CN115948316B - 一种提升乳酸菌耐酸性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提升乳酸菌耐酸性的方法。该方法为：将启动子和如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的目的基因插入至乳酸菌中表达即可。本发明发现通过代谢工程，采用精氨酸脱亚胺酶基因和氨基甲酸激酶基因来改造乳酸菌胞内的精氨酸脱亚胺酶途径，可以有效的提高乳酸菌在酸胁迫环境下的存活率。相对于乳酸菌NZ9000原始菌株而言，重组菌株在酸胁迫下的存活率提高了1.25倍和1.51倍。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种提升乳酸菌耐酸性的方法。
背景技术
乳酸菌所具有的益生作用以及提高食品质量和安全等功能，使其在人类的生活中具有不可忽视的作用。如嗜盐四联球菌具备缩短发酵周期和提高发酵品质的优良特性，尤其在提升食品中风味物质，以此被广泛应用与高盐传统食品发酵，如酱油、鱼酱、豆制品等。
但是由于乳酸菌的产酸特性，酸型性环境是乳酸菌无法避免的胁迫问题，这会导致细胞包内的代谢紊乱，严重的造成细胞细胞膜的损伤甚至造成细胞死亡。因此，亟需开发一种可提升乳酸菌酸胁迫耐受性的方法
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种提升乳酸菌耐酸性的方法，可有效提升乳酸菌的酸胁迫耐受性。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种提升乳酸菌耐酸性的方法，将启动子和如SEQ ID NO.1和/或SEQ IDNO.2所示的目的基因插入至乳酸菌中表达即可。
进一步地，同时将Pnis启动子，如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱亚胺酶基因，和如SEQ ID NO.2所示的氨基甲酸激酶基因转化至乳酸菌中，Pnis启动子的核酸序列如SEQ IDNO.3所示。具体如下如下：
精氨酸脱亚胺酶基因(SEQ ID NO.1)
ATGAGTATGCCAATTAATGTTTTTTCAGAAATAGGTCCACTTAAAACAG
TTATGTTACACCGTCCGGGAAAAGAACTAGGAAATTTAATGCCTGATTATTT
AAAGCGATTATTATTTGATGATATCCCCTTTTTAGAGCAGGCACAAAAAGA
ACATGATTATTTCGCTGAAATTCTACGAAAAAAGGAAATAGAGGTCTTATAT
TTAGAAGATTTAGCAGCGGACTCATTAAAAAATGAAAAAATCCGTGCTCAA
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CAATTGAGAAATTGGCTAAAAATATTTTTACAAAAAACTTAGGCTTTAATTG
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ATGCTAGAGGTTTACTCTATTAGACCAAAGAGCAATGGAGAGATAAAAATT
ACTAAAGAAGAAGATAGCCTCGAACGAATTTTAGCTAAATATTTACAACGT
GATTCTGTGCAATTGATTCGCTGTGGAGATGGTAATCGCGCTGCGGCTGCA
AGAGAACAATGGAATGATGGCTCTAATACTTTAACGATTGCACCGGGCGAA
GTTGTTGTTTATGATCGTAACACTGTGACCAATGAAGCTTTAAAAAAAGCT
GGGATAAAGCTAAATTATGTTCCAGGTGGTGAATTAGTTCGTGGACGAGGC
GGTCCACGTTGTATGAGTATGCCTTTATATCGTGAAAATCTTACAGAATAA；
氨基甲酸激酶基因(SEQ ID NO.2)
ATGGCTAAAATTGTAATTGCACTCGGGGGAAACGCCTTAGGAAAGTCACCAGAAGAACAATTAAATCTTGTAAAAAACACAGCTAAATCGCTGGCGGGAGCTATTTCCCAAGGCCATAAGATAACCATTAGTCATGGTAATGGACCGCAAGTTGGTGCAATTAATTTAGGAATGAATTACGCGAATGAACATAATCAAGGTCCCGCATTTCCTTTTCCTGAATGCGGGGCTATGAGTCAAGGTTATATAGGCTATCATCTGCAACAAAGTTTACAAAATGAACTAAATAGACAAAATATTACCCAAGATGTAGTCACATTAATCACACAAGTAGAGGTTGAAGCTGACGATCCTGCATTTAAAAATCCAACCAAACCAATCGGGACATTTTATAGTAAAAAACAGGCGGAAAAGATTGAAAAGGAAAAAAATTATATCTTTAAAGAAGATGCAGGAAGAGGATATCGTCAAGTTATTGCTTCACCTATGCCTAAAAATATTATTGAAATCGATAGCGTCAACCGTTTGATTAACAACAATAATGTAGTTATCGCCGGCGGTGGAGGTGGTATTCCGGTCTTAAAATCTGAAGGTGGAAATATAAAAGGTGTATCTGCTGTAATTGATAAAGACCGTTCCAGTGCATTGCTGGCTGACAATATAGTTGCAGATAAGCTAATTATTCTAACTGCTGTTGAATATGTTTATATGAACTATGGGAAATCAGATCAAGAAGCTCTTCAAGAAATAGATAGTAAACAAGCAAAAGATCTTATTCAAGAAAAACAATTCGCAACTGGAAGTATGTTACCCAAAATAGAAGCTTGTTTAGATTTTGTAACGCAAGGTAAAGATAGAGAAGCGATTATTACATCTTTGGAAAATTTAGATGATGCTCTTGCTGGTAAAACTGGAACTATAATAAAAAAATAG；
Pnis启动子(SEQ ID NO.3)：
CTAGTCTTATAACTATACTGACAATAGAAACATTAACAAATCTAAAACAGTCTTAATTCTATCTTGAGAAAGTATTGGTAATAATATTATTGTCGATAACGCGAGCATAATAAACGGCTCTGATTAAATTCTGAAGTTTGTTAGATACAATGATTTCGTTCGAAGGAACTACAAAATAAATTAT。
进一步地，精氨酸脱亚胺酶基因和氨基甲酸激酶基因均来自保藏号为CGMCC 3792的嗜盐四联球菌，该嗜盐四联球菌菌株在本申请日以前已被公开，如公开日为2016-02-03，申请号为CN201510813755.8的专利中已公开了该菌株。
进一步地，乳酸菌为乳酸乳球菌NZ9000。
进一步地，目的基因通过与表达质粒重组之后，电转化至乳酸菌中表达。
进一步地，目的基因经双酶切后，与质粒连接，获得重组质粒，再在大肠杆菌中克隆提取重组质粒，最后将提取的重组质粒转化至乳酸菌中表达。
进一步地，质粒为pNZ8148。
一种重组载体，包括如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的目的基因。
上述重组载体在用于制备高耐酸性乳酸菌中的用途。
一种高耐酸性乳酸菌，采用上述方法获得。
本发明的有益效果：
精氨酸脱亚胺酶途径是细菌胞内调节自身抗逆性能的关键途径。在面临酸胁迫时，乳酸菌会通过该途径将胞外的精氨酸转运至胞内，并在精氨酸脱亚胺酶和氨基甲酸激酶的作用下生成鸟氨酸和瓜氨酸，同时还会有能量与氨分子的生成。碱性的氨分子可以通过中和作用消耗胞内过盛的氢离子，从而提高的酸胁迫下乳酸菌的胞内pH值，以维持了乳酸菌胞内微环境的稳定，确保乳酸菌生命代谢的有序进行。
本发明首次发现，通过代谢工程，采用精氨酸脱亚胺酶基因和氨基甲酸激酶基因来改造乳酸菌胞内的精氨酸脱亚胺酶途径，可以有效的提高乳酸菌在酸胁迫环境下的存活率。本申请构建的重组菌包括了Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcA)，Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcC)和Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcA/Pnis/arcC)。相对于NZ9000原始菌株而言，重组菌株在酸胁迫下的存活率提高了1.25倍和1.51倍。
附图说明
图1为重组质粒pNZ8148-arcA的构建示意图；
图2为重组质粒pNZ8148-arcC的构建示意图；
图3为重组质粒pNZ8148-/arcA/Pnis/arcC的构建示意图；
图4为酸胁迫下(pH 5.0乳酸调节)重组菌株和对照菌株的存活率对比。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
材料
1、本发明中所涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000来自于江南大学。
2、本发明所涉及的培养基如下：
液体LB培养基：5g/L酵母浸粉，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，pH调节至7.0。121℃，灭菌20min。根据需要添加氯霉素至终浓度为10ug/ml。
固体LB培养基：液体LB培养基额外添加2％(m/v)琼脂。根据需要添加氯霉素至终浓度为10ug/ml。
液体GM17培养基：按M17培养基(Oxoid公司)，另额外补充葡萄糖至5g/L的，121℃，灭菌20min。根据需要添加氯霉素至终浓度为10ug/ml。
固体GM17培养基：液体GM17培养基额外添加2％(m/v)琼脂。添加根据需要添加氯霉素至终浓度为10ug/ml。
实施例1重组菌株的构建
重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcA)，Lactococcus lactisNZ9000(pNZ8148/arcC)和Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcA/Pnis/arcC)的构建(如图1～3所示)，具体过程如下：
1、Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcA)的制备
(1)经全基因组测序获得嗜盐四联球菌(CGMCC 3792)中获得目的基因arcA的核苷酸序列，并设计引物对arcA基因进行扩增纯化，所用引物为arcA-F和arcA-R。
其中所涉及引物序列为:
arcA-F:5’-AACTGCAGATGAGTATGCCAATTAATGTTTTTT-3’；
arcA-R:5’-CCGGTACCTTATTCTGTAAGATTTTCACGATATAA-3’；
(2)将纯化后的PCR产物用pstI和kpnI双酶切后，与pNZ8148连接。
(3)连接产物转化到感受态大肠杆菌MC1061，筛选阳性克隆，经PCR和酶切验证后，提取重组质粒，通过电转技术，将重组质粒导入到感受态乳酸乳球菌NZ9000。
(4)电转条件为：将10μL重组质粒与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min；调节电压2000V，电容25μF，电阻200Ω进行电击转化。
(5)筛选阳性克隆，经PCR和酶切验证后，获得正确的重组菌Lactococcus lactisNZ9000(pNZ8148/arcA)。
2、Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcC)的制备
(1)经全基因组测序获得嗜盐四联球菌(CGMCC 3792)中获得目的基因arcC的核苷酸序列，并设计引物对arcC基因进行扩增纯化，所用引物为arcC-F和arcC-R。
其中所涉及引物序列为:
arcC-F:5’-AACTGCAGATGGCTAAAATTGTAATTGCACTCGGG-3’；
arcC-R:5’-CCGGTACCCTATTTTTTTATTATAGTTCCAGTTTTACCAGCAA GAGC-3’；
(2)将纯化后的PCR产物用pstI和kpnI双酶切后，与pNZ8148连接。
(3)连接产物转化到感受态大肠杆菌MC1061，筛选阳性克隆，经PCR和酶切验证后，提取重组质粒，通过电转技术，将重组质粒导入到感受态乳酸乳球菌NZ9000。
(4)电转条件为：将10μL重组质粒与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min；调节电压2000V，电容25μF，电阻200Ω进行电击转化。
(5)筛选阳性克隆，经PCR和酶切验证后，获得正确的重组菌Lactococcus lactisNZ9000(pNZ8148/arcC)。
3、Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcA/Pnis/arcC)的制备
(1)利用引物IF-arcA-F、IF-arcA-R、IF-Pnis-F、IF-Pnis-R、IF-arcC-F和IF-arcC-R，分别以嗜盐四联球菌和pNZ8148作为模板，获得具有同源臂的三基因片段。同时，用pstI和kpnI双酶切pNZ8148以获得线性载体。
所涉及引物序列为：
IF-arcA-F:5’-GAGGCACTCACCATGGGTACTGCAGATGAGTATGCCAATT AATGTTTTTT-3’；
IF-arcA-R:5’-ATAAGACTAGTTATTCTGTAAGATTTTCACGAT-3’；
IF-Pnis-F:5’-TACAGAATAACTAGTCTTATAACTATACTGACA-3’；
IF-Pnis-R:5’-TTTTAGCCATATAATTTATTTTGTAGTTCCTTCGA-3’；
IF-arcC-F:5’-AATAAATTATATGGCTAAAATTGTAATTGCA-3’；
IF-arcC-R:5’-TGAGCTCTCTAGAACTAGTGGTACCCTATTTTTTTATTATA GTTCCAGT-3’；
(2)具有同源臂的基因三基因以及线性载体，通过无缝克隆的方法连接。
(3)连接产物转化到感受态大肠杆菌MC1061，筛选阳性克隆，经PCR和酶切验证后，提取重组质粒，通过电转的技术，将重组质粒导入到感受态乳酸乳球菌NZ9000。
(4)电转条件为：将10μL重组质粒与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min；调节电压2000V，电容25μF，电阻200Ω进行电击转化。
(5)筛选阳性克隆，经PCR和酶切验证后，获得正确的重组菌Lactococcus lactisNZ9000(pNZ8148/arcA/Pnis/arcC)。
实施例2重组菌株存活率检测
检测重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcA)，Lactococcuslactis NZ9000(pNZ8148/arcC)和Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcA/Pnis/arcC)在酸性环境中的存活率，具体步骤如下：
(1)将菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)和实施例1得到的菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcA)，Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcC)和Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/arcA/Pnis/arcC)分别以5％接种量接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中，在30℃下进行活化培养过夜；
(2)分别以2％的接种量将上述得到的种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养。
(3)培养至1.5h后，加入10ng/mL的nisin进行诱导处理，诱导2h后，取诱导细胞进行胁迫处理，胁迫条件为pH 5.0，乳酸条件，时间为3h。
(4)胁迫结束后通过梯度稀释并点板计数，计算重组菌和对照菌在酸胁迫下的存活率，结果见图4。
如图4所示，重组菌株在酸胁迫条件下的存活率高于对照菌株，并且，同时插入精氨酸脱亚胺酶和氨基甲酸激酶两端基因的重组菌株在酸性条件下的存活率高于只插入一种基因的存活率，表明本申请所构建的通过强化精氨酸脱亚胺酶途径以提高乳酸菌耐酸性的方法可以有效的提高乳酸菌的酸胁迫耐受性。
Claims (8)
1.一种提升乳酸菌耐酸性的方法，其特征在于，将启动子和如SEQ ID NO.1所示的目的基因插入至乳酸菌中表达；
或将启动子和如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示的目的基因插入至乳酸菌中表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，同时将Pnis启动子，如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱亚胺酶基因，和如SEQ ID NO.2所示的氨基甲酸激酶基因转化至乳酸菌中；所述Pnis启动子的序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，精氨酸脱亚胺酶基因和氨基甲酸激酶基因均来自保藏号为CGMCC NO.3792的嗜盐四联球菌。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，乳酸菌为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NZ9000。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，目的基因通过与表达质粒重组之后，电转化至乳酸菌中表达。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，目的基因经双酶切后，与质粒连接，获得重组质粒，再在大肠杆菌中克隆提取重组质粒，最后将提取的重组质粒转化至乳酸菌中表达。
7.重组载体在用于制备高耐酸性乳酸菌中的用途，其特征在于，所述重组载体包括启动子，以及如SEQ ID NO.1所示的目的基因，或如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示的目的基因。
8.一种高耐酸性乳酸菌，其特征在于，采用权利要求1～6任一项所述方法获得。
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