CN110964670B - 一株产l-赖氨酸的大肠杆菌及其应用 - Google Patents

一株产l-赖氨酸的大肠杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产L‑赖氨酸的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。所述大肠杆菌已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019435，保藏地址为中国武汉，武汉大学。本发明的大肠杆菌(Escherichia coli)FMME‑lys，表现出耐受高浓度L‑赖氨酸的能力，其耐受能力达260g/L，减少了在发酵过程中因产物对细胞产生毒害的影响，并进一步促进赖氨酸的生成。经发酵罐扩大培养，发酵33h L‑赖氨酸产量高达210g/L，葡萄糖得率为75％。

Description

一株产L-赖氨酸的大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株产L-赖氨酸的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
赖氨酸(L-Lysine)，分子量146.19Da，是一种α-氨基酸，化学式表示为：HO2CCH(NH2)(CH2)4NH2，遗传密码是AAA和AAG。赖氨酸与精氨酸，组氨酸一样，属于碱性氨基酸。由于赖氨酸是动物和人体的必需氨基酸之一，因此广泛用于动物饲料添加剂、食品、医药健康、化工新材料等领域，其中90％赖氨酸被应用在饲料行业。
发酵法生产赖氨酸具有污染小、成本低等优势，已经逐步取代传统的抽提法、化学合成法和酶法等生产方式。国外赖氨酸生产企业主要有日本味之素、美国阿丹米、韩国希杰、德国赢创德固赛，这些企业赖氨酸的产量分别占到了全球赖氨酸市场的12％、9％、22％和7％；而2017年中国企业的赖氨酸产能则达到了50％，成为赖氨酸生产的第一产国和出口国。其中，宁夏伊品、通辽梅花和长春大成的产能所占比例分别为15％、11％和8％。目前，大部分研究通过代谢工程改造来提高赖氨酸产量，最高产量(以盐酸盐计)可达到200g/L。很少研究关注从通过适应性进化来提高菌体本身的赖氨酸耐受性从而提高赖氨酸产量。
在利用微生物发酵生产赖氨酸过程中，发酵过程的反应速率往往随着赖氨酸的积累而受到抑制，如何消除或减轻这种由目标代谢产物赖氨酸积累而引起的胁迫抑制，是获得有赖氨酸发酵过程中高产量、高产率和高生产强度的关键。目前，研究多集中在代谢工程改造来解除胁迫抑制，效果甚微。
发明内容
本发明以一株能积累赖氨酸的大肠杆菌为出发菌株。通过诱变适应性进化筛选获得了一株耐受260g/L赖氨酸突变菌株FMME-lys，产量进一步得到提升；最后进一步优化了突变株的发酵培养基成分和条件，赖氨酸(以盐酸盐计)产量达到210g/L，筛选出能耐受高浓度赖氨酸的L-赖氨酸产生菌为出发菌株用来生产赖氨酸，减少了产物的反馈抑制，对提高L-赖氨酸的发酵水平十分重要。
本发明的第一个目的是提供一株产L-赖氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)，所述大肠杆菌已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019435，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
本发明的第二个目的是提供一种组合物，含有所述大肠杆菌CCTCC NO:M2019435。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌CCTCC NO:M 2019435的含量≥1×105CFU/mL或1×105CFU/g。
本发明的第三个目的是提供一种生产L赖氨酸的方法，所述方法是以葡萄糖为底物，利用所述的大肠杆菌CCTCC NO:M 2019435进行发酵生产。
在一种实施方式中，所述发酵生产是将所述的大肠杆菌接种到含有葡萄糖的发酵培养基中进行生产。
在一种实施方式中，所述发酵培养基中含硫酸铵3～4g/L。
在一种实施方式中，所述发酵培养基中NH4 +浓度为1～1.5g/L。
在一种实施方式中，所述发酵过程的溶氧为20～30％。
在一种实施方式中，所述发酵生产的脯氨酸浓度0.5～1.5g/L。
在一种实施方式中，当葡萄糖浓度低于15g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在20～30g/L；当NH4 +浓度低于1g/L时，补加硫酸铵，使NH4 +浓度维持在1～1.5g/L。
在一种实施方式中，所述发酵培养基具体为(每L)：葡萄糖30～60g，玉米浆5～10g，毛发粉5～10g，甜菜糖蜜5～10g，硫酸铵3～4g，磷酸二氢钾1～2g，无水硫酸镁1～4g，脯氨酸0.5～1.5g，维生素500～1000μg，生物素B1 500～1000μg。
本发明的第四个目的所述大肠杆菌FMME-lys在食品和/或药品生产，制备动物饲料添加剂，制备化工新材料中的应用。
在一种实施方式中，所述应用包括制备L-赖氨酸或其上下游产物方面的应用。
本发明的有益效果:本发明选育到的大肠杆菌(Escherichia coli)FMME-lys，表现出积累高水平L-赖氨酸的能力，其赖氨酸耐受能力达260g/L。用该菌通过7.5L发酵罐水平的发酵法生产L-赖氨酸，L-赖氨酸的产量和产率分别达到了210g/L和75％左右，具有工业实用性价值。
生物材料保藏
本发明所提供的大肠杆菌(Escherichia coli)FMME-lys，分类学命名为Escherichia coliFMME-lys，已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019435，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
附图说明
图1为L-赖氨酸标准曲线；发酵液中赖氨酸含量(g/L)＝X*稀释倍数。
图2为突变株大肠杆菌FMME-lys在7.5L发酵罐培养的发酵曲线。
具体实施方式
氨基酸检测采用常规的茚三酮显色比色法检测，具体可见刘飞飞的发表在《中国食品添加剂》期刊上的《茚三酮比色法定量检测赖氨酸条件的研究》。
葡萄糖测定方法：使用SBA-40生物传感分析仪进行分析，可见李宪民的发表在《亚太传统医药》期刊上的《生物传感分析仪测定葡萄糖和L-乳酸的影响因素研究》。
葡萄糖得率的计算：葡萄糖得率(％)＝L-赖氨酸最高产量(g/L)/总葡萄糖添加(g/L)×100。
种子培养基：葡萄糖30g，磷酸二氢钾1.5～2.5g，硫酸镁1～1.5g，玉米浆5～10g，毛发粉2～4g，生物素1000μg，VB11000μg，L-苏氨酸300mg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2，121℃灭菌30min。
筛选液体培养基：赖氨酸盐酸盐200～270g，葡萄糖6g，牛肉膏4g，酵母粉3g，蛋白胨5g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.2，121℃灭菌30min。
筛选固体培养基：赖氨酸盐酸盐分别为200、220、240、260和270g，葡萄糖6g，牛肉膏4g，酵母粉3g，蛋白胨5g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.2，121℃灭菌30min。
固体平板培养基：葡萄糖6g，牛肉膏4g，酵母粉3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.2，121℃灭菌30min。
斜面培养基：葡萄糖6g，牛肉膏4g，酵母粉3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.2，121℃灭菌30min。
发酵培养基：葡萄糖30g，玉米浆5g，毛发粉5g，甜菜糖蜜5g，硫酸铵3g，磷酸二氢钾1g，无水硫酸镁1g，维生素1000μg，生物素B1 1000μg。
实施例1：突变菌株的获得
以2017年从面包中分离的大肠杆菌(Escherichia coli)LQL为出发菌株，按照如下方法进行筛选：
(1)常压室温等离子体(ARTP)诱变
①制备菌悬液
取原始菌株大肠杆菌(Escherichia coli)LQL的菌株200μL接入装有30mL/500mL种子培养基的三角瓶中，37℃，往复式摇床100rpm培养8h至对数中后期，将菌液离心弃上清，菌体用PBS溶液洗涤3次，再用生理盐水重悬，使菌悬液OD562调至1.0。
②ARTP诱变处理
取制备好的菌悬液10μL均匀涂抹至已灭菌冷却的小铁片上，并置入ARTP育种机，诱变功率100W，高纯氦气通气量10SLM，处理距离2mm，分别处理0、20、40、60s。
③后培养
将处理后的小铁片取出，放入装有990μL生理盐水的1.5mL离心管中，用涡旋振荡仪振荡菌体至少100s，使其彻底悬浮于生理盐水中，进入适应性进化。
(2)适应性进化：
诱变后的菌悬液接入装有30mL/500mL种子培养基中，37℃，往复式摇床100rpm培养6h后接入装有30mL/500mL筛选液体培养基(赖氨酸盐酸盐为200g/L)的摇瓶中，37℃，100rpm培养12h后，将菌液6000rpm，离心5～10min，所得菌体全部转接赖氨酸盐酸盐浓度为210g/L的筛选培养基3次，再取第三次培养24h后的菌液6000rpm，离心5～10min，所得菌体全部转接到装有30mL/500mL筛选液体培养基(赖氨酸盐酸盐浓度为210g/L)的摇瓶中，重复转接谷氨酸钠浓度为210g/L的筛选液体培养基3次。重复此操作，逐步提高培养基中赖氨酸盐酸盐的浓度，分别为220、230、240、250、260、270g/L进行培养。
将经过逐级驯化后得到的菌液稀释涂布于筛选固体培养基上(赖氨酸盐酸盐浓度分别为0、200、220、240、260和270g/L)，37℃培养2～3天。从含有不同浓度赖氨酸盐酸盐的平板上挑取单菌落，进行摇瓶发酵验证，并挑选赖氨酸生产能力较出发菌株优良的菌株再次进行摇瓶发酵验证，筛选出10株高产L-赖氨酸的菌株，其中一株大肠杆菌的L-赖氨酸生产能力最优，且其可以在赖氨酸盐酸盐浓度为260g/L的液体培养基和赖氨酸盐酸盐浓度为240g/L的固体培养基上生长，将该菌株命名为Escherichia coli FMME-lys。
大肠杆菌(Escherichia coli)FMME-lys，分类学命名为Escherichia coli FMME-lys，已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019435，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例2：在7.5L发酵罐中大肠杆菌LQL和FMME-lys发酵生产L-赖氨酸的情况
(1)种子液制备
将原始菌株大肠杆菌LQL和突变株大肠杆菌FMME-lys分别在固体平板培养基上划线，37℃恒温培养箱中培养2～3天，用接种针挑取单菌落划线于斜面培养基进行扩培，然后在37℃恒温培养箱中培养1～2天，从长好的斜面上挑取一环接入种子培养基中进行培养，35～37℃，往复式摇床100～130rpm培养12～18h。
(2)7.5L发酵罐发酵培养
将步骤(1)中制备得到的种子液按照12％接种量接种到发酵罐中，发酵罐中初始发酵体积为2L，发酵温度为37℃，通气量为1vvm，初始搅拌转速400rpm，然后搅拌和转速关联溶氧控制在10～20％，当葡萄糖浓度低于15g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在20～30g/L，当NH4 +浓度低于1g/L时，补加硫酸铵，使NH4 +浓度维持在0.5g/L-1g/L，发酵过程中取发酵液离心，收集上清液用茚三酮显色法测定发酵液中L-赖氨酸的含量。
结果表明，突变菌株FMME-lys的L-赖氨酸产量达到175.1g/L，与原始菌株Escherichiacoli LQL相比，产量提高了30g/L。
实施例3：在7.5L发酵罐中氮源对大肠杆菌FMME-lys发酵生产L-赖氨酸的影响
将实施例2步骤(1)中制备得到的种子液按照10％接种量接种到发酵罐中，发酵罐中初始发酵体积为2L，分别添加3g/L的硫酸铵，硝酸钾和尿素，发酵温度为37℃，通气量为1vvm，初始搅拌转速400rpm，然后搅拌和转速关联溶氧控制在10～20％，当葡萄糖浓度低于15g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在20～30g/L，当NH4 +浓度低于1g/L时，补加硫酸铵，使NH4 +浓度维持在0.5-1g/L，发酵过程中取发酵液离心，收集上清液用茚三酮显色法测定发酵液中L-赖氨酸的含量。
结果表明(见表1)：①当初始氮源为硫酸铵时，菌体浓度OD562高达37.2，赖氨酸盐酸盐产量175.1g/L；②初始氮源为硝酸钾和尿素时，发酵效果明显弱于硫酸铵。说硫酸铵更有利于发酵生产赖氨酸。
表1不同氮源对突变株FMME-lys生产L-赖氨酸的影响
Figure BDA0002339595990000051
实施例4：在发酵罐中NH4 +浓度发酵对FMME-lys发酵生产L-赖氨酸的影响
将实施例2步骤(1)中制备得到的大肠杆菌FMME-lys种子液按照10％接种量接种到发酵罐中，发酵罐中初始发酵体积为2L，发酵温度为37℃，通气量为1vvm，初始搅拌转速400rpm，然后搅拌和转速关联溶氧控制在10～20％，当葡萄糖浓度低于15g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在20～30g/L，当NH4 +浓度低于1g/L时，补加硫酸铵，使NH4 +浓度分别维持在0.5～1、1～1.5、1.5～2和2～2.5g/L，发酵过程中取发酵液离心，收集上清液用茚三酮显色法测定发酵液中L-赖氨酸的含量。
结果表明(见表2)：①当NH4 +离子浓度维持在1～1.5g/L时，发酵36h，菌体浓度达到40.1，产量达到190.4g/L，转化率高达67％。②当NH4 +浓度为0.5～1g/L时，产量只有175.1g/L，可能的原因是氮含量处于亚适量，使得产量低；③当NH4 +浓度高于1.5g/L时，菌体浓度高于低浓度而产量和转化率降低，可能的原因是高浓度的NH4 +利于菌体的生长，但不利于产酸。
表2发酵中NH4 +浓度对突变株FMME-lys生产L-赖氨酸的影响
Figure BDA0002339595990000061
实施例5：在发酵罐中溶氧对FMME-lys发酵生产L-赖氨酸的影响
将实施例2步骤(1)中制备得到的大肠杆菌FMME-lys种子液按照10％接种量接种到发酵罐中，发酵罐中初始发酵体积为2L，发酵温度为37℃，初始通气量为1vvm，初始搅拌转速400rpm，然后搅拌和转速关联溶氧控制在10～20％、20～30％、30～40％和40～50％，当葡萄糖浓度低于15g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在20～30g/L，当NH4 +浓度低于1g/L时，补加硫酸铵，使NH4 +浓度维持在0.1～0.15，发酵过程中取发酵液离心，收集上清液用茚三酮显色法测定发酵液中L-赖氨酸的含量。
结果表明(见表3)：①当溶氧控制在30～40％和40～50％时，发酵罐产生气泡，菌液黏附在罐壁上，造成菌体浓度降低，从而耗糖和产酸变慢，产量降低；②当溶氧控制在20～30％时，L-赖氨酸产量最高，达到195.0g/L；③当溶氧控制在10～20％时，产量只有190.4g/L。说明低溶氧不利于赖氨酸的积累。
表3发酵中溶氧对突变株FMME-lys生产L-赖氨酸的影响
Figure BDA0002339595990000062
实施例6：在发酵罐中葡萄糖浓度对FMME-lys发酵生产L-赖氨酸的影响
将实施例2步骤(1)中制备得到的大肠杆菌FMME-lys种子液按照10％接种量接种到发酵罐中，发酵罐中初始发酵体积为2L，发酵温度为37℃，初始通气量为1vvm，初始搅拌转速400rpm，然后搅拌和转速关联溶氧控制在20～30％，当葡萄糖浓度低于15g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度分别维持在0～10、10～20、20～30和30～40g/L，当NH4 +浓度低于1g/L时，补加硫酸铵，使NH4 +浓度维持在1～1.5g/L，发酵过程中取发酵液离心，收集上清液用茚三酮显色法测定发酵液中L-赖氨酸的含量。
结果表明(见表4)：①当葡萄糖浓度控制范围越高时，菌体浓度赖氨酸产量越低，可能原因是在高糖浓度下，提高了发酵液中的渗透压，使菌体浓度和赖氨酸产量均降低；②当葡萄糖浓度控制在0～10g/L时，L-赖氨酸产量最高，达到202.0g/L；说明发酵过程中控制低浓度葡萄糖更利于菌体的生长和赖氨酸的生产。
表4发酵过程中葡萄糖控制浓度对突变株FMME-lys生产L-赖氨酸的影响
Figure BDA0002339595990000071
实施例7：在发酵罐中海藻糖，脯氨酸和甲硫氨酸对FMME-lys发酵生产L-赖氨酸的影响
将实施例2步骤(1)中制备得到的大肠杆菌FMME-lys种子液按照10％接种量接种到发酵罐中，发酵罐中初始发酵体积为2L，发酵初始分别添加1g/L海藻糖，1g/L脯氨酸和1g/L甲硫氨酸，发酵温度为37℃，初始通气量为1vvm，初始搅拌转速400rpm，然后搅拌和转速关联溶氧控制在20～30％，当葡萄糖浓度低于15g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度分别维持在0～10g/L，当NH4 +浓度低于1g/L时，补加硫酸铵，使NH4 +浓度维持在1～1.5g/L，发酵过程中取发酵液离心，收集上清液用茚三酮显色法测定发酵液中L-赖氨酸的含量。
结果表明(见表5)：①通过添加海藻糖，脯氨酸和甲硫氨酸，有利于赖氨酸的产生，对菌体浓度无明显影响。②当添加1g/L的脯氨酸，L-赖氨酸产量最高，达到210.0g/L，产率为75％。
表5发酵过程中海藻糖、脯氨酸、甲硫氨酸对突变株FMME-lys生产L-赖氨酸的影响
Figure BDA0002339595990000072
实施例8：
将大肠杆菌FMME-lys按照实施例6最优条件传代10代后，在茚三酮比色条件下进行检测，结果显示，原代大肠杆菌FMME-lys发酵33h的L-赖氨酸产量为210g/L，传代10代后的L-赖氨酸产量达209-210g/L，葡萄糖得率维持在73-75％，具体结果如下表6。
表6传代对突变株FMME-lys生产L-赖氨酸的影响
Figure BDA0002339595990000081
对比例1：
具体实施方式同实施例4，区别在于，将硫酸铵替换为氯化铵，结果显示，通过采用补加氯化铵维持NH4 +浓度为1～1.5g/L，赖氨酸产量只有182g/L，菌体OD值为35.2，转化率只有62％。说明氯化铵对L-赖氨酸生产无法达到促进效果。
对比例2：
按照实施例6条件进行发酵，将葡萄糖替换为蔗糖，结果显示，通过控制蔗糖浓度在0-10g/L，赖氨酸产量只有150g/L，菌体OD值为30.2，转化率只有59％。说明采用蔗糖为碳源，并不能促进赖氨酸的生产。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (12)

1.一株产L-赖氨酸的大肠杆菌（Escherichia coli），其特征在于，所述大肠杆菌已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2019435，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
2.含有权利要求1所述大肠杆菌CCTCC NO: M 2019435的组合物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述大肠杆菌CCTCC NO: M 2019435的含量≥1×105CFU/mL或≥1×105CFU/g。
4.一种生产L-赖氨酸的方法，所述方法是以葡萄糖为底物，利用权利要求1所述的大肠杆菌CCTCC NO: M 2019435进行发酵。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基中还含有铵盐和脯氨酸；NH4 +浓度为1~1.5g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基中含硫酸铵3~4 g/L。
7.根据权利要求4~6任一所述的方法，其特征在于，所述发酵过程的溶氧为20~30%。
8.根据权利要求4~6任一所述的方法，其特征在于，当葡萄糖浓度低于15g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在20~30g/L；当NH4 +浓度低于1 g/L时，补加铵盐，使NH4 +浓度维持在1~1.5 g/L。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当葡萄糖浓度低于15g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在20~30g/L；当NH4 +浓度低于1 g/L时，补加铵盐，使NH4 +浓度维持在1~1.5 g/L。
10.根据权利要求4~6,9任一所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基每L含有：葡萄糖30~60g，玉米浆5~10g，毛发粉5~10g，甜菜糖蜜5~10g，硫酸铵3~4g，磷酸二氢钾1~2g，无水硫酸镁1~4g，脯氨酸0.5~1.5g，维生素500~1000μg，生物素B1 500~1000μg。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵过程的溶氧为20~30%，用于发酵的培养基每L含有：葡萄糖30~60g，玉米浆5~10g，毛发粉5~10g，甜菜糖蜜5~10g，硫酸铵3~4g，磷酸二氢钾1~2g，无水硫酸镁1~4g，脯氨酸0.5~1.5g，维生素500~1000μg，生物素B1 500~1000μg。
12.权利要求1所述的大肠杆菌在制备动物饲料添加剂中的应用。
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