CN109370933A

CN109370933A - 一种提高酵母菌耐酸能力的共培养方法

Info

Publication number: CN109370933A
Application number: CN201811134668.XA
Authority: CN
Inventors: 吴重德; 姚尚杰; 杨欢
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2038-09-28
Also published as: CN109370933B

Abstract

本发明公开了一种提高酵母菌耐酸能力的共培养方法，属于生物工程技术领域。本发明是将培养好的乳酸菌在培养基中前培养4 h后，再接入酵母菌进行共培养4 h，所获得的菌体重悬于含有乳酸的生理盐水(pH=1.9，30℃)胁迫90 min，将酸胁迫后的菌体离心洗涤后点种到酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上（含0.01%氯霉素），30℃静置培养48 h，酵母菌生物量比未经共培养的细胞数分别提高了7.16倍。本发明方法简单、便于操作，可用于酵母菌抗逆能力的提高。

Description

一种提高酵母菌耐酸能力的共培养方法

技术领域

本发明涉及一种提高酵母菌耐酸能力的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

鲁氏酵母菌属于酵母科中的接合酵母属，是传统发酵重要的生产菌，广泛存在于酱油、豆瓣等盐渍食品中。鲁氏酵母在酱油主发酵期发挥作用，主要产生乙醇、高级醇等风味物质，酵母中的谷氨酰胺酶能转化底物生成谷氨酸而增强酱油的鲜味，对发酵调味品的风味起着积极作用。嗜盐四联球菌也是传统发酵食品如酱油、果酱等发酵生产中的重要菌株，是产生挥发性物质的主要微生物之一，具有促进香味成分生成，改善产品品质和口感等功能。利用乳酸菌和酵母菌共培养不仅能缩短产品发酵周期，延长产品的货架期，同时提高产品品质。

在传统发酵食品的生产过程中，乳酸菌等产酸细菌的繁殖代谢会使得发酵体系中的酸含量增高，导致细胞的生长和代谢受到抑制，从而影响食品生产的效率。通过优化乳酸菌和酵母菌的共培养条件能有效提高酵母菌在酸性条件下的生物量和代谢能力，进一步提高食品发酵效率，对传统发酵食品生产具有着重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用乳酸菌和酵母菌共培养提高酵母菌耐酸能力的方法。

所述的共培养方法为在共培养系统中，先将乳酸菌经过前培养4h后，再加入酵母菌共同培养4 h。

菌株：鲁氏酵母，保藏于CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.3791，保藏日期为2010年04月29日，分类命名为Zygosaccharomyces rouxii SZ-1；嗜盐四联球菌，保藏于CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.3792，保藏日期为2010年04月29日，分类命名为Tetragenococcus haiophilus SZ-B-2。

种子培养方法：乳酸菌培养基：10 g/L蛋白胨，8 g/L牛肉膏，4 g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖，0.1% 山梨醇单油酸酯，2 g/L磷酸氢二钾，5 g/L三水乙酸钠，2 g/L柠檬酸三铵，0.2 g/L七水合硫酸镁，0.2 g/L 四水合硫酸锰，60 g/L NaCl，pH为6.2；酵母菌培养基：10g/L酵母粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，60 g/L NaCl，pH 为6.0。分别取-80℃保藏的乳酸菌和酵母菌甘油管储存液接种于5 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24h，再分别转接到100 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h做种子液。

共培养培养基：10 g/L蛋白胨，8 g/L牛肉膏，4 g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖，0.1%山梨醇单油酸酯，2 g/L磷酸氢二钾，5 g/L三水乙酸钠，2 g/L柠檬酸三铵，0.2 g/L七水合硫酸镁，0.2 g/L 四水合硫酸锰，60 g/L NaCl，pH6.2。

共培养方法：将培养好的乳酸菌种子液以10000 rpm（4℃）离心5 min收集菌体，将菌体重悬于30 mL前培养培养基中30℃静置培养4 h，再将培养好的酵母菌种子液以10000rpm（4℃）离心5 min收集菌体，并加入到前培养的培养基中共同培养4 h。

酸胁迫处理：取2 mL共培养结束后的菌悬液以10000 rpm（4℃）离心5 min丢弃上清液，加入4 mL含有乳酸的生理盐水(pH =1.9)于30℃下胁迫90 min。

耐酸能力的测定：将酸胁迫后的菌悬液用无菌水离心（10000 rpm, 4℃，5min）洗涤两次，再重悬于1mL的无菌水中，经适当稀释后，接种到酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（含0.01%氯霉素）上，30℃静置培养24h后进行菌落计数。

本发明的有益效果：本发明提供的将嗜盐四联球菌提前培养4 h，再与鲁氏酵母共同培养4 h后，对离心收集的菌体进行酸胁迫处理。将处理后的菌悬液离心洗涤，再适度稀释后点种到酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上，培养后对菌落计数。相比对照组（未经过共同培养处理），经共培养后酵母菌具有更好的生长性能。本发明提供一种基于乳酸菌和酵母菌共同培养提升酵母菌耐酸能力的方法，简单易行，可用于提高酵母菌在酸性环境中的生长性能。

附图说明

图1是酸胁迫下共培养和单培养酵母菌存活率图。

具体实施方式

实例1：酵母菌（Zygosaccharomycesrouxii）CGMCC3791单独培养（对照组），经酸胁迫处理后，在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上计得的酵母菌菌落数，计算出存活率（图1）。

取-80℃保藏的酵母菌甘油管储存液，按20 %的接种量接种于5 mL酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h，再按5 %的接种量转接到100 mL酵母菌培养基中，30℃静置培养24h。将种子液10000 rpm（4℃）离心5 min收集菌体，重悬到4 mL无菌水中，取其中0.5 mL量接种至30 mL共培养培养基中，30℃静置培养4 h。取2 mL培养液于3支5 mL的EP管中，10000rpm（4℃）离心5 min，丢弃上清液，再分别加入4 mL 乳酸调后pH为5.4（共培养培养基pH）和1.9的生理盐水，并于30℃下静置90 min。将处理后的菌悬液离心洗涤3次，离心收集菌体，再重悬到1 mL，再稀释100倍，吸取10 μL稀释后的菌悬液接种到酵母菌固体培养基上30℃静置培养48 h后计得的酵母菌菌落数。以经pH为5.4的酸胁迫后酵母菌菌落数为对照的菌落数，计算得经pH为1.9的酸胁迫后酵母存活率为0.37%。

实例2：乳酸菌（Tetragenococcushalophilus）CGMCC 3792提前培养4 h，再与酵母菌（Zygosaccharomycesrouxii）CGMCC3791共同培养4 h（实验组），经酸胁迫处理后，在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（加入0.01%氯霉素）上计得的酵母菌菌落数，计算出存活率（图1）。

分别取-80℃保藏的乳酸菌和酵母菌甘油管储存液，按20 %的接种量接种于5 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h，再均按5 %的接种量转接到100 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h。分别将两种培养液10000 rpm（4℃）离心5 min收集菌体，重悬到4 mL无菌水中，取乳酸菌重悬液0.5 mL接种至共培养培养基中30℃静置培养4 h，再将收集的酵母菌体重悬到4 mL无菌水中，取其中0.5 mL量接种至乳酸菌培养体系中共同培养4 h。取2 mL培养液于3支5 mL的EP管中，10000 rpm（4℃）离心5 min，丢弃上清液。再分别加入4 mL 乳酸调后pH为5.4（共培养培养基pH，乳酸菌前培养4h后的pH=5.19）和1.9的生理盐水，并于30℃下胁迫90 min。将处理后的菌悬液用无菌水离心（条件）洗涤3次，离心收集菌体，再重悬到1 mL无菌水中，经适当稀释，吸取10μL稀释后的菌悬液接种到酵母菌固体选择培养基上，30℃静置培养48 h后计算酵母菌菌落数。以经pH为5.4的酸胁迫后酵母菌菌落数为对照的菌落数，计算得经共培养后再经pH为1.9的酸胁迫后酵母存活率为2.65%，为对照组结果的7.16倍。结果表明经共培养再经pH为1.9的酸胁迫后酵母存活率明显高于单菌培养再经酸胁迫处理后酵母存活率。

存活率计算公式如下：

存活率：

A：胁迫后的菌落数(个/mL)； B：对照的菌落数(个/mL)； C：存活率(%)。

Claims

1.一种提高酵母菌耐酸能力的方法，包含以下步骤：

（1）乳酸菌和酵母菌种子液的制备；

（2）乳酸菌的前培养；

（3）乳酸菌和酵母菌的共培养；

（4）酵母菌酸胁迫处理。

2.根据权利要求1所述提高酵母菌耐酸能力的方法，其特征在于：所述乳酸菌为嗜盐四联球菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792，所述酵母菌为鲁氏酵母Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791。

3.根据权利要求1所述提高酵母菌耐酸能力的方法，其特征在于：所述乳酸菌和酵母菌种子液的制备，包含以下步骤：

（1）乳酸菌培养基为：10 g/L蛋白胨，8 g/L牛肉膏，4 g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖，0.1%山梨醇单油酸酯，2 g/L磷酸氢二钾，5 g/L三水乙酸钠，2 g/L柠檬酸三铵，0.2 g/L七水合硫酸镁，0.2 g/L 四水合硫酸锰，60 g/LNaCl，pH 6.2；酵母菌培养基为：10 g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，60 g/L NaCl，pH 6.0；

（2）分别取-80℃保藏的乳酸菌和酵母菌甘油管储存液，接种于5 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h，再转接到100 mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，30℃静置培养24 h作为种子液；

（3）将上述培养的种子液离心（10000 rpm，4℃）5 min收集菌体。

4.根据权利要求1所述提高酵母菌耐酸能力的方法，其特征在于：将乳酸菌在共培培养基中提前培养4 h，再加入酵母菌共同培养4 h。

5.根据权利要求1所述提高酵母菌耐酸能力的方法，其特征在于：所述乳酸菌的前培养包含以下步骤：

（1）共培培养基：10 g/L蛋白胨，8 g/L牛肉膏，4 g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖，0.1% 山梨醇单油酸酯，2 g/L磷酸氢二钾，5 g/L三水乙酸钠，2 g/L柠檬酸三铵，0.2 g/L七水合硫酸镁，0.2 g/L 四水合硫酸锰，6 %NaCl，pH6.2；

（2）将上述收集到的乳酸菌菌体重悬到4 mL无菌水中，取其中1 mL到30 mL的前培养培养基中，30℃静置培养4 h。

6.根据权利要求1所述提高酵母菌耐酸能力的方法，其特征在于：所述乳酸菌和酵母菌的共培养是将上述收集的酵母菌体重悬到4 mL无菌水中，取其中0.5 mL接种至上述5的乳酸菌培养体系中，30℃静置培养4 h。

7.根据权利要求1所述提高酵母菌耐酸能力的方法，其特征在于：所述酸胁迫处理是取上述6共培养后的菌悬液2 mL于5 mL的EP管中，离心收集菌体再加入4 mL含有乳酸的生理盐水（pH=1.9）于30℃下胁迫90 min 。