳性菌株能扩增出1088bp片段，阴性菌无片段，阳性基因工程菌标记为LYPB。

实施例2甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶过表达工程菌构建

甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.2，1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.4，1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶能够以甘油-3-磷酸酰基转移酶的催化产物1-单酰甘油-3-磷酸为底物进一步合成1，2-二酰甘油-3-磷酸。

甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的过表达重组质粒pBMC-PBC图谱如图2所示，其构建过程为，以类球红细菌HCCB20619的染色体为模板，利用PC-F/R扩增1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的编码基因plsC(序列见SEQ ID NO.5)，克隆至pMD19-T simple载体，获得重组质粒pMD-C。实施例1中的pMD-PB以HindⅢ-EcoRⅠ酶切，回收PB片段，pMD-C以EcoRⅠ-KpnⅠ酶切回收C片段，然后克隆至经HindⅢ-KpnⅠ酶切的pBBR1MCS-2中，获得重组质粒pBMC-PBC。

参照实施例1中1.2-1.4方法，将pBMC-PBC电转至大肠杆菌S17-1，然后通过接合转移导入类球红细菌HCCB20619中，利用引物GP-F及PC-R进行验证，阳性菌株能扩增出1891bp片段，阴性菌无片段，阳性基因工程菌标记为LYPBC。

实施例3磷脂酸胞苷转移酶过表达过工程菌构建

磷脂酸胞苷转移酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.6，该酶能够以1，2-二酰甘油-3-磷酸为底物催化合成CDP-二脂酰甘油。

磷脂酸胞苷转移酶的过表达重组质粒pBMC-CDSA图谱见图3，其构建过程为：以类球红细菌HCCB20619的染色体为模板，利用引物GP-F、GCS-R扩增pG启动子，利用引物CDA-F/R扩增磷脂酸胞苷转移酶的编码基因cdsA(序列见SEQ ID NO.7)，回收两者PCR产物并以此为模板，利用引物GP-F、CDA-R扩增PCDA片段，然后克隆至pMD19-T simple载体，获得重组质粒pMD-PCDA。pMD-PCDA以HindⅢ-KpnⅠ酶切克隆至经HindⅢ-KpnⅠ酶切的pBBR1MCS-2中，获得cdsA过表达重组质粒pBMC-CDSA。

参照实施例1中1.2-1.4方法，将pBMC-CDSA电转至大肠杆菌S17-1，然后通过接合转移导入类球红细菌HCCB20619中，利用引物GP-F及CDA-R进行验证，阳性菌株能扩增出1296bp片段，阴性菌无片段，阳性基因工程菌标记为LYCDSA。

实施例4磷脂酰甘油磷酸合酶及磷脂酰甘油磷酸酶过表达工程菌构建

磷脂酰甘油磷酸合酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.8，磷脂酰甘油磷酸酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.10，两酶以CDP-二脂酰甘油为底物生成磷脂酰甘油，磷脂酰甘油是细胞膜磷脂的重要组成部分。

磷脂酰甘油磷酸合酶及磷脂酰甘油磷酸酶的过表达重组质粒pBMC-PGSP图谱见图4，其构建过程为：以类球红细菌HCCB20619的染色体为模板，利用引物GP-F、GPS-R扩增pG启动子，利用引物PGS-F/R扩增磷脂酰甘油磷酸合酶的编码基因pgsA(序列见SEQ ID NO.9)，利用引物PGP-F/R扩增磷脂酰甘油磷酸酶的编码基因pgpA(序列见SEQ ID NO.11)，回收三者PCR产物并以此为模板，利用引物GP-F、PGP-R扩增PGSP片段，然后克隆至pMD19-T simple载体，获得重组质粒pMD-PGSP。pMD-PGSP以HindⅢ-KpnⅠ酶切克隆至经HindⅢ-KpnⅠ酶切的pBBR1MCS-2中，获得重组质粒pBMC-PGSP。

参照实施例1中1.2-1.4方法，将pBMC-PGSP电转至大肠杆菌S17-1，然后通过接合转移导入类球红细菌HCCB20619中，利用引物GP-F及PGP-R进行验证，阳性菌株能扩增出1634bp片段，阴性菌无片段，阳性基因工程菌标记为LYPGSP。

实施例5发酵

分别将类球红细菌HCCB20619、基因工程菌LYPB、基因工程菌LYPBC、基因工程菌LYCDSA、基因工程菌LYPGSP划线于LB平板，32℃培养2天，挖块接种于含50mL种子培养基的500mL摇瓶中，32℃、220rpm振荡培养24h。种子培养基配方为：葡萄糖0.4％，酵母粉0.1％，谷氨酸钠0.05％，玉米浆粉0.03％，MgSO₄ 0.2％，NaCl 0.2％，FeSO₄ 0.01％，CaCO₃ 0.8％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，核黄素0.00002％，硫胺素0.002％。

以10％的接种量将种子培养液转种于含3L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基配方为：葡萄糖6.5％，酵母粉0.5％，谷氨酸钠1.2％，MgSO₄ 1.9％，(NH₄)₂SO₄ 1％，FeSO₄0.17％，KH₂PO₄ 0.5％，K₂HPO₄ 0.5％，核黄素0.00004％，硫胺素0.004％。发酵温度32℃，通气量1：1(vol：vol)，搅拌速度500rpm，pH用氨水控制在7.0左右，发酵过程补加50％葡萄糖，速率为2mL/h。

发酵5天后，利用HPLC对辅酶Q10产量进行测定。HPLC条件：色谱柱为Agilentextend C18(5μm，46×150mm)；流动相A：无水乙醇，B：甲醇，A：B＝68：32；柱温：40℃；流速1mL/min。

类球红细菌出发菌株及基因工程改造后菌株的辅酶Q10产量见表2。

表2不同菌株辅酶Q10产量

从表2可以看出，过表达磷脂合成过程中不同阶段的酶对辅酶Q10的产量具有不同影响。其中单独过表达甘油-3-磷酸酰基转移酶可以使辅酶Q10的产量由2.31g/L提高到2.85g/L，同时过表达甘油-3-磷酸酰基转移酶及1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶，能将辅酶Q10的产量进一步提高到3.20g/L，较出发菌株HCCB20619提高了38.5％，效果最为明显。

实施例6紫外诱变及突变株筛选、发酵

6.1紫外诱变

取LYPBC新鲜培养液，收集菌体，用生理盐水洗涤、重悬细胞，并将细胞数量调整为10⁹个/mL。取上述细胞悬液5mL至平皿中，用磁力搅拌器搅拌，置于15W紫外灯下30cm处诱变40s。诱变结束后，菌悬液经适当稀释涂布于LB平板，32℃避光培养。

6.2筛选

将诱变后长出的菌落划线于LB平板，32℃培养2天，挖块接种于含25mL种子培养基的250mL摇瓶中，32℃、220rpm振荡培养24h。以10％接种量将种子培养基转接于含25mL发酵培养基的250mL摇瓶中，32℃、220rpm振荡培养5天。发酵结束后，HPLC分析辅酶Q10产量。经过反复诱变和筛选，最终获得了一株辅酶Q10高产菌株HCCB20743，菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.19600。

6.3突变株发酵

利用实施例5中方法，对CGMCC NO.19600进行发酵，辅酶Q10产量可以达到3.92g/L，较LYPBC提高22.5％，较原始出发菌株提高69.7％。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司

<120> 一种产辅酶Q10的基因工程菌及其应用

<130> 201088

<141> 2020-11-02

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 462

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catcctcacc gccctccctt aaccgcgcgt ttcgacggac aggaaccggc ccacaagaaa 60

ccgggccgag ccatcgatgg ctctgcaccc cccctcccag tgcgctttcc ggcagccttg 120

cggcccggag gacagccgac gcgcggcagg tcacgctgcg gacagcgccg tggaaggtgc 180

cctgcgcgca aggccgggcc gcccccgaat ttctcacggg cggcttcggc ctccgcgggc 240

cggagcgatc ccgttcgtcc ggggcccgcc tcccgtcctc tcccgaggcg ggtcgggccg 300

cggcggcaag gcctcggaac cgggcactat cttgccgtcc tgcgccgatt tcctcctttc 360

ttcggttgaa ttgcgctcgg atctggggtc gttaccttgg agaccgtccg cgggcgcgcg 420

actcgatcct cgctgtgcgc ccgcccattg tgggagagct ct 462

<210> 2

<211> 201

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Pro Ala Ile Glu Ser Gly Leu Trp Ala Leu Ile Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Leu Gly Tyr Leu Leu Gly Ser Ile Pro Phe Gly Ile Val Ile Thr Arg

20 25 30

Ala Leu Gly Leu Gly Asp Leu Arg Lys Ile Gly Ser Gly Asn Ile Gly

35 40 45

Ala Thr Asn Val Leu Arg Thr Gly Asn Lys Pro Ala Ala Leu Ala Thr

50 55 60

Leu Leu Leu Asp Ser Gly Lys Gly Ala Ile Ala Val Leu Ile Ala Arg

65 70 75 80

Ala Ala Val Gly Glu Asp Ala Ala Gln Leu Ala Ala Phe Thr Ser Phe

85 90 95

Leu Gly His Leu Phe Pro Val Trp Leu Gly Phe Arg Gly Gly Lys Gly

100 105 110

Val Ala Thr Phe Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Ala Trp Pro Val Gly

115 120 125

Leu Ala Cys Cys Leu Thr Trp Leu Ala Thr Ala Ala Leu Gly Arg Ile

130 135 140

Ser Ser Leu Ser Ala Leu Val Ala Ala Ala Ser Gly Val Leu Trp Met

145 150 155 160

Ile Leu Leu Gly Tyr Gly Gln Met Ala Ala Leu Gly Ala Val Leu Ala

165 170 175

Val Leu Ile Phe Ile Arg His His Ala Asn Ile Arg Arg Ile Leu Ala

180 185 190

Gly Thr Glu Pro Arg Ile Gly Lys Lys

195 200

<210> 3

<211> 606

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgccggcca tcgaaagcgg cctttgggcg ctgatcctga cgggagtgct gggctatctg 60

ctcggctcga tcccgttcgg catcgtcatc acccgcgcgc tggggctggg cgacctgcgc 120

aagatcggct cgggcaatat cggcgcgacc aacgtgctcc ggacgggcaa caagcccgcg 180

gcgctggcca cgctgctcct cgattcgggc aagggcgcca tcgccgtgct gatcgcccgc 240

gccgccgtgg gcgaggatgc agcgcagctt gcggccttca cctcgtttct ggggcacctc 300

ttcccggtct ggctcggctt ccgcggcggc aagggggtcg cgaccttcct cggcacgctc 360

ctcgcgctcg cctggcccgt ggggctcgcc tgctgcctca cctggctcgc gaccgcggcc 420

ctgggccgaa tctcctcgct ctcggccctc gtggctgcgg cgagcggtgt cctctggatg 480

atccttctgg gctacggcca gatggcggcg ctgggggcgg tgctcgcggt gctgatcttc 540

atccgccacc atgcgaacat ccgccggatc ctcgccggca ccgagccgcg gatcgggaag 600

aagtaa 606

<210> 4

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Arg Thr Ala Leu Gln Trp Ile Arg Ser Ile Leu Phe Asn Ile Val

1 5 10 15

Met Tyr Val Ser Met Ile Ala Ile Ala Leu Ala Phe Thr Pro Leu Val

20 25 30

Leu Val Asp Arg Lys Trp Ala Pro Val Trp Met Arg Ile Phe Ala Arg

35 40 45

Trp Thr Arg Phe Thr Leu Arg Trp Ile Ala Gly Leu Arg Thr Glu Val

50 55 60

Arg Gly Glu Ile Pro Thr Thr Gly Ala Leu Ile Ala Ser Lys His Gln

65 70 75 80

Ser Phe Leu Asp Ser Ile Leu Leu Phe Ser Val Leu Pro Ala Pro Arg

85 90 95

Phe Ile Met Lys Lys Gln Leu Ala Trp Ile Pro Leu Met Gly Trp Met

100 105 110

Ala Leu Gln Ala Gly Phe Ile Pro Val Asp Arg Gly Lys Arg Gly Ala

115 120 125

Ala Ile Lys Lys Met Met Ala Asp Val Glu Lys Gly Arg Ala Thr Pro

130 135 140

Gly Gln Leu Ile Ile Tyr Pro Gln Gly Thr Arg Val Ala Pro Gly Ala

145 150 155 160

His Leu Pro Tyr Lys Met Gly Thr Ala Ala Leu Tyr Gly Gln Leu Glu

165 170 175

Gln Pro Cys Tyr Pro Val Ala Ala Asn Val Gly Val Phe Trp Pro Arg

180 185 190

His Gly Ile Tyr Arg Arg Pro Gly Thr Ala Val Val Glu Phe Leu Pro

195 200 205

Pro Ile Gln Pro Gly His Thr Ala Ala Ala Phe Met Val Glu Leu Glu

210 215 220

Thr Ala Ile Glu Gly Ala Ser Asn Arg Leu Ile Ala Glu Ala Arg Gln

225 230 235 240

Gly

<210> 5

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcgcaccg cgctgcaatg gatccggtcc atcctcttca acatcgtgat gtatgtctcg 60

atgatcgcca tcgcgctggc cttcacgccg ctcgtgctgg tcgaccgcaa gtgggcgccg 120

gtctggatgc ggatcttcgc gcgctggacg cgcttcacgc tgcgctggat cgcggggctc 180

cggaccgagg tgcgcggcga gatccccacg accggcgcgc ttatcgcctc gaagcaccag 240

agcttcctcg attccatcct gctcttctcg gtgctgcccg cgccgcgctt catcatgaag 300

aagcagctgg cctggatccc gctgatgggc tggatggcgc ttcaggcggg cttcattccg 360

gtggaccgcg gcaagcgggg cgcggccatc aagaagatga tggccgatgt cgagaagggc 420

cgcgcgacgc cgggccagct catcatctat ccgcagggca cccgcgtggc cccgggcgcg 480

cacctgccct acaagatggg cacagccgcc ctctacggcc agctcgagca gccttgctat 540

ccggtggcgg ccaatgtggg cgtcttctgg ccgcggcacg ggatctatcg ccgccccggc 600

accgcggtgg tggagttcct gccgccgatc cagcccggcc acacggccgc ggccttcatg 660

gtcgagctgg agaccgcgat cgagggcgcc tcgaaccggc tgatcgccga ggcccggcag 720

ggctga 726

<210> 6

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ser Lys Ser Gly Lys Pro Lys Gly Arg Trp Gly Asp Leu Arg Arg

1 5 10 15

Arg Met Ile Ser Ala Ala Ile Met Leu Ser Val Gly Ala Ile Glu Val

20 25 30

Trp Leu Gly Gly Val Pro Phe Ala Leu Leu Val Ile Gly Leu Thr Gly

35 40 45

Leu Met Leu Trp Glu Leu Ala Arg Met Thr Ala Pro Gln Arg Thr Leu

50 55 60

Pro Asn Ile Leu Val Gly Leu Leu Ala Ser Ala Ile Leu Thr Gly Val

65 70 75 80

Leu Ser Phe Val Phe Arg Glu Glu Met Met Leu Ala Leu Ala Ala Leu

85 90 95

Val Leu Ala Pro Ala Ala Gly Leu Leu Gly Pro Arg Arg Asp Arg Arg

100 105 110

Ile Phe Phe Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Met Val Ala Gly Ala Gly Leu

115 120 125

Val Met Leu Arg Glu Glu Gly Gly Ser Val Ala Ile Leu Trp Leu Ile

130 135 140

Leu Val Val Val Thr Ser Asp Val Met Gly Tyr Phe Ala Gly Arg Ser

145 150 155 160

Leu Gly Gly Pro Lys Phe Trp Pro Ala Val Ser Pro Asn Lys Thr Trp

165 170 175

Ser Gly Thr Ile Ala Gly Trp Leu Gly Ala Ala Ile Val Gly Leu Gly

180 185 190

Phe Ser Ile Ala Ala Gly Ala Gly Trp Gly Leu Ile Ile Leu Ser Pro

195 200 205

Val Ile Ala Leu Ala Gly Gln Leu Gly Asp Ile Val Glu Ser Trp Ile

210 215 220

Lys Arg Arg Ser Gly Val Lys Asp Ser Ser Ser Leu Ile Pro Gly His

225 230 235 240

Gly Gly Val Leu Asp Arg Phe Asp Ala Leu Thr Gly Ala Val Leu Ala

245 250 255

Val Leu Val Leu Gly Met Leu Gly Asp Leu Pro Leu Pro Ala Met Gly

260 265 270

Asn

<210> 7

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgagcaagt ccgggaagcc gaaggggcgc tggggcgacc tgcgccgccg gatgatctcg 60

gccgcgatca tgctgtcggt gggggccatc gaggtctggt tgggcggcgt gcccttcgcg 120

cttctcgtga tcgggcttac gggtctcatg ctgtgggaac tggcgcgcat gaccgcgccg 180

cagcggaccc ttccgaacat cctcgtgggc cttctcgcct cggccatcct gacgggcgtg 240

ctgagcttcg tcttccggga ggagatgatg ctggcgctcg cggccctcgt gctggcgccc 300

gcggcgggac ttctgggccc gcgccgcgac cgtcggatct tcttcaccta cggcacggcg 360

ctgatggtgg cgggcgcagg cctcgtcatg ctgcgcgagg agggcgggtc ggtcgcgatc 420

ctgtggctca tcctcgtggt cgtcacttcg gacgtgatgg gctattttgc cggccgcagc 480

ctcggcggcc ccaagttctg gcccgcggtc agccccaaca agacctggtc cggcacgatc 540

gcgggctggc tgggtgcggc aattgtgggt cttggattct ccattgcggc gggtgcaggc 600

tggggcctca tcatcctgtc gcccgtgatc gcgctggcag gacaactcgg ggacattgtc 660

gagagctgga tcaagcggcg ttccggggtc aaggacagct cctcgctgat cccgggccat 720

ggcggcgtgc tggaccggtt cgacgcgctg accggggcgg tgctcgccgt gctcgttctg 780

gggatgctcg gtgaccttcc gctgccggct atggggaact ga 822

<210> 8

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Asn Trp Ser Ile Pro Asn Ile Leu Thr Val Leu Arg Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Pro Gly Val Ala Val Met Phe Leu Tyr Phe His Arg Pro Trp Ala

20 25 30

Asp Trp Phe Ala Leu Thr Leu Phe Ile Leu Ala Ala Val Thr Asp Phe

35 40 45

Phe Asp Gly Tyr Leu Ala Arg Leu Trp Lys Gln Glu Ser Lys Phe Gly

50 55 60

Ala Met Leu Asp Pro Ile Ala Asp Lys Ala Met Val Val Ile Ala Leu

65 70 75 80

Val Ile Ile Thr Gly Tyr Ser Gly Met Asn Pro Trp Leu Ile Leu Pro

85 90 95

Val Thr Leu Ile Leu Phe Arg Glu Val Phe Val Ser Gly Leu Arg Glu

100 105 110

Phe Leu Gly Ala Lys Ala Ser Leu Leu Lys Val Thr Lys Leu Ala Lys

115 120 125

Trp Lys Thr Thr Ala Gln Met Val Ala Ile Ala Ile Leu Phe Leu Gly

130 135 140

Thr Gly Leu Glu His Leu Glu Gly Ile Ala Arg Gln Gly Met Thr Trp

145 150 155 160

Glu Gln Tyr Ala Arg Ala Val Ser Ala Gly Glu Ala Asp Pro Ile Arg

165 170 175

Ser Cys Gly Met His Gly Cys Ser Ser Tyr Ala Thr Trp Leu Gly Leu

180 185 190

Ala Leu Ile Trp Ile Ala Ala Ala Leu Thr Phe Ile Thr Gly Trp Asp

195 200 205

Tyr Phe Arg Lys Ala Leu Pro Tyr Leu Lys Asp Glu Lys

210 215 220

<210> 9

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaactggt cgatcccgaa tattctcacc gttctgcgcc tgctggccgc gcccggcgtg 60

gcggtgatgt tcctctattt ccacaggccc tgggccgact ggttcgcgct cactctcttc 120

atcctggcgg cggtgacgga cttcttcgac ggctatctcg cccggctgtg gaagcaggaa 180

tcgaagttcg gcgccatgct cgatcccatc gccgacaagg cgatggtggt gatcgcgctg 240

gtcatcatca ccggctattc cggcatgaac ccctggctca tcctgccggt gactctgatt 300

ctcttccgcg aggtcttcgt ctcgggcctg cgcgaattcc tcggcgcaaa ggccagcctc 360

ctcaaggtca ccaagctcgc caagtggaag acgacggcgc agatggtggc gatcgccatc 420

cttttcctcg gcaccgggct cgagcatctc gaggggatcg cgcggcaggg catgacctgg 480

gagcaatatg cccgggcggt cagcgccggc gaggccgatc cgatccgcag ctgcgggatg 540

cacggctgct cgtcctatgc aacctggctg gggcttgcgc tgatctggat cgcggcggcc 600

cttaccttca tcaccggctg ggactatttc aggaaggcgc ttccctacct caaggacgag 660

aaatga 666

<210> 10

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Arg Leu Thr Arg Ala Ile Cys Thr Ala Gly Gly Ile Gly Leu Leu

1 5 10 15

Arg Pro Ala Pro Gly Thr Trp Gly Ser Ala Ala Ala Val Gly Ala Gly

20 25 30

Leu Leu Leu His Gly Leu Gly Ser Phe Pro Leu Leu Leu Ala Ala Thr

35 40 45

Leu Ala Ala Cys Gly Leu Gly Leu Trp Ala Val Arg Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Leu Arg Pro His Ala Asp Pro Pro Glu Phe Val Ile Asp Glu Val Ala

65 70 75 80

Gly Gln Trp Ile Ala Leu Leu Phe Pro Ser Cys Gly Phe Trp Leu Met

85 90 95

Gly Leu Ala Asn Trp His Phe Pro Tyr Pro Gly Trp Val Gly Ala Phe

100 105 110

Phe Phe Phe Arg Leu Phe Asp Ile Trp Lys Pro Trp Ile Ile Gly Arg

115 120 125

Leu Asp Arg Arg Glu Asp Trp Val Gly Leu Met Ala Asp Asp Leu Met

130 135 140

Ala Gly Leu Phe Ala Gly Val Ala Thr Met Ile Ala Ala Gly Ile Ala

145 150 155 160

His Gly Val Leu Met

165

<210> 11

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgaggctca cccgcgcgat ctgcactgcc ggaggcatcg gcctcctccg ccccgcaccg 60

ggcacctggg gctcggccgc ggccgtgggg gcgggcctcc tcctccacgg gctgggcagc 120

ttcccgctcc ttctcgcggc gacgctcgcc gcctgcgggc tgggcctctg ggccgtccgc 180

gaggagctga agctgcgccc ccatgccgat ccgcccgaat tcgtcatcga cgaggtggcg 240

ggccagtgga tcgcgctgct ctttccttcc tgcggcttct ggctgatggg gctcgccaac 300

tggcactttc cctatccggg ctgggtcggc gcgttcttct tcttccggct gttcgacatc 360

tggaagccct ggatcatcgg ccggctcgac cggcgcgagg actgggtggg gctgatggcc 420

gacgatctga tggcgggcct ctttgccggc gtggccacca tgatcgcggc cgggatcgcg 480

cacggggtgc tgatgtga 498

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aagcttcatc ctcaccgccc tcccttaac 29

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaggccgct ttcgatggcc ggcatagagc tctcccacaa tgggc 45

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

attgtgggag agctctatgc cggccatcga aagcggcctt 40

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggtaccgaga attcttactt cttcccgatc cgcg 34

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaattccatc aacggaggta ctaccatgcg caccgcgctg caatg 45

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggtaccttcg gcttcaattc cgccat 26

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccttcggctt cccggacttg ctcatagagc tctcccacaa tgggc 45

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcccattgtg ggagagctct atgagcaagt ccgggaagcc g 41

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggtacctcag ttccccatag ccggcag 27

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaatattcgg gatcgaccag ttcatagagc tctcccacaa tgggc 45

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgcccattgt gggagagctc tatgaactgg tcgatcccga at 42

<210> 23

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agtgcagatc gcgcgggtga gcctcatttc tcgtccttga ggt 43

<210> 24

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ttccctacct caaggacgag aaatgaggct cacccgcgcg atc 43

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggtacctcac atcagcaccc cgtgcg 26

Claims

1.一种产辅酶Q10的基因工程菌(Rhodobacter sphaeroides)，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.19600。

2.一种如权利要求1所述的产辅酶Q10的基因工程菌CGMCC NO.19600用于发酵生产辅酶Q10的应用。

3.磷脂合成酶编码基因在构建生产辅酶Q10的基因工程菌中的应用，其特征在于，所述磷脂合成酶为甘油-3-磷酸酰基转移酶，所述甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，其以类球红细菌为出发菌株，过表达甘油-3-磷酸酰基转移酶构建获得产辅酶Q10的基因工程菌。

5.磷脂合成酶编码基因在构建生产辅酶Q10的基因工程菌中的应用，其特征在于，所述磷脂合成酶为甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶，所述甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，其以类球红细菌为出发菌株，过表达甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶构建获得产辅酶Q10的基因工程菌。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法包括如下步骤：

步骤三、将重组质粒转化进入大肠杆菌S17-1；

步骤四、通过接合转移将重组质粒导入类球红细菌，获得甘油-3-磷酸酰基转移酶过表达工程菌；

其中，pG启动子、甘油-3-磷酸酰基转移酶编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法包括如下步骤：

步骤二、将pG启动子与甘油-3-磷酸酰基转移酶、1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶的编码基因相连并插入类球红细菌载体pBBR1MCS-2，构建甘油-3-磷酸酰基转移酶与1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶过表达重组质粒pBMC-PBC；

步骤三、将重组质粒转化进入大肠杆菌S17-1；

步骤四、通过接合转移将重组质粒导入类球红细菌，获得获得甘油-3-磷酸酰基转移酶和1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶过表达的基因工程菌；

其中，pG启动子、甘油-3-磷酸酰基转移酶编码基因、1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示。