CN103930559A - 制备氨甲酰磷酸和尿素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备氨甲酰磷酸的方法，所述方法包括在氨基甲酸激酶的存在下使组合物中的氨、ATP、碳酸氢盐和CO2或其水合形式反应，其中将所述氨和CO2或其水合形式在化学反应中转化为氨基甲酸，并且将所述氨基甲酸和ATP在通过氨基甲酸激酶进行的酶催化反应中转化为氨甲酰磷酸，并且其中所述组合物的pH为约8-约12。本发明还涉及制备尿素的方法。

Description

制备氨甲酰磷酸和尿素的方法
技术领域
本发明涉及一种制备氨甲酰磷酸的方法，所述方法包括在氨基甲酸激酶的存在下使组合物中的氨、ATP、碳酸氢盐和CO2或其水合形式反应，其中将所述氨和CO2或其水合形式在化学反应中转化为氨基甲酸，并且将所述氨基甲酸和ATP在通过所述氨基甲酸激酶进行的酶催化反应中转化为氨甲酰磷酸，并且其中所述组合物的pH为约8-约12。本发明还涉及制备尿素的方法。
背景技术
尿素是最常用的氮肥，并且占世界肥料市场的50%以上。这种肥料目前利用能量密集型Bosch-Meiser方法制备自利用Haber方法制备的氨。尿素生产中对大型能量和天然气投入的需求使尿素生产集中在具有丰富的化石染料供应的地区，结果许多国家进口大量的尿素，并且相关的运输成本很高。高能量投入、对天然气和高运输成本的依赖还使得尿素肥料的成本与化石燃料的价格相关连，其对供应依赖性波动敏感。对尿素肥料成本的未来影响的另一考虑是建议引入2015落实到位的碳污染减排计划，这是因为与肥料生产和运输相连的CO2排放的相关成本。
作为尿素肥料施用的大部分氮流失至各种废物流，包括动物和市政废物。这些废物流包含大量的氮，为硝酸盐、亚硝酸盐、氨和有机氮化合物(氨基酸和核苷酸)，必须将其从废物流去除以防止富营养化效应(例如细菌大量繁殖(bacterial bloom))。废水处理中的氮最终作为气态的氮氧化物(N2O，强效GHG，和NO)和氮气(N2)。回收这些系统中的氮会：i)提供氮肥的低能量、低GHG来源；ii)从废物流除去氮，防止下游富营养化效应；以及iii)减少氧化亚氮的产生。此外，获得自回收的废氮的尿素肥料的制备可以分布在本地，减少转运成本和产物的总体环境痕迹。
尿素循环为代谢过程，通过该过程氮通过一系列的5种酶适当地传播，在动物中将氨解毒为排泄的尿素，并且在其他生物中提供含氮的代谢中间产物。尿素循环中的第一步是通过酶氨甲酰磷酸合成酶从碳酸、有机磷(ATP)以及氨或谷氨酸产生氨甲酰磷酸。
氨的pKa为9.25，因此在生物pH下主要是铵而不是氨可用。事实上99.4%的氨在pH7下是质子化的。由于在大多数生物中发现的低水平的氨，需要尿素循环将氨甲酰磷酸转化为尿素(Jones and Lipman,1960)。氨甲酰磷酸经历另外4个酶促转化，最终导致形成尿素。化学上，这些同时进行的步骤可以在用氨处理时氨甲酰磷酸转化为尿素而消除。
氨甲酰磷酸在生理pH和温度下不稳定，具有5分钟的半衰期(Wang etal.,2008)。尽管这种不稳定性，其经历进一步的转化，提供瓜氨酸、精氨酸、嘧啶核苷酸和尿素。通过转氨甲酰酶稳定来避免氨甲酰磷酸的热分解。天冬氨酸和鸟氨酸转氨甲酰酶减少氨甲酰磷酸的热分解率5,000倍。在没有转氨甲酰酶的溶液中，氨甲酰磷酸通过平面中间体分解(Allen and Jones,1964)。这种几何结构在天冬氨酸和鸟氨酸转氨甲酰酶的活性位点被阻止，因此稳定氨甲酰磷酸并能够将其转化为稳定的脲基产物。
氨甲酰磷酸在水性环境中不稳定并容易分解(Wang et al.,2008)。分解发生的途径是pH依赖性的。在酸水解下，分解发生为铵、正磷酸和二氧化碳(Allen and Jones,1964)，而碱性条件中存在的二价阴离子分解为正磷酸盐和氰酸盐(Allen and Jones,1964)。分解的途径对于随后的转化很重要，因为进一步的氮取代对于氨和碳酸盐是不可能的，但是已知对于氰酸盐容易发生(Wen and Brooker,1994)。例如，当用氨处理碳酸盐时不发生尿素形成，但是当用氨处理氰酸盐时其的确形成，并且尿素的产生随氨浓度的增加而增加。
氨甲酰磷酸的不稳定性使得认为其作为商业中间体是不切实际的。因此，需要制备氨甲酰磷酸的方法以及制备尿素的方法。此外，需要从废料降低氨水平的方法。
发明内容
本发明人开发了一种可以利用单一的酶将氨转化为氨甲酰磷酸的方法。
因此，在第一方面，本发明提供一种制备氨甲酰磷酸的方法，所述方法包括在氨基甲酸激酶的存在下使组合物中的氨、ATP、碳酸氢盐和CO2或其水合形式反应，其中将所述氨和CO2或其水合形式在化学反应中转化为氨基甲酸，并且将所述氨基甲酸和ATP在通过所述氨基甲酸激酶进行的酶催化反应中转化为氨甲酰磷酸，并且其中所述组合物的pH为约8-约12。
在一优选实施方案中，pH为约9.9、约9-约11、约9.25-约11.25、约10.25-约11.25或者约10.5-约11.5。在这个实施方案中，优选氨基甲酸激酶来源于超嗜热菌，或者是其生物活性突变体。超嗜热菌的实例包括但不限于热球菌(Pyrococcus sp.)和嗜热球菌(Thermococcus sp.)。热球菌的实例包括但不限于Pyrococcus abyssi、Pyrococcus endeavori、Pyrococcus glycovorans、掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)和沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)。嗜热球菌的实例包括但不限于Thermococcus acidaminovorans、Thermococcusaegaeus、Thermococcus aggregans、Thermococcus alcaliphilus、Thermococcusatlanticus、Thermococcus barophilus、Thermococcus barossii、速生热球菌(Thermococcus celer)、Thermococcus celericrescens、Thermococcuschitonophagus、Thermococcus coalescens、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gammatolerans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcusguaymasensis、Thermococcus hydrothermalis、Thermococcus kodakarensis、Thermococcus litoralis、Thermococcus marinus、Thermococcus mexicalis、Thermococcus nautilus、Thermococcus onnurineus、Thermococcus pacificus、Thermococcus peptonophilus、Thermococcus profundus、Thermococcusradiotolerans、Thermococcus sibiricus、Thermococcus siculi、Thermococcusstetteri、Thermococcus thioreducens、Thermococcus waimanguensis、Thermococcus waiotapuensis和Thermococcus zilligii。此外，这类氨基甲酸激酶的实例包括包含以下的氨基甲酸激酶：
a)SEQ ID NO:1-9中任一个提供的氨基酸序列，
b)与SEQ ID NO:1-9中任一个或多个至少50%相同的氨基酸序列，和/或
c)a)或b)的生物活性片段。
在另一实施方案中，氨基甲酸激酶包含
a)SEQ ID NO:4-9中任一个提供的氨基酸序列，
b)与SEQ ID NO:4-9中任一个或多个至少50%相同的氨基酸序列，和/或
c)a)或b)的生物活性片段。
在另一实施方案中，氨基甲酸激酶包含
a)SEQ ID NO:1、8或9提供的氨基酸序列，
b)与SEQ ID NO:1、8或9中任一个或多个至少50%相同的氨基酸序列，和/或
c)a)或b)的生物活性片段。
在另一实施方案中，氨基甲酸激酶包含
a)SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9提供的氨基酸序列，
b)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中任一个或多个至少50%相同的氨基酸序列，和/或
c)a)或b)的生物活性片段。
在以上实施方案中，温度为约10℃-约100℃。在一实施方案中，温度为约20℃-约80℃。在另一实施方案中，温度为约20℃-约60℃。在另一实施方案中，温度为约20℃-约30℃。
在另一优选实施方案中，在40℃下于NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)和20mM NH4OH中温育30分钟之后，在pH11下0.5μM的氨基甲酸激酶产生至少0.5μmol/min/mg、至少0.9μmol/min/mg或者0.5-3μmol/min/m的ADP。
在另一优选实施方案中，在40℃下于NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)和20mM NH4OH中温育30分钟之后，在pH11.5下0.5μM的氨基甲酸激酶产生至少0.25μmol/min/mg、至少0.6μmol/min/mg或者0.25-2.5μmol/min/m的ADP。
在一可选实施方案中，pH为约9-约10.5或者约9.5-约10.5。在这个实施方案中，优选氨基甲酸激酶来源于嗜热菌，或者是其突变体。嗜热菌的实例包括但不限于Fervidobacterium sp.(例如，Fervidobacterium nodosum)、Thermosipho sp.(例如，Thermosipho melanesiensis)、Anaerobaculum sp.(例如，Anaerobaculum hydrogeniformans和Aminobacterium colombiense)、Thermanaerovibrio sp.(例如，Thermanaerovibrio acidaminovorans)、Halothermothrix sp.(例如，奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii))、Kosmotoga sp.(例如，Kosmotoga olearia)和穆尔氏菌(Moorella sp.)(例如热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica))。这类氨基甲酸激酶的实例包括包含以下的氨基甲酸激酶：
a)SEQ ID NO:28-35中任一个提供的氨基酸序列，
b)与SEQ ID NO:28-35中任一个或多个至少50%相同的氨基酸序列，和/或
c)a)或b)的生物活性片段。
此外，在一实施方案中，温度为约10℃-约60℃、约20℃-约60℃、约20℃-约40℃或者约20℃-约30℃。此外，在一实施方案中，在40℃下于NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)和200mM NH4OH中温育30分钟之后，在pH10.5下0.5μM的氨基甲酸激酶产生至少0.6μmol/min/mg的ADP。
在一优选实施方案中，氨基甲酸激酶在4℃下储存1年和/或在40℃下储存60小时后保持其活性的至少约50%、至少约60%、至少约70%或者至少约80%。
在另一实施方案中，压力为约0-约350MPa，或者约1atm-约10atm。
在一实施方案中，所述方法在连续系统中进行。
在另一实施方案中，将氨基甲酸激酶固定在固体支持物上。
在另一实施方案中，氨的来源为废料。
在另一实施方案中，所述方法通过分解至少一些氨甲酰磷酸进一步产生氰酸盐和氰酸中的一种或两者。
在另一实施方案中，氨基甲酸激酶为融合蛋白，其包含至少一种其他多肽。所述至少一种其他多肽可以是例如增强氨基甲酸激酶的稳定性的多肽，促进融合蛋白从细胞如细菌细胞或酵母细胞分泌的多肽，辅助纯化融合蛋白的多肽和/或辅助多肽结合至固体支持物的多肽。
将氨甲酰磷酸原位转化为尿素和/或其他稳定的可运输的商品使得能够用高效的生物途径代替目前的能量密集型商业过程。因此，在另一方面，本发明提供一种从氨甲酰磷酸制备化合物的方法，所述方法包括
i)进行本发明的方法以制备氨甲酰磷酸，以及
ii)进行一个或多个进一步的反应以制备所述化合物。
本发明人设计了一种制备尿素的简单方法。因此，在一特别优选的实施方案中，所述化合物为尿素，并且步骤ii)包括使制备自步骤i)的氨甲酰磷酸与氨反应以通过中间体产生尿素，所述中间体为氰酸盐和氰酸中的一种或两者。氨可以是步骤i)期间存在的氨和/或步骤ii)期间加入的额外的氨。
在一实施方案中，当制备尿素时，至少步骤ii)在至少约90℃的温度下进行。更优选地，当制备尿素时，至少步骤ii)在约90℃-约100℃的温度下进行。
在另一实施方案中，所述方法包括
i)进行本发明的方法以用固定在固体支持物上的氨基甲酸激酶制备氨甲酰磷酸，
ii)从所述固体支持物分离步骤i)制备的氨甲酰磷酸，
iii)使所述氨甲酰磷酸结合至树脂，以及
iv)在包含氨的溶液中洗涤所述树脂以通过中间体将所述氨甲酰磷酸转化为尿素，所述中间体为氰酸盐和氰酸中的一种或两者。
步骤iv)不仅产生尿素，而且还从树脂释放分子，允许在从树脂洗脱的物质中收集尿素。
在一实施方案中，步骤iv)在约90℃-约100℃的温度下进行。
在另一实施方案中，所述化合物为选自以下的尿素循环的中间体：瓜氨酸、精氨琥珀酸、精氨酸、鸟氨酸及其两种或更多种的组合。
在另一实施方案中，所述方法包括进行本发明的方法以制备氰酸盐和氰酸中的一种或两者，并且使所述氰酸盐和/或氰酸与亲核试剂反应。
在一实施方案中，所述化合物为嘧啶化合物。嘧啶化合物的实例包括但不限于尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶，或者其具有一个、两个或三个磷酸基团的衍生物。
在一实施方案中，所述方法在单一容器中进行。
在另一方面，本发明提供一种减少废料中的氨浓度的方法，所述方法包括进行本发明的方法。
在一实施方案中，所述废料在水中。
本发明人还鉴定了一种多核苷酸，当在细菌细胞中表达时，其导致较高水平的氨基甲酸激酶产量，所述氨基甲酸激酶包含SEQ ID NO:1提供的氨基酸序列而不是天然的开放阅读框(SEQ ID NO:11)。因此，在另一方面，本发明提供编码氨基甲酸激酶的分离和/或外源的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:10提供的核苷酸序列。在另一方面，本发明提供编码氨基甲酸激酶的分离和/或外源的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO:10、12、14、16、18、20、22、24、26或36-43中任一个提供的核苷酸序列。
在一优选实施方案中，所述多核苷酸可操作地连接至启动子，所述启动子能够指导所述多核苷酸在细胞中的表达。
还提供包含本发明的多核苷酸的载体。
在另一方面，本发明提供宿主细胞或其包含本发明的多核苷酸和/或本发明的载体的提取物。合适的宿主细胞的实例包括但不限于细菌细胞、酵母细胞或植物细胞。优选地，所述宿主细胞为细菌细胞。在一实施方案中，所述细菌细胞为大肠杆菌(E.coli)细胞。在另一实施方案中，所述方法在无细胞系统中进行，在无细胞系统中使用本发明的宿主细胞的提取物和/或本发明的载体。
在另一方面，本发明提供一种制备氨基甲酸激酶的方法，所述方法包括在允许表达编码所述氨基甲酸激酶的多核苷酸的条件下培养本发明的宿主细胞或其包含本发明的多核苷酸或载体的提取物。
在一实施方案中，所述方法从1克细胞制备至少10mg、更优选至少15mg的氨基甲酸激酶。
在另一方面，提供利用本发明的方法制备的氨甲酰磷酸。
还提供利用本发明的方法制备的化合物。优选地，所述化合物为尿素、瓜氨酸、精氨琥珀酸、精氨酸、鸟氨酸或嘧啶化合物。
除非另有特别说明，本文的任何实施方案应当准用于任何其他实施方案。
本发明的范围并不限于本文所述的具体实施方案，其仅为了示例的目的。明确地，功能等同的产物、组合物和方法在如本文所述的发明的范围内。
在本说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，提到单一步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组应当涵盖那些步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组中的一个或许多(即一个或多个)。
此后本发明通过以下非限制性实施例并参考附图来描述。
附图说明
图1.(A)氨甲酰磷酸的阴离子的分解。(B)氨甲酰磷酸的二价阴离子的分解。
图2.包含浓度为a)0.2mM；b)0.4mM；c)0.6mM；和d)0.8mM的AMP ADP和ATP的多种标准溶液的HPLC分析。
图3.在40℃下于NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)和NH4OH(■=200mM,◆=20mM,▲=2mM)中Pfu CK(0.5μM)催化的ADP生成的pH依赖性。
图4.在pH9.9下于NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)和NH4OH(20mM)中Pfu CK催化的ADP生成的温度依赖性。
图5.在40℃下于NaHCO3、ATP(10mM)和NH4OH(200mM和20mM)中温育30分钟后Pfu CK催化的ADP生成的pH依赖性。
图6.在调整至pH7.2、8.4、8.9、9.4、9.9、10.4、10.9和11.4的氨(2M)和13C标记的碳酸氢钠(0.2M)在水中的溶液中观察到的碳共振的综合比较。
图7.在40℃下于NaHCO3、ATP(10mM)和NH4OH(200mM和20mM)中温育30分钟后CK催化的ADP生成的pH依赖性。
图8.在pH9.9下于NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)和NH4OH(200mM)中CK催化的ADP生成的温度依赖性。
图9.在pH9.9下于NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)和NH4OH(200mM)中CK催化的ADP生成的温度依赖性。
图10.溶于DMSO，通过a)1H NMR和b)13C NMR进行的实际尿素分析。
图11.在100℃下于氨水(2.5M)中温育氨甲酰磷酸(10mg)4小时后尿素产物的分析。a)1H NMR和b)13C NMR，溶于DMSO。
图12.在100℃下于碳酸氢钠(0.2M)、ATP(10mM)和氨水(2.5M)溶液中温育Pfu CK(0.5μM)4小时后尿素产物的分析。a)1H NMR和b)13CNMR，溶于DMSO。
图13.可用于本发明的一些氨基甲酸激酶的比对。仅示出不同于激烈火球菌(P.furiosus)氨基甲酸激酶的氨基酸。
序列表说明
SEQ ID NO:1–激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:NP_578405.1)。
SEQ ID NO:2–掘越氏热球菌氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:NP_143170)。
SEQ ID NO:3–Pyrococcus abyssi氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBIRef:NP_126565.1)。
SEQ ID NO:4–嗜热球菌氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:ZP_04879925.1)。
SEQ ID NO:5–Thermococcus gammatolerans氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:YP_002958486.1)。
SEQ ID NO:6–Thermococcus kodakarensis氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:YP_184571.1)。
SEQ ID NO:7–Thermococcus onnurineus氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:YP_002307889.1)。
SEQ ID NO:8–Thermococcus barophilus氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:YP_004071992.1)。
SEQ ID NO:9–Thermococcus sibiricus氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:YP_002995234.1)。
SEQ ID NO:10–编码激烈火球菌氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11–编码激烈火球菌氨基甲酸激酶的核苷酸序列(NCBIRef:NC_003413)。
SEQ ID NO:12–编码掘越氏热球菌氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13–编码掘越氏热球菌氨基甲酸激酶的核苷酸序列(NCBIRef:NC_000961)。
SEQ ID NO:14–编码Pyrococcus abyssi氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15–编码Pyrococcus abyssi氨基甲酸激酶的核苷酸序列(NCBI Ref:NC_000868)。
SEQ ID NO:16–编码嗜热球菌氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17–编码嗜热球菌氨基甲酸激酶的核苷酸序列(NCBI Ref:NZ_DS999059的反向互补)。
SEQ ID NO:18–编码Thermococcus gammatolerans氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19–编码Thermococcus gammatolerans氨基甲酸激酶的核苷酸序列(NCBI Ref:NC_012804)。
SEQ ID NO:20–编码Thermococcus kodakarensis氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21–编码Thermococcus kodakarensis氨基甲酸激酶的核苷酸序列(NCBI Ref:NC_006624)。
SEQ ID NO:22–编码Thermococcus onnurineus氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23–编码Thermococcus onnurineus氨基甲酸激酶的核苷酸序列(NCBI Ref:NC_011529)。
SEQ ID NO:24–编码Thermococcus barophilus氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25–编码Thermococcus barophilus氨基甲酸激酶的核苷酸序列(NCBI Ref:NC_014804)。
SEQ ID NO:26–编码Thermococcus sibiricus氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27–编码Thermococcus sibiricus氨基甲酸激酶的核苷酸序列(NCBI Ref:NC_012883)。
SEQ ID NO:28–Fervidobacterium nodosum氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:A7HNY8)。
SEQ ID NO:29–Thermosipho melanesiensis氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:A6LPA8)。
SEQ ID NO:30–Anaerobaculum hydrogeniformans氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:D3L0Z7)。
SEQ ID NO:31–Aminobacterium colombiense氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:D5ECR9)。
SEQ ID NO:32–Thermanaerovibrio acidaminovorans氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:D1B8A3)。
SEQ ID NO:33–奥氏嗜热盐丝菌氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBIRef:B8D2J8)。
SEQ ID NO:34–Kosmotoga olearia氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBIRef:C5CE22)。
SEQ ID NO:35–热醋穆尔氏菌氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:Q2RGN0)。
SEQ ID NO:36–编码Fervidobacterium nodosum氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:37–编码Thermosipho melanesiensis氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:38–编码Anaerobaculum hydrogeniformans氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:39–编码Aminobacterium colombiense氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:40–编码Thermanaerovibrio acidaminovorans氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:41–编码奥氏嗜热盐丝菌氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:42–编码Kosmotoga olearia氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:43–编码热醋穆尔氏菌氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:44–粪肠球菌(Enterococcus faecalis)氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBI Ref:P0A2X7)。
SEQ ID NO:45–Clostridium tetani氨基甲酸激酶的氨基酸序列(NCBIRef:Q890W1)。
SEQ ID NO:46–编码粪肠球菌氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:47–编码Clostridium tetani氨基甲酸激酶的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:48和49–寡核苷酸引物。
具体实施方式
一般技术和定义
除非另有特别定义，本文所用的所有技术和科学术语应当具有与本领域(例如，细胞培养、分子遗传学、酶学、尿素生产、蛋白化学和生物化学)技术人员通常理解的相同的含义。
除非另有说明，本发明所用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员公知的标准方法。这类技术通过以下来源的文献描述和解释，例如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbour Laboratory Press(1989),T.A.Brown(editor),EssentialMolecular Biology:A Practical Approach,Volumes1and2,IRL Press(1991),D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes1-4,IRL Press(1995and1996),and F.M.Ausubel et al.(editors),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates andWiley-Interscience(1988,包括到目前为止的所有更新)。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应当理解为表示“X和Y”或者“X或Y”，并且应当用来提供对两种含义或任一种含义的明确支持。
如本文所用，除非另有相反的说明，术语约指指定值的+/-20%，更优选+/-10%，更优选+/-5%。
在整个说明书中，单词“包含(comprise)”或者变化形式如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应当理解为简单地包括所述元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组，但是不排除任何其他元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组。
如本文所用，“嗜热生物”是一种生物体，优选细菌，其可以在约45℃-约70℃的温度下存活。如本文所用，“超嗜热生物”是一种生物体，优选细菌，其可以在约70℃-约120℃的温度下存活。
氨甲酰磷酸的合成
氨甲酰磷酸是生物系统中氮转移的关键代谢物，并且由氨甲酰磷酸合成酶(CPS)和氨基甲酸激酶(CK)合成。激烈火球菌(Pfu)CK(EC6.3.4.16)(SEQ ID NO:1)最初分类为CPS，直至发现其真实底物为氨基甲酸并且其仅使用摩尔的ATP。不像CPS，CPS酶促产生氨基甲酸，然后其转化为氨甲酰磷酸，Pfu CK转化从二氧化碳和氨化学形成的氨基甲酸(方程1)。
氨、二氧化碳和氨基甲酸形成的平衡主要由CO2比NH3的比例决定(Mani et al.,2006)。当等量的氨和CO2在溶液中时，碳酸氢铵是主要产物(方程2)。如果过量的氨可用，则平衡有利于形成氨基甲酸铵(方程3)。
本发明人开发了一种可以在单一过程中将氨转化为氨甲酰磷酸的方法。这个系统的优点是其可以在高pH和低浓度的氨下进行。高pH确保大部分氨不是铵的形式，而相对低浓度的氨使得所述方法适合从诸如生物和水废物产物的来源去除氨。
实施例中提供的酶pH-速率谱表明在2mM、20mM和200mM氨的存在下于约pH9.9下氨基甲酸激酶的速率最大值。这与Durbecq等人(1997)报道的结果相反。还显而易见的是，在所研究的氨浓度下，更中性的pH水平实际上不利于氨甲酰磷酸合成，这是由于氨基甲酸可用性的相关减少。
产物稳定性也受到pH的影响。氨甲酰磷酸在水性环境中不稳定并容易分解(Wang et al.,2008)。分解发生的途径是pH依赖性的。在pH2-4下存在的阴离子分解为氨、碳酸和磷酸(图1A)，而在碱性条件下存在的二价阴离子分解为磷酸盐和氰酸盐(图1B)。分解的途径对于随后的转化很重要，因为进一步的氮取代对于氨和碳酸盐是不可能的，但是已知对于氰酸盐则容易发生(Wen and Brooker,1994)。例如，当用氨处理碳酸盐时不发生尿素形成，但是当用氨处理氰酸盐和氰酸中的一种或多种时其的确形成，并且尿素的产生随着氨浓度的增加而增加。
优选地，产生氨甲酰磷酸的反应中的氨浓度为至少约1mM。在一实施方案中，氨浓度为约1mM-约5M。在另一实施方案中，氨浓度为约2mM-约2M。当存在高浓度的氨时，可以通过如本文所述的中间体从氨甲酰磷酸形成尿素。
在一实施方案中，ATP浓度为至少约0.1mM。在另一实施方案中，ATP浓度为约0.1mM-约100mM。在另一实施方案中，ATP浓度为约1mM-约20mM。在另一实施方案中，ATP浓度为约10mM。
在一实施方案中，碳酸氢盐以碳酸氢钠的形式提供。在一实施方案中，碳酸氢盐浓度为至少约10mM。在另一实施方案中，碳酸氢盐浓度为约约10mM-约1M。在另一实施方案中，碳酸氢盐浓度为约100mM-约500mM。在另一实施方案中，碳酸氢盐浓度为约200mM。
根据特定酶可以耐受的温度，反应可以在包括约10℃-约100℃的温度范围中进行。在一实施方案中，温度为约10℃-约80℃。但是，在某些情况下，在低于酶的最佳温度的温度如约20℃-约30℃下进行反应可以更经济和/或实际(例如当利用废水中的铵/氨时)。对于某些酶，例如SEQ ID NO1-9提供的酶，在较高的温度如约90℃-约100℃下，并且在足够水平的氨存在下会产生尿素。
在另一实施方案中，氨基甲酸激酶在pH10.5、11或11.5下保持其最大活性的至少30%、至少40%、至少50%或至少60%。例如，这可以利用实施例5所述的方法使用20mM或200mM的NH4OH浓度来确定。
本发明可以用来从水如废水、废料去除氨或至少减少氨的浓度。例如，废物可以来源于农业或工业过程。在一实施方案中，废料在液体中，例如来自水坝或河流的水。在另一实施方案中，废料为污水，特别包含人和/或动物废物。在另一实施方案中，废料为气体如废气。
在另一实施方案中，废料在液体中，将所述液体澄清以去除悬浮的固体。澄清可以利用常规设备如relief澄清器、抛光过滤器等进行。
尿素的合成
已提出两种不同途径将铵和氰酸盐(例如)转化为尿素。第一种是通过离子机制NH4 ++NCO-→CO(NH2)2，而另一种是非离子机制，通过氨和氰酸的反应NH3+HNCO→CO(NH2)2。哪种是实际机制的最令人信服的证据由Wen和Brooker(1994)报道。他们报道氰酸盐至尿素的反应速率与铵而不是氨的浓度直接成比例，这支持离子机制。
利用本发明的方法制备的氨甲酰磷酸可以用来合成尿素。反应需要氨，一般在至少约90℃的高温下进行。
在一实施方案中，尿素在单一容器中制备，优选在连续系统中制备。
在一可选实施方案中，尿素在多个阶段中制备。例如，虽然CK在90℃以上的温度(例如90℃-100℃)下发挥功能，但是氨甲酰磷酸的制备通常在更低的温度(例如约60℃)下更有效。在一实例中，按照本发明用固定在固体支持物上的酶制备氨甲酰磷酸。然后从固体支持物分离制备的氨甲酰磷酸，例如通过柱形式的固体支持物，并且从所述柱洗脱氨甲酰磷酸。然后可以使洗脱的氨甲酰磷酸结合至合适的树脂，随后在包含氨的溶液中洗涤树脂以通过如本文所定义的中间体将氨甲酰磷酸转化为尿素。这不仅产生尿素，而且还从树脂释放分子，允许在从树脂洗脱的物质中收集尿素。
适合本发明的树脂包括单或二价阴离子树脂，例如用于从废水和土壤去除磷酸盐的树脂。实例包括KFR-3tT-40、SBS-3和Amberlite IRA-400(Rohm&Haas)。
优选地，产生尿素的反应中的氨浓度为至少约2.5M。在一实施方案中，氨浓度为约2.5M-约40M。在另一实施方案中，氨浓度为约2.5M-约10M。
氨基甲酸激酶
如本文所用，“氨基甲酸激酶”或“CK”是能够将氨基甲酸转化为氨甲酰磷酸的酶。在本发明的方法中，将氨和CO2或其水合形式在化学反应中转化为氨基甲酸，并且所得的氨基甲酸和ATP在通过所述氨基甲酸激酶进行的酶催化反应中转化为氨甲酰磷酸。用于本发明的方法的氨基甲酸激酶可以具有或没有一些氨甲酰磷酸合成酶(CPS)活性，并且因此能够不可逆地从氨、碳酸氢盐和ATP三步合成氨甲酰磷酸。在一优选实施方案，氨基甲酸激酶没有CPS活性。
术语“多肽”、“蛋白”和“氨基甲酸激酶”一般可交换使用并指单多肽链，其可以或可以不通过添加非氨基酸基团来修饰。应当理解这类多肽链可以与其他多肽或蛋白或其他分子如辅因子关联。如本文所用，术语“蛋白”、“多肽”、“氨基甲酸激酶”还包括本文所述多肽的变体、突变体、生物活性片段、修饰、类似和/或衍生物。
通过GAP(Needleman and Wunsch,1970)分析(GCG程序)以缺口产生罚分=5和缺口延伸发生=0.3确定多肽的%相同性。查询序列长度为至少25个氨基酸，并且GAP分析在至少25个氨基酸的区域中比对两个序列。更优选地，查询序列长度为至少50个氨基酸，并且GAP分析在至少50个氨基酸的区域中比对两个序列。更优选地，查询序列长度为至少100个氨基酸，并且GAP分析在至少100个氨基酸的区域中比对两个序列。甚至更优选地，查询序列长度为至少250个氨基酸，并且GAP分析在至少250个氨基酸的区域中比对两个序列。甚至更优选地，查询序列长度为至少300个氨基酸，并且GAP分析在至少300个氨基酸的区域中比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析在它们的整个长度比对两个序列。
如本文所用，“生物活性片段”是如本文所述的多肽的一部分，其保持将氨基甲酸和ATP转化为氨甲酰磷酸的能力。生物活性片段可以是任何大小，只要它们保持所定义的活性。优选地，生物活性片段长度为至少200，更优选至少300个氨基酸。
关于所定义的多肽，应当理解高于上文所提供的%相同性数字会涵盖优选的实施方案。因此，当适用时，根据最小%相同性数字，优选多肽包含与相关指定的SEQ ID NO至少55%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，更优选至少95%，更优选至少96%，更优选至少97%，更优选至少98%，更优选至少99%，更优选至少99.1%，更优选至少99.2%，更优选至少99.3%，更优选至少99.4%，更优选至少99.5%，更优选至少99.6%，更优选至少99.7%，更优选至少99.8%，以及甚至更优选99.9%相同的氨基酸。
本文所述多肽的氨基酸序列突变体可以通过将适当的核苷酸改变引入本文所定义的核酸，或者通过体外合成期望的多肽来制备。这类突变体包括例如氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。可以使缺失、插入和取代的组合到达最终构建体，只要最终多肽产物具有期望的特征。
可以利用本领域已知的任何技术制备突变(改变)的多肽。例如，本文所述的多核苷酸可以进行体外诱变。这类体外诱变技术可以包括将多核苷酸亚克隆入合适的载体，将所述载体转化入“增变”菌株如大肠杆菌XL-1red(Stratagene)并使转化的细菌增殖合适的世代数。在另一实例中，使本文所述的多核苷酸(例如SEQ ID NO10-27或36-43中的两个或更多个)进行如Harayama(1998)广泛描述的DNA改组技术。可以利用本文所述的技术容易地筛选来源于突变/改变的DNA的产物以确定它们是否具有氨基甲酸激酶活性。
在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的位置和突变的性质会取决于待改变的特征。突变位点可以单独或系列改变，例如通过(1)首先用保守的氨基酸选择取代，然后根据所得的结果用更激进的选择，(2)缺失靶残基，或者(3)相邻所处位点插入其他残基。
氨基酸序列缺失一般范围为约1-15个残基，更优选约1-10个残基，并且通常约1-5个相邻残基。
取代突变体在多肽分子中具有至少一个去除的氨基酸残基以及插入其位置的不同残基。所关注的位点是其中获得自不同菌株或物种的特定残基相同的位点。这些位置对于生物活性可能很重要。优选以相对保守的方式取代这些位点，特别是落在至少其他三个相同的保守位点的序列内的位点。这类保守取代如表1所示。
在一优选实施方案中，当与天然存在的多肽相比时，突变体/变体多肽具有1或2或3或4个保守氨基酸改变，或者相对于参考序列如SEQ ID NO:1-9或28-35，具有高达10或15或20个氨基酸改变。保守氨基酸改变的细节在表1中提供。本领域技术人员会知道，可以合理地预测当在重组细胞中表达时，这类微小改变不会改变多肽的活性。
表1.示例性取代。
原始残基 示例性取代
Ala(A) val;leu;ile;gly
Arg(R) lys
Asn(N) gln;his
Asp(D) glu
Cys(C) ser
Gln(Q) asn;his
Glu(E) asp
Gly(G) pro,ala
His(H) asn;gln
Ile(I) leu;val;ala
Leu(L) ile;val;met;ala;phe
Lys(K) arg
Met(M) leu;phe
Phe(F) leu;val;ala
Pro(P) gly
Ser(S) thr
Thr(T) ser
Trp(W) tyr
Tyr(Y) trp;phe
Val(V) ile;leu;met;phe;ala
Ramon-Maiques等人(2000)已描述了P.furiosus CK(SEQ ID NO:1)的晶体结构以及结构/功能关系。他们的研究讨论了结构怎样与其热稳定性相关以及活性位点的结构怎样与其功能相关。他们能够推断酶的热稳定性可以由疏水的亚基间接触的延伸以及大量暴露的离子对所致，并且37℃下缓慢的速率可能是缓慢的产物解离的结果。Ramon-Maiques等人(2000)将缓慢的产物解离归因于“夹心在Met274和TYR244”之间的嘌呤环的强结合以及His268和Ala241的形成氢键的氧原子与腺嘌呤NH2和Ala241的NH的结合，导致腺嘌呤N1处的另一氢键。他们指出这些键应当导致酶对腺嘌呤核苷酸的高度特异性。而且，氨甲酰基部分与10Gly-Gly-Asn和52Gly-Asn-Gly相互作用，并且磷酰基转移包括3个完全保守的赖氨酸残基，Lys131、Lys215和Lys277(Ramon-Maiques et al.,2000)，所有均在实施例5测试的酶中保守。此外，Asp65和Tyr71定义2倍对称性相关的αβ螺旋之间的相互作用，而Gln94参与延伸氢键的网络。Asp65在所有分析的Thermococci中保守。带电荷的残基在所有测试的氨基甲酸激酶中保守为谷氨酸或天冬氨酸。P.furiosus CK的氨基酸编号71在所有Thermococci中均为酪氨酸或组氨酸，但是在测试的其他氨基甲酸激酶中不存在。P.furiosus CK的氨基酸编号94在Thermococci中为谷氨酰胺或甘氨酸，而在测试的其他氨基甲酸激酶中为丙氨酸或谷氨酰胺。本领域技术人员会知道，诸如Ramon-Maiques等人的研究为设计可用于本发明的天然存在的CK的功能变体提供了相当大的指导。
技术人员会理解，可以比对本文所述的多肽(例如具有SEQ ID NO:1-9或28-35中的两个或更多个提供的序列的那些多肽)以辅助设计变体/突变体酶(参见，例如图13)。优选地，保持高度保守的氨基酸，或者可能以保守的方式取代(参见表1)。在另一实施方案中，如果改变蛋白的氨基酸，用在另一氨基甲酸激酶SEQ ID NO:1-9或28-35提供的那些之一的相应位置中发现的氨基酸将其取代。
此外，如果期望，可以将非天然氨基酸或化学氨基酸类似物作为取代或添加引入本文所述的多肽。这类氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计师氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸以及一般的氨基酸类似物。
本发明的范围内还包括在合成期间或之后不同修饰的多肽，例如通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白酶切割、连接至抗体分子或其他细胞配体等。这些修饰可以用来增加多肽的稳定性和/或生物活性。
本文所述的多肽可以通过各种方式制备，包括制备和回收天然多肽、制备和回收重组多肽以及化学合成多肽。在一实施方案中，通过在高效产生多肽的条件下培养能够表达的多肽的细胞并回收多肽来制备酶。培养的优选细胞是如本文所定义的重组细胞。高效培养条件包括但不限于允许多肽产生的高效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。高效培养基指任何培养基，其中培养细胞以产生多肽。这样的培养基通常包含具有可同化的碳的水性介质、氮源和磷源以及适当的盐、矿物质、金属和其他营养如维生素。细胞可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定板和培养皿中培养。培养可以在适合重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。这类培养条件在本领域技术人员的专业知识之内。在一可选实施方案中，本文所述的多肽可以在不含细胞的系统中制备。不含细胞的系统通常包含反应混合物，所述反应混合物包含生物提取物和/或明确的试剂。反应混合物包含产生多肽的模板，例如DNA、mRNA等；合成所必需的氨基酸、酶和其他试剂等，例如核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子等。例如，生物提取物可以来自产生多肽的大肠杆菌、嗜热球菌或热球菌。这类合成反应系统是本领域公知的，并且已在文献中描述。如本领域已知的，不含细胞的合成反应可以分批、连续流或半连续流进行。
在一实施方案中，酶包含能够指导多肽从细胞分泌的信号序列。已分离大量这样的信号序列，其包括N-和C-末端信号序列。原核和真核N-末端信号序列相似，并且据显示真核N-末端信号序列能够作为分泌序列在细菌中发挥功能。这样的N-末端信号序列的实例为细菌β-内酰胺酶信号序列，其为充分研究的序列，并且已广泛用于促进多肽分泌至外部环境。C-末端信号序列的实例为大肠杆菌的溶血素A(hlyA)信号序列。信号序列的其他实例非限制性地包括气单胞菌溶素、碱性磷酸酶基因(phoA)、几丁质酶、内切几丁质酶、α-溶血素、MIpB、支链淀粉酶、Yops和TAT信号肽。
多核苷酸
包括正义或反义方向或两者的组合的单链或双链的DNA、RNA或这些的组合、dsRNA或其他在内的“分离的多核苷酸”表示至少部分分离自在其天然状态下相关或相连的多核苷酸序列的多核苷酸。优选地，分离的多核苷酸至少60%不含，优选至少75%不含，并且最优选至少90%不含它们天然相关的其他组分。此外，术语“多核苷酸”在本文中可与术语“核酸”交换使用。
在多核苷酸的上下文中，术语“外源”指当存在于细胞或不含细胞的表达系统中时，与其天然状态相比改变量的多核苷酸。在一实施方案中，所述细胞是不天然包含所述多核苷酸的细胞。但是，所述细胞可以是包含非外源多核苷酸的细胞，所述多核苷酸导致产生所编码的多肽的量改变，优选增加。本发明的外源多核苷酸包括尚未从其存在的转基因(重组)细胞或不含细胞的表达系统的其他组分分离的多核苷酸，以及在这类细胞或不含细胞的系统产生并随后从至少一些其他组分纯化的多核苷酸。
当与本文提供的分子相比时，本发明的多核苷酸可以具有一个或多个突变，所述突变为核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变体可以是天然存在的(即，分离自天然来源)或合成的(例如，通过在核酸上进行位点定向诱变)。
通常，多核苷酸的单体通过磷酸二酯键或其他类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate和磷酰胺酯。
重组载体
本发明的一实施方案包括重组载体，其包含至少一种本发明的分离/外源多核苷酸，所述多核苷酸插入能够将该多核苷酸分子递送入宿主细胞的任何载体。重组载体可以用来制备可用于本发明的氨基甲酸激酶，例如包含SEQ ID NO:10-27或36-43中任一个提供的核苷酸序列，或者与其中一个或多个至少50%相同的核苷酸序列的重组载体。这样的载体包含异源多核苷酸序列，即未天然发现邻近编码氨基甲酸激酶的多核苷酸分子并优选来源于与多核苷酸分子所源自的物种不同的物种的多核苷酸序列。载体可以是RNA或DNA，原核或真核的，并且通常是转座子(如US5,792,924所述)、病毒或质粒。
一种类型的重组载体包含可操作地连接至表达载体的多核苷酸。短语可操作地连接指多核苷酸分子以这样的方式插入表达载体，从而在转化入宿主细胞时所述分子能够表达。如本文所用，表达载体是能够转化宿主细胞并表达指定多核苷酸分子的DNA或RNA载体。优选地，表达载体还能够在宿主细胞内复制。表达载体可以是原核或真核的，并且通常为病毒或质粒。表达载体包括在重组细胞中发挥功能(即，指导基因表达)的任何载体，所述重组细胞包括细菌、真菌、内寄生物、节肢动物、动物和植物细胞。本发明的载体还可以用来在不含细胞的表达系统中制备多肽，这类系统是本领域公知的。
如本文所用，“可操作地连接”指两个或更多个核酸(例如，DNA)片段之间的功能关系。通常，其指转录序列的转录调控元件的功能关系。例如，如果启动子刺激或调节编码序列在适当的宿主细胞和/或不含细胞的表达系统中的转录，将启动子可操作地连接至编码序列，例如本文定义的多核苷酸。一般来说，可操作地连接至转录序列的启动子转录调控元件与转录序列在物理上是连续的，即它们是顺式作用的。但是，一些转录调控元件如增强子不必与其增强转录的编码序列在物理上连续或靠近编码序列。
特别地，表达载体包含调控序列如转录控制序列、翻译控制序列、复制原点以及与重组细胞相容并控制多核苷酸分子表达的其他调控序列。特别地，重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制起始的那些转录控制序列，例如启动子、增强子、操纵子和阻遏子序列。合适的转录控制序列包括可以在本文所述的至少一种重组细胞中发挥功能的任何转录控制序列。各种这样的转录控制序列是本领域技术人员公知的。优选的转录控制序列包括在细菌、酵母、节肢动物、线虫、植物或动物细胞中发挥功能的那些转录控制序列，例如但不限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、噬菌体λ、噬菌体T7、T7lac、噬菌体T3、噬菌体SP6、噬菌体SP01、金属硫蛋白、α-交配因子、毕赤酵母醇氧化酶、甲病毒亚基因组启动子(例如辛德比斯病毒亚基因组启动子)、抗生素抗性基因、杆状病毒、玉米夜蛾(Heliothis zea)昆虫病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、浣熊痘病毒、其他痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒(例如中间早期启动子)、猿猴病毒40、反转录病毒、肌动蛋白、反转录病毒长末端重复、劳氏肉瘤病毒、热休克、磷酸盐和硝酸盐转录控制序列以及能够在原核或真核细胞中控制基因表达的其他序列。
宿主细胞
本发明的另一实施方案包括用本文所述的一种或多种重组分子转化的宿主细胞或其子代细胞，或者宿主细胞或其子代细胞的用途。将多核苷酸分子转化入细胞可以通过任何方法完成，通过所述方法可以将多核苷酸分子插入细胞。转化技术包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、脂质体转染、吸附和原生质体融合。重组细胞可以保持单细胞，或者可以生长为组织、器官或多细胞生物。转化的多核苷酸分子可以保持在染色体外，或者可以整合入转化的(即，重组)细胞的染色体内的一个或多个位点，通过这样的方式，保留它们表达的能力。
转化的合适的宿主细胞包括可以用本文所定义的多核苷酸转化的任何细胞。宿主细胞可以能够内源性(即，天然)产生本文所述的多肽，或者可以能够在用本文所述的至少一种多核苷酸分子转化之后产生这类多肽。宿主细胞可以是能够产生本文所定义的至少一种蛋白的任何细胞，并且包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫、线虫、节肢动物、动物和植物细胞。宿主细胞的实例包括沙门氏菌(Salmonella)、埃希氏菌(Escherichia)、芽孢杆菌(Bacillus)、李斯特菌(Listeria)、酵母菌(Saccharomyces)、夜蛾(Spodoptera)、分枝杆菌(Mycobacteria)、粉夜蛾(Trichoplusia)、BHK(幼仓鼠肾)细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、COS(例如，COS-7)细胞以及Vero细胞。宿主细胞的其他实例为大肠杆菌，包括大肠杆菌K-12衍生物；伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，包括减毒株；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)；以及非致瘤小鼠成肌细胞G8细胞(例如，ATCC CRL1246)。可用的酵母细胞包括毕赤酵母(Pichia sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)和酿酒酵母(Saccharomycessp.)。特别优选的宿主细胞为细菌细胞、酵母细胞或植物细胞。
重组DNA技术可以用来改进转化的多核苷酸分子的表达，通过操纵例如宿主细胞内多核苷酸分子的拷贝数、那些多核苷酸分子转录的效率、翻译所得的转录物的效率以及翻译后修饰的效率。可用于增加多核苷酸分子表达的重组技术包括但不限于将多核苷酸分子可操作地连接至高拷贝数质粒，将多核苷酸分子整合入一条或多条宿主细胞染色体，向质粒添加载体稳定性序列，取代或修饰转录控制信号(例如，启动子、操纵子、增强子)，取代或修饰翻译控制信号(例如，核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)，修饰多核苷酸分子以对应于宿主细胞的密码子使用(参见，例如，SEQ IDNO:10、12、14、16、18、20、22、24、26或36-43)，以及缺失使转录物不稳定的序列。
组合物
可用于本发明的组合物包括赋形剂，在本文中也称为“可接受的载体”。这类赋形剂的实例包括水、盐水、林格氏液、葡萄糖溶液、Hank's液和其他水性生理平衡盐溶液。还可以使用非水性媒介物，例如不挥发性油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其他可用的制剂包括混悬剂，其包含增稠剂，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。赋形剂还可以包含少量添加剂，例如增加等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，而防腐剂的实例包括硫柳汞或邻甲酚、福尔马林和苯甲醇。赋形剂还可以用来增加组合物的半衰期，例如但不限于聚合物控释媒介物、生物可降解的植入物、脂质体、细菌、病毒、其他细胞、油、酯和乙二醇。
在一实施方案中，将氨基甲酸激酶固定在固体支持物上。这可以增加氨甲酰磷酸的产量，和/或增加多肽的稳定性。例如，可以将多肽固定在聚氨基甲酸基质上(Gordon et al.,1999)，或者包裹在适当的脂质体中(Petrikovics et al.,2000a and b)。还可以将多肽掺入包含泡沫的组合物，例如通常用于灭活的那些泡沫(LeJeune et al.,1998)。技术人员会理解，如WO00/64539公开的，氨基甲酸激酶可以在海绵或泡沫中容易地使用。可用于本发明的其他固体支持物包括具有丙烯酸型结构的树脂，具有环氧官能团的树脂如Sepabeads EC-EP(Resindion srl--Mitsubishi Chemical Corporation)和Eupergit C(Rohm-Degussa)，或者具有伯氨基的树脂如Sepabeads EC-has和EC-EA(Resindion srl--Mitsubishi Chemical Corporation)。在任何情况下，使多肽与固体支持物接触并通过官能团(环氧化物)的高反应性或者用双功能剂如戊二醛激活支持物来固定，以便将酶结合至基质。适合本发明的其他支持物为聚苯乙烯树脂、大孔吸附树脂和具有碱性官能团的树脂如Sepabeads EC-Q1A，多肽吸附在树脂上，然后通过与双功能剂(戊二醛)交联来稳定。
在一实施方案中，组合物为控释制剂形式，能够将组合物缓慢释放入环境(包括土壤和水样品)。如本文所用，控释制剂包含控释媒介物。合适的控释媒介物包括但不限于生物相容性聚合物、其他聚合物基质、胶囊、微囊、微粒、团制剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质球体(liposphere)和透皮递送系统。优选的控释制剂是生物可降解的(即，生物可蚀解的(bioerodible))。
酶的浓度取决于例如待去污的样品的性质、样品中氨的浓度以及组合物的制剂。组合物内酶的有效浓度可以利用本发明的方法通过实验容易地确定。
用途
氨甲酰磷酸
原位化学或生物转化氨甲酰磷酸产生有价值的商品。氨甲酰磷酸可以如本文所述用来制备尿素。
可以将氨甲酰磷酸转化为氨基甲酰基衍生物的阵列，因为其会通过中间体如氰酸盐和/或氰酸与亲核试剂反应。醇会与氰酸盐反应以形成氨基甲酸(Love and Kormendy,1963)。例如，来自酚的醇官能团会与氨甲酰磷酸反应以形成苯基氨基甲酸，这是常用的尿素衍生物的合成前体(Xiao et al.,1997)。相似地，氨甲酰磷酸可以与硫醇反应，导致产生广泛用作除草剂的硫代氨基甲酸酯(Wootton et al.,1993)。氨甲酰磷酸还可以用来将尿素官能度引入肽。
用尿素取代基代替酰胺键已令人感兴趣，并且这些非天然的肽已作为HIV蛋白酶抑制剂(Kempf et al.,1991)以及β-转角蛋白模拟物(Nowick et al.,1995)进行研究。
据显示氨甲酰磷酸对龋齿具有预防和可能的治疗效果。已发现氨甲酰磷酸和其他氨基甲酸化合物对骨组织和骨密度的稳定或生长具有有益效果(US20030096741)。
氨甲酰磷酸可以是反应的能源(US20020168706)。
当与天冬氨酸反应时，氨甲酰磷酸可以用来形成尿苷-5'-单磷酸酯(US20020058244)。
通过多步途径从天冬氨酸和氨甲酰磷酸(衍生自谷氨酰胺和CO2)合成嘧啶、嘧啶核苷和嘧啶核苷酸(参见O'Donovan and Neuhard,1970)。
在尿素循环中从氨甲酰磷酸生物化学形成的瓜氨酸用作治疗心脏病的药物(Barr et al.,2007)。
尿素
全世界超过90%的尿素生产用作释放氮的肥料。在常用的所有固体氮肥中，尿素具有最高的氮含量。许多土壤细菌具有尿素酶，其催化尿素分子转化为两个氨分子和一个二氧化碳分子，因此尿素肥料在土壤中非常迅速地转化为铵形式。氨和硝酸盐容易被植物吸收，并且是植物生长的主要氮源。尿素在水中高度可溶，因此还非常适合用于肥料溶液(与硝酸铵组合)，例如在“叶面施肥”肥料中。在肥料使用中，颗粒优于小球，因为它们较窄的粒径分布有利于机械施用。
尿素通常以40-300kg/ha的速率扩散，但是速率变化。由于渗出，较小的施用引起较低的损失。在夏季期间，通常在下雨之前或期间散播尿素以最小化挥发(其中氮作为氨气损失至空气的过程)损失。尿素溶于水用于作为喷雾或通过灌溉系统施用。
尿素从空气吸收水分，因此通常储存在托盘上封闭/密闭的袋中，或者如果大量储存，在防水油布覆盖下。对于大多数固体肥料，推荐储存在阴凉、干燥、通风良好的地方。
尿素是制备许多重要化合物的原料，例如一些塑料(例如，尿素-甲醛树脂)、一些胶粘剂(例如，用于船用胶合板的尿素-甲醛或尿素-三聚氰胺-甲醛)、氰酸钾(工业原料)和硝酸尿素(爆炸物)。
在汽车系统中，尿素用于选择性非催化还原和选择性催化还原反应以减少来自燃烧柴油、双燃料和稀燃天然气发动机的废气中的NOx污染物。例如，BlueTec系统将基于水的尿素溶液注入排气系统。通过尿素水解产生的氨与氮氧化物排放物反应并在催化转化器内转化为氮和水。
尿素可以作为氢源用于随后燃料电池中的发电。尿/废水中存在的尿素可以直接使用(通过通常快速降解尿素的细菌)。通过尿素溶液的电解产生氢在较低电压(0.37v)下发生，因此比水的电解(1.2v)消耗更少的能量。
关于医学用途，在局部皮肤病产物中使用尿素以促进皮肤的再水合。如果被封闭敷料覆盖，40%尿素制剂还可以用于指甲的非手术清创。某些类型的即时冷敷袋(或冰袋)包含水和分离的尿素晶体。使内部水袋破裂开始吸热反应并允许所述袋用来减轻肿胀。像盐水一样，尿素注射用来进行流产。尿素是称为尿疗法的可选药物治疗的主要组分。用碳-14或碳-13标记的尿素用于尿素呼吸测试，其用来检测与消化性溃疡相关的人胃和十二指肠中细菌幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的存在。
利用本发明的方法制备的尿素的其他可能的用途包括但不限于硝化纤维素炸药中的稳定剂，动物饲料的组分，用于道路除冰的岩盐的非腐蚀性替代物，滑雪板半管和地形公园的表面重修，香烟的风味增强添加剂，脱发剂的成分，工厂生产的椒盐卷饼的褐变剂，一些护肤霜、保湿霜和护发素的成分，一些用于急救使用的即用型冷敷布的反应剂，播云剂，耐火剂，牙齿美白产品中的成分，洗碗剂中的成分，用于将糖发酵为乙醇的酵母营养，为了地球工程学目的的海洋营养实验中浮游生物所用的营养，延长皮胶的工作温度和开发时间的添加剂，用于纺织品染色或印花的染浴的增溶和水分保持添加剂，以及蛋白变性剂。
实施例
实施例1-激烈火球菌氨基甲酸激酶的制备
目前表达Pfu CK的文献方法包括利用合成的寡核苷酸引物PCR扩增该酶的基因组DNA(cpkA,Y09829.1)，所述引物设计为在起始ATG引入NcoI位点并在终止密码子的下游引入BlpI位点(5′-GTGGTTTCCATGGGTAAGAGGGTAGTGATTGC-3′(SEQ ID NO:48)和5′-GCATTCGCTAAGCTGGGTCTTCTAAAGTTCCTCAGG-3′(SEQ IDNO:49))(Dubecq et al.,1997)。然后将PCR产物用NcoI和BlpI限制性酶消化，插入质粒pET-15b的相应位点，并且将重组Pfu CK质粒(pCPS184)转化入大肠杆菌DH5α细胞。还转化额外的质粒(pSJS1240)以允许表达精氨酸(AGA和AGG)和异亮氨酸(ATA)的tRNA密码子(这些密码子在大肠杆菌中很少使用并在Pfu CK基因中经常出现)。然后使转化的大肠杆菌DH5α细胞在3L的Luria-Bertani培养基(补充了0.1mg/mL氨苄西林和0.05mg/mL壮观霉素)中于37℃下在振荡培养箱中生长过夜，并且在用1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导3小时后，通过离心收获细胞。利用这种表达方法可以获得约10g细胞(Dubecq et al.,1997)。
然后在0-4℃下利用一系列纯化方法从这些细胞分离Pfu CK。首先，将细胞悬浮于50mM Tris-HCl，pH7.5中，通过超声裂解(超声振荡器，250W，10kHz，20分钟)并离心(80000x g，30分钟)。然后加入硫酸铵至40%饱和，将溶液搅拌30分钟并离心(12000x g，20分钟)。然后将硫酸铵浓度增加至80%饱和，将溶液再次搅拌30分钟并离心(12000x g，20分钟)。将这种硫酸铵分级分离之后获得的Pfu CK颗粒悬浮于50mM Tris-HCl，pH7.2中，在相同缓冲液中透析，并且在一系列色谱纯化中分离Pfu CK(DEAEsepharose,Blue Sepharose,DEAE Affi-gel Blue(Bio-Rad))利用这种表达和纯化方法，50g细胞获得约0.75mg蛋白(0.015mg/g)(Uriate et al.,1999)。
为了解决这种低蛋白收率，利用重新设计的酶表达和纯化方案代替获得Pfu CK。首先，为大肠杆菌表达优化Pfu CK基因组DNA序列，这使得pSJS1240的使用多余。然后将优化的cpkA基因在NdeI和EcoRI限制性位点之间插入T7启动子载体pETMCSIII以用于随后通过N-末端(His)6标签进行表达，并且将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。使转化的细胞在100mL的Luria-Bertani培养基(补充了0.1mg/mL氨苄西林)中于37℃下在振荡培养箱中生长过夜，并且通过离心收获细胞(4000x g，5分钟)。获得约1g细胞。
Pfu CK的分离在0-4℃下进行。将细胞悬浮于补充了500mM NaCl和20mM咪唑的20mM磷酸钠，pH7.4中，并且利用弗氏压碎器裂解。然后通过离心(12000x g，30分钟)去除细胞碎片，并且通过金属离子亲和色谱(His GraviTrap(GE Healthcare))从上清分离Pfu CK，用补充了500mMNaCl和500mM咪唑的20mM磷酸钠，pH7.4洗脱。从最初的1g细胞颗粒分离了约16mg Pfu CK，代表酶收率的1,000倍提高。
实施例2-氨甲酰磷酸的制备
以前通过Pfu CK将ATP催化转化为ADP的分析已涉及丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联测定(Uriarte et al.,1999)。在磷酸烯醇丙酮酸的存在下，丙酮酸激酶将ADP转化为ATP并产生丙酮酸，然后通过乳酸脱氢酶将丙酮酸转化为乳酸，同时氧化NADH。在稳定状态下，UV监测的NADH浓度的减少则用作Pfu CK催化的ADP产生的量度。因为这种动力学分析是基于第二产物的检测，所以设计可选测定以更直接地测量Pfu CK催化的ADP产生。这种测定是基于Buchan(2009)设计的HPLC监测的tRNA合成酶活性的测定。
利用Alltech Alltima HP C18柱，根据表2所列的溶剂系统用60mM磷酸二氢铵和水中的5mM四丁基磷酸二氢铵(溶剂A)和甲醇中的5mM四丁基磷酸铵(溶剂B)的梯度洗脱以实现AMP、ADP和ATP标准溶液的HPLC分离。观察到的AMP、ADP和ATP标准品的保留时间分别为7.9分钟、17.4分钟和25.6分钟。为了加快HPLC分析，确定每27分钟分析可以监测4个注射而不共洗脱AMP或ADP(见图2)。
然后在各种条件下监测Pfu CK将ATP催化转化为ADP的活性。制备0.2M碳酸氢钠和10mM ATP的测定溶液，其包含2mM、20mM或200mM氨，并且用2M NaOH将pH调整至pH8.9-11.4。将测定稳定保持在40℃下。为了允许缓冲测定在pH8下进行，将0.1M Tris-HCl加入测定混合物，并且利用5M HCl调整pH(对照测定证实添加Tris-HCl不影响酶活性)。通过添加Pfu CK(0.5μM终浓度)来开始反应，并且在4小时中通过用水中的0.1%十二烷基硫酸钠终止20μL反应等分试样，然后如表2所列进行HPLC分析来监测ADP浓度。利用标准校准确定反应等分试样中的ADP浓度，并且为背景修正ADP浓度的改变速率。
表2.用于分离AMP、ADP和ATP的HPLC溶剂系统。
图3示出的是在2mM、20mM和200mM氨的存在下Pfu CK的pH-速率谱。在全部3个氨浓度下均在约pH9.9观察到速率最大值。在这个pH下，氨浓度从200mM至20mM的10倍减少对ADP产生速率的影响可以忽略不计，两个条件均允许以约1.2μmol/min/mg酶的速率产生ADP。但是，在pH9.9下氨浓度进一步10倍减少至2mM导致速率减少78%至0.26μmol/min/mg酶。这些结果表明在pH9.9下，当混合≥20mM氨与0.2M碳酸氢钠时，在酶饱和浓度下可以化学合成氨基甲酸。这些结果与(Dubecqet al.,1997)的结果相反，(Dubecq et al.,1997)的结果表明在37℃下于7.8和8之间获得最大活性，而在60℃下值接近pH7.6。
在图3中可以看到，当低于pH9.9时，氨浓度从200mM至20mM的10倍减少对酶活性具有负面影响。这表明20mM氨在这些条件下于饱和浓度下较不能产生氨基甲酸。这可以通过低于氨的pKa的pH(9.25)减少酶可用的氨基甲酸的氨/铵比例极限浓度来解释。因此通过增加氨浓度10倍(200mM)来增加这个比例会增加氨基甲酸浓度接近饱和水平。利用2mM氨，这些趋势进一步明显，在所有pH下速率的减少表明氨基甲酸浓度的进一步降低。
还进行研究最佳温度条件的进一步实验。这包括如上文所述的在pH9.9下和在20mM氨的存在下的Pfu CK的重复测定，同时增加测定温度从40℃至60℃和80℃。图4示出在这些改变的温度下Pfu CK产生ADP的活性。当温度从40℃增加至60℃时观察到ADP产量增加约3倍。但是，温度进一步增加至80℃未导致相似的增加，ADP产量与在60℃下观察到的大致相同。这些观察表明Pfu CK的酶活性的最佳温度为60℃-80℃。
总的来说，Pfu CK能够在可变温度、高pH和低浓度的氨下操作，并且因此可以用来从废水去除有毒的氨以产生氨甲酰磷酸。
实施例3-氨甲酰磷酸的制备的进一步分析
获得实施例2所示的数据之后，本发明人进行了优化一些参数的进一步分析。所用的方法如实施例1所述，但是将细胞碎片以20,000x g离心60分钟，并且获得酶收率的1,000倍提高。
利用Alltech Alltima HP C18柱，根据表3所列的溶剂系统用60mM磷酸二氢铵和水中的5mM四丁基磷酸二氢铵(溶剂A)和甲醇中的5mM四丁基磷酸铵(溶剂B)的梯度洗脱以实现AMP、ADP和ATP标准溶液的HPLC分离。观察到的AMP、ADP和ATP标准品的保留时间分别为8分钟、17.5分钟和25.5分钟。
表3.用于分离AMP、ADP和ATP的HPLC溶剂系统。
所有梯度均为线性的。
然后在各种条件下监测Pfu CK将ATP催化转化为ADP的活性。制备0.2M碳酸氢钠和10mM ATP的测定溶液，其包含20mM或200mM氨，并且用5M HCl或2M NaOH将pH调整至8.9-11.4。将测定稳定保持在40℃下。通过添加Pfu CK(0.5μM终浓度)来开始反应，并且在4小时中通过用水中的0.1%十二烷基硫酸钠终止20μL反应等分试样，然后如表3所列进行HPLC分析来监测ADP浓度。利用标准校准确定反应等分试样中的ADP浓度。
图5示出在20mM和200mM氨的存在下于代表性稳定状态下10-30分钟的Pfu CK的pH-活性谱。在约pH9.9下观察到速率最大值。更重要的是，在非常高的pH下仍保持活性，在pH11.4下仅减少至最大值的三分之一至三分之二。这与中温氨基甲酸激酶相反，已报道中温氨基甲酸激酶在pH最大值之上表现出活性的急剧下降(Jones,1962)。这些结果显示Pfu CK在9.9(40℃)下具有速率最大值，而以前报道最大值在7.8和8之间(Dubecqet al.,1997)。此外，这是Pfu CK在40℃下于高达11.4的pH下有活性的首次报道。可能在高pH下较高的氨/铵比例增加酶可用的氨基甲酸的浓度，并且这有助于在高pH下令人惊讶的酶活性。
实施例4-氨基甲酸形态
为了确定氨基甲酸浓度是否与Pfu CK pH特征谱相关，进行实验监测作为pH的函数的氨基甲酸浓度。利用盐酸或氢氧化钠将氨(2M)和13C-标记的碳酸氢钠(0.2M)在水中的溶液各自调整至pH7.2、8.4、8.9、9.4、9.9、10.4、10.9和11.4，并且利用D2O同轴连接器通过13C NMR光谱进行分析。在pH7.2下，在159.5ppm观察到碳共振。这个峰分配至快速改变的碳酸氢盐/碳酸盐对。将pH增加至8.4引起这个峰迁移至160.0ppm，第二碳共振出现在164.9ppm。这个第二峰分配至通过氨与碳酸氢盐的反应形成的氨基甲酸(Mani et al.,2006)。然后在7.2-11.4的pH间隔的范围中监测这些峰和它们的相对整合。因为这些化合物仅包含一个碳原子，并且可能在NMR分析期间表现出非常相似的弛豫时间(Mani et al.,2006)，所以这些峰的整合用作它们在溶液中的相对浓度的量度。这些整合和化学位移如表4所示。相对整合的趋势还如图6所示。
表4.调整至pH7.2、8.4、8.9、9.4、9.9、10.4、10.9和11.4的氨(2M)和13C标记的碳酸氢钠(0.2M)在水中的溶液中观察到的化学位移和相对整合。
如表4所示，在pH7.2下分配至碳酸氢盐/碳酸盐的交换对的碳共振(159.5ppm)随着pH增加移动至更高的化学位移。对分配至氨基甲酸的碳共振未观察到这种影响，在所有pH值下均观察到164.9ppm的恒定化学位移。碳酸氢盐/碳酸盐和氨基甲酸的共振的相对整合(图6)还显示氨基甲酸浓度在pH9.9下最高，相对于碳酸氢盐/碳酸盐有32%丰度的氨基甲酸。这表明改变氨基甲酸底物的浓度可以有助于Pfu CK的活性谱。
实施例5-额外的酶的选择和分析
为了确定Pfu CK的pH-活性谱是否是激烈火球菌特有的，选择来自其他生物的一系列氨基甲酸激酶用于分析并比较它们的活性与Pfu CK的活性。本发明人测试了具有与Pfu CK相似结构的来自其他超嗜热生物的氨基甲酸激酶以及来自嗜热和中温物种的氨基甲酸激酶。基于相对于Pfu CK的氨基酸序列同源性比较氨基甲酸激酶结构。选择用于进一步分析的6种酶在表5中列出。
表5.氨基甲酸激酶
基于序列分析Mardanov et al.(2009)预测了来自Thermococcus sibiricus的氨基甲酸激酶(TS CK，表5)，但是到目前为止尚未将其分离。相似地，2011年3月报道了Thermococcus barophilus的完整基因组序列(TB CK，表5)，但是尚未分离TB CK(Vannier et al.,2011)。在2007年完成了Fervidobacterium nodosum的基因组序列。这个工作由美国能源部的科学、生物学和环境研究计划办公室和加利福尼亚大学进行。尚未分离来自Fervidobacterium nodosum的氨基甲酸激酶(FN CK，表5)。来自Thermosiphomelanesiensis的氨基甲酸激酶(TM CK，表5)也尚未分离，但是2009年报道了其基因组(Zhaxybayeva et al.,2009)。自1964年以来已广泛研究来自粪肠球菌(以前称为粪链球菌(Streptococcus faecalis))的氨基甲酸激酶(EF CK，表5)(Kalman and Duffield,1964)。以前尚未分离来自Clostrididium tetani的氨基甲酸激酶(CT CK，表5)。在2003年完成基因组序列(Bruggemann etal.,2003)。表6提供了测试的不同酶之间的氨基酸相同性的总结。
表6.氨基甲酸激酶的氨基酸序列相同性。
TB TS Pfu
CT 52 53 53
EF 50 49 49
FN 54 55 52
TM 55 53 52
Pfu 77 78 -
TS 83 - 78
TB - 83 77
除了TB CK，利用如上文所述用于Pfu CK的优化的方案表达和纯化表5所列的酶。通过利用IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)化学诱导成功过量表达TB CK。对于IPTG诱导，将在37℃下生长过夜的10mL预培养物接种入1L LBA培养基。使细胞生长直至达到0.55的OD，然后添加1mL IPTG(1M，最终1mM)。使用IPTG诱导的细胞在37℃下生长过夜。通过在4℃下离心5,000rpm，15min来收获细胞。所有额外的酶的纯化收率在表7中列出。EF CK的收率为7mg/100mL，代表与以前报道的表达(Marina et al.,1998)相比提高约3倍。此外，所用的方案包括单一纯化步骤，在一天中容易地完成，而以前的报道在所报道的3天时间中包括多个步骤(包括2个柱和2次沉淀)(Marina et al.,1998)。
表7.表达的额外的CK酶的纯化收率。基于100ml液体培养物的收率。
表达和分离之后，对CK酶进行HPLC活性测定。对于除中温孢子形成细菌酶CT CK之外的所有酶，活性是基于预温育10分钟之后的20分钟测定，并且pH特征谱如图7所示，CT CK在所用的任何条件下均没有活性并未进一步研究。活性结果显示相对于Pfu CK具有高度序列同源性的两种超嗜热酶(TS CK和TB CK，表5)表现出与Pfu CK相似的pH活性谱(图7)。如上文所讨论的，Pfu CK在非常高的pH下保持其活性。Pfu CK、TS CK和TB CK在9.4-9.9之间具有pH-速率最大值，并且在pH11.4下保留这种活性的很大比例。基于这些结果，预期相对于CK Pfu具有高度序列同源性的氨基甲酸激酶会具有相似的pH-活性谱。
相对于Pfu CK具有较少序列同源性的两种氨基甲酸激酶嗜热菌(FNCK和TM CK)(表5和6)具有与报道的中温生物的pH-活性谱(Jones andLipmann,1960)相似的pH-活性谱，其中从pH9.4至10.4观察到活性的急剧下降(与Pfu CK、TS CK和TB CK很少或没有减少相比)，并且它们在pH10.9-11.4下不保留活性(图7)。
如上文所述，中温孢子形成细菌酶CT CK在任何条件下均没有活性。另一中温酶EF CK具有与嗜热生物FN CK和TM CK相似的pH-活性谱，在pH9.5以上活性急剧下降(图7)。
因此，所选酶的pH-活性谱可以通过它们与Pfu CK相比的氨基酸序列同源性进行归类。
实施例6-不同氨基甲酸激酶的温度特征谱
为了进一步研究结构与活性之间的关系，进行温度-活性实验。
进行如上文所述的在pH9.9下和在200mM氨的存在下的测定，同时保持20℃、40℃、60℃和80℃的测定温度。图8示出在指定温度下作为时间函数的稳定状态温度特征谱。来自超嗜热生物且相对于Pfu CK具有高度序列同源性的氨基甲酸激酶(TS CK和TB CK，表5)全部随着温度具有增加的活性，在4个指定温度中具有80℃的最大活性。在20℃下，ADP的酶促产生减少至接近背景水平。来自嗜热生物且相对于Pfu具有较少序列同源性的氨基甲酸激酶(FN CK和TM CK，表5)在较高温度下活性较低(图8)。FN CK在40℃下最具活性，而TM CK在40-60℃下最具活性。来自中温生物的活性氨基甲酸激酶(EF)在40℃下最具活性(图8)，并且在60℃或80℃下表现出很少活性。在图8中的EF CK特征谱中，在80℃下的ADP产生可能是背景ATP水解的假象。
温度特征谱总结图如图9所示。在80℃下，Pfu CK以及相对于Pfu CK具有高序列同源性的氨基甲酸激酶具有5-9.5μmol/min/mg的活性，而其他氨基甲酸激酶在这个温度下没有活性。
实施例7-不同氨基甲酸激酶的稳定性
Pfu CK以及相似序列同源性酶TS CK和TB CK在高pH下稳定并出人意料地发挥功能。此外，在升高的温度下，它们稳定并发挥功能，具有增加的活性，并且它们可能在储存时保留功能和结构。这些不寻常的特征是商业应用的重要属性，因此本发明人开始评价氨基甲酸激酶的稳定性。
对Pfu CK、TS CK、TB CK、FN CK、TM CK和EF CK进行初步稳定性测定。在40℃下温育60小时后，Pfu CK、TS CK和TB CK基本上保持它们的活性，而其他酶失活。此外，Pfu CK在4℃下储存一年后保留其活性，证实其用于商业应用的潜力。
实施例8-尿素的制备
为了确定生物合成的氨甲酰磷酸原位化学转化为尿素的可行性，进行模型研究以确定在各种浓度的氨的存在下氨甲酰磷酸的反应性。对于-78℃下氨甲酰磷酸(50mg)和液氨(10mL)的混合物，观察到最小溶解。据认为操作液氨所需的低温并不适合氨甲酰磷酸溶解性。因此进行促进氨甲酰磷酸溶解性的进一步实验。将氨甲酰磷酸(10mg)与氨水(1mL,14.8M)混合并在100℃下加热4小时。利用这些改变的条件观察到氨甲酰磷酸的溶解。在干燥粗反应产物时，与可信样品的比较分析(TLC,1H/13C NMR,HPLC)证实已实现氨甲酰磷酸向尿素的转化(光谱分析见图10和11)。如HPLC分析所示，混合氨甲酰磷酸与减少浓度的10M、5M和2.5M的氨的额外的实验显示对尿素产生的影响可忽略不计。但是，进行至低于2.5M的氨浓度导致观察到的尿素浓度明显减少。
然后将来源于这些模型研究的条件应用于试图将生物合成的氨甲酰磷酸转化为尿素的Pfu CK测定。将Pfu CK(0.5μM终浓度)加入0.2M碳酸氢钠、10mM ATP和2M氨(pH11)的溶液，并且将反应在100℃下加热4小时。然后将溶液通过氮气干燥，并且通过1H和13C NMR进行分析(图12)。这些分析证实已合成尿素。
本申请要求2011年6月17日提交的US61/498,395的优先权，其整体内容援引加入本文。
本领域技术人员会理解，如具体实施方案所示，可以对本发明进行许多变化和/或修改而不背离广泛描述的本发明的精神或范围。因此在各方面均认为目前的实施方案是说明性而不是限制性的。
本文讨论和/或引用的所有出版物均整体加入本文。
本说明书中已包括的文件、条例、材料、装置、文章等的任何讨论仅为了提供本发明上下文的目的。并不是承认因为在本申请的每项权利要求的优先权日期之前存在，任何或所有这些材料构成现有技术基础的一部分或是本发明相关领域的公知常识。
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Claims (41)

1.一种制备氨甲酰磷酸的方法，所述方法包括在氨基甲酸激酶的存在下使组合物中的氨、ATP、碳酸氢盐和CO2或其水合形式反应，其中将所述氨和CO2或其水合形式在化学反应中转化为氨基甲酸，并且将所述氨基甲酸和ATP在通过所述氨基甲酸激酶进行的酶催化反应中转化为氨甲酰磷酸，并且其中所述组合物的pH为约8-约12。
2.权利要求1的方法，其中所述pH为约9-约11、约9.25-约11.25、约10.25-约11.25或者约10.5-约11.5。
3.权利要求2的方法，其中所述氨基甲酸激酶来源于超嗜热菌，或者是其生物活性突变体。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述氨基甲酸激酶包含
a)SEQ ID NO:1-9中任一个提供的氨基酸序列，
b)与SEQ ID NO:1-9中任一个或多个至少50%相同的氨基酸序列，和/或
c)a)或b)的生物活性片段。
5.权利要求4的方法，其中所述氨基甲酸激酶包含
a)SEQ ID NO:4-9中任一个提供的氨基酸序列，
b)与SEQ ID NO:4-9中任一个或多个至少50%相同的氨基酸序列，和/或
c)a)或b)的生物活性片段。
6.权利要求2-5中任一项的方法，其中温度为约10℃-约80℃。
7.权利要求2-6中任一项的方法，其中在40℃下于NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)和20mM NH4OH中温育30分钟之后，在pH11下0.5μM的氨基甲酸激酶产生至少0.5μmol/min/mg的ADP。
8.权利要求2-7中任一项的方法，其中在40℃下于NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)和20mM NH4OH中温育30分钟之后，在pH11.5下0.5μM的氨基甲酸激酶产生至少0.25μmol/min/mg的ADP。
9.权利要求1的方法，其中所述pH为约9-约10.5或者约9.5-约10.5。
10.权利要求9的方法，其中所述氨基甲酸激酶来源于嗜热菌，或者是其生物活性突变体。
11.权利要求9或10的方法，其中所述氨基甲酸激酶包含
a)SEQ ID NO:28-35中任一个提供的氨基酸序列，
b)与SEQ ID NO:28-35中任一个或多个至少50%相同的氨基酸序列，和/或
c)a)或b)的生物活性片段。
12.权利要求9-11中任一项的方法，其中在40℃下于NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)和200mM NH4OH中温育30分钟之后，在pH10.5下0.5μM的氨基甲酸激酶产生至少0.6μmol/min/mg的ADP。
13.权利要求9-12中任一项的方法，其中温度为约10℃-约60℃。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中温度为约20℃-约30℃。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述氨基甲酸激酶在4℃下储存1年和/或在40℃下储存60小时后保持其活性的至少约50%、至少约60%、至少约70%或者至少约80%。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中压力为约0-约10atm。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其在连续系统中进行。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中将所述氨基甲酸激酶固定在固体支持物上。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述氨的来源为废料。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其通过分解至少一些所述氨甲酰磷酸来进一步产生氰酸盐和氰酸中的一种或两者。
21.一种从氨甲酰磷酸制备化合物的方法，所述方法包括
i)进行权利要求1-20中任一项的方法以制备氨甲酰磷酸，以及
ii)进行一个或多个进一步的反应以制备所述化合物。
22.权利要求21的方法，其中所述化合物为尿素，并且步骤ii)包括使制备自步骤i)的氨甲酰磷酸与氨反应以通过中间体产生尿素，所述中间体为氰酸盐和氰酸中的一种或两者。
23.权利要求22的方法，其中至少步骤ii)在至少约90℃或者约90℃-约100℃的温度下进行。
24.权利要求21的方法，其包括
i)用固定在固体支持物上的氨基甲酸激酶进行权利要求1-20中任一项的方法，
ii)从所述固体支持物分离步骤i)制备的氨甲酰磷酸，
iii)使所述氨甲酰磷酸结合至树脂，以及
iv)在包含氨的溶液中洗涤所述树脂以通过中间体将所述氨甲酰磷酸转化为尿素，所述中间体为氰酸盐和氰酸中的一种或两者。
25.权利要求24的方法，其中步骤iv)在约90℃-约100℃的温度下进行。
26.权利要求21的方法，其中所述化合物为选自以下的尿素循环的中间体：瓜氨酸、精氨琥珀酸、精氨酸、鸟氨酸及其两种或更多种的组合。
27.权利要求21的方法，其包括进行权利要求20的方法以制备氰酸盐和氰酸中的一种或两者，并且使所述氰酸盐和/或氰酸与亲核试剂反应。
28.权利要求21或27的方法，其中所述化合物为嘧啶化合物。
29.权利要求28的方法，其中所述嘧啶化合物为尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶，或者其具有一个、两个或三个磷酸基团的衍生物。
30.权利要求21-23或26-29中任一项的方法，其中所述方法在单一容器中进行。
31.一种减少废料中的氨浓度的方法，所述方法包括进行权利要求1-30中任一项的方法。
32.权利要求31的方法，其中所述废料在水中。
33.编码氨基甲酸激酶的分离和/或外源的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22、24、26或36-43中任一个提供的核苷酸序列。
34.权利要求33的多核苷酸，其可操作地连接至启动子，所述启动子能够指导所述多核苷酸在细胞中的表达。
35.包含权利要求33或34的多核苷酸的载体。
36.包含权利要求33或34的多核苷酸和/或权利要求35的载体的宿主细胞。
37.权利要求36的宿主细胞，其为细菌细胞、酵母细胞或植物细胞。
38.一种制备氨基甲酸激酶的方法，所述方法包括在允许表达编码所述氨基甲酸激酶的多核苷酸的条件下培养权利要求36或37的宿主细胞或其包含所述多核苷酸或权利要求35的载体的提取物。
39.利用权利要求1-20中任一项的方法制备的氨甲酰磷酸。
40.利用权利要求21-32中任一项的方法制备的化合物。
41.权利要求40的化合物，其为尿素、瓜氨酸、精氨琥珀酸、精氨酸、鸟氨酸或嘧啶化合物。
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