CN114752575A

CN114752575A - 一种nad+依赖性脱氢酶基因及其在提高辅酶q10产量中的应用

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Publication number: CN114752575A
Application number: CN202210359522.5A
Authority: CN
Inventors: 刘占英; 张龙
Original assignee: Inner Mongolia University of Technology
Current assignee: Inner Mongolia University of Technology
Priority date: 2022-04-07
Filing date: 2022-04-07
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2042-04-07
Also published as: CN114752575B

Abstract

本发明公开了一种NAD⁺依赖性脱氢酶基因及其在提高辅酶Q10产量中的应用以及作为该基因来源的一株高产辅酶Q10的类球红细菌。本发明提供了NAD⁺依赖性脱氢酶或NAD⁺依赖性脱氢酶基因在调控类球红细菌的辅酶Q10产量中的应用。本发明还提供了一种提高类球红细菌的辅酶Q10产量的方法：将NAD⁺依赖性脱氢酶基因导入类球红细菌，从而提高类球红细菌的辅酶Q10产量。NAD⁺依赖性脱氢酶如序列3所示，NAD⁺依赖性脱氢酶基因如序列2所示，是本发明的发明人从类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)VK‑2‑3中创造性的发现的新基因。本发明可用于辅酶Q10生产领域，对于辅酶Q10生产及其下游产品的制备具有应用推广价值。

Description

一种NAD+依赖性脱氢酶基因及其在提高辅酶Q10产量中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种NAD⁺依赖性脱氢酶基因及其在提高辅酶Q10产量中的应用以及作为该基因来源的一株高产辅酶Q10的类球红细菌。

背景技术

辅酶Q10，化学名称为2-[(全-E)3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-十甲基-2,6,10，14,18,22,26,30,34,38-四十癸烯基}-5,6-二甲氧基-3-甲基-p-苯醌，别名为泛醌10，CAS号为303-98-0，EINECS号为206-147-9。辅酶Q10是真核细胞线粒体中电子传递链和有氧呼吸的参与物质之一，为黄色至橙黄色结晶性粉末，无臭无味，遇光易分解。辅酶Q10是一种脂溶性抗氧化剂，能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能，医学上广泛用于心血管系统疾病预防和治疗。此外，其作为抗氧化剂，广泛应用于化妆品行业。2003年，美国食品药品监督管理局(FDA)正式批准辅酶Q10作为食品添加剂广泛使用在食品行业中，如丹麦、挪威和荷兰等乳制品出口大国，辅酶Q10被直接添加于乳酪、酸奶和牛奶等大宗乳制品里，以此增加产品的抗肥胖作用；辅酶Q10也被添加在多种复合维生素、矿物质的运动型饮料中，研究表明采用功能性营养成分强化的运动型饮料能够更好地补充运动中损失的电解质、体液和能量物质，延缓疲劳的产生，从而提高运动能力。

目前，辅酶Q10的主要生产方式为微生物发酵法，工业上常用的菌种为类球红细菌，生产中的主要问题是需要不断选育优良的微生物菌种，以提高产品产量和生产性能。因此，如何获得优良的微生物菌种成为制约产业发展的关键问题，关系到工业生产的效率和效益。传统的微生物诱变育种包括紫外诱变和化学诱变等，这些方法在工业菌种改良和提高菌种目标产物产量方面发挥了重要作用。然而，这些传统方法的反复和重复使用也造成一些弊端，最明显的是菌种产生“抗性”,诱变作用钝化，诱变效果显著降低甚至没有作用。因此，寻找新型诱变方式进行工业菌种的诱变，以达到良好的诱变效果，获得高产或高性能菌种是工业生产的迫切需要。重离子辐照诱变作为一种新型的诱变育种方式，具有突变率高、突变谱广、相对生物学效应高、传能线密度大、修复效应小和不易回复突变等特点，作为新型诱变方式在微生物工业诱变育种中具有诸多优势。

随着分子生物学技术的迅速发展，通过基因工程和代谢工程改造来提高菌种的目标产物产量已经成为一种趋势，具体方法是过表达与目标产物合成相关的关键基因或抑制与目标产物竞争的途径来提高产量。与传统诱变方式相比，该方法具有定向性好、省时和省力等优点。然而，这种方法也存在一些弊端，例如需要对菌种代谢途径有清晰的认知才能开展，受菌种抗性基因和改造难易程度等因素的影响。其中，最大的弊端就是因为对菌种代谢途径和代谢目标产物机理认识的不全面性导致一些影响产量提高的关键基因或因素未被发现。

发明内容

本发明的目的是提供一种NAD⁺依赖性脱氢酶基因及其在提高辅酶Q10产量中的应用以及作为该基因来源的一株高产辅酶Q10的类球红细菌。

本发明提供了NAD⁺依赖性脱氢酶或NAD⁺依赖性脱氢酶基因在调控类球红细菌的辅酶Q10产量中的应用。

所述调控为正调控，即所述NAD⁺依赖性脱氢酶含量增加会促进类球红细菌辅酶Q10产量的增加。

所述调控为正调控，即所述NAD⁺依赖性脱氢酶基因的表达量增加会促进类球红细菌辅酶Q10产量的增加。

本发明还提供了一种提高类球红细菌辅酶Q10产量的方法，包括如下步骤：将NAD⁺依赖性脱氢酶基因导入类球红细菌，从而提高类球红细菌的辅酶Q10产量。

本发明还提供了一种制备辅酶Q10产量提高的重组类球红细菌的方法，包括如下步骤：将NAD⁺依赖性脱氢酶基因导入类球红细菌，得到辅酶Q10产量提高的重组类球红细菌。

本发明还提供了NAD⁺依赖性脱氢酶基因在制备辅酶Q10产量提高的重组类球红细菌中的应用。

本发明还提供了一种新的NAD⁺依赖性脱氢酶或一种新的NAD⁺依赖性脱氢酶基因。

本发明还提供了一种重组类球红细菌，是将NAD⁺依赖性脱氢酶基因导入类球红细菌得到的。

示例性的，以上任一所述类球红细菌(作为受体菌或宿主菌)为类球红细菌V-0。

以上任一所述NAD⁺依赖性脱氢酶如序列表的序列3所示。

以上任一所述NAD⁺依赖性脱氢酶基因如序列表的序列2所示。

以上NAD⁺依赖性脱氢酶或NAD⁺依赖性脱氢酶基因是本发明的发明人从类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)VK-2-3中创造性的发现的。

本发明还提供了类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)VK-2-3，已于2021年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021735。

由于具有该NAD⁺依赖性脱氢酶新基因，类球红细菌VK-2-3进一步的具有创造性。

本发明还保护类球红细菌VK-2-3的菌剂。

本发明还保护类球红细菌VK-2-3或所述菌剂或所述重组类球红细菌在生产辅酶Q10中的应用。

所述应用中，生产辅酶Q10的方法如下：采用发酵培养基培养类球红细菌。

所述培养的时间具体可为：72h。

所述培养的条件具体可为：避光、32℃、220rpm。

所述应用中，生产辅酶Q10的方法具体包括如下步骤：

(1)将类球红细菌单菌落接种至种子培养基，进行培养，得到种子液；

(2)将种子液接种于发酵培养基，进行培养。

所述步骤(1)中，所述培养的条件具体可为：避光、32℃、220rpm。

所述步骤(1)中，所述种子液的OD_600nm值＝1.5。

所述步骤(2)中，所述培养的时间具体可为：72h。

所述步骤(2)中，所述培养的条件具体可为：避光、32℃、220rpm。

所述步骤(2)中，种子液和发酵培养基的配比具体为：6mL：60mL。

种子培养基具体可为：葡萄糖3g/L、氯化钠2g/L、酵母提取粉8g/L、七水硫酸镁0.25g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、氯化钴0.01g/L、辅液1mL/L，余量为水。

发酵培养基具体可为(pH 6.7)：葡萄糖35g/L、谷氨酸钠3g/L、玉米浆干粉12g/L、氯化钠3g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵3g/L、七水硫酸镁12.5g/L、氯化钴0.01g/L、辅液1mL/L，余量为水。

辅液具体可为：烟酸1g/L、盐酸硫铵1g/L、生物素0.015g/L，余量为水。

本发明还保护一种类球红细菌诱变方法(方法甲)，包括如下步骤：采用高压芒刺电场对类球红细菌进行诱变。

本发明还保护一种类球红细菌诱变方法(方法乙)，包括如下步骤：对类球红细菌依次进行重离子束诱变和高压芒刺电场诱变，或者，对类球红细菌依次进行高压芒刺电场诱变和重离子束诱变。

具体的，所述高压芒刺电场诱变的参数为：2-3.8kv/cm诱变10min-20min。

具体的，所述高压芒刺电场诱变的参数为：2-2.6kv/cm诱变10min-20min、2.6-3.2kv/cm诱变10min-20min或3.2-3.8kv/cm诱变10min-20min。

所述诱变方法中，诱变的目的为提高类球红细菌生产辅酶Q10的能力。

所述诱变方法中，类球红细菌具体可为类球红细菌V-0。

所述诱变方法中，类球红细菌具体可为类球红细菌V-4。

为弥补现有技术中的缺陷，本发明的发明人用新型随机诱变方式——重离子诱变和高压芒刺电场诱变进行类球红细菌菌种诱变选育，获得高产辅酶Q10菌种，然后通过反向代谢工程解析，获得目标产物产量提高的新基因和新位点。本发明研究对提高工业类球红细菌辅酶Q10产量以及扩大辅酶Q10高产菌种的改造位点具有指导意义。

本发明可用于辅酶Q10生产领域，对于辅酶Q10生产及其下游产品的制备具有应用推广价值。

附图说明

图1为实施例2中辅酶Q10浓度和峰面积的标准曲线。

图2为实施例4中辅酶Q10产量、细胞干重、辅酶Q10产率和生产性能的结果。

图3为实施例4中残糖浓度的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

基础培养基(pH7.2)：葡萄糖3g/L、氯化钠2g/L、酵母提取粉8g/L、七水硫酸镁0.25g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、琼脂粉20g/L、辅液1mL/L，余量为水。

辅液：烟酸1g/L、盐酸硫铵1g/L、生物素0.015g/L，余量为水。

种子培养基：葡萄糖3g/L、氯化钠2g/L、酵母提取粉8g/L、七水硫酸镁0.25g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、氯化钴0.01g/L、辅液1mL/L，余量为水。

发酵培养基(pH 6.7)：葡萄糖35g/L、谷氨酸钠3g/L、玉米浆干粉12g/L、氯化钠3g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵3g/L、七水硫酸镁12.5g/L、氯化钴0.01g/L、辅液1mL/L，余量为水。

实施例1、对类球红细菌依次进行重离子束诱变和高压芒刺电场诱变

一、重离子诱变

将类球红细菌V-0(Rhodobacter sphaeroides)培养至对数期，吸取2mL菌液装入无菌辐照皿中并用封口膜密封，然后转移至辐照室用¹²C⁶⁺离子束进行辐照诱变(辐照速率为40Gy/min；重离子诱变选择的辐照剂量分别为：25Gy、50Gy、75Gy、100Gy、125Gy、150Gy、175Gy、200Gy、225Gy、250Gy、275Gy和300Gy；每个辐照剂量设3个平行样，并设对照组)。然后通过筛选得到类球红细菌V-4(V代表具有维生素K3抗性；4代表重离子诱变剂量为100Gy)。记载于如下文献：重离子诱变类球红细菌提高辅酶Q10产量，内蒙古工业大学学报，Vol.39No.22020。

二、高压芒刺电场诱变

1、活化培养

从-70℃冰箱中取出类球红细菌V-4冻存管，室温缓慢解冻，然后采用稀释涂布法均匀涂布于基础培养基平板中，32℃培养5～6d。

2、高压芒刺电场诱变

完成步骤2后，将平板上菌落长势良好的菌株作为诱变对象，进行高压芒刺电场诱变。诱变效果受诱变场强与诱变时间两个变量的影响，因此设计了4种场强下的2个诱变时间的8组诱变试验，分别为：2kv/cm诱变10min、2.6kv/cm诱变10min、3.2kv/cm诱变10min、3.8kv/cm诱变10min；2kv/cm诱变20min、2.6kv/cm诱变20min、3.2kv/cm诱变20min、3.8kv/cm诱变20min。诱变结束后用接种环将诱变菌落挑入0.9％生理盐水中备用。

得到多株诱变后的菌株。

实施例2、菌株的筛选

一、初筛

从实施例1得到的多株诱变后的菌株中进行初筛。

吸取实施例1的步骤二得到的菌液100μL于离心管，用无菌水稀释至10^-6稀释度后取40μL均匀涂布于含不同筛选物的基础培养基平板(L代表氯霉素浓度为1.9mg·L^-1，R代表罗红霉素浓度为6.0mg·L^-1，K代表卡那霉素浓度为45mg·L^-1)，培养5～6天。培养条件：避光、32℃，空气湿度35％～45％。

从氯霉素筛选平板上获得了多株维生素K3和氯霉素双抗菌株，即类球红细菌VL-1-1、类球红细菌VL-1-2、类球红细菌VL-1-3、类球红细菌VL-1-4、类球红细菌VL-2-1、类球红细菌VL-2-2、类球红细菌VL-2-3、类球红细菌VL-2-4。

从罗红霉素筛选平板上获得了多株维生素K3和罗红霉素双抗菌株，即类球红细菌VR-1-1、类球红细菌VR-1-2、类球红细菌VR-1-3、类球红细菌VR-1-4、类球红细菌VR-2-1、类球红细菌VR-2-2、类球红细菌VR-2-3、类球红细菌VR-2-4。

从卡那霉素筛选平板上获得了多株维生素K3和卡那霉素双抗菌株，即类球红细菌VK-1-1、类球红细菌VK-1-2、类球红细菌VK-1-3、类球红细菌VK-1-4、类球红细菌VK-2-1、类球红细菌VK-2-2、类球红细菌VK-2-3、类球红细菌VK-2-4。

二、复筛

供试菌株分别为：步骤一得到的抗性菌株以及类球红细菌V-4。

1、将供试菌株接种于抗性平板培养基，培养5～6天。培养条件：避光、32℃，空气湿度35％～45％。

氯霉素抗性平板培养基是在基础培养基中添加氯霉素和维生素K3得到的；培养基中，氯霉素的浓度为1.9mg·L^-1，维生素K3的浓度为5.0mg·L^-1。

罗红霉素抗性平板培养基是在基础培养基中添加罗红霉素和维生素K3得到的；培养基中，罗红霉素的浓度为6.0mg·L^-1，维生素K3的浓度为5.0mg·L^-1。

卡那霉素抗性平板培养基是在基础培养基中添加卡那霉素和维生素K3得到的；培养基中，卡那霉素的浓度为45mg·L^-1，维生素K3的浓度为5.0mg·L^-1。

2、完成步骤1后，将单菌落用接种环挑入装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养至OD_600nm值＝1.5(此时达到对数生长期)，得到种子液。将6mL种子液接种于装有60mL发酵培养基的500mL三角瓶中，培养72h。培养条件：避光、32℃，220rpm。

3、完成步骤2后，检测辅酶Q10产量。

(1)完成步骤2后，取样5mL培养体系，转移至50mL的棕色容量瓶中，先加1mol·L^-1的盐酸水溶液0.5mL，再加入30％过氧化氢水溶液0.5mL，然后加入适量无水乙醇，于超声波清洗仪中超声2～3分钟至气泡全部被赶出，然后加入无水乙醇定容至50mL，控制超声波清洗仪中水温在55～60℃，然后超声破碎45分钟，最后用0.22μm有机系针筒式滤膜过滤并收集滤液。

(2)取步骤(1)得到的滤液，进行高效液相色谱检测。

高效液相色谱检测辅酶Q10含量的参数见表1。

表1高效液相色谱检测辅酶Q10含量的检测条件

色谱柱型号	C18反相柱(4.6mm×150mm×5μm)
		流动相	甲醇：无水乙醇(体积比)＝65：35
检测波长	275nm
		流速	1.0～2.0mL/min
进样量	10μL
		柱温	35℃
运行时间	20min

辅酶Q10标准品按照表1的参数进行高效液相色谱检测，出峰时间为14min。辅酶Q10浓度和峰面积的标准曲线见图1。

根据标准曲线完成步骤2的培养体系中的辅酶Q10产量计算，单位为mg·L^-1。

维生素K3和氯霉素双抗菌株的结果见表2。在相同的发酵培养条件下，类球红细菌VL-2-3的辅酶Q10产量高于类球红细菌V-4，较类球红细菌V-4提高了2.33％。

表2维生素K3和氯霉素双抗条件下菌株的筛选结果

注：肩注大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

维生素K3和罗红霉素双抗菌株的结果见表3。在相同的发酵培养条件下，维生素K3和罗红霉素双抗菌株的辅酶Q10产量相对于类球红细菌V-4均未提高。

表3维生素K3和罗红霉素双抗条件下菌株的筛选结果

菌株编号	辅酶Q10产量(mg·L<sup>-1</sup>)	增长率
			V-4	361.43±5.81<sup>Aa</sup>	——
VR-1-1	342.28±9.10<sup>Aab</sup>	-5.30％
			VR-1-2	309.23±9.50<sup>BCc</sup>	-14.44％
VR-1-3	334.38±10.09<sup>ABb</sup>	-7.49％
			VR-1-4	283.61±10.98<sup>CDd</sup>	-21.53％
VR-2-1	265.60±5.63<sup>Dd</sup>	-26.51％
			VR-2-2	352.76±12.66<sup>Aab</sup>	-2.40％
VR-2-3	360.04±1.44<sup>Aa</sup>	-0.39％
			VR-2-4	342.84±5.47<sup>Aab</sup>	-5.14％

维生素K3和卡那霉素双抗菌株的结果见表4。VK-1-4与VK-2-1在筛选平板上没有生长。在相同的发酵培养条件下，类球红细菌VK-2-3的辅酶Q10产量高于类球红细菌V-4，较类球红细菌V-4提高了4.15％，差异显著。

表4维生素K3和卡那霉素双抗条件下菌株的筛选结果

菌株编号	辅酶Q10产量(mg·L<sup>-1</sup>)	增长率
			V-4	370.83±2.49<sup>Ab</sup>	——
VK-1-1	294.05±12.17<sup>Bc</sup>	-20.71％
			VK-1-2	292.62±1.69<sup>Bc</sup>	-21.09％
VK-1-3	270.17±5.31<sup>Cd</sup>	-27.14％
			VK-2-2	301.73±7.88<sup>Bc</sup>	-18.64％
VK-2-3	386.22±0.67<sup>Aa</sup>	4.15％
			VK-2-4	373.67±0.13<sup>Aab</sup>	0.76％

实施例3、类球红细菌VK-2-3的保藏和性能检测

一、菌株的保藏

实施例2中获得的类球红细菌VK-2-3辅酶Q10产量最高。

类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)VK-2-3的16S rDNA鉴定结果如序列表的序列1所示。

类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)VK-2-3已于2021年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021735。

二、类球红细菌VK-2-3的性能检测

供试菌分别为：类球红细菌VK-2-3和类球红细菌V-0。

1、将供试菌单菌落用接种环挑入装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养至OD_600nm值＝1.5(此时达到对数生长期)，得到种子液。将6mL种子液接种于装有60mL发酵培养基的500mL三角瓶中，培养72h。培养条件：避光、32℃，220rpm。

2、完成步骤1后，检测辅酶Q10产量，同时检测体系中的细胞干重(g/L)、残糖浓度(g/L)。计算辅酶Q10产率和生产性能。

检测辅酶Q10产量的方法同实施例2的步骤二的3。

辅酶Q10产率(mg/g)＝辅酶Q10产量÷细胞干重。

辅酶Q10生产性能[mg/(g·g·h·L)]＝A÷(B×C×D)；

A－辅酶Q10产率；B－糖消耗量；C－发酵液体积；D－发酵时间

结果见表5。与类球红细菌V-0相比，类球红细菌VK-2-3的辅酶Q10产量提高了22.6％。相同发酵条件下，在P＝0.05水平下，与类球红细菌V-0相比，类球红细菌VK-2-3的细胞干重、辅酶Q10产率和残糖浓度差异显著。

表5诱变后高产菌株VK-2-3和出发菌株V-0的发酵性能比较

实施例4、NAD⁺依赖性脱氢酶新基因的发现和功能验证

一、NAD⁺依赖性脱氢酶新基因的发现

从类球红细菌VK-2-3中发现一个NAD⁺依赖性脱氢酶新基因，如序列表的序列2所示，其编码的蛋白质如序列表的序列3所示。

二、重组菌的制备

1、将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pBBR1MCS-4质粒的BamH I和HindIII酶切位点之间，得到重组质粒。重组质粒已进行测序验证。

2、采用电转法将步骤1制备的重组质粒导入类球红细菌V-0感受态细胞中(将重组质粒导入类球红细菌V-0中是为了验证过表达NAD⁺依赖性脱氢酶之后重组菌与V-0之间的辅酶Q10产量差异和发酵性能差异)，得到重组菌，重组菌命名为RS.NAD⁺。

三、发酵

供试菌分别为：类球红细菌V-0和重组菌RS.NAD⁺。

检测辅酶Q10产量的方法同实施例2的步骤二的3。

辅酶Q10产率和辅酶Q10生产性能计算公式同实施例3的步骤二。

结果见表6、图2和图3。与类球红细菌V-0相比，重组菌RS.NAD⁺辅酶Q10产量提高了21.6％。在P＝0.05水平下，与类球红细菌V-0相比，重组菌RS.NAD⁺的细胞干重、辅酶Q10产率差异显著。可以看出，重组菌RS.NAD⁺与类球红细菌VK-2-3相比，辅酶Q10产量、产率、生产性能还有差距，推断原因可能是NAD⁺依赖性脱氢酶基因的改变是辅酶Q10产量提高的主要原因之一。

表6出发菌株V-0与重组菌株RS.NAD⁺的性能比较

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 内蒙古工业大学

<120> 一种NAD+依赖性脱氢酶基因及其在提高辅酶Q10产量中的应用

<130> GNCYX211973

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1380

<212> DNA

<213> Rhodobacter sphaeroides

<400> 1

gaacttggcg gcgctaccat gcagtcgagc gaagtcttcg gacttacggc ggacgggtga 60

gtaacgcgtg ggaacgtgcc ctttgcttcg gaatagcccc gggaaactgg gagtaatacc 120

gaatgtgccc tatgggggaa agatttatcg gcaaaggatc ggcccgcgtt ggattaggta 180

gttggtgggg taatggccta ccaagccgac gatccatagc tggtttgaga ggatgatcaa 240

ccacactggg actgaaacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatcttac 300

acaatgggcg caagcctgat ctagccatgc cgcgtgatcg atgaaggcct tagggttgta 360

aagatctttc aggtgggaag ataatgacgg taccgaccag aatgaaggcc ccggcctaac 420

tccgtgccag caggccgcgg taatacgaag ggggctagcg ttattcagaa gtactgggcg 480

taaagcgcac gtaggcggat cggaaagtca gaggtgaaat cacagggctc aaccctggaa 540

ctgcctttga aactcccgat cttgaggtcg agagaggtga gtggaattcc gagtgtagag 600

gtgaaattcg tagatattcg gaggaacacc agtggcgaag gcggctcact ggctcgatac 660

tgacgctgag gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 720

cgtaaacgat gaatgccagt cgtcaggcag catgctgttc ggtgacacac ctaacggatt 780

aagcattccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaaggaatt gacgggggcc 840

cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgcagaacct taccaacccc 900

tgacatggcg atcgcggttc cagagatgga tccttcagta cgactggatc gcacacaggt 960

gctgcatggc ctgtcgtcag actcgggtcg tggagactgt ttcggacaag tccggcaacg 1020

agcgcaaccc acgtccttag ttgccagcat tcagttgggc actctaggga aactgccggt 1080

gataagccgg aggaaggtgt ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttacg ggttgggcta 1140

cacacgtgct acaatggcag tgacaatggg ttaatcccaa aaagctgtct cagttcggat 1200

tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgta acagcatgac 1260

gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg aattggttct 1320

acccgaaggc ggtgcgccaa cctcgcaaga ggaggcagcc gaccacggtg atcagtgctt 1380

<210> 2

<211> 1215

<212> DNA

<213> Rhodobacter sphaeroides

<400> 2

atgtcgaaga tcaaggtagc gaaccccgtc gtcgagctcg acggcgacga gatgacccgc 60

atcatctggg acttcatcaa gcagaagctg atcctgccct acctcgacat cgacctgcat 120

tactacgatc tcggcatcga ggagcgcgac cgcaccgagg acaagatcac ggtcgatgcg 180

gcccatgcga tcaagcagta tggcgtgggc gtgaagtgcg ccaccatcac gccggacgag 240

gcgcgggtcg aggaattcgg cctgaaatcc atgtggaaga gcccgaacgg cacgatccgc 300

aacatcctcg gcggcgtgat cttccgccag ccgatcatct gccgcaacgt cccgcgcctc 360

gtgccgggct ggacgaagcc catcgtcgtc ggccgccatg ccttcggcga ccagtatcgc 420

gcgaccgact tccgcttccc gggcaagggc aagctcacgc tgaaattcgt gggcgaggac 480

ggcgcggtga tcgagcgcga ggtgttcgac gcgccgggct cgggcgtgac catggcgatg 540

tacaacctcg accagtcgat catcgacttc gcgcgcgcct cgatgaacta cgggctgaac 600

ctcggctggc cggtgtacct ctcgaccaag aacacgatcc tcaaggccta cgacgggcgc 660

ttcaaggacc tcttccagca ggtctacgag gaggaattcg ccgagaagtt caaggcggcg 720

ggcatcacct acgagcaccg gctgatcgac gacatggtgg cttcggcgct gaaatggtcg 780

ggcggctatg tctgggcctg caagaactac gacggcgacg tgcagtcgga tacggtggcg 840

cagggcttcg gctcgctcgg gctgatgacg agcgtgctga tgacgccgga cgggcagacg 900

gtggaggccg aggccgcgca tggcacggtc acgcggcact tccgccagca tcaggcgggc 960

aaggagacct cgaccaactc gatcgcctcg atctacgcct ggacgggggg gctcaagcac 1020

cgcgccaagc tcgacggcaa tgccgatctc gcccgcttcg ccgagacgct cgagcgggtc 1080

acggtgcaga cggttgagga cggcttcatg acgaaggacc tggcgctcct cgtgggcccg 1140

gatcagaagt ggctgaccac gatgggctat ctcgagaagg tcgacgaata tctcgaccgc 1200

gcgctcggcg cctga 1215

<210> 3

<211> 404

<212> PRT

<213> Rhodobacter sphaeroides

<400> 3

Met Ser Lys Ile Lys Val Ala Asn Pro Val Val Glu Leu Asp Gly Asp

1 5 10 15

Glu Met Thr Arg Ile Ile Trp Asp Phe Ile Lys Gln Lys Leu Ile Leu

20 25 30

Pro Tyr Leu Asp Ile Asp Leu His Tyr Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Glu

35 40 45

Arg Asp Arg Thr Glu Asp Lys Ile Thr Val Asp Ala Ala His Ala Ile

50 55 60

Lys Gln Tyr Gly Val Gly Val Lys Cys Ala Thr Ile Thr Pro Asp Glu

65 70 75 80

Ala Arg Val Glu Glu Phe Gly Leu Lys Ser Met Trp Lys Ser Pro Asn

85 90 95

Gly Thr Ile Arg Asn Ile Leu Gly Gly Val Ile Phe Arg Gln Pro Ile

100 105 110

Ile Cys Arg Asn Val Pro Arg Leu Val Pro Gly Trp Thr Lys Pro Ile

115 120 125

Val Val Gly Arg His Ala Phe Gly Asp Gln Tyr Arg Ala Thr Asp Phe

130 135 140

Arg Phe Pro Gly Lys Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Val Gly Glu Asp

145 150 155 160

Gly Ala Val Ile Glu Arg Glu Val Phe Asp Ala Pro Gly Ser Gly Val

165 170 175

Thr Met Ala Met Tyr Asn Leu Asp Gln Ser Ile Ile Asp Phe Ala Arg

180 185 190

Ala Ser Met Asn Tyr Gly Leu Asn Leu Gly Trp Pro Val Tyr Leu Ser

195 200 205

Thr Lys Asn Thr Ile Leu Lys Ala Tyr Asp Gly Arg Phe Lys Asp Leu

210 215 220

Phe Gln Gln Val Tyr Glu Glu Glu Phe Ala Glu Lys Phe Lys Ala Ala

225 230 235 240

Gly Ile Thr Tyr Glu His Arg Leu Ile Asp Asp Met Val Ala Ser Ala

245 250 255

Leu Lys Trp Ser Gly Gly Tyr Val Trp Ala Cys Lys Asn Tyr Asp Gly

260 265 270

Asp Val Gln Ser Asp Thr Val Ala Gln Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu

275 280 285

Met Thr Ser Val Leu Met Thr Pro Asp Gly Gln Thr Val Glu Ala Glu

290 295 300

Ala Ala His Gly Thr Val Thr Arg His Phe Arg Gln His Gln Ala Gly

305 310 315 320

Lys Glu Thr Ser Thr Asn Ser Ile Ala Ser Ile Tyr Ala Trp Thr Gly

325 330 335

Gly Leu Lys His Arg Ala Lys Leu Asp Gly Asn Ala Asp Leu Ala Arg

340 345 350

Phe Ala Glu Thr Leu Glu Arg Val Thr Val Gln Thr Val Glu Asp Gly

355 360 365

Phe Met Thr Lys Asp Leu Ala Leu Leu Val Gly Pro Asp Gln Lys Trp

370 375 380

Leu Thr Thr Met Gly Tyr Leu Glu Lys Val Asp Glu Tyr Leu Asp Arg

385 390 395 400

Ala Leu Gly Ala

Claims

1.NAD⁺依赖性脱氢酶或NAD⁺依赖性脱氢酶基因在调控类球红细菌的辅酶Q10产量中的应用；所述NAD⁺依赖性脱氢酶如序列表的序列3所示；所述NAD⁺依赖性脱氢酶基因如序列表的序列2所示。

2.一种提高类球红细菌的辅酶Q10产量的方法，包括如下步骤：将NAD⁺依赖性脱氢酶基因导入类球红细菌，从而提高类球红细菌的辅酶Q10产量；所述NAD⁺依赖性脱氢酶基因如序列表的序列2所示。

3.一种制备辅酶Q10产量提高的重组类球红细菌的方法，包括如下步骤：将NAD⁺依赖性脱氢酶基因导入类球红细菌，得到辅酶Q10产量提高的重组类球红细菌；所述NAD⁺依赖性脱氢酶基因如序列表的序列2所示。

4.NAD⁺依赖性脱氢酶基因在制备辅酶Q10产量提高的重组类球红细菌中的应用；所述NAD⁺依赖性脱氢酶基因如序列表的序列2所示。

5.Rhodobacter sphaeroides VK-2-3，其保藏编号为CCTCC NO：M 2021735。

6.权利要求5所述Rhodobacter sphaeroides VK-2-3的菌剂。

7.NAD⁺依赖性脱氢酶或NAD⁺依赖性脱氢酶基因；所述NAD⁺依赖性脱氢酶如序列表的序列3所示；所述NAD⁺依赖性脱氢酶基因如序列表的序列2所示。

8.一种重组类球红细菌，是将NAD⁺依赖性脱氢酶基因导入类球红细菌得到的；所述NAD⁺依赖性脱氢酶基因如序列表的序列2所示。

9.权利要求5所述类球红细菌或权利要求6所述菌剂或权利要求8所述重组类球红细菌在生产辅酶Q10中的应用。

10.一种类球红细菌诱变方法，为方法甲或方法乙：

所述方法甲包括如下步骤：采用高压芒刺电场对类球红细菌进行诱变；

所述方法乙包括如下步骤：对类球红细菌依次进行重离子束诱变和高压芒刺电场诱变，或者，对类球红细菌依次进行高压芒刺电场诱变和重离子束诱变。