CN111500476A - 一种利用乳酸菌提高酵母菌酒精耐受能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用乳酸菌提高酵母菌酒精耐受能力的方法，属于生物工程技术领域。本发明是将乳酸菌外源添加到酵母菌培养体系中混合培养4 h，所获得的菌体重悬于含有8%（v/v）酒精的生理盐水，30℃条件下胁迫90 min。将经酒精胁迫后的菌体离心洗涤后点种到含0.01%氯霉素的酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基上，30℃静置培养36 h后对菌落计数并计算存活率。结果表明经酒精胁迫后，添加了乳酸菌混合培养后得到的酵母菌存活率为23.64%，纯培养后的酵母菌存活率3.87%，存活率提高了6.11倍。本发明法简单、便于操作，可用于提高酵母菌的抗酒精性能。

Description

一种利用乳酸菌提高酵母菌酒精耐受能力的方法
技术领域
本发明涉及一种提高酵母菌酒精耐受能力的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
鲁氏酵母菌属于酵母科中的接合酵母属，是传统发酵重要的生产菌，广泛存在于酱油、豆瓣等盐渍食品中。鲁氏酵母在酱油主发酵期发挥作用，主要产生乙醇、高级醇等风味物质，酵母中的谷氨酰胺酶能转化底物生成谷氨酸而增强酱油的鲜味，对发酵调味品的风味起着积极作用。嗜盐四联球菌也是传统发酵食品如酱油、果酱等发酵生产中的重要菌株，是产生挥发性物质的主要微生物之一，具有促进香味成分生成，改善产品品质和口感等功能。利用乳酸菌和酵母菌混合培养不仅能缩短产品发酵周期，延长产品的货架期，同时提高产品品质。
在传统发酵食品的生产过程中，包括酵母在内的多种产醇微生物的生长代谢提高发酵体系中醇类的含量。已有研究表明，发酵体系中酒精含量达到一定浓度后会对酵母菌产生毒害作用，抑制细胞存活、生长和发酵活性，从而影响食品生产的效率。当酒精度为4%vol时，便会使一些酵母菌株对糖、离子及氨基酸的吸收率降到50%，只有当发酵醪液中酒精度<3.8%vol时，酒精对酵母菌株的抑制作用才能够忽略不计。通过优化乳酸菌和酵母菌的混合培养条件能有效提高酵母菌在高酒精含量环境中的生物量和代谢能力，进一步提高食品发酵效率，对传统发酵食品生产具有着重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用乳酸菌提高酵母菌酒精耐受能力的方法。
所述的方法为将培养好的乳酸菌离心收集后添加到酵母培养体系中混合培养4h。
菌株：鲁氏酵母，保藏于CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.3791，保藏日期为2010年04月29日，分类命名为Zygosaccharomyces rouxii SZ-1；嗜盐四联球菌，保藏于CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.3792，保藏日期为2010年04月29日，分类命名为Tetragenococcus halophilus SZ-B-2。
种子培养方法：乳酸菌培养基：10 g/L蛋白胨，8 g/L牛肉膏，4 g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖，0.1% 山梨醇单油酸酯，2 g/L磷酸氢二钾，5 g/L三水乙酸钠，2 g/L柠檬酸三铵，0.2 g/L七水合硫酸镁，0.2 g/L 四水合硫酸锰，60 g/L NaCl，pH为6.2；酵母菌培养基：10g/L酵母粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，60 g/L NaCl，pH 为6.0。分别取-80℃保藏的乳酸菌和酵母菌甘油管储存液接种于5 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24h，再分别转接到100 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h做种子液。
混合培养培养基：10 g/L蛋白胨，8 g/L牛肉膏，4 g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖，0.1%山梨醇单油酸酯，2 g/L磷酸氢二钾，5 g/L三水乙酸钠，2 g/L柠檬酸三铵，0.2 g/L七水合硫酸镁，0.2 g/L 四水合硫酸锰，60 g/L NaCl，pH6.2。
混合培养方法：将培养好的酵母菌种子液于10000 rpm，4℃条件下离心5 min收集菌体，重悬至4 mL无菌水中，取0.5 mL酵母菌悬液加入到混合培养培养基中，再将培养好的乳酸菌种子液于10000 rpm，4℃条件下离心5 min收集菌体，重悬至4 mL无菌水中，取1 mL乳酸菌悬液于酵母菌培养体系中，30℃静置培养4 h。
酒精胁迫处理：取2 mL混合培养结束后的菌悬液于10000 rpm，4℃条件下离心5min丢弃上清液，加入4 mL含有8%（v/v）酒精的生理盐水于30℃下胁迫90 min。
酒精耐受能力的测定：将酒精胁迫后的菌悬液用无菌水于10000 rpm，4℃条件下离心洗涤两次，再重悬于1mL的无菌水中，经适当稀释后，接种到含0.01%氯霉素的YPD琼脂培养基上，30℃静置培养36 h后进行菌落计数。
本发明的有益效果：本发明提供的将培养好的嗜盐四联球菌外源添加到鲁氏酵母培养体系中混合培养4 h后，对离心收集的菌体进行酒精胁迫处理。将处理后的菌悬液离心洗涤，再适度稀释后点种到YPD琼脂培养基上，培养后对菌落计数。酒精胁迫后，相比对照组即酵母菌纯培养组，添加了乳酸菌混合培养后得到的酵母菌具有更高的存活率。本发明提供一种基于在酵母菌培养体系中外源添加乳酸菌并混合培养提升酵母菌酒精耐受能力的方法，简单易行，可用于提高酵母菌在高酒精含量环境中的生长性能。
附图说明
图1是两种不同方式处理后酵母菌再经酒精胁迫后存活率图。
具体实施方式
实例1：将乳酸菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792添加到酵母菌Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791培养体系中混合培养4 h。经酒精处理后，在加入了0.01%氯霉素的YPD琼脂培养基上计得的酵母菌菌落数，计算出存活率（图1）。
分别取-80℃保藏的乳酸菌和酵母菌甘油管储存液，按20 %的接种量接种于5 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h，再均按5%的接种量转接到100 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h。将两种培养液于10000 rpm，4℃条件下离心5 min收集菌体，均分别重悬到4 mL无菌水中。取0.5 mL酵母菌悬液接种至混合培养培养基中，再将1 mL乳酸菌悬液加入酵母菌培养体系中混合培养4 h。取2 mL培养液于2支5mL的EP管中，于10000 rpm，4℃条件下离心5 min，丢弃上清液。再分别加入4 mL生理盐水和4 mL含有8%（v/v）酒精的生理盐水，并于30℃下静置90 min。将处理后的菌悬液用无菌水于10000 rpm，5 min，4℃条件下离心洗涤3次，离心收集菌体，再重悬到1 mL无菌水中，经适当稀释，吸取10μL稀释后的菌悬液接种到酵母菌固体选择培养基上，30℃静置培养48 h后计算酵母菌菌落数。计算经8%（v/v）酒精胁迫后酵母存活率为23.64%。
实例2：酵母菌Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791纯培养。经酒精处理后，在YPD琼脂培养基上计得的酵母菌菌落数，计算出存活率（图1）。
取-80℃保藏的酵母菌甘油管储存液，按20 %的接种量接种于5 mL酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h，再按5 %的接种量转接到100 mL酵母菌培养基中，30℃静置培养24h。将种子液于10000 rpm，4℃条件下离心5 min收集菌体，重悬到4 mL无菌水中，取其中0.5mL量接种至30 mL混合培养养培养基中，30℃静置培养4 h。取2 mL培养液于2支5 mL的EP管中，于10000 rpm，4℃条件下离心5 min，丢弃上清液。再分别加入4 mL生理盐水和4 mL含有8%（v/v）酒精的生理盐水，并于30℃下静置90 min。将处理后的菌悬液于10000 rpm，5 min，4℃条件下离心洗涤3次，离心收集菌体，再重悬到1 mL，经适当稀释，吸取10 μL稀释后的菌悬液接种到酵母菌固体培养基上30℃静置培养36 h后计得的酵母菌菌落数。计算得经8%（v/v）酒精胁迫后酵母存活率为3.87%。
存活率计算公式如下：
存活率(%)=酒精处理后菌落数(个/mL)/生理盐水处理后菌落数(个/mL)×100%。

Claims (6)

1.一种提高酵母菌酒精耐受能力的方法，其特征在于：包含以下步骤：
（1）乳酸菌和酵母菌种子液的制备；
（2）酵母菌培养体系中乳酸菌的外源添加及混合培养；
（3）酵母菌酒精胁迫处理；
（4）酵母菌酒精耐受能力的测定。
2.根据权利要求1所述提高酵母菌酒精耐受能力的方法，其特征在于：所述乳酸菌为嗜盐四联球菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792，所述酵母菌为鲁氏酵母Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791。
3.根据权利要求1所述提高酵母菌酒精耐受能力的方法，其特征在于：所述乳酸菌和酵母菌种子液的制备，包含以下步骤：
（1）乳酸菌培养基为：10 g/L蛋白胨，8 g/L牛肉膏，4 g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖，0.1%山梨醇单油酸酯，2 g/L磷酸氢二钾，5 g/L三水乙酸钠，2 g/L柠檬酸三铵，0.2 g/L七水合硫酸镁，0.2 g/L 四水合硫酸锰，60 g/L NaCl，pH 6.2；酵母菌培养基为：10 g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，60 g/L NaCl，pH 6.0；
（2）分别取-80℃保藏的乳酸菌和酵母菌甘油管储存液，分别接种于5 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h，再按5%的接种量分别转接到100 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h作为种子液；
（3）将上述培养的种子液于10000 rpm，4℃条件下离心5 min收集菌体，分别重悬至4mL无菌水中。
4.根据权利要求1所述提高酵母菌酒精耐受能力的方法，其特征在于：所述酵母菌培养体系中乳酸菌的外源添加及混合培养包含以下步骤：
（1）混合培养培养基：10 g/L蛋白胨，8 g/L牛肉膏，4 g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖，0.1%山梨醇单油酸酯，2 g/L磷酸氢二钾，5 g/L三水乙酸钠，2 g/L柠檬酸三铵，0.2 g/L七水合硫酸镁，0.2 g/L 四水合硫酸锰，6 % NaCl，pH6.2；
（2）取上述3中0.5 mL酵母菌悬液接种至混合培养培养基，再加入上述3中1mL乳酸菌悬液，30℃静置混合培养4 h。
5.根据权利要求1所述提高酵母菌酒精耐受能力的方法，其特征在于：所述酒精胁迫处理是取上述4混合培养后的菌悬液2 mL于5 mL的离心管管中，离心收集菌体，再加入4 mL含有8%（v/v）酒精的生理盐水，于30℃下胁迫90 min 。
6.根据权利要求1所述提高酵母菌酒精耐受能力的方法，其特征在于：所述酒精耐受能力的测定是将上述5酒精胁迫后的菌悬液用无菌水于10000 rpm，5 min，4℃条件下离心洗涤两次，再重悬于1mL的无菌水中，经适当稀释后，接种到含0.01%氯霉素的YPD琼脂培养基上，30℃静置培养36h后进行菌落计数。
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