ES2329778T3 - 2,3-aminomutasa de alanina. - Google Patents
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Abstract
Una célula transformada que comprende la actividad de 2,3-aminomutasa de alanina, en donde la célula abarca al menos una molécula exógena de ácido nucleico, en donde la molécula de ácido nucleico abarca una secuencia de ácido nucleico que codifica una 2,3-aminomutasa de alanina que produce beta-alanina a partir de alfa-alanina, en donde la secuencia del ácido nucleico que codifica una 2,3-aminomutasa de alanina abarca: a) nucleótidos 307-1017 de una secuencia mostrada en ID. SEC. N.º: 20, o b) nucleótidos 55-1026 de una secuencia mostrada en ID. SEC. N.º: 29, o c) nucleótidos 307-1017 de ID. SEC. N.º: 20 o nucleótidos 55-1026 de ID. SEC. N.º: 29 que incluyen una o más sustituciones que dan lugar a unas o más sustituciones conservadoras del aminoácido, o d) una secuencia del ácido nucleico que tiene por lo menos una identidad del 6096 con ID. SEC. N.º: 20 o ID. SEC. N.º: 29, en donde la molécula de ácido nucleico no tiene la secuencia ID. SEC. N.º: 1 ó 2 de US-B1-6248874.
Description
2,3-aminomutasa de alanina.
Esta divulgación se relaciona con las secuencias
de ácido nucleico y aminoácido 2,3-aminomutasa de
alanina, células que tienen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina que puede convertir el
alfa-alanina en beta-alanina y
métodos que utilizan estas células para hacer
beta-alanina, ácido pantoténico, ácido
3-hidroxipropiónico, y otros compuestos
orgánicos.
Los productos químicos orgánicos tales como
ácidos orgánicos, ésteres y polioles se pueden utilizar para
sintetizar los materiales plásticos y otros productos. Para
resolver la demanda en aumento de productos químicos orgánicos, se
están desarrollando métodos de producción más eficaces y rentables
que utilizan materias primas basadas en los carbohidratos en lugar
de hidrocarburos. Por ejemplo, se han utilizado ciertas bacterias
para producir grandes cantidades de ácido láctico usado en la
producción del ácido poliláctico.
El ácido 3-hidroxipropiónico
(3-HP) es un ácido orgánico. Se ha informado que
varias rutas de síntesis químicas producen 3-HP y
también se han revelado rutas biocatalíticas (WO 01/16346 a Suthers
y col.). El 3-HP es útil para la síntesis de la
especialidad y se puede convertir en los intermedios comercialmente
importantes mediante técnicas comunes en la industria química, p.
ej. ácido acrílico mediante deshidratación, ácido malónico mediante
oxidación, ésteres mediante reacciones de esterificación con
alcoholes y 1,3-propanodiol por reducción.
El compuesto de ácido
3-hidroxipropiónico (3-HP) se puede
producir biocatalíticamente a partir de PEP o piruvato, a través de
un intermedio dominante de beta-alanina (Fig. 1). El
compuesto de beta-alanina se puede sintetizar a
partir de células de carnosina, arginina
beta-alanil, lisina beta-alanil,
uracilo a través de 5,6-dihidrouracilo y
N-carbamoilo-beta-alanina,
N-acetilo-beta-alanina,
anserina o aspartato (Fig. 1 y 2). Sin embargo, estas rutas son
relativamente ineficaces porque requieren precursores poco comunes
o compuestos iniciales más valiosos que el
3-HP.
Por lo tanto, la producción de
3-HP mediante el uso de rutas biocatalíticas sería
más eficaz si el compuesto de alfa-alanina pudiera
convertirse directamente en beta-alanina (Fig. 1).
Lamentablemente, todavía no se ha identificado la enzima que
interconvierte la alfa-alanina en
beta-alanina. Se lograría un gran avance si se
pudieran identificar las actividades enzimáticas que realizan la
conversión de alfa-alanina en
beta-alanina, p. ej.
2,3-aminomutasa de alanina.
La invención actual se define en las
reivindicaciones adjuntas.
Las secuencias descritas en el presente
documento son las de ácido nucleico de
2,3-aminomutasa de alanina (tales como las ID de
SEC. N.º: 20 y 29), secuencias de aminoácido (tales como las ID de
SEC. N.º: 21 y 30), así como las variantes, los fragmentos, las
fusiones y los polimorfismos de los mismos que conservan actividad
de 2,3-aminomutasa de alanina. En un ejemplo, el
polipéptido es una secuencia que incluye la ID de SEC. N.º: 21 ó
30, o las variantes, los fragmentos, o las fusiones de los mismos
que conservan actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina. En un ejemplo, el polipéptido es una secuencia de
aminoácido transformado de 2,3-aminomutasa de
lisina o una secuencia de aminoácido de
5,6-aminomutasa de lisina. Las secuencias descritas
se pueden utilizar para transformar las células, de manera que las
células transformadas posean actividad de
2,3-aminomutasa de alanina, lo cual permite que las
células transformen alfa-alanina en
beta-alanina. Los agentes astringentes que se unen
específicamente a una 2,3-aminomutasa de alanina
también se incluyen en la presente publicación.
Se describen las células que tienen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina y permiten que la célula
convierta el alfa-alanina en
beta-alanina. Dichas células pueden ser eucarióticas
o procarióticas, tales como células de levadura, células de
plantas, células de Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus o
Escherichia. En un ejemplo, la célula se transforma con
2,3-aminomutasa de lisina transformada o
5,6-aminomutasa de lisina transformada que le
confiere a las células transformadas actividad de
2,3-aminomutasa. En otro ejemplo, las células
transformadas incluyen 2,3-aminomutasa de alanina,
tal como la ID de SEC. N.º: 21 ó 30. Las células descritas se pueden
utilizar para producir moléculas de ácido nucleico, polipéptidos y
compuestos orgánicos. Los polipéptidos se pueden utilizar para
catalizar la formación de compuestos orgánicos o se pueden utilizar
como antígenos para crear agentes de enlace específicos.
Se describe una célula de producción que posee
al menos un ácido nucleico exógeno, tal como una codificación de
ácido nucleico para una 2,3-aminomutasa de alanina.
En un ejemplo, la secuencia de ácido nucleico incluye la ID de SEC.
N.º: 20 ó 29 (o las variantes, los fragmentos o las fusiones de los
mismos que conservan actividad de 2,3-aminomutasa
de alanina). En otro ejemplo, la secuencia de ácido nucleico
codifica una secuencia de aminoácido demostrada en la ID de SEC.
N.º: 21 ó 30 (o fragmentos, variantes o proteínas de fusión que
conservan actividad de 2,3-aminomutasa del
alanina). Las células de producción se pueden utilizar para
expresar polipéptidos que poseen actividad enzimática tal como
actividad de CoA-transferasa, actividad de la liasa
de amoniaco de beta-alanina, actividad de
deshidratasa de
3-hidroxipropionil-CoA
(3-HP-CoA), glutamato
deshidrogenasa, de
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa,
alanina deshidrogenasa, piruvato-glutamato
transaminasa o actividad de
3-hidroxiisobutirilo-CoA hidrolasa.
En otro ejemplo, las células de producción se utilizan para
expresar los polipéptidos que poseen actividad enzimática tal como
de
beta-alanina-2-oxoglutarato
aminotransferasa y 3-HP deshidrogenasa o
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa. Se indican los
métodos de producción de polipéptidos codificados por las
secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente.
Se describe un método de identificación de
células con actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina. El método incluye el cultivo de una célula, que se suprime
funcionalmente para panD, en medios que no incluyen
beta-alanina ni pantotenato. Por ejemplo, la célula
puede producir alfa-alanina a partir de fuentes de
medios de carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno, pero que no
incluye beta-alanina. Se identifican las células
capaces de crecimiento en el medio, donde el crecimiento de la
célula indica que la célula está produciendo
beta-alanina a partir de
alfa-alanina, lo cual indica que la célula incluye
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina. En cambio,
la ausencia del crecimiento de la célula indica que no está
produciendo beta-alanina a partir de
alfa-alanina, lo cual indica que la célula no posee
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina. En un
ejemplo, antes de cultivar la célula para la selección, las células
se transforman con una o más 2,3-aminomutasas de
lisina transformadas o 5,6-aminomutasas de
lisina.
Se describe un método de producción de
polipéptidos con actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina. En un ejemplo, el método incluye el cultivo de células que
tienen por lo menos una molécula de ácido nucleico exógeno que
codifica una 2,3-aminomutasa de alanina (tal como
la ID de SEC. N.º: 20 y 29), que es capaz de producir
beta-alanina a partir de
alfa-alanina.
Se indican varios métodos de producción de
3-HP a partir de beta-alanina,
mediante el uso las células descritas con actividad de
2,3-aminomutasa de alanina. En un ejemplo, la célula
está transfectada con una o más enzimas necesarias para convertir
la beta-alanina en 3-HP. En otro
ejemplo, el método incluye la purificación de la
beta-alanina a partir de la célula y el contacto
posterior de la beta-alanina con los polipéptidos
necesarios para convertir la beta-alanina en
3-HP.
3-HP.
Las células, las secuencias de aminoácido y
ácido nucleico de 2,3-aminomutasa de alanina (tales
como las ID de SEC. N.º: 20, 21, 29 y 30), y los métodos descritos
en la presente publicación se pueden utilizar para producir
pantotenato, 3-HP y los derivados de los mismos,
por ejemplo, la coenzima A (CoA) y otros compuestos orgánicos tales
como 1,3-propanodiol, ácido acrílico, acrilato
polimerizado, ésteres de acrilato, 3-HP
polimerizado, copolímeros de 3-HP y otros
compuestos tales como butiratos, valeratos y otros compuestos,
ésteres de 3-HP, y ácido malónico y sus ésteres.
3-HP es biológica y comercialmente importante. Por
ejemplo, la industria alimenticia puede utilizar el
3-HP como alimento, aditivo o conservante para
alimentos, y además los compuestos derivados mencionados
anteriormente se pueden producir a partir del
3-HP.
Las moléculas de ácido nucleico que se codifican
para una 2,3-aminomutasa de alanina (tal como la ID
de SEC. N.º: 20 y 29) se pueden utilizar para crear células huésped
con capacidad para producir 3-HP, así como otros
compuestos orgánicos tales como los enumerados anteriormente. Los
péptidos de 2,3-aminomutasa de alanina (tales como
las ID de SEC. N.º: 21 y 30) se pueden utilizar en sistemas sin
células para crear 3-HP y otros compuestos
orgánicos tales como los enumerados anteriormente. Las células
descritas en este documento se pueden utilizar en sistemas de
cultivo para producir grandes cantidades de 3-HP así
como otros compuestos orgánicos tales como los enumerados
anteriormente.
Un aspecto de la divulgación proporciona células
que, además de actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina, incluyen otras actividades enzimáticas, tales como
actividad de CoA-transferasa, actividad de liasa de
amoniaco de beta-alanil-CoA, y
actividad de deshidratasa de
3-hidroxipropionil-CoA. Además, se
describen los métodos de producción de derivados a partir de estas
células. En algunos ejemplos, la célula también incluye una o más
moléculas de ácido nucleico exógeno que codifica uno o más
polipéptidos que incluyen: actividad de glutamato deshidrogenara,
actividad de CoA-transferasa,
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa o
actividad de
3-hidroxiisobutirilo-CoA hidrolasa y
actividad de alanina deshidrogenasa o
piruvato-glutamato transaminasa. En otro ejemplo,
la célula también incluye actividad 4-aminobutirato
o actividad de aminotransferasa
beta-alanina-2-oxoglutarato
y 3-HP deshidrogenasa, o actividad de
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa. Además, la
célula puede incluir actividad de CoA-hidrolasa,
actividad de sintasa de polihidroxiácido o actividad de lipasa o
esterasa.
En otro ejemplo, una célula que incluye
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina, actividad
de CoA-transferasa, actividad de liasa de amoniaco
de beta-alanil-CoA, actividad de
transaminasa de alanina deshidrogenasa o
piruvato-glutamato, y actividad de deshidratasa de
3-HP-CoA produce un derivado, por
ejemplo, 3-HP, o un éster de 3-HP,
tal como 3-hidroxipropionato de metilo,
3-hidroxipropionato de etilo,
3-hidroxipropionato de propilo, y/o
3-hidroxipropionato de butilo. En algunos ejemplos,
la célula también incluye actividad de glutamato deshidrogenasa,
actividad de CoA-transferasa,
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa y/o
3-hidroxiisobutirilo-CoA hidrolasa.
Por consiguiente, la divulgación también proporciona métodos para
producir uno o más de estos productos. Estos métodos implican el
cultivo de la célula que incluye actividad de
CoA-transferasa, actividad de liasa de amoniaco
beta-alanil-CoA, actividad de
deshidratasa 3-HP-CoA y, en algunos
ejemplos, actividad de glutamato deshidrogenasa, actividad de
CoA-transferasa,
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa,
actividad de hidrolasa de
3-hidroxiisobutilo-CoA, y/o
actividad de alanina deshidrogenasa o
piruvato-glutamato transaminasa, en condiciones que
permiten la elaboración del producto. Estas células también pueden
incluir actividad de lipasa o esterasa.
Otro aspecto de la divulgación proporciona
células que, además de poseer actividad de
2,3-aminomutasa de alanina, tienen actividad de
CoA-transferasa, actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA, actividad de
deshidratasa de
3-hidroxipropionil-CoA, y actividad
de sintasa de polihidroxiácido. En algunos ejemplos, estas células
pueden contener una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica
uno o más polipéptidos que incluyen: actividad de
CoA-transferasa, actividad de la liasa de amoniaco
de beta-alanil-CoA, actividad de
3-hidroxipropionil-CoA
deshidratasa, actividad de alanina deshidrogenasa o
piruvatoglutamato transaminasa, y actividad de sintasa de
polihidroxiácido. Esta célula se puede usar, p. ej. para elaborar
productos tales como el 3-HP polimerizado y
copolímeros de 3-HP, además de otros compuestos
tales como butiratos, valeratos y otros.
En otro ejemplo, la célula, que además de
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina tiene
actividad de CoA-transferasa, actividad de liasa de
amoniaco de beta-alanil-CoA,
actividad de transaminasa de alanina deshidrogenasa o
piruvato-glutamato, y actividad de sintasa de
polihidroxiácido, puede originar un producto, p. ej. el
3-HP polimerizado. En algunos ejemplos, estas
células pueden contener unas o más moléculas exógenas de ácido
nucleico que codifiquen uno o más polipéptidos con actividad de
CoA-transferasa, actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA, o actividad de
sintasa de polihidroxiácido.
Otro aspecto de la divulgación proporciona una
célula que incluye actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina, CoA-transferasa, actividad de liasa de
amoniaco de beta-alanil-CoA,
actividad de transaminasa de alanina deshidrogenasa o
piruvato-glutamato, y actividad de lipasa o
esterasa. En un ejemplo, la célula también incluye actividad de
CoA-hidrolasa. En algunos ejemplos, la célula
contiene una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica uno o
más polipéptidos que tienen actividad de
CoA-transferasa; actividad de liasa de amoniaco
beta-alanil-CoA; actividad de
lipasa o esterasa, o actividad de CoA-hidrolasa.
Esta célula se puede utilizar, entre otras cosas, para obtener
productos tales como ésteres de acrilato (p. ej. acrilato de
metilo, acrilato de etilo, acrilato de propilo y acrilato de
butilo).
Se describen las células que pueden producir el
1,3-propanodiol y los métodos de uso. El
1,3-propanodiol se puede generar a partir de
3-HP-CoA o 3-HP a
través del uso de los polipéptidos con actividad enzimática. Al
convertir el 3-HP-CoA en
1,3-propanodiol, se pueden utilizar polipéptidos
que incluyen actividad de óxido-reductasa o
actividad de reductasa, tal como los polipéptidos que tienen
actividad de óxido-reductasa de aldehído
acetilante: NAD(+) y óxido-reductasa de alcohol: NAD
(-) (p. ej. enzimas de la clase de enzimas 1.1.1.1 ó 1.2.1 10). Al
elaborar 1,3-propanodiol a partir de 3 HP, se puede
utilizar una combinación de un polipéptido con actividad de
aldehído deshidrogenasa (p. ej. una enzima de la clase 1.2.1) y un
polipéptido con actividad de alcohol deshidrogenasa (p. ej. una
enzima de la clase 1.1.1), tal como aldehído deshidrogenasa
(NAD(P)+) (EC 1.2.1.-) y alcohol deshidrogenasa (EC
1.1.1.1).
En algunos ejemplos, los productos se elaboran
in vitro (fuera de la célula). En otros ejemplos, los
productos se elaboran usando una combinación de métodos in
vitro e in vivo (dentro de una célula). En otros
ejemplos, los productos se elaboran in vivo. Para los
métodos que implican pasos in vivo, las células pueden ser
células cultivadas de forma aislada u organismos completos tales
como plantas transgénicas, mamíferos no humanos, u organismos
unicelulares tales como levadura y bacterias (p. ej. las células
del Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, y Escherichia). De ahora
en adelante, dichas células se denominan como células de
producción. Los productos generados por estas células de producción
pueden ser productos orgánicos tales como
beta-alanina, 3-HP, pantotenato, y
derivados de los mismos, por ejemplo, ácidos orgánicos, polioles
(es decir 1,3-propanodiol), coenzima A (CoA),
además de la 2,3-aminomutasa de alanina descrita en
la presente publicación.
El pantotenato, una vitamina esencial para el
crecimiento y la salud de muchos animales, participa en la síntesis
y degradación de los ácidos grasos. La deficiencia de vitaminas da
lugar a un malestar clínico generalizado. Por lo tanto, el
pantotenato producido mediante los métodos divulgados en la
presente publicación se puede administrar a un paciente con
deficiencia pantoténica, en una dosis terapéutica efectiva. Se
describen las células que producen el pantotenato y los métodos de
producción del pantotenato a partir de beta-alanina
mediante el uso de las células descritas. Las células de producción
usadas para producir el pantotenato o CoA, se pueden utilizar para
expresar alfa-ketopantoato hidroximetiltransferasa
(EC 2.1. 2.11), alfa-ketopantoato reductasa (EC
1.1.1.169), y pantotenato sintasa (EC 6.3.2.1), para producir
pantotenato o, además, pantotenato kinasa (EC 2.7.1.33),
4'-fosfopantetenoil-1-cisteína
sintetasa (EC 6.3.2.5), 4'-fosfopantotenoilcisteína
decarboxilasa (EC 4.1.1.36), ATP:
4'-fosfopanteteína adeniltransferasa (EC 2.7.7.3),
y defosfo-CoA kinasa (A.C. 2.7.1.24), para producir
la coenzima A.
Fig. 1 es el diagrama de una ruta para generar
3-HP y derivados del mismo a través de un
intermedio de beta-alanina, y para elaborar beta
alanina a partir de alfa-alanina.
Fig. 2 es el diagrama de una ruta para generar
beta-alanina.
Fig. 3 es el diagrama de una ruta para generar
coenzima A y pantotenato a partir de
beta-alanina.
Fig. 4 es una alineación de
2,3-aminomutasa de lisina de B., subtilis
tipo natural (KAM, ID de SEC. N.º: 31), y una forma transformada de
la misma que codifica una 2,3-aminomutasa de
alanina (ID de SEC. N.º: 21) Las sustituciones se muestran en
negrita. El motivo de enlace del grupo FE-S aparece
subrayado y el motivo de enlace PLP putativo se muestra en
cursiva.
Fig. 5 es una alineación de
2,3-aminomutasa de lisina de P. gingivalis
tipo natural (karn, IDD de SEC. N.º: 28), y una forma transformada
de la misma que codifica una 2,3-aminomutasa de
alanina (aam, ID de SEC. N.º: 30). Las sustituciones se muestran en
negrita. El motivo de enlace del grupo FE-S aparece
subrayado y el motivo de enlace PLP putativo se muestra en
cursiva.
Fig. 6 es una alineación de
2,3-aminomutasa de lisina de B. subtilis y
P. gingivalis tipo natural (kam, ID de SEC. N.º: 31 y 28), y
una forma transformada de las mismas que codifica una
2,3-aminomutasa de alanina (aam, ID de SEC. N.º: 21
y 30). Las sustituciones que poseen una ubicación común se muestran
en negrita.
Las secuencias de ácido nucleico y aminoácido
enumeradas en el listado de secuencias adjunto se indican mediante
abreviaturas de letras estándares para las bases nucleótidas, y
códigos de tres letras para los aminoácidos. Solamente se muestra
una hebra de cada secuencia de ácido nucleico, pero la hebra
complementaria se entiende según lo indicado por la referencia a la
hebra exhibida.
Identificación de SEC. N.º: 1 y 2 son cebadores
de PCR utilizados para clonar un gen de
2,3-aminomutasa de lisina de B. subtilis
(KAM).
Identificación de SEC. N.º: 3 es una secuencia
de ácido nucleico de un gen de KAM de B. subtilis.
Identificación de SEC. N.º: 4 y 5 son cebadores
de PCR usados para amplificar un gen CAT de pKD3.
Identificación de SEC. N.º: 6 y 7 son cebadores
de PCR usados para confirmar la inserción correcta del gen CAT en
el locus de panD.
Identificación de SEC. N.º: 8 y 9 son secuencias
de ácido nucleico de los cebadores usados para amplificar el gen
CAT de pKD3.
Identificación de SEC. N.º: 10 y 11 son
secuencias de ácido nucleico de los cebadores usados para generar
una mutación de L103M en el gen de 2,3-aminomutasa
de lisina de B. subtilis de tipo natural.
Identificación de SEC. N.º: 12 y 13 son
secuencias de ácido nucleico de los cebadores usados para generar
una mutación de M136V en el gen de 2,3-aminomutasa
de lisina de B. subtilis de tipo natural.
Identificación de SEC. N.º: 14 y 15 son
secuencias de ácido nucleico de los cebadores usados para generar
una mutación de D339H en el gen de 2,3-aminomutasa
de lisina de B. subtilis.
Identificación de SEC. N.º:
16-19, 26, 27 y 32 son secuencias de ácido nucleico
de los cebadores usados para clonar un gen de 3-HP
deshidrogenasa a partir del M3A de Alcaligenes faecalis.
Identificación de SEC. N.º: 20 es una secuencia
de ácido nucleico del ADN de 2,3-aminomutasa de
alanina.
Identificación de SEC. N.º: 21 es una secuencia
de aminoácido de una proteína de 2,3-aminomutasa de
alanina.
Identificación de SEC. N.º: 22 es una secuencia
de ácido nucleico del ADNc de la liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA
(ACL-1).
Identificación de SEC. N.º: 23 es una secuencia
de ácido nucleico de una proteína de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA
(ACL-1).
Identificación de SEC. N.º: 24 es una secuencia
de ácido nucleico del ADNc de CoA-transferasa.
Identificación de SEC. N.º: 25 es una secuencia
de aminoácido de una proteína de
CoA-transferasa.
Identificación de SEC. N.º: 28 es una secuencia
de aminoácido de KAM de P. gingivalis.
Identificación de SEC. N.º: 29 es una secuencia
de ácido nucleico de 2,3-aminomutasa de
alanina.
Identificación de SEC. N.º: 30 es una secuencia
de aminoácido de una proteína de 2,3-aminomutasa de
alanina.
Identificación de SEC. N.º: 31 es una secuencia
de aminoácido de KAM de B. subtilis.
Identificación de SEC. N.º: 33 es una secuencia
de ácido nucleico de un gen de 3-HP deshidrogenasa
de M3A de Alcaligenes faecalis.
Identificación de SEC. N.º: 34 es una secuencia
de aminoácido de un gen de 3-HP deshidrogenasa de
M3A de Alcaligenes faecalis.
Identificación de SEC. N.º:
35-37 son secuencias de ácido nucleico de los
cebadores usados para clonar liasa de amoniaco de
beta-alanina-CoA
(ACL-1 y ACL-2).
Identificación de SEC. N.º:
38-40 son secuencias de ácido nucleico de los
cebadores usadas para clonar CoA-transferasa de
E. coli.
Identificación de SEC. N.º:
41-48 son las secuencias de ácido nucleico de los
cebadores usados para generar operones 1 y 2 que incluyen genes de
ACL-1 o ACL-2,
CoA-transferasa y CoA-hidratasa.
\newpage
Identificación de SEC. N.º:
49-52 son secuencias de ácido nucleico de los
cebadores usados para generar el operón 3 que incluye genes de
4-aminobutirato aminotransferasa y
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa.
Identificación de SEC. N.º: 53 es una secuencia
de ácido nucleico del ADNc de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA
(ACL-2).
Identificación de SEC. N.º: 54 es una secuencia
de aminoácido de una proteína de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA
(ACL-2).
Identificación de SEC. N.º:
55-56 son secuencias de ácido nucleico de los
cebadores usados para amplificar el operón ATH-2
del plásmido
pATH-2-2-1.
Identificación de SEC. N.º:
57-58 son secuencias de ácido nucleico de los
cebadores usados para amplificar el operón ATD del plásmido
pATD.
Identificación de SEC. N.º:
59-60 son las secuencias de ácido nucleico de los
cebadores usados para amplificar una 2,3-aminomutasa
de alanina de B. subtilis.
Identificación de SEC. N.º:
61-62 son las secuencias de ácido nucleico de los
cebadores usados para amplificar un gen de aminotransferasa de
beta-alanina de rata.
Identificación de SEC. N.º:
63-64 son las secuencias de ácido nucleico de los
cebadores usados para amplificar la deshidrogenasa
3-HP del A. faecalis.
Identificación de SEC. N.º:
65-66 son las secuencias de ácido nucleico de los
cebadores usados para amplificar un gen de aminotransferasa de
alfa-alanina de rata.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes explicaciones de términos y
métodos se proporcionan para describir mejor la presente
divulgación y para orientar a los especialistas del área en la
práctica de la presente divulgación. Según se utiliza en el
presente documento, el término "abarcar" significa
"incluir" y los artículos singulares "un", "una" o
"el/la" incluye las referencias en plural, a menos que el
contexto indique expresamente lo contrario. Por ejemplo, la
referencia "que abarca una proteína" incluye una o un grupo de
dichas proteínas, y la referencia "que abarca la célula" hace
referencia a una o más células y los equivalentes de los mismos
conocidos por los especialistas, y así sucesivamente.
A menos que se indique lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos empleados en la presente
publicación tienen el mismo significado según el concepto aceptado
como válido por los especialistas en el área a quienes va dirigida
la presente divulgación. Si bien los métodos y los materiales
similares o equivalentes a los descritos en el presente documento
se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente
divulgación, los métodos y los materiales apropiados se describen a
continuación. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente
ilustrativos y no pretenden ser exhaustivos. Otras características
y ventajas de la divulgación se deducen de la siguiente descripción
detallada y de las declaraciones.
2,3-aminomutasa de alanina: Una
enzima que puede convertir alfa-alanina en
beta-alanina, p. ej. en una célula. Incluye
cualquier gen o proteína de 2,3-aminomutasa de
alanina, ADNc, ARN de cualquier organismo, tal como un organismo
procariota. En un ejemplo, una 2,3-aminomutasa de
alanina es una 2,3-aminomutasa de lisina
transformada o una 5,6-aminomutasa de lisina
transformada que tiene actividad de 2,3-aminomutasa
de alanina. Las 2,3-aminomutasas de lisina (o los
genes registrados en bases de datos genéticas como
2,3-aminomutasa de lisina) se pueden obtener a
partir de cualquier organismo, tal como un procariota, p. ej.
Bacillus subtilis, Deinococcus radiodurans, Clostridium
subterminale, Porphyromonas gingivalis o E. coli. y
transformados con cualquier método conocido de la
especialidad.
especialidad.
En determinados ejemplos, una secuencia de ácido
nucleico de 2,3-aminomutasa de alanina incluye la
secuencia indicada en la ID de SEC. N.º: 20 ó 29, o fragmentos,
variantes, o fusiones de los mismos que conservan la capacidad de
codificar un péptido o una proteína que tiene actividad de
2,3-aminomutasa de alanina. En otro ejemplo, una
proteína de 2,3-aminomutasa de alanina incluye la
secuencia de aminoácido indicada en la ID de SEC.: 21 ó 30, o las
variantes, los fragmentos, o las fusiones de los mismos que
conservan actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina.
alanina.
En otro ejemplo, una secuencia de
2,3-aminomutasa de alanina incluye una secuencia
tipo natural de longitud completa, tal como la ID de SEC.: 21 ó 30,
así como las secuencias más cortas que conservan la capacidad de
convertir alfa-alanina en
beta-alanina, tal como los aminoácidos 50 390 de la
ID de SEC. N.º: 21, los aminoácidos 101-339 de la
ID de SEC. N.º: 21, los aminoácidos 15-390 de la ID
de SEC. N.º: 30 y los aminoácidos 15-340 de la ID
de SEC. N.º 30. Esta descripción incluye variantes alélicas de
2,3-aminomutasa de alanina, así como cualquier otra
variante, fragmento o fusión de secuencia que conserve la capacidad
de convertir alfa-alanina en
beta-alanina.
2,3-aminomutasa de alanina: La
capacidad de la 2,3-aminomutasa de alanina de
convertir alfa-alanina en
beta-alanina. En un ejemplo, dicha actividad se
produce en una célula. En otro ejemplo, la actividad ocurre in
vitro. Dicha actividad se puede medir usando cualquier tipo de
análisis válido en la especialidad; p. ej. los ensayos de detección
y los ensayos de enzima descritos en los Ejemplos 6 y
9-11. Además, la enzima con actividad de
2,3-aminomutasa de alanina se puede identificar al
incubar la enzima con alfa-alanina o
beta-alanina y determinar los productos de la
reacción mediante la cromatografía líquida de alto rendimiento (por
ejemplo, mediante el método de Abe y col. J. Chromatography B,
712:43-9, 1998). En un ejemplo, es la capacidad de
una 2,3-aminomutasa de alanina de convertir
alfa-alanina en beta-alanina en un
mutante de E. coli suprimido funcionalmente para el gen de
panD.
Anticuerpo: Una molécula que incluye un punto de
unión al antígeno que une específicamente (reacciona
inmunológicamente frente a) un antígeno. Los ejemplos incluyen los
anticuerpos policlonales, los anticuerpos monoclonales, los
anticuerpos monoclonales humanizados o las partes inmunológicamente
eficaces de los mismos.
Incluye las moléculas de inmunoglobulina y las
partes inmunológicamente activas de las mismas. Los anticuerpos
naturales (p. ej. IgG) incluyen cuatro cadenas de polipéptidos, dos
cadenas pesadas (H) y dos cadenas livianas (L) interconectadas
mediante enlaces de disulfuro. Sin embargo, la función de unión a
un antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante los
fragmentos de un anticuerpo natural. Las partes inmunológicamente
eficaces de los anticuerpos monoclonales incluyen, entre otros:
partes de Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fabc y Fv (para obtener
una reseña, consulte Better y Horowitz, Methods. Enzymol 1989,
178:476-96). Otros ejemplos de fragmentos de unión a
un antígeno incluyen, entre otros: (i) un fragmento de Fab que
consiste en dominios de VL, VH, CL y CHI; (ii) un fragmento de Fd
que consiste en dominios de VH y CHI; (iii) un fragmento de Fv que
consiste en dominios de VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo,
(iv) un fragmento de dAb que consiste en un dominio de VH; (v) una
región de determinación de complementariedad (CDR) aislada; y (vi)
un fragmento de F(ab')2, un fragmento bivalente que abarca
dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la
región de enlace. Además, si bien los dos dominios del fragmento Fv
están cifrados por genes separados, se puede crear un enlazador
sintético que les permita constituir una sola cadena de proteína
(conocida como cadena simple de Fv (scFv)) mediante métodos
recombinantes. También se incluyen dichos anticuerpos de cadena
simple.
"Se une específicamente" se refiere a la
capacidad de un agente particular ("agente aglutinante
específico") de reaccionar específicamente frente a un analito
particular; por ejemplo, para inmunorreaccionar específicamente
frente a un anticuerpo, o de unirse específicamente a una secuencia
de péptido particular. La unión es una reacción aglutinante no
aleatoria, por ejemplo, entre una molécula de anticuerpo y un
determinante antigénico. La especificidad de unión de un anticuerpo
se determina generalmente desde el punto de referencia de la
capacidad del anticuerpo para unirse diferencialmente un antígeno
específico y un antígeno no afín, y, por tanto, distingue entre dos
antígenos diferentes, particularmente donde los dos antígenos
poseen epítopos únicos. Un anticuerpo que se une específicamente a
un epítopo particular se denomina como "anticuerpo
específico".
Los anticuerpos monoclonales o policlonales se
pueden transformar en un polipéptido de
2,3-aminomutasa de alanina (tal como la ID de SEC.
N.º: 21 ó 30), fragmentos de un polipéptido de
2,3-aminomutasa de alanina (tales como los
aminoácidos 50-390 de la ID de SEC. N.º: 21, p. ej.
los aminoácidos 101-339 de la ID de SEC. N.º: 21, o
los aminoácidos 15-390 de la ID de SEC. N.º: 30, p.
ej. los aminoácidos 15-331 de la ID de SEC. N.º:
30), o variantes, fusiones, o fragmentos de los mismos. De manera
óptima, los anticuerpos que reaccionan frente a uno o más epítopos
en un antígeno de polipéptido detectarán específicamente dicho
polipéptido. Es decir, los anticuerpos que reaccionan frente a un
polipéptido particular reconocerían y se unirían a dicho
polipéptido particular, y sustancialmente no reconocerían ni se
unirían a otros polipéptidos. La determinación del hecho de que un
anticuerpo se une específicamente a un polipéptido particular se
realiza mediante alguno de los numerosos métodos de inmunoensayo
estándares; p. ej. Western blotting (consulte, p. ej. Sambrook y
col. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol.
1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, 1989).
Para determinar si la preparación de un
anticuerpo (tal como una preparación producida en un ratón contra
un polipéptido de 2,3-aminomutasa de alanina, p.
ej. la ID de SEC. N.º: 21 ó 30) detecta específicamente el
polipéptido apropiado (p. ej. un polipéptido de
2,3-aminomutasa de alanina) mediante Western
blotting, la proteína celular completa se puede extraer de las
células y separarse usando electroforesis en gel de poliacrilamida
con SDS. La proteína celular total separada se puede transferir a
una membrana (p. ej. a la nitrocelulosa), y la preparación del
anticuerpo se puede incubar con la membrana. Después de lavar la
membrana para extraer los anticuerpos no unidos específicamente, la
presencia de anticuerpos unidos específicamente se puede detectar
al usar un anticuerpo secundario apropiado (p. ej. un anticuerpo
anti-ratón) conjugado con una enzima tal como
fosfatasa alcalina, ya que la aplicación de fosfato de 5
bromo-4-cloro-3-indolil/azul
de nitro-tetrazolio genera la producción de un
compuesto de color azul intenso mediante la fosfatasa alcalina
inmunolocalizada.
Los polipéptidos substancialmente puros, aptos
para su uso como inmunógenos, se pueden obtener a partir de células
transfectadas, células transformadas, o células de tipo natural.
Las concentraciones de polipéptidos en la preparación final se
pueden ajustar, p. ej. a través de la concentración en un
dispositivo de filtro Amicon, hasta el nivel de unos pocos
microgramos por mililitro. Además, los polipéptidos cuyo tamaño
varía desde longitud completa hasta aquellos que poseen solo nueve
residuos de aminoácido se pueden utilizar como inmunógenos. Tales
polipéptidos se pueden producir en cultivos celulares, se pueden
sintetizar químicamente mediante métodos estándares o se pueden
obtener al dividir los polipéptidos grandes en polipéptidos más
pequeños para purificarlos. Los polipéptidos que tienen únicamente
nueve residuos de aminoácido de longitud pueden ser inmunogénicos
cuando se introducen en un sistema inmune, en el contexto de una
molécula de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), tal como
una molécula MHC de clase I o clase II. Por consiguiente, los
polipéptidos que tienen al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25,
30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300,
350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000, 1050,
1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 o más residuos consecutivos de
aminoácido de un polipéptido de 2,3-aminomutasa de
alanina se pueden utilizar como inmunógenos para producir
anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales a cualquiera de los
polipéptidos descritos en la presente se pueden preparar a partir
de hibridomas murinos según el método clásico de Kohler y Milstein
(Nature 256:495, 1975) o un método derivado del mismo.
El antisuero policlonal que contiene anticuerpos
a los epítopos heterogéneos de cualquier polipéptido descrito en la
presente se puede preparar al inmunizar animales aptos con el
polipéptido (o el fragmento, la fusión, o la variante del mismo),
lo cual se puede modificar o no para mejorar la inmunogenicidad.
Para obtener un protocolo eficaz de inmunización para conejos,
consulte Vaitukaitis y col. (J. Clin. Endocrinol. Metab.
33:988-91, 1971).
Los fragmentos de anticuerpo se pueden utilizar
en lugar de los anticuerpos enteros y se pueden expresar fácilmente
en células huésped procarióticas. Los métodos de creación y uso de
porciones inmunológicamente eficaces de anticuerpos monoclonales,
también denominados "fragmentos de anticuerpo", son ampliamente
conocidos e incluyen los descritos en Better y Horowitz (Methods
Enzymol. 178:476-96, 1989), Glockshuber y col.
(Biochemistry 29:1362-7, 1990), patente US
5,648,237 ("Expression of Functional Antibody Fragments"),
patente US 4.946.778 ("Single Polypeptide Chain Binding
Molecules"), patente US 5.455.030 ("Immunotherapy Using Single
Chain Polypeptide Binding Molecules"), y las referencias citadas
en las mismas.
Antígeno: Un compuesto, una composición o una
sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una
respuesta de células T en un animal, incluidas las composiciones
que se administran; p. ej. inyectadas o absorbidas, a un animal. Un
antígeno reacciona con los productos de la inmunidad humoral o
celular específica, incluidos aquellos inducidos por los inmunógenos
heterólogos. El término "antígeno" incluye todos los epítopos
antigénicos relacionados.
ADNc (ADN complementario): Una sección de ADN
que carece de segmentos internos, no-codificantes
(intrones) y secuencias reguladoras que determinan la
transcripción. El ADNc se puede sintetizar en el laboratorio
mediante la transcripción inversa del ARN1 mensajero extraído de
las células.
Sustitución conservadora: Una o más
sustituciones de aminoácido (p. ej. 1, 2, 5 ó 10 residuos) para los
residuos de aminoácido que poseen características bioquímicas
similares. Típicamente, las sustituciones conservadoras tienen un
impacto mínimo o nulo en la actividad de un polipéptido resultante.
Por ejemplo, una sustitución conservadora es una sustitución de
aminoácido en un péptido de 2,3-aminomutasa de
alanina que no afecta sustancialmente la capacidad del péptido de
convertir alfa-alanina en
beta-alanina. En un ejemplo particular, una
sustitución conservadora es una sustitución de aminoácido en un
péptido de 2,3-aminomutasa de alanina, tal como una
sustitución conservadora en la ID de SEC. N.º: 21 ó 30, que no
altera de manera significativa la capacidad de la proteína para
convertir alfa-alanina en
beta-alanina. Los métodos que se pueden utilizar
para determinar actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina se describen en la presente (Ejemplos 6 y
9-11). Se puede utilizar un escaneo de alanina para
identificar los residuos de aminoácido en un péptido de
2,3-aminomutasa de alanina que pueden tolerar una
sustitución del aminoácido. En un ejemplo, la actividad de
2,3-aminomutasa de alanina no se altera en más del
25%, p. ej. no llega a un 20% o un 10%, cuando una alanina, o el
otro aminoácido conservador (tales como los enumerados a
continuación), se sustituye para uno o más aminoácidos nativos.
En un ejemplo, una sustitución conservadora se
incluye en el péptido, tal como la sustitución conservadora en la
ID de SEC. N.º: 21 ó 30. En otro ejemplo, se incluyen 10 o menos
substituciones conservadoras en el péptido; p. ej. cinco o menos.
Se puede producir un polipéptido que contenga una o más
sustituciones conservadoras al manipular la secuencia nucleotídica
que codifica ese polipéptido mediante el uso, p. ej. de
procedimientos estándares tales como la mutagénesis dirigida al
sitio o PCR. También se puede producir un polipéptido que contenga
una o más sustituciones conservadoras mediante métodos estándares
de síntesis de péptidos.
Las variantes sustitutivas son aquellas en las
cuales se ha eliminado al menos un residuo en la secuencia del
aminoácido y en su lugar se ha introducido un residuo diferente.
Los ejemplos de aminoácidos que se pueden sustituir por un
aminoácido original en una proteína y que se consideran como
sustituciones conservadoras incluyen: Ser para Ala; Lys para Arg;
Gin o His para Asn; Glu para Asp; Ser para Cys; Asn para Gin; Asp
para Glu; Pro para Gly; Asn o Gln para His; Leu o Val para Ile; Ile
o Val para Leu; Arg o Gln para Lys; Leu o Ile para Met; Met, Leu o
Tyr para Phe; Thr para Ser; Ser para Thr; Tyr para Trp; Trp o Phe
para Tyr; y Ile o Leu para Val.
Para obtener información adicional sobre las
sustituciones conservadoras, consulte, entre otras fuentes,
Ben-Bassat y col. (J Bacteriol.
169:751-7, 1987), O'Regan y col. (Gene
77:237-51, 1989), Sahin-Toth y
col., (Protein Sci 3:240-7, 1994), Hochuli y col.,
(Bio/Technology 6:1321-5, 1988), WO 00/67796 (Curd
y col.) y en libros de texto estándar sobre genética y biología
molecular.
Deleción: La extracción de una secuencia de
ácido nucleico, p. ej. ADN; las regiones de cualquier lado que se
unen.
Detectable: Capaz de tener una existencia o
presencia comprobada. Por ejemplo, la producción de
beta-alanina a partir de
alfa-alanina es detectable si la señal generada por
la beta-alanina es lo suficientemente fuerte como
para ser medida.
ADN: Ácido desoxirribonucleico. El ADN es un
polímero de cadena larga que abarca el material genético de la
mayoría de los organismos vivos (algunos virus poseen genes que
incluyen ácido ribonucleico, ARN). Las unidades de repetición en
los polímeros de ADN son cuatro nucleótidos diferentes, cada uno
abarcando una de las cuatro bases, adenina, guanina, citosina y
timina unidas a un azúcar desoxirribosa a la que se une un grupo de
fosfato. Tripletes de nucleótidos, denominados codones, en el
código de las moléculas de ADN para el amino-ácido en un
polipéptido. El término codón también se usa para las secuencias
correspondientes (y complementarias) a tres nucleótidos en el ARNm
en el que se transcribe la secuencia de ADN.
Exógeno: El término "exógeno", según se usa
aquí en referencia al ácido nucleico y a una célula particular, se
refiere a cualquier ácido nucleico que no se origine de dicha
célula particular en su estado natural. Así, un ácido nucleico no
producido naturalmente se considera exógeno a una célula, una vez
introducido en la célula. Un ácido nucleico producido naturalmente
también puede ser exógeno a una célula particular. Por ejemplo, un
cromosoma entero aislado de una célula de la persona X es un ácido
nucleico exógeno con respecto a la célula de la persona Y una vez
que el cromosoma se introduce en la célula de Y.
Deleción funcional: Una mutación, una deleción
parcial o completa, una inserción, u otra variación realizada en la
secuencia de un gen que inhibe la producción de producto del gen,
y/o hace que el producto del gen no sea funcional. Por ejemplo, la
deleción funcional del panD en E. coli previene la producción
de beta-alanina del aspartato a través del
aspartato decarboxilasa, que es codificado por el gen del panD.
Esta deleción funcional del panD en E. coli inactiva el
aspartato decarboxilasa da lugar a la inhibición del crecimiento
del E. coli en ausencia de beta-alanina o
pantotenato en el medio de crecimiento.
Funcionalmente equivalente: Que posee una
función equivalente. En el contexto de una molécula de
2,3-aminomutasa de alanina, las moléculas
funcionalmente equivalentes incluyen diversas moléculas que
conservan la función de la 2,3-aminomutasa de
alanina. Por ejemplo, los equivalentes funcionales se pueden obtener
mediante alteraciones de la secuencia en una
2,3-aminomutasa de alanina, en la que el péptido
con una o más alteraciones de secuencia conserva una función del
péptido inalterado, de manera tal que conserva su capacidad de
convertir alfa-alanina en
beta-alanina.
Los ejemplos de las alteraciones de secuencia
incluyen, entre otros, las sustituciones conservadoras, las
deleciones, las mutaciones, los desplazamientos de marco y las
inserciones. En un ejemplo, un polipéptido dado une un anticuerpo y
un equivalente funcional es un polipéptido que une el mismo
anticuerpo. Así un equivalente funcional incluye a los péptidos que
tienen la misma especificidad de unión que un polipéptido, y que
se pueden utilizar como reactivo en lugar de dicho polipéptido (p.
ej. en la producción del ácido pantoténico y 3-HP).
En un ejemplo, un equivalente funcional incluye un polipéptido en
el que la secuencia de unión es discontinua y en la que el
anticuerpo une un epítopo lineal. Así, si la secuencia del péptido
es MKNKWYKPKR (aminoácidos 1-10 de la ID de SEC.
N.º: 21), un equivalente funcional incluye los epítopos
discontinuos, que pueden aparecer de la siguiente manera
(**=cualquier cantidad de aminoácidos involucrados):
NH2-**-M**K**N**K**W**Y**K**P**K**R-COOH. En este
ejemplo, el polipéptido es funcionalmente equivalente a los
aminoácidos 1-10 de la ID de SEC. N.º: 21 si la
estructura tridimensional del polipéptido es tal que puede unir un
anticuerpo monoclonal que enlace los aminoácidos
1-10 de la ID de SEC. N.º: 21.
Hibridación: Método de prueba para la
complementariedad en la secuencia del nucleótido de dos moléculas
de ácido nucleico, basado en la capacidad del ADN o ARN
complementario de una hebra para formar una molécula doble. Las
técnicas de hibridación del ácido nucleico se pueden utilizar para
obtener un ácido nucleico aislado dentro del alcance de la
divulgación. En resumen, todo ácido nucleico que tenga cierta
homología con una 2,3-aminomutasa de alanina (tal
como la homología con la ID de SEC. N.º: 20 y 29, o las variantes o
los fragmentos de las mismas) se pueden utilizar como prueba para
identificar un ácido nucleico similar mediante la hibridación en
condiciones de restricciones medias a altas. Una vez identificado,
el ácido nucleico se puede purificar, ordenar en secuencia y
analizar para determinar si es una 2,3-aminomutasa
de alanina que tiene actividad de 2,3-aminomutasa
de alanina.
La hibridación se puede realizar mediante
Análisis Southern o Northern para identificar una secuencia de ADN
o ARN, respectivamente, que hibrida con una sonda. La sonda se
puede etiquetar, p. ej. con una biotina, un fluoróforo,
digoxigenina, una enzima o un radioisótopo, tal como el ^{32}P.
El ADN o el ARN que se analizará se puede separar
electroforéticamente en un gel de agarosa o poliacrilamida,
transferir a la nitrocelulosa, al nylon, o a otra membrana
adecuada, e hibridar con la sonda mediante técnicas estándares
conocidas en la materia, tal como las descritas en las secciones
7.39-7.52 de Sambrook y col. (1989) Molecular
Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview,
NY. Generalmente, una sonda posee al menos cerca de 20 nucleótidos
de longitud. Por ejemplo, una sonda que incluye 20 nucleótidos
contiguos de una 2,3-aminomutasa de alanina (tal
como los 20 nucleótidos contiguos de la ID de SEC. N.º: 20 ó 29) se
pueden utilizar para identificar un ácido nucleico idéntico o
similar. Además, se pueden utilizar las sondas más largas o las que
incluyen menos de 20 nucleótidos.
La divulgación también proporciona las
secuencias aisladas del ácido nucleico que son de al menos 12 bases
de longitud (por ejemplo, al menos unas 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1400, 2000, 3000,
4000 ó 5000 bases de longitud) e hibridan, en condiciones de
hibridación, la hebra de sentido o antisentido de una secuencia de
ácido nucleico de 2,3-aminomutasa de alanina, p.
ej. la ID de SEC. N.º: 20 ó 29). Las condiciones del hibridación
pueden ser moderadas o altamente restrictivas.
Las condiciones restrictivas moderadas de la
hibridación se dan cuando la hibridación se realiza a aprox. 42ºC
en una solución de hibridación que contiene 25 mM KPO_{4} (pH
7,4), 5X SSC, solución de Denhart 5X, 50 \mug/mL de ADN de
esperma de salmón desnaturalizado y sometido a ultrasonido, 50% de
formamida, 10% de sulfato de dextrano, y una sonda de
1-15 ng/ml (aprox. 5x10^{7} cpm/\mug), mientras
que los lavados se realizan a aprox. 50ºC con una solución de
lavado que contiene 2X SSC y 0,1% de dodecil sulfato sódico.
Las condiciones restrictivas altas de la
hibridación se dan cuando la hibridación se realiza a
aproximadamente 42ºC en una solución de hibridación que contiene 25
mM KPO_{4} (pH 7,4), 5X SSC, solución de Denhart 5X, 50 \mug/mL
de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sometido a
ultrasonido, 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, y una
sonda de 1-15 ng/ml (aprox. 5x10^{7} cpm/\mug),
mientras que los lavados se realizan a aprox. 65ºC con una solución
de lavado que contiene 0,2X SSC y 0,1% de dodecil sulfato
sódico.
Aislado: Un componente biológico "aislado"
(tal como una molécula o proteína de ácido nucleico) se ha separado
o purificado substancialmente, lejos de otros componentes
biológicos en la célula del organismo en el cual el componente se
genera naturalmente; es decir, otros ADN y ARN cromosómicos y
extracromosómicos y proteínas. Los ácidos nucleicos y las proteínas
que se han "aislado" incluyen ácidos nucleicos y proteínas
purificadas mediante métodos de purificación estándares. El término
también abarca los ácidos nucleicos y las proteínas preparados por
expresión recombinante en una célula huésped, además de los ácidos
nucleicos, las proteínas y los péptidos químicamente
sintetizados.
En un ejemplo, el término "aislado" se
refiere a un ácido nucleico natural que no es inmediatamente
contiguo a ambas secuencias con las cuales está inmediatamente
contiguo (una en el extremo de 5' extremo y otra en el extremo de
3') en el genoma natural del organismo del cual deriva. Por
ejemplo, un ácido nucleico aislado puede ser, sin limitación, una
molécula recombinante de ADN de cualquier longitud, siempre que una
de las secuencias de ácido nucleico normalmente ubicada
inmediatamente adyacente a la molécula recombinante de ADN en un
genoma natural se haya extraído o no esté presente. Así, un ácido
nucleico aislado incluye, sin limitación, un ADN recombinante que
existe como molécula autónoma (p. ej. un ADNc o un fragmento
genómico de ADN producido por PCR o tratamiento por endonucleasa de
restricción) independiente de otras secuencias, así como el ADN
recombinante que se incorpora en un vector, un plásmido autónomo
que se replica automáticamente, un virus (p. ej. un retrovirus,
adenovirus o un herpes), o en el ADN genómico de un procariota o un
eucariota. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir una
molécula de ADN recombinante que forma parte de una secuencia de
ácido nucleico híbrido o producto de una fusión.
En un ejemplo, el término "aislado" según
se utiliza en relación al ácido nucleico también incluye todo ácido
nucleico que no se produce naturalmente, ya que las secuencias de
ácido nucleico que no se producen naturalmente no se encuentran en
la naturaleza ni poseen secuencias inmediatamente contiguas en un
genoma natural. Por ejemplo, el ácido nucleico que no se produce
naturalmente, tal como un ácido nucleico diseñado, se considera
como ácido nucleico aislado. El ácido nucleico diseñado se puede
crear mediante clonación molecular o técnicas químicas comunes de
síntesis de ácido nucleico. El ácido nucleico aislado que no se
produce naturalmente puede ser independiente de otras secuencias, o
puede estar incorporado en un vector, un plásmido que se replique
de forma autónoma, un virus (p. ej. un retrovirus, un adenovirus o
un herpes), o el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además,
un ácido nucleico aislado que no se produce naturalmente puede
incluir una molécula de ADN recombinante que forma parte de una
secuencia de ácido nucleico híbrido o producto de una fusión.
2,3-aminomutasa de leucina: Una
enzima que puede convertir alfa-leucina en
beta-leucina. Incluye cualquier gen, ADNc, ARN o
proteína de 2,3-aminomutasa de leucina de cualquier
organismo, tal como un procariota o un eucariota; p. ej. de ratas,
del ser humano, del pollo o del Clostridium sporogenes (Poston,
Biol del J. Quím. 251:1859-63, 1976). Esta
descripción incluye las variantes alélicas de la
2,3-aminomutasa de leucina, así como todas las
variantes, los fragmentos o las secuencias de proteínas de fusión
que conservan la capacidad de convertir
alfa-leucina en beta-leucina.
2,3-aminomutasa de leucina: Una
enzima que puede convertir alfa-leucina en
beta-leucina. Incluye cualquier gen, ADNc, ARN o
proteína de 2,3-aminomutasa de lisina de cualquier
organismo, tal como un procariota, p. ej. Bacillus subtilis,
Deinococcus radiodurans, Clostridium subterminale, Porphyromonas
gingivalis, Aquifex aeolicus, Haemophilus influenzae o E.
coli. Esta descripción incluye las variantes alélicas de la
2,3-aminomutasa de lisina, así como cualquier
variante, fragmento o secuencia de fusión que conserve la capacidad
de convertir alfa-lisina en
beta-lisina. En un ejemplo, incluye los polipéptidos
codificados por los genes registrados como
2,3-aminomutasa de lisina en bases de datos
públicas de secuencias de ADN, tales como GenBank.
Ácido nucleico: Abarca el ARN y el ADN incluido,
entre otros, el ADNc, el ADN genómico y el ADN sintético (p. ej.
químicamente sintetizado). El ácido nucleico puede ser de hebra
doble o simple. Si es de hebra simple, el ácido nucleico puede ser
la hebra de sentido o de antisentido. Además, el ácido nucleico
puede ser circular o lineal.
Oligonucleótido: Una secuencia lineal
polinucleótida (tal como el ADN o ARN) de al menos 9 nucleótidos,
por ejemplo, de al menos 15, 18, 24, 25, 27, 30, 50, 100 o incluso
200 nucleótidos de longitud.
Funcionalmente enlazado: Una primera secuencia
de ácido nucleico está funcionalmente enlazada con una segunda
secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia se coloca
en una relación funcional con respecto a la segunda. Por ejemplo,
un promotor está funcionalmente enlazado a una secuencia de
codificación si el promotor afecta la transcripción o la expresión
de la secuencia de codificación. Generalmente, las secuencias de
ADN funcionalmente enlazadas son contiguas y, donde resulta
necesario para unir dos regiones de codificación de proteína, en la
misma estructura de lectura.
ORF (estructura de lectura abierta): Una serie
de tripletes de nucleótidos (codones) que codifican los aminoácidos
sin alguno de los codones de finalización. Estas secuencias
generalmente se traducen en un péptido.
Pantotenato o ácido pantoténico: Una vitamina
comercialmente importante que se utiliza en cosméticos, medicina y
nutrición. Los términos ácido pantoténico y pantotenato se utilizan
indistintamente en la presente divulgación, y se refieren no sólo
al ácido libre sino también a las sales del ácido
D-pantoténico, tales como la sal de calcio, la sal
del sodio, la sal de amonio o la sal del potasio. El pantotenato se
puede producir por síntesis química o biotecnológicamente a partir
de la beta-alanina, mediante las células y los
métodos aquí divulgados.
Los métodos para medir la cantidad de
pantotenato son conocidos en el área de la especialidad (p. ej.
consultar la patente US 6,184,006 de Rieping y col. y la US
6,177,264 de Eggeling y col.). Por ejemplo, la determinación
cuantitativa del D-pantotenato se puede realizar
mediante el ensayo de pantotenato del Lactobaciltus
plantarum (cepa del ensayo: Lactobaciltus plantarum ATCC
8014, N.º de cat. 3211-30-3; medio
de cultivo: Bacto para medio de ensayo de pantotenato (DIFCO
Laboratories, Michigan, EE. UU.), Nº cat.
0604-15-3). Esta cepa indicadora
puede crecer solamente en presencia del pantotenato en el medio de
cultivo indicado y exhibe una dependencia fotométrica mensurable y
lineal del crecimiento con la concentración del pantotenato en el
medio. La sal de hemicalcio de pantotenato se puede utilizar para
la calibración (número de catálogo Sigma P 2250). La densidad
óptica se puede determinar en una longitud de onda de 580 nm.
Modificaciones del péptido: La presente
divulgación incluye los péptidos de 2,3-aminomutasa
de alanina, así como realizaciones sintéticas. Además, los análogos
(moléculas orgánicas del no-péptido), derivados
(moléculas de péptidos químicamente funcionalizadas obtenidas
comenzando por las secuencias de péptidos descritas) y las
variantes (homólogos) que tienen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina se pueden utilizar en los
métodos aquí descritos. Los péptidos descritos en la presente
incluyen una secuencia de aminoácidos que pueden ser aminoácidos L
y/o D, que se producen naturalmente y de otra manera.
Los péptidos se pueden modificar mediante una
variedad de técnicas químicas para producir los derivados que
poseen esencialmente la misma actividad que los péptidos sin
modificar y que opcionalmente tienen otras características
deseables. Por ejemplo, los grupos del ácido carboxílico de la
proteína, ya sea carboxilo terminal o de cadena lateral se pueden
proporcionar bajo la forma de una sal de un catión
farmacéuticamente aceptable o esterificar para formar un éster de
C_{1}-C_{16}, o convertir en una amida de
fórmula NR_{1}R_{2}, donde R_{1} y R_{2} son
independientemente de H o C_{1}-C_{16} alquilo
o combinar para formar un anillo heterocíclico, tal como el anillo
de 5 ó 6 miembros. Los grupos aminos del péptido, ya sean amino
terminales o de cadena lateral, pueden estar bajo la forma de una
sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable, como HCI, HBr,
acéticas, benzoecas, tolueno sulfónicas, maleicas, tartáricas u
otras sales orgánicas, o se pueden modificar para formar amino
alquilo o dialquilo de C_{1}-C_{16}, o incluso
convertir en una amida.
Los grupos de hidroxilo de las cadenas laterales
del péptido se pueden convertir en alcoxi
C_{1}-C_{16} o en éster de
C_{1}-C_{16} mediante técnicas conocidas. Los
anillos fenilos y fenólicos de las cadenas laterales del péptido se
pueden sustituir por uno o más átomos halógenos, tales como F, Cl,
Br o I, o por alquilo de C_{1}-C_{16}, alcoxi
de C_{1}-C_{16}, ácidos carboxílicos y ésteres
de los mismos, o amidas de dichos ácidos carboxílicos. Los grupos
metileno de las cadenas laterales del péptido se pueden extender a
los alquilenos homólogos C_{2}-C_{4}. Los tioles
se pueden proteger con cualquiera de los grupos de protección
conocidos, tales como los grupos de acetamida. Los expertos en la
materia también reconocerán los métodos para introducir las
estructuras cíclicas en los péptidos de la presente divulgación
para seleccionar y proporcionar las restricciones conformacionales
de la estructura que da lugar a una estabilidad mejorada. Por
ejemplo, una cisteína de terminal C o N se puede agregar al
péptido, de manera que cuando se oxide, el péptido contenga un
enlace de disulfuro y genere un péptido cíclico. Otros métodos de
ciclización del péptido incluyen la formación de tioésteres y
amidas y ésteres de terminal carboxilo y amino.
Las realizaciones peptidomiméticas y
organomiméticas también están dentro del alcance de la presente
divulgación, por lo que la disposición tridimensional de los
componentes químicos de dichas realizaciones peptidomiméticas y
organomiméticas imitan la disposición tridimensional de las
columnas de péptidos y las cadenas laterales de aminoácido del
componente, lo que da lugar a la realización peptidomimética y
organomimética de las proteínas de la invención con actividad
detectable de 2,3-aminomutasa de alanina. Para las
aplicaciones de modelos computarizados, un farmacóforo es una
definición idealizada y tridimensional de los requisitos
estructurales para la actividad biológica. Las realizaciones
peptidomiméticas y organomiméticas se pueden diseñar a la medida de
cada farmacóforo mediante el software de modelado actual (mediante
el diseño de fármacos asistido por ordenador o CADD). Consulte a
Walters, "Computer Assisted Modeling of Drugs", en Klegerman y
Groves, eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press:
Buffalo Grove, IL, pp. 165-174 y Principles of
Pharmacology Munson (ed.) 1995, Ch 102, para obtener las
descripciones de las técnicas usadas en CADD. También se incluye
dentro del alcance de la divulgación los miméticos preparados
mediante dichas técnicas. En un ejemplo, un mimético imita la
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina generada por
una 2,3-aminomutasa de alanina o una variante,
fragmento, o fusión de las mismas.
Polinucleótido: Una secuencia lineal del ácido
nucleico de cualquier longitud. Por lo tanto, un polinucleótido
incluye las moléculas que poseen al menos cerca de 15, 25, 50, 75,
100, 200 ó 400 (oligonucleótidas) y también nucleótidos junto con
ADNc de longitud completa.
Sondas y cebadores: Una "sonda" incluye un
ácido nucleico aislado que contiene un marcador detectable o una
molécula indicadora. Los marcadores típicos incluyen los isótopos
radioactivos, los ligandos, los agentes quimioluminiscentes, los
fluoróforos y las enzimas. Los métodos para marcar y guiar en la
opción de las etiquetas apropiadas para los diferentes propósitos
se analizan en, por ejemplo, Sambrook y col.(ed.), Molecular
Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed., vol. 1-3, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, y
Ausubel y col. (ed.) Current Protocols in Molecular Biology,
Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York
(con actualizaciones periódicas), 1987.
Los "cebadores" son moléculas de ácido
nucleico típicas que tienen diez o más nucleótidos (por ejemplo,
moléculas de ácido nucleico con alrededor de 10 nucleótidos y cerca
de 100 nucleótidos). Una cebador se puede hibridar a una hebra de
ácido nucleico complementario diana mediante la hibridación del
ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la hebra
del ácido nucleico de destino, y después extender a lo largo de la
hebra de ácido nucleico diana mediante, por ejemplo, una enzima de
polimerasa de ADN. Los pares de cebadores se pueden utilizar para
la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo,
por la reacción de una cadena de polimerasa (PCR) u otros métodos
de amplificación del ácido nucleico.
Los métodos para preparar y usar sondas y
cebadores se describen, p. ej. en la publicaciones tales como
Sambrook y col.(ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
ed., vol., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel y col. (ed.),
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and
Wiley-Interscience, New York (con actualizaciones
periódicas), 1987; y Innis y col., PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Los
pares de cebadores de PCR se pueden derivar de una secuencia
conocida, p. ej. mediante los programas informáticos previstos a
tal fin, como Primer (versión 0.5, © 1991, Whitehead Institute for
Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Los expertos en la materia
apreciarán que la especificidad de una sonda o de una cebador
particular aumenta con la longitud, pero una sonda o un cebador
puede variar de tamaño desde una secuencia de longitud completa
hasta las secuencias reducidas como las de cinco nucleótidos
consecutivos. Así p. ej., un cebador de 20 nucleótidos consecutivos
puede hibridar un compuesto diana con una especificidad más alta
que una cebador correspondiente de solamente 15 nucleótidos. Así,
para obtener mayor especificidad, las sonas y los cebadores pueden
seleccionarse de manera que abarquen p. ej. 25, 30, 35, 40, 50, 60,
70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600,
650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200,
1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 o más nucleótidos
consecutivos.
Promotor: Una selección de secuencias de control
de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un ácido
nucleico. Un promotor incluye las secuencias necesarias del ácido
nucleico cerca del punto de inicio de la transcripción, p. ej. en
el caso de un promotor tipo II de la polimerasa, un elemento TATA.
Un promotor también incluye opcionalmente los elementos
potenciadores o represores distales que se pueden ubicar a varios
miles de pares básicos desde el punto de inicio de la
transcripción.
Purificado: El término purificado no significa
pureza absoluta, sino que se utiliza como un término relativo. Así
p. ej., una preparación purificada de un péptido es aquella en la
cual el péptido o la proteína está más enriquecida que el péptido,
o la proteína en su entorno dentro de la célula, de manera que el
péptido está sustancialmente separado de los componentes celulares
(ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos y otros polipéptidos) que
pueden acompañarlo. En otro ejemplo, una preparación purificada del
péptido es aquella en la cual el péptido está sustancialmente libre
de sustancias contaminantes, tales como las que pudieran estar
presentes después de la síntesis química del péptido.
En un ejemplo, se purifica un péptido de
2,3-aminomutasa de alanina cuando al menos el 50%
del peso de una muestra se compone del péptido; por ejemplo, cuando
al menos el 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% o más de
una muestra se compone del péptido. Los ejemplos de los métodos que
se pueden utilizar para purificar un antígeno incluyen, entre
otros, los métodos descritos en Sambrook y col. (Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Ch 17). La
pureza de la proteína se puede determinar mediante, p. ej. la
electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína,
seguida por la visualización de una sola banda de polipéptido al
realizar la tinción del gel de poliacrilamida; la cromatografía
líquida de alta presión; el ordenamiento en secuencia; otros
métodos convencionales.
Recombinante: Un ácido nucleico recombinante es
aquel que tiene una secuencia que no se produce naturalmente y/o
que se fabricó mediante una combinación artificial de dos segmentos
de secuencia separados mediante algún otro método. Esta combinación
artificial a menudo se logra mediante la síntesis química o, más
comúnmente, por la manipulación artificial de segmentos aislados de
ácidos nucleicos; por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería
genética. Recombinante también se utiliza para describir las
moléculas de ácido nucleico que se han manipulado artificialmente,
pero que contienen las mismas secuencias reguladoras y regiones de
codificación que se encuentran en el organismo del cual se aisló el
ácido nucleico.
Homología/semejanza de la secuencia: La
homología/semejanza entre dos o más secuencias de ácido nucleico, o
dos o más secuencias de aminoácidos se expresa en términos de
homología o semejanza entre las secuencias. La homología de la
secuencia se puede medir en términos de porcentaje de homología:
cuanto más alto es el porcentaje, más idénticas serán las
secuencias. La semejanza de la secuencia se puede medir en términos
de porcentaje de semejanza (el cual considera las sustituciones
conservadoras de aminoácido); cuanto más alto es el porcentaje, más
similares serán las secuencias. Los homólogos u ortólogos de las
secuencias de ácido nucleico o aminoácido poseen un grado
relativamente alto de homología/semejanza de la secuencia cuando
están alineados mediante métodos estándares. Esta homología es más
significativa cuando las proteínas o los ADNc ortólogos se derivan
de las especies que guardan una relación más cercana (p. ej. las
secuencias de humanos y ratones), en comparación con las especies
que no guardan una relación tan cercana (p. ej. las secuencias de
humanos y C. elegans).
Los métodos de alineación de las secuencias para
la comparación son conocidos en la materia. Los diversos programas
y algoritmos de alineación se describen en: Smith y Waterman, Adv.
Appl Math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443,
1970; Pearson y Lipman, Proc Nati. Acad Set EE.UU. 85: 2444, 1988;
Higgins y Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins y
Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet y col., Nuc.
Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang y col. Computer
Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; y
Pearson y col., Meth. Mol. Bio. 24: 307-31,1994.
Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-10.1990,
presentan un análisis detallado de los métodos de alineación de
secuencia y cálculos de homología.
La herramienta NCBI Basic Local Alignment Search
Tool (BLAST) (Altschul y col., J. Mol.
Biol.215:403-10, 1990) está disponible en diversas
fuentes, incluido el National Center for Biological Information
(NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805,
Bethesda, MD 20894) y en Internet, para su uso en conjunto con los
programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn
y tblastx. Para obtener información adicional, consulte el sitio
web de la NCBI.
BLASTN se utiliza para comparar secuencias de
ácido nucleico, mientras que BLASTP se utiliza para comparar
secuencias de aminoácido. Para comparar dos secuencias de ácido
nucleico, las opciones se pueden configurar de la siguiente manera:
- i se configura como un archivo que contiene la primera secuencia
de ácido nucleico que se comparará (p. ej. C:\seq1.txt); - j se
configura como un archivo que contiene la segunda secuencia de
ácido nucleico que se comparará (p. ej. C:\seq2.txt); - p se
configura como blastn; - o se establece con cualquier nombre de
archivo (p. ej. C:\output.txt); - q se configura como - 1; - r se
configura como 2; y el resto de las opciones se mantienen con la
configuración predeterminada. Por ejemplo, el comando siguiente se
puede utilizar para generar un archivo de salida que contiene una
comparación entre dos secuencias: C:\B12seq -i c:\seq1.txt -j
c:\seq2.txt -p blastn -o
c:\output.txt -q -1 -r 2.
c:\output.txt -q -1 -r 2.
Para comparar dos secuencias de ácido nucleico,
las opciones de BI2seq se pueden configurar de la siguiente manera:
- i se configura como un archivo que contiene la primera secuencia
de aminoácido que se comparará (p. ej. C:\seq1.txt); - j se
configura como un archivo que contiene la segunda secuencia de
aminoácido que se comparará (p. ej. C:\seg2.txt); - p se configura
como blastp; - o se configura con cualquier nombre de archivo (p; e.
C:\output.txt); y el resto de las opciones se mantiene con la
configuración predeterminada. Por ejemplo, el siguiente comando se
puede utilizar para generar un archivo de salida que contiene una
comparación entre dos secuencias de aminoácido: C:\B12seq -i
C:\seq1.txt -j C:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt Si las dos
secuencias comparadas comparten la homología, entonces el archivo
de salida designado presentarán dichas regiones de la homología
como secuencias alineadas. Si las dos secuencias comparadas no
comparten la homología, entonces el archivo de salida designado no
presentará secuencias alineadas.
Una vez hecha la alineación, la cantidad de
coincidencias se determinará en función del número de posiciones en
las que existe un residuo de nucleótido o aminoácido idéntico en
ambas secuencias. El porcentaje de homología de la secuencia se
determina al dividir la cantidad de coincidencias por la longitud
de la secuencia establecida en la secuencia identificada, o por una
longitud articulada (p. ej. 100 residuos de nucleótidos o
aminoácidos consecutivos para una secuencia establecida en una
secuencia identificada), y después al multiplicar el valor obtenido
por 100. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que tiene
1166 coincidencias al alinearse con una secuencia de prueba que
tiene 1154 nucleótidos tiene un 75% de homología con respecto a la
secuencia de prueba (es decir, 1166-1554 *
100=75,0). El valor del porcentaje de homología de la secuencia se
redondea hasta el valor decimal más cercano. Por ejemplo, 75,11,
75,12, 75,13 y 75,14 se redondean hacia abajo hasta 75,1, mientras
que 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 y 75 19 se redondean a 75,2. El
valor de la longitud será siempre un número entero. En otro
ejemplo, una secuencia diana que contiene una región de 20
nucleótidos y que se alinea con 20 nucleótidos consecutivos de una
secuencia identificada de la siguiente manera contiene una región
que comparte un 75% de homología con la secuencia identificada (es
decir, 15-20*100=75).
Para las comparaciones de secuencias de
aminoácido de más de 30 aminoácidos, se emplea la función de
secuencias Blast 2 mediante la matriz predeterminada BLOSUM62
configurada con los parámetros predeterminados, (coste de intervalo
de existencia de 11 y coste por intervalo residual de 1). Los
homólogos se caracterizan generalmente por tener al menos un 70% de
homología de secuencia calculada en la alineación de longitud
completa con una secuencia de aminoácido mediante Basic Blast 2.0
de NCBI, blastp con intervalo, con bases de datos tales como la
base de datos nr o swissprot. Las consultas realizadas con el
programa blastn se filtran con DUST (Hancock y Armstrong, 1994,
Comput. Appl. Bioscl.10:67-70). Otros programas
utilizan SEG. Además, se puede realizar una alineación manual. Las
proteínas con mayor semejanza mostrarán mayores porcentajes de
homología cuando se determinen mediante este método; p. ej. al
menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de homología de
secuencia.
Al alinear péptidos cortos (menos de 30
aminoácidos), la alineación debe realizarse con la función de
secuencias de Blast 2, mediante la matriz PAM30 con los parámetros
predeterminados (intervalo abierto 9, penalizaciones por extensión
de intervalo 1). Las proteínas con incluso mayor semejanza con la
secuencia de referencia mostrarán mayores porcentajes de homología
cuando se determinen mediante este método; p. ej. al menos un 60%,
70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de homología de secuencia.
Cuando se compara menos que la secuencia entera para determinar la
homología, los homólogos mostrarán generalmente un 75% de homología
en las escalas reducidas de 10-20 aminoácidos, y
pueden mostrar homologías de secuencia de al menos 85%, 90%, 95% o
98%, según la homología con respecto a la secuencia de referencia.
Los métodos para determinar la homología de la secuencia en escalas
reducidas se describen en el sitio web de la NCBI.
Una indicación de que dos moléculas de ácido
nucleico están relacionadas estrechamente es que las dos moléculas
se hibridan entre sí en condiciones restrictivas. Las condiciones
restrictivas dependen de las secuencias y son diferentes bajo
distintos parámetros ambientales. Las moléculas de ácido nucleico
que hibridan en condiciones restrictivas a una secuencia de un gen
de 2,3-aminomutasa de alanina generalmente se
hibridan a una sonda basada en un gen completo de
2,3-aminomutasa de alanina o partes seleccionadas
del gen, respectivamente, en las condiciones descritas
anteriormente.
Las secuencias de ácido nucleico que no
demuestran un alto grado de identidad pueden, sin embargo,
codificar secuencias de aminoácido idénticas o similares
(conservadas), debido a la degeneración del código genético. Los
cambios en una secuencia de ácido nucleico se pueden realizar
usando esta degeneración para producir las moléculas múltiples del
ácido nucleico que codifican sustancialmente la misma proteína.
Tales secuencias homólogas de ácido nucleico pueden, p. ej. poseer
al menos la identidad de la secuencia del 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,
98%, o del 99% determinada con este método.
Cualquier experto en la materia apreciará que
estos rangos de identidad de la secuencia se proporcionan solo para
fines de orientación; es posible que puedan obtenerse homólogos
altamente significativos que se encuentren fuera de los rangos
proporcionados.
Una indicación alternativa (y no necesariamente
acumulativa) que dos secuencias de ácido nucleico son
sustancialmente idénticas es que el polipéptido que el primer ácido
nucleico codifica presenta reacción cruzada mediada
inmunológicamente con el polipéptido codificado por el segundo
ácido nucleico.
Agente aglutinante específico: Un agente que se
une sustancialmente solamente a una diana definida, tal como un
péptido diana. Por ejemplo, un agente aglutinante de
2,3-aminomutasa de alanina incluye los anticuerpos
de 2,3-aminomutasa antialanina y otros agentes
(tales como péptidos o fármacos) que se unen sustancialmente solo a
2,3-aminomutasa de alanina. Los anticuerpos a una
proteína de 2,3-aminomutasa de alanina (o a
fragmentos de las mismas) se pueden utilizar para purificar o
identificar tal proteína.
Transformado: Una célula en la que se ha
introducido una molécula de ácido nucleico, p. ej. mediante
técnicas moleculares biológicas. Según se utiliza en esta memoria,
el término transformación abarca todas las técnicas mediante las
cuales una molécula de ácido nucleico se puede introducir en dicha
célula, incluyendo, entre otros, la transfección con vectores
virales, la conjugación, la transformación con vectores plásmidos y
la introducción del ADN desnudo por electroporación, lipofección y
aceleración de la pistola de la partícula.
Variantes, fragmentos o proteínas de fusión: Las
proteínas de 2,3-aminomutasa de alanina divulgadas
incluyen variantes, fragmentos y fusiones de las mismas. Las
secuencias de ADN que codifican una proteína (p. ej. ID. SEC. N.º.:
20 ó 29), la proteína 2,3-aminomutasa de alanina de
fusión, o un fragmento o una variante de una proteína
2,3-aminomutasa de alanina, se pueden diseñar para
permitir que la proteína se exprese en células eucarióticas,
bacterias, insectos, y/o plantas. Para obtener la expresión, la
secuencia de ADN se puede alterar y enlazar funcionalmente a otras
secuencias reguladoras. El producto final, que contiene las
secuencias reguladoras y la proteína, se conocen como vector. Este
vector se puede introducir en células eucarióticas, de bacterias,
insectos y/o plantas. Una vez dentro de la célula, el vector
permite la introducción de la proteína.
Una proteína de fusión, incluyendo una proteína,
como p. ej. 2,3-aminomutasa de alanina (o variante,
polimorfismo, mutante o fragmento de la misma), p. ej. ID. SEC.
N.º.: 21 ó 30, enlaza a otras secuencias de aminoácidos que no
inhiben la actividad deseada de la 2,3-aminomutasa
de alanina, p. ej. la capacidad de convertir el
alfa-alanina a beta-alanina. En un
ejemplo, las demás secuencias de aminoácido no son más de 10, 12,
15, 20, 25, 30 ó 50 aminoácidos en longitud.
Cualquier persona experta en la materia
apreciará que una secuencia de ADN puede alterarse de numerosas
maneras sin afectar la actividad biológica de la proteína
codificada. Por ejemplo, se puede utilizar la RCP para generar
variaciones en la secuencia del ADN que codifica una
2,3-aminomutasa de alanina. Dichas variantes pueden
optimizarse debido a preferencia codónica en una célula huésped
usada para expresar la proteína, u otros cambios de la secuencia
que faciliten la expresión.
Vector: Una molécula de ácido nucleico según se
introduce en una célula, produciendo de ese modo una célula
transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico
que le permiten replicarse en la célula, tal como un origen de la
replicación. Un vector también puede incluir unos o más genes
marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en
la materia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos que tienen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina se divulgan en la
presente memoria descriptiva. En un ejemplo, el polipéptido es una
secuencia transformada del aminoácido del aminomutasa, tal como una
secuencia de 2,3-aminomutasa de lisina,
2,3-aminomutasa de leucina o
5,6-aminomutasa de lisina. Los ejemplos de un
polipéptido que tiene actividad de 2,3-aminomutasa
de alanina se muestran en ID. SEC. N.º: 21 y 30. Sin embargo, la
divulgación también abarca variantes, fusiones y fragmentos de ID.
SEC. N.º: 21 y 30 que conservan actividad de
2,3-aminomutasa de alanina. Entre los ejemplos de
los fragmentos que pueden utilizarse se incluyen, entre otros:
aminoácidos 50-390, 50-350,
60-350, 75-340 ó
100-339 del ID. SEC. N.º.: 21 y aminoácidos
1-390, 15-390,
15-340 ó 19-331 del ID. SEC. N.º.:
30. Ejemplos de las sustituciones que pueden realizarse, mientras
se conserva la actividad de la 2,3-aminomutasa de
alanina, incluyen, entre otros: V21I o V2U.; Y71P; L171; K361R;
A4I0V; y/o Y430F o Y430W del ID. SEC. N.º.: 21 y T40S; V96I o V96L;
D102E; A252V; y/o L393V del ID. SEC. N.º.: 30, así como
combinaciones de las mismas.
La divulgación proporciona polipéptidos
enzimáticos, como p. ej. 2,3-aminomutasa de alanina
(p. ej. ID. SEC. N.º.: 21 y/o 30, y variantes, fragmentos y
fusiones de los mismos que conservan la actividad de la
2,3-aminomutasa de alanina). Un experto en la
materia comprenderá que las secuencias variantes de la enzima se
pueden utilizar, mientras la enzima conserve la actividad
enzimática deseada, tal como actividad de la
2,3-aminomutasa de alanina. Por ejemplo, la
divulgación proporciona polipéptidos que contienen al menos 15
aminoácidos contiguos que son idénticos a una secuencia de la
enzima, tal como una secuencia enzimática de la
2,3-aminomutasa, como la de alanina. También se
apreciará que la divulgación también proporciona polipéptidos que
contienen una secuencia del aminoácido que sea mayor a al menos 15
residuos de aminoácido (p. ej., al menos 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300
o más residuos de aminoácido) e idéntica a cualquier enzima
divulgada en la presente descripción o de otra manera públicamente
disponible.
Además, la divulgación proporciona polipéptidos
enzimáticos, como p. ej. péptido de 2,3-aminomutasa
de alanina (p. ej. ID. SEC. N.º.: 21 y/o 30), que incluyen una
secuencia del aminoácido que tiene una variación de la secuencia
del aminoácido de la enzima. Las secuencias variantes pueden poseer
una sola inserción, una sola deleción, una sola sustitución,
múltiples inserciones, múltiples deleciones, múltiples
sustituciones o cualquier combinación de las mismas (p. ej., un
sola deleción junto con múltiples inserciones). Dichos polipéptidos
comparten por lo menos una identidad de secuencia del 60, 65, 70,
75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 o 99% con una secuencia de la enzima,
como p. ej. una secuencia de 2,3-aminomutasa de
alanina, siempre que el péptido codificado por la secuencia del
aminoácido conserve la actividad enzimática deseada.
Los polipéptidos que tienen una secuencia
variante del aminoácido pueden conservar la actividad enzimática,
tal como la actividad de la 2,3-aminomutasa de
alanina. Tales polipéptidos pueden producirse al manipular la
secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido mediante
procedimientos estándares tales como mutagénesis dirigida o RCP. Un
tipo de modificación incluye la sustitución de uno o más residuos
de aminoácido, como por ejemplo no más de 10 aminoácidos, para los
residuos de aminoácido que tienen una propiedad bioquímica similar,
es decir, una sustitución conservadora.
Se pueden obtener cambios más substanciales al
seleccionar las sustituciones que sean menos conservadoras, p. ej.
al seleccionar residuos que se diferencian más significativamente
en su efecto para mantener: (a) la estructura de la base del
polipéptido en el área de la sustitución, p. ej., como una
conformación plana o helicoidal; (b) la carga o hidrofobicidad del
polipéptido en el lugar diana; o (c) el grueso de la cadena
lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan
los cambios más grandes de la función del polipéptido son aquellas
en las cuales: (a) un residuo hidrofílico, p. ej. una serina o
treonina, se sustituye por un residuo hidrófobo, p. ej. una leucina,
isoleucina, fenilalanila, valina o alanina; (b) una cisteína o
prolina se sustituye por cualquier otro residuo; (c) un residuo que
tiene una cadena lateral electropositiva, p. ej. una lisina,
arginina o histidina, se sustituye por un residuo electronegativo,
p. ej. un ácido glutámico o un ácido aspártico; o (d) un residuo
que tiene una cadena lateral voluminosa, p. ej. fenilalanila, se
sustituye por uno que no tiene una cadena lateral, p. ej. glicina.
Los efectos de estas sustituciones de aminoácido (u otras
deleciones o adiciones) se pueden analizar para detectar
polipéptidos que tengan actividad enzimática al analizar la
capacidad del polipéptido de catalizar la conversión del mismo
sustrato que el polipéptido nativo relacionado al mismo producto
que el polipéptido nativo relacionado. Por tanto, en esta
descripción se proporcionan polipéptidos que tienen no más de 5,
10, 20, 30, 40 ó 50 sustituciones conservadoras.
\newpage
También se divulgan los ácidos nucleicos
aislados que codifican los polipéptidos que tienen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina, p. ej. una secuencia
que incluye ID. SEC. N.º.: 20 ó 29. Sin embargo, la divulgación
también abarca variantes, fusiones y fragmentos de ID. SEC. N.º: 20
y 29 que conservan la capacidad de codificar una proteína o péptido
que tiene actividad de 2,3-aminomutasa de alanina.
En un ejemplo, un ácido nucleico aislado que codifica un
polipéptido que tiene actividad de 2,3-aminomutasa
de alanina se enlaza funcionalmente a una secuencia del promotor y
puede ser parte de un vector. El ácido nucleico puede ser un ácido
nucleico recombinante que se puede utilizar para transformar las
células y para generar células transformadas y/o mamíferos no
humanos transgénicos.
Se divulgan células transformadas que incluyen
al menos una molécula exógena del ácido nucleico que codifica un
polipéptido que tiene actividad de 2,3-aminomutasa
de alanina (como p. ej. ID. SEC. N.º.: 20 y/o 29 o los fragmentos,
las fusiones o las variantes de las mismas que conservan actividad
de 2,3-aminomutasa de alanina). En un ejemplo,
dicha célula transformada produce beta-alanina de
la alfa-alanina. En otro ejemplo, la célula produce
3-HP, el pantotenato, CoA y/o compuestos orgánicos
como por ejemplo 1,3-propanodiol.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican
las enzimas divulgadas en la descripción, p. ej.
2,3-aminomutasa de alanina (ID. SEC. N.º.: 20 y
29), 2,3-aminomutasa de lisina (identificación SEQ
No.: 3 y 28), y liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA (ID. SEC. N.º.:
22), (tan bien como cualquier otra enzima divulgada en la
descripción), pueden contener una secuencia entera de ácido
nucleico que codifica la enzima, así como porciones de las mismas
que conservan la actividad enzimática deseada. Por ejemplo, un
ácido nucleico de la enzima puede contener al menos 15 nucleótidos
contiguos de una secuencia del ácido nucleico de la enzima. También
se apreciará que la divulgación también proporciona ácido nucleico
aislado que contiene una secuencia de nucleótidos que sea mayor a
por lo menos 15 nucleótidos mayor (p. ej., al menos 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 75, 10, 200,
500 o más nucleótidos) en longitud e idéntico a cualquier porción
de una secuencia de la enzima, tal como una secuencia de
2,3-aminomutasa de alanina mostrada en ID. SEC.
N.º.: 20 y/o 29.
Además, la divulgación proporciona secuencias
aisladas de ácido nucleico de la enzima que contienen una variación
de una secuencia de la enzima, tal como una secuencia variante del
ácido nucleico de la 2,3-aminomutasa de alanina. Las
variantes pueden poseer una sola inserción, una sola deleción, una
sola sustitución, múltiples inserciones, múltiples deleciones,
múltiples sustituciones o cualquier combinación de las mismas (p.
ej., un sola deleción junto con múltiples inserciones) siempre que
el péptido codificado por las mismas retenga la actividad de
2,3-aminomutasa de alanina. Dichas moléculas
aisladas de ácido nucleico pueden compartir por lo menos una
identidad de secuencia del 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98 o
99% con una secuencia de la enzima, como p. ej. una secuencia de
2,3-aminomutasa de alanina, siempre que el péptido
codificado por el ácido nucleico conserve la actividad enzimática
deseada, como p. ej. la actividad de
2,3-aminomutasa de alanina. Por ejemplo, pueden
realizarse las siguientes variaciones a la secuencia del ácido
nucleico de la 2,3-aminomutasa de alanina: para ID.
SEC. N.º.: 20, la "a" en la posición 12 se puede sustituir con
una "g"; la "g" en la posición 1050 se puede sustituir
con una "a"; la "a" en la posición 255 se puede sustituir
con una "g" "t" o "c; " para ID. SEC. N.º.: 29, la
"a" en la posición 6 se puede sustituir con una "g"
"t" o "c"; el "t" en la posición 66 se puede
sustituir con una "c"; y la "g" en la posición 315 se
puede sustituir con una "a" "t" o "c".
Las preferencias codónicas y las tablas del uso
del codón para una especie en particular se pueden utilizar para
diseñar las moléculas aisladas del ácido nucleico que se aprovechan
de las preferencias del uso del codón de esa especie en particular.
Por ejemplo, las enzimas divulgadas en la presente descripción se
pueden diseñar para que tengan codones que sean utilizados
preferentemente por un organismo particular del interés.
La divulgación también proporciona secuencias
aisladas de ácido nucleico que codifican una enzima, tal como
2,3-aminomutasa de alanina, en la que la secuencia
es al menos de aprox. 12 bases de longitud (p. ej. al menos aprox.
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500,
750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 ó 5000 bases de longitud) e
hibrida, en condiciones de hibridación, a la hebra sentido o
antisentido de un ácido nucleico que codifica la enzima. Las
condiciones de hibridación pueden ser condiciones moderadas o
altamente restrictivas de
hibridación.
hibridación.
Los polipéptidos y el polipéptido de
codificación del ácido nucleico se pueden producir mediante las
técnicas estándares de,mutagénesis del ADN, p. ej. mutagénesis del
cebador M13. Los detalles de estas técnicas se proporcionan en
Sambrook y col. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd
ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring, Harbor, N.Y., 1989, Cap. 15,. Las moléculas de ácido
nucleico pueden contener cambios de una región de codificación para
ajustarse a la tendencia de uso del codón del organismo en
particular en el cual la molécula debe introducirse.
Alternativamente, la región de codificación
puede alterarse al aprovechar la degeneración del código genético
para alterar la secuencia de codificación de manera tal que,
mientras que la secuencia del ácido nucleico se modifica
sustancialmente, codifique, de todos modos, un polipéptido que
tenga una secuencia del aminoácido idéntica o sustancialmente
similar a la secuencia nativa del aminoácido. Por ejemplo, debido a
la degeneración del código genético, la alanina es codificada por
los cuatro tripletes del codón del nucleótido: GCT, GCA, GCC y GCG.
De esta manera, la secuencia del ácido nucleico de la estructura de
lectura abierta se puede cambiar en una posición de la alanina a
cualquiera de estos codones sin afectar la secuencia del aminoácido
del polipéptido codificado o las características del polipéptido.
En base a la degeneración del código genético, las variantes del
ácido nucleico se pueden derivar de una secuencia de ácido nucleico
mediante técnicas estándar de mutagénesis del ADN según se describe
en esta descripción o mediante la síntesis de las secuencias del
ácido nucleico. Por tanto, esta divulgación también abarca las
moléculas de ácido nucleico que codifican el mismo polipéptido,
pero que varían en secuencia del ácido nucleico en virtud de la
degeneración del código genético.
\vskip1.000000\baselineskip
Se divulgan las células que tienen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina. Dichas células pueden
producir beta-alanina de la
alfa-alanina. En un ejemplo, tales células tienen
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina debido a
una mutación natural y/o a una mutación inducida en el/los
cromosoma(s) de la célula, p., ej. al exponer la célula a la
mutagénesis química o inducida por radiación UV. Las células que
incluyen actividad de 2,3-aminomutasa de alanina
pueden ser eucarióticas o procarióticas. Algunos ejemplos de dichas
células incluyen, entre otros, lactobacilo, lactococcus, bacilo,
escherichia, geobacillus, corynebacterium, clostridium, células
fungicidas, de plantas y de levadura. En un ejemplo, una célula de
plantas es parte de una planta, tal como una planta
transgénica.
En un ejemplo, las células que tienen actividad
de 2,3-aminomutasa de alanina son células
transformadas. Dichas células pueden incluir al menos una molécula
exógena de ácido nucleico que codifique una
2,3-aminomutasa de alanina, p. ej. una secuencia
que comprenda ID. SEC. N.º.: 20 ó 29, o variantes, fragmentos o
fusiones de las mismas que conserven la capacidad de codificar una
proteína que tenga actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina. En un ejemplo, la molécula exógena de ácido nucleico es
una 2,3-aminomutasa de lisina mutada, tal como una
2,3-aminomutasa de lisina procariótica mutada. En
ejemplos específicos, la 2,3-aminomutasa de lisina
procariótica mutada es una 2,3-aminomutasa de
lisina mutada de bacillus subtilis, deinococcus radiodurans,
clostridium subterniinale, aquifex aeolicus, haemophilus
influenzae, E. coli, o porphyromonas gingivalis. Otras
2,3-aminomutasas de lisina pueden identificarse
mediante métodos conocidos en la materia, p. ej. al buscar
secuencias similares en BLAST y/o mediante métodos del hibridación.
En un ejemplo específico, la 2,3-aminomutasa de
lisina mutada es 2,3-aminomutasa de lisina mutada
B,. subtilis o P. gingivalis. En otro ejemplo, la
molécula exógena de ácido nucleico es una
5,6-aminomutasa de lisina mutada, tal como una
5,6-aminomutasa de lisina procariótica mutada.
Alternativamente, la molécula exógena de ácido nucleico es una
2,3-aminomutasa de leucina mutada o una
5,6-aminomutasa de lisina mutada, tal como una
5,6-aminomutasa de lisina mutada de C
sticklandii.
En un ejemplo particular, la
2,3-aminomutasa de lisina mutada es una
2,3-aminomutasa de lisina mutada de B
subtilis que tiene una sustitución en la posición L103, D339
y/o M136. Por ejemplo, la sustitución puede incluir una sustitución
L103M, L103K, L103R, L103E o L103S. En otro o ejemplo adicional, la
sustitución incluye una sustitución de D339H, D339Q, D339T o D339N.
En otro ejemplo, la sustitución puede incluir una sustitución de
L103M, M136V, D339H o cualquier combinación de las mismas.
Se divulgan células que incluyen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina así como otras
actividades enzimáticas. Dichas células se pueden utilizar para
producir beta-alanina, 3-HP,
pantotenato, CoA y ácidos orgánicos, polioles como p. ej.
1,3-propanodiol, ácido acrílico, acrilato
polimerizado, ésteres de acrilato, 3-HP
polimerizado, copolímeros de 3-HP y otros
compuestos tales como butiratos, valeratos y otros compuestos, y
ésteres de 3-HP.
En un ejemplo, dichas células también incluyen
actividad de la alanina deshidrogenasa o el piruvato glutamato
transaminasa, actividad de CoA-transferasa o
CoA-sintetasa, actividad de la liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA, actividad de
3-hidroxipropionil-CoA
deshidratasa, actividad del glutamato deshidrogenasa, actividad del
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa o
actividad del
3-hidroxisobutiril-CoA hidrolasa. En
otro ejemplo, tales células también incluyen actividad de alanina
deshidrogenasa o de glutamato piruvato transaminasa, actividad de
4-aminobutirato y/o de
beta-alanina-2-oxoglutarato
aminotransferasa, actividad de glutamato deshidrogenasa y actividad
de 3-HP o de 3-hidroxisobutirato
deshidrogenasa. En estos ejemplos, las células se pueden utilizar
para producir 3-HP.
En otro ejemplo, las células también incluyen
actividad de alanina deshidrogenasa o piruvato glutamato
transaminasa, actividad de CoA-transferasa o
actividad de CoA-sintetasa, actividad de liasa de
amoniaco de beta-alanil-CoA,
actividad de 3-hidroxipropionil-CoA
deshidratasa, actividad de glutamato deshidrogenasa y actividad de
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa
3-hidroxiisobutirilo-CoA hidrolasa.
En otro ejemplo, tales células también incluyen actividad de
alanina deshidrogenasa o glutamato piruvato transaminasa,
4-aminobutirato y/o de
beta-alanina-2-oxoglutarato
aminotransferasa, actividad de glutamato deshidrogenasa, y
actividad de 3-HP o de
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa; y actividad de
lipasa o esterasa. Dichas células se pueden utilizar para producir
un éster de 3-HP, tal como
3-hidroxipropionato de metilo,
3-hidroxipropionato de etilo,
3-hidroxipropionato de propilo,
3-hidroxipropionato de butilo o
3-hidroxipropionato de
2-etilhexil.
En otro ejemplo, las células también incluyen
actividad de alanina deshidrogenasa o piruvato glutamato
transaminasa, actividad de CoA-sintetasa, liasa de
amoniaco de beta-alanil-CoA,
actividad de 3-hidroxipropionil-CoA
deshidratasa, actividad de glutamato deshidrogenasa y actividad de
polihidroxiácido sintasa. Esas células pueden usarse para producir
3-HP polimerizado.
En otro ejemplo, las células también incluyen
actividad de alanina deshidrogenasa o piruvato glutamato
transaminasa, actividad de CoA-sintetasa, liasa de
amoniaco de beta-alanil-CoA,
actividad de 3-hidroxipropionil-CoA
deshidratasa, actividad de glutamato deshidrogenasa y actividad de
polihidroxiácido sintasa. Dichas células se pueden utilizar para
producir acrilato polimerizado.
En otro ejemplo, las células también incluyen
actividad de alanina deshidrogenasa o glutamato piruvato
transaminasa, actividad de CoA-transferasa o
CoA-sintetasa, actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA, actividad de
glutamato deshidrogenasa, y actividad de la lipasa o esterasa, en
el que las células se puedan utilizar para producir un éster del
acrilato, tal como acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato
de propilo o acrilato de butilo.
Alternativamente, estas células también incluyen
actividad de alanina deshidrogenasa o piruvato glutamato
transaminasa, actividad de CoA-transferasa o
actividad de CoA-sintetasa, liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA, actividad de
3-hidroxipropionil-CoA
deshidratasa, actividad de glutamato deshidrogenasa, actividad de
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa o
3-hidroxiisobutirilo-CoA hidrolasa
y actividad de aldehído o alcohol deshidrogenasa. Tales células se
pueden utilizar para producir el
1,3-propanodiol.
En un ejemplo, las células también tienen
actividad de alfa-ketopantoato
hidroximetiltransferasa (EC 2.1.2.11),
alfa-ketopantoato reductasa (EC 1.1.1.169) y
pantotenato sintasa (EC 6.3.2.1). Dichas células se pueden utilizar
para producir pantotenato. Alternativamente o además, las células
también tienen actividad de pantotenato kinasa (EC 2.7.1.33),
4'-fosfopantetenoil-1-cisteína
sintetasa (EC 6.3.2.5), 4'-fosfopantotenoilcisteína
descarboxilasa (EC 4.1.1.36),
ATP:4'-fosfopanteteina adeniltransferasa (EC
2.7.7.3) y defosfo-CoA kinasa (EC 2.7.1.24). Tales
células se pueden usar para producir la coenzima A (CoA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe un método de identificación de
células con actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina. El método incluye cultivar una célula, tal como una célula
procariótica, que se suprima funcionalmente para panD, en un medio
que incluya alfa-alanina, pero no
beta-alanina o pantotenato, o en un medio en el
cual la célula pueda producir alfa-alanina de
fuentes de medios de carbón, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno, pero
que no incluya beta-alanina ni pantotenato, e
identificar las células capaces de crecer en el medio que carezca
de beta-alanina o pantotenato. En ejemplos
particulares, la célula también se suprimen funcionalmente para
panF. El crecimiento de la célula indica que la célula está
produciendo beta-alanina de
alfa-alanina, que indica que la célula tiene
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina. En cambio,
si una célula no crece y/o no sobrevive en el medio que carece de
beta-alanina o pantotenato, esto indica que la
célula no está produciendo beta-alanina de la
alfa-alanina, que indica que la célula no tiene
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina.
En un ejemplo, la célula suprimida
funcionalmente para panD se transforma con una o más aminomutasas
transformadas, como p. ej. bibliotecas que incluyen
2,3-aminomutasa de lisina mutada,
2,3-aminomutasa de leucina mutada y/o
5,6-aminomutasa de lisina mutada. En un ejemplo
particular, la célula se transforma con una biblioteca de
2,3-aminomutasa de lisina mutada antes de cultivar y
detectar las células. La 2,3-aminomutasa de lisina
se ha clonado anteriormente de Clostridium subterminale SB4
(Chirpich y col. J. Biol. Chem. 245:1778-89, 1970)
y Bacillus subtilis (Chen y col., Biochem. J.
348:539-49, 2000), y se ha demostrado que cataliza
la interconversión de la lisina y la beta-lisina.
Las aminomutasas mutantes, como p. ej.
2,3-aminomutasa de lisina mutante, se pueden
examinar para detectar su capacidad de conferir actividad de
2,3-aminomutasa de alanina. Además, a pesar de que
un polipéptido con actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina no se ha descrito previamente, tal enzima puede existir en
la naturaleza. Por lo tanto, una célula suprimida funcionalmente
para panD puede transformarse con una biblioteca que incluya una
codificación genética para la 2,3-aminomutasa de
alanina y el gen aislado por su capacidad de conferir crecimiento a
esta célula en el medio que contiene alfa-alanina o
fuentes de carbón, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno de manera que la
célula pueda generar alfa-alanina, pero sin
contener beta-alanina o pantotenato.
En otro ejemplo, el método además incluye
identificar una mutación en la/las aminomutasa(s) mutadas
después de la identificación de una célula que crece en el medio,
en el que la/s aminomutasa(s) mutadas confieren actividad de
2,3-aminomutasa de alanina a la célula. Para
identificar la mutación, el ácido nucleico o aminoácido de la
aminomutasa se puede secuenciar y comparar a una secuencia de
aminomutasa no mutada para identificar las mutaciones que confieren
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina a la
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Se divulga un método para producir péptidos de
2,3-aminomutasa de alanina que tienen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina. El método incluye
cultivar las células divulgadas que tienen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina en condiciones que
permitan que la célula produzca el péptido de
2,3-aminomutasa de alanina. En un ejemplo, el
método incluye las células de cultivo que tienen unas o más
moléculas exógenas de ácido nucleico que codifican una
2,3-aminomutasa de alanina (tal como una secuencia
que incluya ID. SEC. N.º.: 20 y/o 29 o variantes, fusiones o
fragmentos de las mismas que conservan la actividad de
2,3-aminomutasa de alanina), de manera tal que se
produzca la 2,3-aminomutasa de alanina.
También se divulga un método para generar
beta-alanina de alfa-alanina. En un
ejemplo, el método incluye cultivar las células divulgadas que
tengan actividad de 2,3-aminomutasa de alanina en
condiciones que permitan que la célula produzca
beta-alanina de la alfa-alanina. En
un ejemplo, el método incluye las células de cultivo que tienen una
o más moléculas exógenas de ácido nucleico que codifican una
2,3-aminomutasa de alanina, de manera tal que la
2,3-aminomutasa de alanina sea capaz de producir la
beta-alanina de la alfa-alanina. En
un ejemplo, el ácido nucleico exógeno es una secuencia que incluye
ID. SEC. N.º.: 20 y/o 29 o variantes, fusiones o fragmentos del
mismo que conservan la actividad de la
2,3-aminomutasa de alanina.
En ejemplos particulares, la célula se suprime
funcionalmente para panD o panD y panF.
\vskip1.000000\baselineskip
Se divulgan los métodos y los materiales
relacionados con producir beta-alanina de
alfa-alanina, a través de una
2,3-aminomutasa de alanina, como p. ej. utilizando
las secuencias divulgadas de 2,3-aminomutasa de
alanina y las células divulgadas que tienen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina. Además, se divulgan los
métodos y los materiales relacionados con la producción de
pantotenato y 3-HP a partir de la
beta-alanina, así como CoA y compuestos orgánicos
como p. ej. 1,3-propanodiol, ácido acrílico,
acrilato polimerizado, ésteres de acrilato, 3-HP
polimerizado, copolímeros de 3-HP y otros compuestos
como p. ej. butiratos, valeratos y otros compuestos, y ésteres de
3-HP. Específicamente, la divulgación proporciona
ácidos nucleicos de 2,3-aminomutasa de alanina
(como p. ej. ID. SEC. N.º.: 20 y 29), polipéptidos (como p. ej. ID.
SEC. N.º.: 21 y 30), células huésped y los métodos y materiales
para producir beta-alanina de
alfa-alanina, que se pueden utilizar para crear más
eficientemente pantotenato de beta-alanina y
3-HP así como derivados del mismo, por ejemplo CoA
y compuestos orgánicos como p. ej. 1,3-propanodial,
ácido acrílico, acrilato polimerizado, ésteres de acribato,
3-HP polimerizado y ésteres de
3-HP.
Es posible utilizar varias vías metabólicas para
producir compuestos orgánicos de beta-alanina que
se ha producido a partir de alfa-alanina (figuras 1
y 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Según se muestra en la figura 1, la
beta-alanina se puede convertir en
beta-alanil-CoA con el uso de un
polipéptido que tenga actividad de CoA transferasa (EC 2.8.3.1) o
CoA sintasa (EC 6.2.1.-). La beta-alanina se puede
producir a partir de alfa-alanina mediante
polipéptidos endógenos en una célula huésped que convierta
alfa-alanina a beta-alanina y/o
mediante el uso de una célula transformada con
2,3-aminomutasa de alanina recombinante, como una
secuencia que incluya ID. SEC. N.º.: 20 y/o 29, o fragmentos,
variantes o fusiones de las mismas que conservan actividad de
2,3-aminomutasa de alanina. La
beta-alanil-CoA entonces se
convierte en acrilil-CoA mediante el uso de un
polipéptido que tiene actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA (EC4.3.1.6). El
acrilil-CoA entonces puede convertirse en
3-hidroxipropionil-CoA
(3-HP-CoA) con el uso de un
polipéptido que tenga actividad de
3-hidroxipropionil-CoA deshidratasa
(EC 4.2.1.-). El 3-HP-CoA entonces
se puede convertir en 3-HP a través de varias
enzimas, incluyendo, entre otras: un polipéptido que tenga
actividad de transferasa de CoA (EC 2.8. 3.1), un polipéptido que
tenga actividad de hidrolasa de
3-hidroxipropionil-CoA (EC 3.1.2.-)
y un polipéptido que tenga actividad de hidrolasa de
3-hidroxiisobutirilo-CoA (EC
3.1.2.4) se pueden utilizar para convertir
3-HP-CoA en
3-HP.
Según se muestra en la figura 1,
3-HP se puede crear a partir de
beta-alanina mediante el uso de un polipéptido que
tenga actividad de 4-aminobutirato o actividad de
aminotransferasa
beta-alanina-2-oxoglutarato
que genere semialdehído malónico a partir de
beta-alanina. El semialdehído malónico se puede
convertir en 3-HP con un polipéptido que tenga
actividad de 3-HP deshidrogenasa (EC 1.11.59) o un
polipéptido que tenga actividad de
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa (EC
1.1.1.31).
Los derivados de 3-HP se pueden
generar a partir de la beta-alanina según se
muestra en la figura 1. El 3-HP-CoA
resultante se puede convertir en 3-HP polimerizado
mediante un polipéptido que tenga actividad de sintasa de
polihidroxiácido (EC 2.3.1.-). Alternativamente o además,
3-HP CoA se puede convertir en
1,3-propanodiol por medio de polipéptidos que tenga
actividad de óxido-reductasa o actividad de
reductasa.
El acrilil-CoA resultante se
puede convertir en acrilato polimerizado mediante un polipéptido
que tenga actividad de sintasa de polihidroxiácido (EC 2.3.1.-).
Alternativamente o además, el acrilil-CoA se puede
convertir en el acrilato con un polipéptido que tenga actividad de
transferasa de CoA y/o de hidrolasa de CoA; y el acrilato
resultante se puede convertir en un éster de acrilato con un
polipéptido que tenga actividad de lipasa o esterasa.
El 3 HP resultante se puede convertir en un
éster de 3-HP con un polipéptido que tenga
actividad de lipasa o esterasa (EC 3.1.1.-). Alternativamente o
además, el 1,3-propanodiol se puede crear a partir
del 3-HP, mediante la combinación de un polipéptido
que tenga actividad de aldehído deshidrogenasa y un polipéptido que
tenga actividad de alcohol deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Según se muestra en la figura 3, el pantotenato
se pueden generar a partir de la beta-alanina con
un péptido que tenga actividades de
alfa-ketopantoato hidroximetiltransferasa (EC
2.12.11), alfa-ketopantoato reductasa (EC 1.1.1.169)
y pantotenato sintasa (EC 6.3.2.1), que convierte la
beta-alanina en pantotenato.
\newpage
Los derivados del pantotenato se pueden generar
a partir de la beta-alanina de la siguiente manera.
El pantotenato resultante se puede convertir en CoA con
polipéptidos que tengan actividad de pantotenato kinasa (EC
2.7.1.33),
4'-fosfopantetenoil-1-cisteína
sintetasa (EC 6.3.2.5),
4'-fosfopantotenoil-cisteína
descarboxilasa (EC 4.1.1.36),
ATP:4'-fosfopantotenoil-cisteína
descarboxilasa (EC 2.7.7.3) y defosfo-CoA kinasa (EC
2.7.1.24).
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos que tienen actividad de
2,3-aminomutasa de lisina así como el ácido
nucleico que codifica dichos polipéptidos, se pueden obtener a
partir de varias especies incluyendo, entre otras: Clostridium
subterminale, E. coli, B. subtilis, Deinococcus radiodurans,
Porphyromonas gingivalis, Aquifex aeolicus o Haemophilus
influenza. Por ejemplo, las secuencias del aminoácido que
tienen actividad de 2,3-aminomutasa de lisina se
muestran en ID. SEC. N.º.: 31 para B. subtilis y en ID. SEC.
N.º.: 28 para P. gingivalis.
En otro ejemplo, un ácido nucleico que codifica
un polipéptido que tiene actividad de
2,3-aminomutasa de alanina se muestra en ID. SEC.
N.º.: 20 para B. subtilis (la secuencia correspondiente del
aminoácido se muestra en ID. SEC. N.º.: 21) y en ID. SEC. N.º.: 29
para P. gingivalis (la secuencia correspondiente del
aminoácido se muestra en ID. SEC. N.º.: 30). Además, se pueden
obtener otros polipéptidos que tienen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina así como los ácidos
nucleicos que codifican tales polipéptidos, con los métodos
descritos en la presente descripción. Por ejemplo, las variantes de
la 2,3-aminomutasa de alanina se pueden utilizar
para codificar un polipéptido que tenga actividad de
2,3-aminomutasa de alanina como se describe
anteriormente.
Los polipéptidos que tienen actividad de la
transferasa de CoA, así como el ácido nucleico que codifica dichos
polipéptidos, se pueden obtener a partir de varias especies,
incluyendo, entre otras, Megasphaera elsdenii, Clostridium
propionicum, Clostridium kluyveri y E. coli. Por
ejemplo, el ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene
actividad de transferasa de CoA se muestra en ID. SEC. N.º.: 24
para M elsdenii. Además, los polipéptidos que tienen actividad de
transferasa de CoA (ID. SEC. N.º.: 25) así como el ácido nucleico
que codifica dichos polipéptidos (ID. SEC. N.º.: 24) pueden
obtenerse según se describe en la presente descripción. Por
ejemplo, las variantes de la transferasa de CoA se pueden utilizar
para codificar un polipéptido que tenga actividad de transferasa de
CoA. Por ejemplo, se pueden realizar las siguientes variaciones a
la secuencia del ácido nucleico de la transferasa de CoA (ID. SEC.
N.º.: 24): la "a" en la posición 49 se puede sustituir con una
"c"; la "a" en la posición 590 se puede sustituir con una
"atgg"; una "aaac" se puede insertar antes de la "g"
en la posición 393; o la "gaa" en la posición 736 se puede
eliminar. Se apreciará que las secuencias estipuladas en el listado
de secuencias pueden contener cualquier cantidad de variaciones así
como cualquier combinación de tipos de variaciones, siempre que el
péptido conserve la actividad de transferasa de CoA. Además, se
pueden realizar las siguientes variaciones a la secuencia del
aminoácido de la transferasa de CoA que se muestra en ID. SEC.
N.º.: 25: la "k" en la posición 17 se puede sustituir con una
"p" o "h"; y la "v" en la posición 125 se puede
sustituir con una "i" o "f".
Los polipéptidos que tienen actividad de liasa
de amoniaco de beta-alanil-CoA así
como el ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos, se pueden
obtener a partir de varias especies incluyendo, entre otras, C
propionicum. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un
polipéptido complejo que tenga actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA se puede obtener a
partir de C propionicum según se describe en el ejemplo 10.
El ácido nucleico que codifica una liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA puede contener una
secuencia según se especifica en ID. SEC. N.º.: 22. Además, los
polipéptidos que tienen actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA (ID. SEC. N.º.: 23)
así como el ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos (ID.
SEC. N.º.: 22) se pueden obtener según se describe en la presente
descripción. Por ejemplo, las variaciones a la secuencia de liasa
de amoniaco de beta-alanil-CoA que
se muestra en ID. SEC. N.º.: 22 se pueden utilizar para codificar
un polipéptido que tiene actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA.
Los polipéptidos que tienen actividad de
actividad de deshidratasa de
3-hidroxipropionil-CoA (también
conocida como actividad de acrilil-CoA hidratasa),
así como el ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos se
pueden obtener de varias especies incluyendo, entre otras,
Chloroflexus aurantiacus, Candida rugosa, Rhodosprillium
rubrum y Rhodobacter capsulates. Por ejemplo, un ácido
nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de
deshidratasa de
3-hidroxipropionil-CoA se divulga
en el documento WO 02/42418.
Los polipéptidos que tienen actividad de
glutamato deshidrogenasa, así como el ácido nucleico que codifica
dichos polipéptidos se pueden obtener de varias especies.
Los polipéptidos que tienen actividad de
3-hidroxipropionil-CoA o de
3-hidroxisobutiril-CoA hidrolasa,
así como el ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos, se
pueden obtener de varias especies incluyendo, entre otras,
Pseudomonas fluorescens, Rattus rattus y Homo
sapiens. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un
polipéptido que tiene actividad de hidrolasa de
3-hidroxiisobutirilo-CoA se puede
obtener de H. sapiens y puede tener una secuencia según se
estipula en GenBank número de acceso U66669.
Los polipéptidos que tienen actividad de
4-aminobutirato y/o
beta-alanina-2-oxoglutarato
aminotransferasa, actividad de 3-HP deshidrogenasa
y actividad de 3-hidroxisobutirato deshidrogenasa,
así como el ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos, se
pueden obtener de varias especies.
Los polipéptidos que tienen actividad sintasa de
polihidroxiácido, así como el ácido nucleico que codifica dichos
polipéptidos, se pueden obtener de varias especies incluyendo,
entre otras, Rhodobacter sphaeroides, Comamonas acidororans,
Ralstonia eutropha y Pseudomonas oleovorans. Por
ejemplo, el ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene
actividad de sintasa de polihidroxiácido se puede obtener de R.
sphaeroides y puede tener una secuencia según se estipula en
GenBank con número de acceso X97200. La información adicional sobre
la sintasa de polihidroxiácido se puede encontrar en Song y col.
(Biomacromolecules 1:433-9, 2000).
Los polipéptidos que tienen actividad
aldehído:NAD(+) óxido-reductasa (EC 1.2.1.10) de
acetilación, así como el ácido nucleico que codifica dichos
polipéptidos, se pueden obtener de varias especies incluyendo,
entre otras, E. coli. Por ejemplo, el ácido nucleico que
codifica un polipéptido que tiene actividad aldehído deshidrogenasa
de acetilación se puede obtener de E. coli y puede tener una
secuencia como se estipula en GenBank con número de acceso
Y09555.
La actividad de aldehído:NAD(+)
óxido-reductasa y alcohol:NAD(+)
óxido-reductasa se pueden llevar a cabo por dos
polipéptidos diferentes como se describe anteriormente, o llevar a
cabo por un solo polipéptido, como un
aldehído-alcohol deshidrogenasa multifuncional (EC
1.2.1.10) de E. coli (Goodlove y col. Gene
85:209-14, 1989; GenBank número de acceso
M33504).
Los polipéptidos que tienen actividad de
aldehído deshidrogenasa(NAD (P)+) (EC 1.2.1.-), así como el
ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos, se pueden obtener
de varias especies incluyendo, entre otras, S. cerevisiae.
Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un polipéptido que
tiene actividad de aldehído deshidrogenasa se puede obtener de
S. cerevisiae y puede tener una secuencia como se estipula
en GenBank con número de acceso Z75282 (Tessier y col. FEMS
Microbiol. Lett 164:29-34, 1998).
Los polipéptidos que tienen actividad de alcohol
deshidrogenasa (EC 1.1.1.1), así como el ácido nucleico que
codifica tales polipéptidos, se pueden obtener de varias especies
incluyendo, entre otras Z. mobilis. Por ejemplo, el ácido
nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de alcohol
deshidrogenasa se puede obtener de Z. mobilis y puede tener
una secuencia según se especifica en GenBank con número de acceso
M32100.
Los polipéptidos que tienen actividad de lipasa,
así como el ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos, se
pueden obtener a partir de varias especies incluyendo, entre otras,
Candida rugosa, Candida tropicalis y Candida
albicans. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un
polipéptido que tiene actividad de lipasa se puede obtener de C.
rugosa y puede tener una secuencia según se estipula en GenBank
número de acceso A81171.
Los polipéptidos que tienen actividad de
alfa-ketopantoato hidroximetiltransferasa y
pantotenato sintasa, así como el ácido nucleico que codifica dichos
polipéptidos, se pueden obtener de varias especies incluyendo,
entre otras, E. coli. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que
codifican los polipéptidos que tienen actividad de
alfa-ketopantoato hidroximetiltransferasa y
pantotenato sintasa se pueden obtener de E. coli y pueden
tener una secuencia según se estipula en GenBank con número de
acceso L17086.
Los polipéptidos que tienen actividad de
alfa-ketopantoato reductasa, pantotenato kinasa,
4'-fosfopantetenoil-1-cisteína
sintetasa, 4'-fosfopantotenoilcisteína
descarboxilasa, ATP:4'-fosfopanteteina
adeniltransferasa y defosfo-CoA kinasa, así como el
ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos se pueden obtener
de varias especies incluyendo, entre otras, E. coli. Por
ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que
tienen actividad de alfa-ketopantoato reductasa,
pantotenato kinasa,
4'-fosfopantetenoil-1-cisteína
sintetasa, 4'-fosfopantotenoilcisteína
descarboxilasa, ATP:4'-fosfopanteteina
adeniltransferasa y defosfo-CoA kinasa se pueden
obtener de E. coli y pueden tener una secuencia según se
estipula en GenBank con número de acceso NC000913.
El término "polipéptido que tiene actividad
enzimática" se refiere a cualquier polipéptido que catalice una
reacción química de otras sustancias sin destruirse o modificarse a
sí mismo una vez finalizada la reacción. Típicamente, un
polipéptido que tiene actividad enzimática cataliza la formación de
unos o más productos de unos o más sustratos. Tales polipéptidos
pueden tener cualquier tipo de actividad enzimática incluyendo,
entre otros, la actividad enzimática o la actividades enzimáticas
asociadas a las enzimas como p. ej.
2,3-aminomutasas de alanina,
deshidratasas/hidratasas, deshidratasas/hidratasas de
3-hidroxipropionil-CoA, alaninas
deshidrogenasa, transferasas de CoA, hidrolasas de
3-hidroxipropionil-CoA, hidrolasas
de 3-hidroxiisobutirilo-CoA,
hidrolasas de CoA, sintasas de polihidroxiácido, liasas de amoniaco
de beta-alanina, 4-aminobutiratos o
aminotransferasas
beta-alanina-2-oxoglutarato,
3-HP deshidrogenasas,
3-hidroxisobutiratos deshidrogenasa, glutamatos
deshidrogenasa, lipasas, esterasa, aldehído acetilante:NAD(+)
óxido-reductasas, alcohol:NAD(+)
óxido-reductasas, aldehído deshidrogenasa, alcohol
deshidrogenasa, hidroximetil transferasas, reductasas, sintasas,
kinasas, sintetasas, descarboxilasas,
alfa-ketopantoato hidroximetiltransferasas,
alfa-ketopantoato reductasa, pantotenato sintasa,
4'-fosfopantetenoil-1-cisteína
sintetasas, 4'-fosfopantotenoilcisteína
descarboxilasas, ATP:4'-fosfopanteteina
adeniltransferasas, defosfo-CoA kinasas, aldehído
acetilante: NAD(+) óxido-reductasas, alcohol:NAD(+)
óxido-reductasas, aldehído
deshidrogenasas(NAD (P)+), alcohol dehidrogenasas y
adeniltransferasas.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada paso proporcionado en las vías
representadas en las figuras 1 y 3 se puede realizar dentro de una
célula (in vivo) o fuera una célula (in vitro, p.
ej., en un contenedor o una columna). Además, los productos
compuestos orgánicos se pueden generar a través de una combinación
de la síntesis in vivo y de la síntesis in vitro.
Además, el paso, o los pasos, in vitro de la síntesis puede
ser mediante una reacción química o reacción enzimática.
Por ejemplo, una célula o un microorganismo
proporcionado en la presente descripción se puede utilizar para
realizar los pasos proporcionados en las figuras 1 y 3, o un se
puede utilizar un extracto que contenga polipéptidos con las
actividades enzimáticas indicadas para realizar los pasos
proporcionados en las figuras 1 y 3. Además, se pueden utilizar
tratamientos químicos para realizar las conversiones proporcionadas
en las figuras 1 y 3. Por ejemplo, el acrilil-CoA
se puede convertir en acrilato mediante hidrólisis. Otros
tratamientos químicos incluyen, entre otros, transesterificación
para convertir el acrilato en un éster del acrilato.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos que se describen en la presente
descripción, p. ej. las enzimas enumeradas en la figura 1, se
pueden producir individualmente en una célula huésped o en
combinación en una célula huésped. Además, los polipéptidos que
tienen una actividad enzimática particular pueden ser un
polipéptido que se obtiene naturalmente o que no se obtiene
naturalmente. Un polipéptido que se obtiene naturalmente es
cualquier polipéptido que tiene una secuencia del aminoácido que se
encuentra en la naturaleza, incluyendo polipéptidos tipo natural y
polimórficos. Los polipéptidos que se obtienen naturalmente se
pueden obtener de cualquier especie incluyendo, entre otros
especies animal (p. ej. mamífero), vegetal, fúngico y bacteriana.
Un polipéptido que no se obtiene naturalmente es cualquier
polipéptido que tiene una secuencia del aminoácido que no se
encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido que no se
obtiene naturalmente puede ser una versión mutada de un polipéptido
que se obtiene naturalmente o un polipéptido diseñado. Por ejemplo,
un polipéptido que no se obtiene naturalmente que tiene actividad
de 2,3-aminomutasa de alanina puede ser una versión
mutada de un polipéptido que se obtiene naturalmente que tiene
actividad de 2,3-aminomutasa de lisina que tiene al
menos cierta actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina (como p. ej. ID. SEC. N.º.: 21 y/o 30). Un polipéptido
puede ser transformado por p. ej. adiciones, deleciones o
sustituciones de secuencias, o por la combinación de las
mismas.
Se divulgan células modificadas genéticamente
que se pueden utilizar para realizar unos o más pasos de los pasos
en las vías descritas en la presente descripción o las células
modificadas genéticamente se pueden utilizar para producir los
polipéptidos divulgados para el uso posterior in vitro. Por
ejemplo, un microorganismo individual puede contener
ácido(s) nucleico(s) exógeno(s) que codifica cada uno de los polipéptidos necesarios para realizar los pasos representados en las figuras 1 y 3. Dichas células pueden contener cualquier cantidad de moléculas exógenas de ácido nucleico. Por ejemplo, una célula en particular puede contener una, dos, tres o cuatro moléculas exógenas diferentes de ácido nucleico, en las que cada una codifica el/los polipéptido(s) necesario(s) para convertir el piruvato en 3-HP, según se muestra en la fig. 1, o una célula en particular puede producir endógenamente los polipéptidos necesarios para convertir el piruvato en acrilil-CoA mientras que contiene el ácido nucleico exógeno que codifica los polipéptidos necesarios para convertir el acrilil-CoA en 3-HP.
ácido(s) nucleico(s) exógeno(s) que codifica cada uno de los polipéptidos necesarios para realizar los pasos representados en las figuras 1 y 3. Dichas células pueden contener cualquier cantidad de moléculas exógenas de ácido nucleico. Por ejemplo, una célula en particular puede contener una, dos, tres o cuatro moléculas exógenas diferentes de ácido nucleico, en las que cada una codifica el/los polipéptido(s) necesario(s) para convertir el piruvato en 3-HP, según se muestra en la fig. 1, o una célula en particular puede producir endógenamente los polipéptidos necesarios para convertir el piruvato en acrilil-CoA mientras que contiene el ácido nucleico exógeno que codifica los polipéptidos necesarios para convertir el acrilil-CoA en 3-HP.
Además, una sola molécula exógena de ácido
nucleico puede codificar un, o más de un, polipéptido. Por ejemplo,
una sola molécula exógena de ácido nucleico puede contener las
secuencias que codifican dos, tres o inclusive cuatro polipéptidos
diferentes. Además, las células descritas en la presente
descripción pueden contener una sola copia o múltiples copias (p.
ej., cerca de 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 ó 150 copias) de una
molécula exógena particular de ácido nucleico, como p. ej. una
enzima en particular. Las células descritas en la presente
descripción pueden contener más que una ácido nucleico exógeno en
particular. Por ejemplo, una célula en particular puede contener
cerca de 50 copias de la molécula exógena X de ácido nucleico, así
como cerca de 75 de la molécula exógena Y de ácido
nucleico.
nucleico.
En otro ejemplo, una célula puede contener una
molécula exógena de ácido nucleico que codifique un polipéptido que
tiene actividad de 2,3-aminomutasa de alanina, p.
ej. ID. SEC. N.º.: 20 y/o 29 (o variantes, fragmentos o fusiones de
las mismas que conservan actividad de
2,3-aminomutasa de alanina). Dichas células pueden
tener cualquier nivel detectable de actividad de
2,3-aminomutasa de alanina, incluyendo la actividad
detectada por la producción de metabolitos de
beta-alanina, como p. ej. pantotenato. Por ejemplo,
una células que contiene una molécula exógena de ácido nucleico que
codifica un polipéptido que tiene actividad de
2,3-aminomutasa de alanina puede tener actividad de
2,3-aminomutasa de alanina con una actividad de
beta-alanina mayor a 1 \mug formado por gramo de
peso seco de la célula por hora (p. ej., mayor que aprox. 10, 20,
30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400,
500 o más \mug de beta-alanina formado por gramo
de peso seco de la célula por hora). Alternativamente, una célula
puede tener actividad de 2,3-aminomutasa de alanina
de manera que un extracto celular de las células 1x10^{6} tiene
una actividad de beta-alanina mayor a aprox. 1 ng
formado por mg total de proteína por minuto (p. ej., mayor que
aprox. 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250,
300, 350, 400, 500 o más ng de beta-alanina formado
por mg total de proteína por minuto).
Una molécula del ácido nucleico que codifica un
polipéptido que tiene una actividad enzimática se puede identificar
y obtener mediante cualquier método, como p. ej. los que se
describieron en la presente descripción. Por ejemplo, las moléculas
del ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene
actividad enzimática se pueden identificar y obtener usando la
clonación molecular común o los procedimientos y las técnicas
químicos de síntesis del ácido nucleico, incluyendo RCP. Además,
las técnicas de secuenciamiento estándar del ácido nucleico y los
programas informáticos que traducen las secuencias del ácido
nucleico en secuencias de aminoácido basadas en el código genético
se pueden utilizar para determinar si un ácido nucleico en
particular tiene alguna homología de secuencia con los polipéptidos
enzimáticos conocidos o no. El software de alineación de secuencia,
como p. ej. MEGALIGN (DNASTAR, Madison, WI, 1997) puede utilizarse
para comparar varias secuencias.
Además, las moléculas de ácido nucleico que
codifican los polipéptidos enzimáticos conocidos pueden mutarse con
el uso de las técnicas moleculares comunes de clonación (p. ej.,
mutagénesis dirigida al sitio). Las mutaciones posibles incluyen,
entre otras, deleciones, inserciones y sustituciones de bases, así
como combinaciones de deleciones, inserciones y sustituciones de
bases. Además, las bases de datos de ácido nucleico y aminoácidos
(p. ej., GenBank) se pueden utilizar para identificar una secuencia
de ácido nucleico que codifique un polipéptido con actividad
enzimática. Brevemente, cualquier secuencia del aminoácido que
tenga cierta homología con un polipéptido con actividad enzimática
o cualquier secuencia de ácido nucleico que tenga cierta homología
con una secuencia que codifique a un polipéptido con actividad
enzimática se puede utilizar como consulta para buscar en GenBank.
Los polipéptidos identificados entonces se pueden analizar para
determinar si exhiben actividad enzimática o no.
Además, las técnicas de hibridación del ácido
nucleico se pueden utilizar para identificar y obtener una molécula
de ácido nucleico que codifique a un polipéptido que tiene
actividad enzimática. Brevemente, cualquier molécula de ácido
nucleico que codifique un polipéptido enzimático conocido, o un
fragmento del mismo, se puede utilizar como sonda para identificar
las moléculas de ácido nucleico similares por su hibridación, en
condiciones restrictivas de medias a altas. Dichas moléculas de
ácido nucleico similares pueden entonces aislarse, secuenciarse y
analizarse para determinar si el polipéptido codificado tiene
actividad enzimática.
Las técnicas de clonación del ácido nucleico
también se pueden utilizar para identificar y obtener una molécula
de ácido nucleico que codifique un polipéptido que tiene actividad
enzimática. Por ejemplo, un sustrato que se conoce que interactúa
con un polipéptido enzimático en particular se puede utilizar para
analizar una biblioteca de fagos que contenga ese polipéptido
enzimático. Las bibliotecas de fagos se pueden generar según se
describe en (Burritt y col., Anal. Biochem.
238:1-13, 1990) o se pueden obtener de
distribuidores comerciales como p. ej. Novagen (Madison, WI).
Además, las técnicas de secuenciamiento del
polipéptido también se pueden utilizar para identificar y obtener
una molécula de ácido nucleico que codifique a un polipéptido que
tiene actividad enzimática. Por ejemplo, un polipéptido purificado
se puede separar por electroforesis en gel y su secuencia del
aminoácido se puede determinar por, p. ej. las técnicas de
micro-secuenciamiento del aminoácido. Una vez
determinada, la secuencia del aminoácido se puede utilizar para
diseñar los cebadores de oligonucleótidos degenerados. Los
cebadores de oligonucleótidos degenerados se pueden utilizar para
obtener el ácido nucleico que codifica el polipéptido por RCP. Una
vez obtenido, el ácido nucleico se pueda secuenciar, clonar en un
vector de expresión apropiado e introducir en un
microorganismo.
Se puede utilizar cualquier método para
introducir una molécula exógena de ácido nucleico en una célula.
Por ejemplo, el choque calórico, la lipofección, la
electroporación, la Conjugación, la fusión de protoplastos y la
biolística son métodos comunes para introducir el ácido nucleico en
bacterias y células de la levadura. (Véase, p. ej., Ito y col., J.
Bacterol. 153:163-8, 1983; Durrens y col. Curr.
Genet. 18:712, 1990; Sambrooker y col., Molecular cloning: A
laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York,
USA, segunda edición, 1989; y Becker y Guarente, Methods in
Enzymology 194:182-7, 1991). Otros métodos para
expresar una secuencia del aminoácido de una molécula exógena de
ácido nucleico incluyen, entre otros, la creación de un ácido
nucleico tal que un elemento regulador promueva la expresión de una
secuencia de ácido nucleico que codifique a un polipéptido.
Típicamente, los elementos reguladores son las secuencias de ADN
que regulan la expresión de otras secuencias de ADN al nivel de la
transcripción. Así, los elementos reguladores incluyen, entre
otros, promotores, potenciadores y similares. Cualquier tipo de
promotor puede utilizarse para expresar una secuencia del
aminoácido de una molécula exógena de ácido nucleico. Los ejemplos
de promotores incluyen, entre otros, a promotores constitutivos,
promotores específicos del tejido y promotores sensibles o no
sensibles a un estímulo particular (p. ej., la luz, el oxígeno, la
concentración química). Los métodos para transferir los ácidos
nucleicos en las células mamíferas también son conocidos, p. ej.
usar vectores virales.
Una molécula exógena de ácido nucleico contenida
dentro de una célula particular de la divulgación se puede mantener
dentro de esa célula en cualquier forma. Por ejemplo, las moléculas
exógenas de ácido nucleico se pueden integrar en el genoma de la
célula o mantener en un estado episomal. Es decir, una célula puede
ser un transformante estable o transitorio. Un microorganismo puede
contener las copias simples o múltiples (p. ej. aprox. 5, 10, 20,
35, 50, 75, 100 o 150 copias), de una molécula exógena particular
de ácido nucleico, como p. ej. un ácido nucleico que codifica una
enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias del ácido nucleico y del
aminoácido proporcionadas en la presente descripción se pueden
utilizar con las células para producir
beta-alanina, pantotenato y 3-HP,
así como derivados de los mismos, p. ej. CoA, y compuestos
orgánicos, como p. ej. 1,3-propanodiol, ácido
acrílico, acrilato polimerizado, ésteres de acrilato, ésteres de
3-HP y 3-HP polimerizado. Dichas
células pueden ser de cualquier especie, como aquellas enumeradas
en las páginas de taxonomía en los institutos nacionales de salud.
Las células pueden ser eucarióticas o procarióticas. Por ejemplo,
las células modificadas genéticamente pueden ser células mamíferas
(p. ej., las células humanos, murinas y bobinas), las células
vegetales (p. ej., maíz, trigo, arroz y soja), las células fúngicas
(p. ej., las células de Aspergillus y Rhizopus), las células de la
levadura o las células bacterianas (p. ej., las células de
Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, Escherichia y Clostridium).
En un ejemplo, una célula es un microorganismo. El término
"microorganismo" se refiere a cualquier organismo microscópico
incluyendo, entre otros, bacterias, algas, hongos y protozoos. Así,
E. coli, B. subtilis, B. licheniformis, S. cerevisiae,
Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa y
Pichia pastoris son microorganismos y se pueden utilizar
según se describe en la presente descripción. En otro ejemplo, la
célula es parte de un organismo más grande, tal como una planta,
tal como una planta transgénica. Los ejemplos de las plantas que se
pueden utilizar para generar 3-HP, pantotenato u
otros compuestos orgánicos de beta-alanina incluyen,
entre otros, cultivos vegetales diseñados genéticamente como p.
ej. maíz, arroz, trigo y soja.
En un ejemplo, una célula se modifica
genéticamente de manera que se produce un compuesto orgánico en
particular. En una forma de realización, las células generan
3-HP y/o pantotenato a partir de
beta-alanina, como en las vías que se muestran en
las figuras 1 y 3. En otra forma de realización, las células
generan derivados de 3-HP y/o pantotenato, tal como
CoA, y compuestos orgánicos como p. ej.
1,3-propanodiol, ácido acrílico, acrilato
polimerizado, ésteres de acrilato, ésteres de 3-HP
y 3-HP polimerizado.
En un ejemplo, las células que se modifican
genéticamente para sintetizar un compuesto orgánico particular
contienen unas o más moléculas exógenas de ácido nucleico que
codifican los polipéptidos que tienen actividades enzimáticas
específicas. Por ejemplo, un microorganismo puede contener ácido
nucleico exógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de
deshidratasa de
3-hidroxipropionil-CoA. En este
caso, el acrilil-CoA se puede convertir en
3-hidroxipropionil-CoA que puede
llevar a la producción de 3 HP. Una célula puede recibir una
molécula exógena de ácido nucleico que codifica un polipéptido que
tiene una actividad enzimática que cataliza la producción de un
compuesto no producido normalmente por esa célula. Alternativamente,
una célula puede recibir una molécula exógena de ácido nucleico
que codifica un polipéptido que tiene una actividad enzimática que
cataliza la producción de un compuesto producido normalmente por
esa célula. En este caso, la célula modificada genéticamente puede
producir más del compuesto, o puede producir el compuesto más
eficientemente, que una célula similar que no tiene la modificación
genética.
En otro ejemplo, se divulga una célula que
contiene una molécula exógena de ácido nucleico que codifica un
polipéptido que tiene actividad enzimática que lleva a la formación
de 3-HP, pantotenato y/o los derivados de los
mismos. El/los producto(s) producido(s) se
puede(n) secretar de la célula, eliminando la necesidad de
interrumpir las membranas de la célula para recuperar el compuesto
orgánico. En un ejemplo, la célula produce 3-HP,
pantotenato y/o derivados de los mismos, con la concentración del
producto que es al menos aprox. 100 mg por L. (p. ej., al menos
aprox. 1 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 25 g/l, 50 g/l, 75 g/l, 80 g/l, 90
g/l, 100 g/l o 120 g/l). Al determinar la producción de un
compuesto como 3-HP, pantotenato y/o los derivados
de los mismos para una célula en particular, puede utilizarse
cualquier método. Consulte, p. ej., Applied Environmental
Microbiology 59(12):4261-5 (1993). Una
célula dentro del alcance de la divulgación puede utilizar una
variedad de fuentes de carbón.
Una célula puede contener unas o más moléculas
exógenas de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene
actividad enzimática que conduce a la formación de
3-HP, pantotenato y/o los derivados de los mismos,
p. ej. CoA, 1,3-propanodiol, ácido acrílico,
poli-acrilato, acrilato-ésteres,
3-HP-ésteres y polímeros y copolímeros que
contienen 3-HP. Los métodos para identificar las
células que contienen ácido nucleico exógeno son bien conocidos.
Dichos métodos incluyen, entre otros, RCP y técnicas de hibridación
del ácido nucleico, como p. ej. análisis Northern y Southern (véase
la sección hibridación descrita en la presente descripción). En
algunos casos, las técnicas immunohistoquímicas bioquímicas se
pueden utilizar para determinar si una célula contiene el ácido
nucleico particular al detectar la expresión del polipéptido
codificada por esa molécula en particular del ácido nucleico. Por
ejemplo, un anticuerpo que tiene especificidad para un polipéptido
se puede utilizar para determinar si una célula en particular
contiene el ácido nucleico que codifica el polipéptido o no.
Además, las técnicas Bioquímicas se pueden utilizar para determinar
si una célula contiene una molécula en particular de ácido nucleico
que codifica a un polipéptido que tiene actividad enzimática al
detectar un producto orgánico producido como resultado de la
expresión del polipéptido que tiene actividad enzimática. Por
ejemplo, la detección de 3-HP después de la
introducción del ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido
con actividad de deshidratasa de
3-hidroxipropionil-CoA en una célula
que no exprese normalmente tal polipéptido pueda indicar que la
célula no solo contiene la molécula exógena de ácido nucleico
introducida, sino que también expresa el polipéptido codificado de
la molécula exógena de ácido nucleico introducida. Los métodos para
detectar actividades enzimáticas específicas o la presencia de
productos orgánicos particulares son bien conocidos, p. ej. la
presencia de un compuesto orgánico, como p. ej.
3-HP, se puede determinar según lo descrito en
Sullivan y Clarke (.J. Assoc. Offic. Agr. Chemists,
38:514-8, 1955).
\vskip1.000000\baselineskip
Se divulgan las células modificadas
genéticamente con actividad reducida del polipéptido. El término
"reducido" o "disminuido", según se utiliza en la
presente descripción, con respecto a una actividad de la célula y
de un polipéptido en particular se refiere a un nivel inferior de
la actividad que aquella medida en una célula comparable de la
misma especie. Por ejemplo, un microorganismo particular que carece
de actividad enzimática X posee una actividad enzimática X reducida
si un microorganismo comparable tiene al menos cierta actividad
enzimática X.
\newpage
Una célula puede tener la actividad de cualquier
tipo de polipéptido reducido incluyendo, entre otros, enzimas,
factores de transcripción, transportadores, receptores, moléculas
indicadoras y similares. Por ejemplo, una célula puede contener una
molécula exógena de ácido nucleico que interrumpe una secuencia
reguladora y/o de codificación de un polipéptido que tiene actividad
de panD. La interrupción de panD puede evitar que una célula
genere
beta-alanina.
beta-alanina.
Las actividades reducidas del polipéptido pueden
ser el resultado de una concentración más baja del polipéptido, una
actividad específica más baja de un polipéptido o las combinaciones
de las mismas. Se pueden utilizar muchos métodos diferentes para
generar una célula que tenga una actividad reducida del
polipéptido. Por ejemplo, una célula se puede diseñar para tener
una secuencia reguladora interrumpida o secuencia de
polipéptido-codificación usando tecnología de
mutagénesis o bloqueo comunes. (Methods in Yeast Genetics (edición
1997), Adams, Gottschling, Kaiser, y Sterns, Cold Spring Harbor
Press, 1998; Datsenko y Wanner, Proc. Nati. Acad. Set. USA
97:6640-5, 2000), Alternativamente, la tecnología
antisentido se puede utilizar para reducir la actividad de un
polipéptido en particular. Por ejemplo, una célula se puede diseñar
para contener un ADNc que codifique una molécula antisentido que
evite que un polipéptido se traduzca. El término "molécula
antisentido" abarca cualquier molécula de ácido nucleico o
análogo de ácido nucleico (p. ej., ácidos nucleicos peptídicos) que
contenga una secuencia que corresponda a la hebra de codificación
de un polipéptido endógeno. Una molécula antisentido también puede
tener secuencias adyacentes (p. ej., secuencias reguladoras). Así,
las moléculas antisentido pueden ser ribozima u oligonucleótidos
antisentido. Un ribozima puede tener cualquier estructura general
incluyendo, entre otras, horquillado, cabeza de martillo o en
cabeza de hacha, siempre la molécula escinda el ARN. Además, el
silenciamiento génico se puede utilizar para reducir la actividad
de un polipéptido en particular.
Una célula con actividad reducida de un
polipéptido se puede identificar usando cualquier método. Por
ejemplo, los análisis de la actividad enzimática, como p. ej. los
que se describen en la descripción, se pueden utilizar para
identificar las células que tienen una actividad enzimática
reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos purificados que tienen
actividad enzimática se pueden utilizar solamente o conjuntamente
con las células para producir pantotenato, 3-HP,
y/o derivados de los mismos, p. ej. CoA, y compuestos orgánicos
como por ejemplo 1,3-propanodiol, ácido acrílico,
acrilato polimerizado, ésteres de acrilato, ésteres de
3-HP y 3-HP polimerizado. Por
ejemplo, una preparación que incluye un polipéptido sustancialmente
puro que tiene actividad de
3-Sustancialmente-CoA deshidratasa
se puede utilizar para catalizar la formación de
3-HP-CoA, un precursor del
3-HP.
Además, los extractos sin células que contienen
un polipéptido que tiene actividad enzimática se pueden utilizar
solamente o conjuntamente con los polipéptidos y/o las células
purificados para producir pantotenato, 3-HP y/o
derivados de los mismos. Por ejemplo, un extracto sin células que
incluye un polipéptido que tiene actividad de transferasa de CoA se
puede utilizar para formar
beta-alanil-CoA a partir de
beta-alanina, mientras que un microorganismo que
contiene los polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas
necesarias para catalizar las reacciones necesarias para formar
3-HP de
beta-alanil-CoA puede utilizarse
para producir 3-HP. En otro ejemplo, un extracto sin
células que incluye alfa-ketopantoato
hidroximetiltransferasa (EC. 2.1.2.11),
alfa-ketopantoato reductasa (EC. 1.1 1 169) y
pantotenato sintasa (EC 6.3.2.1) se puede utilizar para formar
pantotenato de beta-alanina. Cualquier método se
puede utilizar para producir un extracto sin células. Por ejemplo,
el choque osmótico, la sonicación y/o un ciclo repetido de
hielo-deshielo seguido de un filtración y/o
centrifugación se pueden utilizar para producir un extracto sin
células de las células intactas.
Una célula, un polipéptido purificado y/o un
extracto sin células se pueden utilizar para producir
3-HP es decir, a su vez, tratarse químicamente para
producir otro compuesto. Por ejemplo, un microorganismo puede
utilizarse para producir 3-HP, mientras que un
proceso químico se utiliza para modificar 3-HP en
un derivado tal como 3-HP polimerizado o un éster de
3-HP. Asimismo, un proceso químico se puede
utilizar para producir un compuesto particular es decir, a su vez,
convertirse en 3-HP o en otro compuesto orgánico
(p. ej. 1,3-propanodiol., ácido acrílico, acrilato
polimerizado, ésteres de acrilato, ésteres de 3-HP
y 3-HP polimerizado) usando una célula, un
polipéptido sustancialmente puro y/o un extracto sin células
descrito en la descripción. Por ejemplo, se puede utilizar un
proceso químico para producir acrilil-CoA, mientras
que un microorganismo se puede utilizar para convertir
acrilil-CoA en 3-HP.
De forma similar, una célula, un polipéptido
purificado, y/o un extracto sin células se pueden utilizar para
producir pantotenato es decir, a su vez, tratado químicamente para
producir otro compuesto. Por ejemplo, un microorganismo puede
utilizarse para producir pantotenato, mientras que un proceso
químico se utiliza para modificar pantotenato en un derivado, como
p. ej. CoA. Asimismo, un proceso químico se puede utilizar para
producir un compuesto particular es decir, a su vez, convertirse en
pantotenato u otro compuesto (p. ej., CoA) usando una célula, un
polipéptido sustancialmente puro y/o un extracto sin células
descrito en la presente descripción. Por ejemplo, se puede utilizar
un proceso químico para producir pantotenato, mientras que un
microorganismo puede utilizarse para convertir ácido pantoténico en
CoA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se divulga un método para producir pantotenato,
3-HP y/o derivados de los mismos al cultivar
células de producción, como p. ej. un microorganismo, en un medio
de cultivo como pantotenato, 3-HP y/o derivados de
los mismos. En general, el medio de cultivo y/o las condiciones del
cultivo pueden ser tales que los microorganismos crecen a una
densidad adecuada y producen el producto eficazmente. Para los
procesos de producción a gran escala, puede utilizarse cualquier
método, p. ej. los descritos en otros lugares (Manual of Industrial
Microbiology and Biotechnology, 2ª edición, Editores: Demain y
Davies, ASM Press; y Principles of Fermentation Technology,
Stanbury y Whitaker, Pergamon).
En resumen, un tanque grande (p. ej., un tanque
de 100 galones, 200 galones, 500 galones o más) que contiene el
medio de cultivo apropiado con, por ejemplo, una fuente del carbono
de glucosa, se inocula con un microorganismo particular. Después
de la inoculación, los microorganismos se incuban para permitir que
se produzca la biomasa. Una vez que se alcance la biomasa deseada,
el caldo que contiene los microorganismos puede ser transferirse a
un segundo tanque. Este segundo tanque puede tener cualquier
tamaño. Por ejemplo, el segundo tanque puede ser más grande, más
pequeño,o del mismo tamaño que el primer tanque. Generalmente, el
segundo tanque será más grande que el primer, de manera que se
pueda añadir medio de cultivo adicional al caldo del primer tanque.
Además, el medio de cultivo dentro de este segundo tanque puede ser
igual, o diferente de, aquel usado en el primer tanque. Por
ejemplo, el primer tanque puede contener medio con xilosa, mientras
que el segundo tanque contiene medio con glucosa.
Una vez que se hayan transferido, los
microorganismos puedan incubarse para permitir la producción del
pantotenato, el 3-HP y/o los derivados de los
mismos. Una vez que se haya producido, se puede utilizar cualquier
método para aislar el producto formado. Por ejemplo, se pueden
utilizar técnicas comunes de separación para quitar la biomasa del
caldo y procedimientos comunes de aislamiento (p. ej., extracción,
destilación y procedimientos de intercambio fónico) para obtener
pantotenato, 3-HP y/o los derivados de los mismos a
partir del caldo sin microorganismos. Alternativamente, el producto
puede aislarse mientras se está produciendo o puede aislarse del
caldo después de que la fase de producción del producto ha
finalizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos generados mediante cualquiera de
los pasos proporcionados en las figuras 1 y 3 se pueden convertir
químicamente en otros compuestos orgánicos. Por ejemplo, el
3-HP se puede hidrogenar para formar
1,3-propanodiol, un monómero de poliéster valioso.
La hidrogenación de un ácido orgánico tal como 3-HP
se puede realizar usando cualquier método como aquellos usados para
hidrogenar el ácido succínico y/o el ácido láctico. Por ejemplo,
3-HP se puede hidrogenar con un catalizador
metálico. En otro ejemplo, 3-HP se puede deshidratar
para formar ácido acrílico. Cualquier método se puede utilizar para
realizar una reacción de deshidratación. Por ejemplo,
3-HP se puede calentar en presencia de un
catalizador (p. ej. un catalizador ácido metálico o mineral) para
formar ácido acrílico. El 1,3-propanodiol también
se puede crear con los polipéptidos que tienen la actividad de
óxido-reductasa (p. ej., enzimas en la clase de
enzimas 111) in vitro o in vivo.
En otro ejemplo, el pantotenato se puede
utilizar para formar los polipéptidos de la coenzima A que tienen
actividades de pantotenato kinasa (EC 2.7. 1.33),
4'-fosfopantetenoil-1-cisteína
sintetasa (EC 6.3.2.5), 4'-fosfopantotenoilcisteína
descarboxilasa (EC 4.1.1.36),
ATP:4'-fosfopanteteina adeniltransferasa (EC
2.7.7.3) y defosfo-CoA kinasa (EC 2.7.1.24) se
pueden utilizar para generar la coenzima A.
\vskip1.000000\baselineskip
Se divulgan los métodos para producir
1,3-propanodiol y las células para dicha
producción. El 1,3-propanediol se puede generar a
partir de 3-HP-CoA o
3-HP. Los microorganismos o las células que
producen 3-HP-CoA o
3-HP se pueden diseñar para generar
1,3-propanediol al clonar los genes que codifican
las enzimas que tienen una actividad de tipo
óxido-reductasa/deshidrogenasa.
Por ejemplo,
3-HP-CoA puede convertirse a
1,3-propanediol en presencia de una enzima que
tiene actividad de aldehído: NAD(+) óxido-reductasa
de acetilación y alcohol:NAD(+) óxido-reductasa.
Esta conversión se puede realizar in vivo, in vitro o una
combinación de los mismos. Estas actividades las pueden realizar un
solo polipéptido o dos polipéptidos diferentes. Las enzimas únicas
incluyen aldehído-alcohol deshidrogenasa
multi-función (EC 1 2 1 10) de E. coli
(Goodlove y col. Gene 85:209-14, 1989; GenBank
número de acceso M33504). Se han descrito las enzimas que tienen
una actividad singular de aldehído: NAD(+)
óxido-reductasa de acetilación (EC 1 2 1 10) o
alcohol: NAD(+) óxido-reductasa (EC 111 1). Los
genes que codifican el aldehído deshidrogenasa de acetilación de
E. coli (GenBank número de acceso Y09555) y el alcohol
deshidrogenasa de Z mobilis (GenBank número de acceso
M32100) se han aislado y secuenciado. Los genes que codifican estas
enzimas se pueden clonar en un organismo o célula que produce
3-HP-CoA mediante técnicas
biológicas moleculares bien conocidas. La expresión de estas
enzimas en organismos o células que producen 3-HP
Co-A dará lugar a la capacidad de convertir
3-HP-CoA a
1,3-propanediol. La especificidad del sustrato de
estas enzimas para 3-HP-CoA se puede
cambiar o mejorar mediante técnicas bien conocidas tales como la
RCP con tendencia al error o hebras de E. coli mutante.
La conversión de 3-HP a
1,3-propanediol se puede alcanzar al poner en
contacto 3-HP con las enzimas que tienen actividad
de aldehído deshidrogenasa (NAD (P)+) (EC 1 2 1 -) y alcohol
deshidrogenasa (EC 1 1.1.1). Dicha conversión se puede realizar
in vivo, in vitro o en una combinación de los mismos. Por
ejemplo, reproducir y expresar estos genes en un microorganismo o
célula que produzca 3-HP dará lugar a la capacidad
de la célula o del organismo de convertir 3-HP a
1,3-propanediol. La especificidad del sustrato de
estas enzimas para 3-HP-CoA se puede
cambiar o mejorar mediante técnicas bien conocidas según se
describe anteriormente.
La formación del 1,3-propanediol
durante la fermentación o en un análisis in vitro se puede
analizar con una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
La separación cromatográfica puede alcanzarse usando una columna de
intercambio fónico BioRad 87H. Una fase móvil del ácido sulfúrico
0.01N se pasa en un caudal de 0,6 ml/minuto y la columna se
mantiene a una temperatura de 45-65ºC. La presencia
de 1,3-propanediol en la muestra se puede detectar
el usar un detector del índice de refracción (Skraly y col, Appl.
Environ Microbiol 64:98-105, 1998).
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar una
2,3-aminomutasa de alanina que produce el
beta-alanina para alanina, las enzimas que realizan
reacciones similares, pero que no aceptan alanina o
beta-alanina como sustratos, se mutaron
aleatoriamente y después se analizaron para identificar las enzimas
mutantes que tienen actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina. Este ejemplo describe la Clonación de
2,3-aminomutasa de lisina (EC 5.4 3 2) a partir de
Bacillus subtilis (ID. SEC. N.º: 3 y 31). Un experto en la materia
entenderá que se pueden utilizar métodos similares para clonar una
2,3-aminomutasa de lisina a cualquier organismo
deseado.
Se escogió la 2,3-aminomutasa de
lisina de B subtilis porque se informó que es estable al
aire, permitiendo así la selección para la actividad en condiciones
anaeróbicas y aeróbicas. Además, porque esta enzima tiene una
actividad específica más baja que la
2,3-aminomutasa de lisina de C subterminale,
se redujeron los efectos deletéreos al anfitrión de E. coli
mediante sobreexpresión de la 2,3-aminomutasa de
lisina activa o de la 2,3-aminomutasa de
alanina.
Para clonar el gen B subtitis KAM que
codifica la 2,3-aminomutasa de lisina, se
utilizaron los siguientes métodos. B subtilis ATCC 6051 se
obtuvo de la ATCC (American Type Culture Collection (ATCC),
Manassas, VA) y el ADN cromosómico se preparó con el genómico Tip
(Qiagen, Valencia, CA) siguiendo el procedimiento recomendado por
el fabricante. Los cebadores diseñados para ampliar el gen KAM
mediante la RCP se basaron en la secuencia completa del genoma de
B. subtilis (GenBank número de acceso: NC 000964) y las
secuencias divulgadas en Chen y col. (Biochem J
348:539-49, 2000) y en la patente de los EE. W. N.º
6.248.874. Se utilizaron los cebadores de la RCP:
GCGC
GAGGAGGAGT TCATATGAAAAACAAATGGT AT AAAC (ID. SEC. N.º: 1), y CGGGCACCGCTTCGAGGC GGC CGC ACCATTCGCATG (ID. SEC. N.º: 2), en donde los nucleótidos subrayados de son los sitios NdeI y NotI usados para clonar el producto de la RCP en plásmidos.
GAGGAGGAGT TCATATGAAAAACAAATGGT AT AAAC (ID. SEC. N.º: 1), y CGGGCACCGCTTCGAGGC GGC CGC ACCATTCGCATG (ID. SEC. N.º: 2), en donde los nucleótidos subrayados de son los sitios NdeI y NotI usados para clonar el producto de la RCP en plásmidos.
La reacción de la RCP (100/\mul del volumen
total) contenía 0,5 \mug de ADN cromosómico B subtilis,
0,2 \muM cada cedador (ID. SEC. N.º: 1 y 2), 10 \mul de 10
porciones de tampón de reacción PfuTurbo (Stratagen, Inc., La
Jolla, CA), 0,2 \muM cada trifosfato nucleótido y 5 unidades de
polimerasa de ADN de PfuTurbo (Stratagen). La reacción de la RCP se
calentó a 95ºC durante 2 minutos, después se sometió a 30 ciclos de
95ºC durante 30 segundos, 58ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 2
minutos, y después se mantuvo a 72º durante unos 10 minutos
adicionales.
El producto de la RCP resultante se precipitó
mediante la adición de 3 \mul de Pellet Paint
Co-Precipitant (Novagen, Inc., Madison, Wl), 100
\mul de 5 M de acetato de amonio y 400 \mul de etanol. La
reacción resuspendida se digirió con NdeI y NotI (New England
Biolabs, Inc., Beverly, MA), purificada con el kit de purificación
QlAquick PCR Purification Kit (Qiagen) y ligada con el kit de
ligado Rapid DNA Ligation Kit (Roche Molecular brochemicals,
Indianapolis, IN) en pET-22b (+) (Novagen) o pPRONde
digerido con las mismas enzimas para generar los plásmidos
pET-KAMI y pPRO-KAMl,
respectivamente. El plásmido pPRONde es un derivado de pPROLar Al22
(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) en el cual se
construyó un sitio Ndel al codon iniciadar ATG mediante muiagenesis
dirigida al oligonucleótido con el kit de mutagénesis dirigido al
sitio QuikChange de Stratagen. La expresión de la
2,3-aminomutasa de lisina en estos vectores está
conducida por el promotor T7 en pE 122(b) o un promotor
lac/ara híbrido en pPRO-Nde. Las ligaduras se
transformaron en E. coli DH5a (Life Technologies,
Gaithersburg, MD) y los clones se verificaron mediante
secuenciación. El gen B subtilis KAM se muestra en ID. SEC.
N.º: 3 (la secuencia del aminoácido se muestra en ID. SEC. N.º: 31)
y se mutagenizó según se describe a continuación para identificar
los mutantes que tenían actividad de 2,3-aminomutasa
de alanina.
\vskip1.000000\baselineskip
Para introducir las mutaciones en el gen B
subtilis KAM (ID. SEC. N.º: 3) in vitro se utilizaron
varios métodos de la RCP con tendencia al error. Existen métodos
similares que se pueden utilizar para introducir mutaciones en
cualquier gen KAM que codifica una 2,3-aminomutasa
de lisina, tal como un gen KAM de Deinococcus radiodurans (GenBank
número de acceso: RDR02336), que es un 5296 idéntico a la secuencia
de la proteína de B subtilis KAM, Clostridium
subterminale (GenBank número de acceso: AF159I46), o P.
gingivalis (genoma incompleto, The Institute for Genomic
Research, consulte el Ejemplo 5).
En un método, un kit de la mutagénesis GeneMorph
PCR Mutagenesis Kit (Stratagene) se utilizó de la siguiente manera.
Las reacciones de 50 \muL se utilizaron con 10,1, 0,1 ó 0,01 ng
de plantilla de ADN pEI-KAM1 y 125 ng cada uno del
cebador promotor T7 y el cebador de terminación T7 (secuencias
según se proporcionan en el catálogo del producto de Novagen) según
lo recomienda el fabricante, se calentaron a 94ºC durante 30
segundos, se sometieron a 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos,
50ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 2 minutos, y después se
mantuvieron a 72º durante 10 minutos adicionales.
Los productos de la RCP resultantes se
precipitaron con 3 \mul Pellet Paint
Co-Precipitant (Novagen), 50 \mul de 5 M de
acetato de amonio, 200 \mul de etanol, se volvieron a suspender,
se digirieron con NdeI y NotI, y 120 ng de cada producto mutagénico
de la RCP se ligó al pPRONde digerido con las mismas endonucleasas
con el kit de ligado Rapid DNA Ligation Kit Roche Molecular
Biochemicals). Las mezclas de ligado se digirieron con endonucleasa
de restricción BamHI (New England Biolabs) para linearizar el ADN
residual del vector sin inserción, precipitado con etanol según se
describe, y se transformó en células electrocompetentes ElectroMax
DH10B E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los transformantes
resistentes a la canamicina de cada biblioteca, que contiene
15.000-20.000 clones, se rasparon de las placas de
selección y las bibliotecas de plásmido mutagienizadas se
prepararon con el plásmido Midi Kit
(Qiagen).
(Qiagen).
En un segundo método, basado en el método de RCP
Mn-dITP de Xu y col. (BioTechniques
27:1102-8, 1999), se llevó a cabo una redonda
inicial de la RCP con tendencia al error inducido por manganeso con
ADIN pET-KAM1 como plantilla y cebadores homólogos
a las regiones del promotor T7 y terminación T7. La mezcla de
reacción (\muL 50) contenía tampón de la RCP IX Taq con 2 mM
MgCl_{2}, 100 ng de ADN, 40 \muM MnCl_{2}, 0,2 \muM de cada
cebador, 200 \muM de cada dNTP y cinco unidades de polimerasa Taq
(Roche Molecular Biochemicals). El programa de la RCP incluida una
desnaturalización inicial a 94ºC durante 2 minutos; 20 ciclos a
94ºC durante 30 segundos, 54ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2,25
minutos; y una extensión final a 72ºC durante 7 minutos.
Se utilizaron tres microlitros del producto de
la RCP como plantilla en una segunda ronda de la RCP usando dITP
para realizar la desunión de nucleótidos durante la amplificación.
La mezcla de la segunda ronda de la RCP (100 \muL) contenía el
tampón de la RCP de polimerasa Taq IX con 2 mM de MgCl_{2}, 40
\muM de dITP, 0,2 \muM de cada cebador, 200 \muM de cada dNTP
y 10 unidades de polimerasa de ADN de Taq. El programa de la RCP
fue idéntico al de la primer ronda pero consistió en 30 ciclos. El
producto de la RCP se separó en un gel de
TAE-agarosa al 1% y se purificó con el
procedimiento de purificación en gel QlAquick (Qiagen). El producto
purificado de la RCP se digirió con las enzimas de restricción NdeI
y NotI y se ligó al vector pPRO-Nde que se había
digerido con las mismas enzimas, purificado mediante gel y se había
desfosforilado con la fosfatasa alcalina de camarón (Roche). La
reacción del ligado se llevó a cabo con una ligasa de ADN T4 (New
England BioLabs) a 16ºC durante 16 horas, después de lo cual otro
volumen de tampón de ligado y ligasa IX se añadió y la reacción
continúo durante dos horas a temperatura ambiente.
La reacción del ligado se purificó con una
columna de purificación QlAquick PCR Purification y se eluyó en 30
\muL de agua. Dos microlitros de la reacción se transformaron en
células de E. coli Electromax^{TM} DH10B^{TM} (Life
Technologies, Inc.) y se colocaron en placas en medio LB que
contenía 25 \mu/ml de canamicina. Las ligaduras de control
indicaron un nivel de fondo (vectores sin inserción) de menos del
3%. Las diferentes transformaciones se realizaron para obtener
aprox. 40.000 colonias. Las colonias se rasparon de las placas y el
ADN del plásmido se preparó con el procedimiento Qiagen MiniSpin
plásmido. El ADN del plásmido se precipitó con acetato de amonio y
etanol para aumentar su concentración antes de la transformación en
huéspedes de selección. El ADN del plásmido también se aisló de
colonias individuales y se secuenció para obtener una estimación
de la tasa de mutación. La tasa media de mutación con este método
fue de 1,3 nucleótidos alterados por Kb.
En un tercer método, la RCP mutagénica se llevó
a cabo en base al protocolo de Cadwell y Joyce (PCR Methods Appl.
2:28-33, 1992). Este método utilizó varias
dilusiones de un tampón mutagénico que contenía 21,2 mM de
MgCl_{2}, 2,0 mM de MnCl_{2}, 3,2 mM de dTIP y 3,2 mM de dCIP.
Los siguientes volúmenes del tampón mutagénico se agregaron a
reacciones separadas de la RCP (cada uno 100 \mul de volumen
final): 0, 1,56, 3,13, 6,25, 12,5 y 25 \muL, además del tampón de
la RCP IX Taq con 1,5 mM de MgCl_{2}, 0,25 \muM de cada
cebador, 200 \muM de cada dNTP, 50 ng de ADN de plantilla
pET-KAM1 y 10 unidades de ADN polimerasa Taq
(Roche). El programa de la RCP incluyó una desnaturalización
inicial a 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos a 94ºC durante 30
segundos, a 54ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 2,25 minutos; y
una extensión final a 72ºC durante 7 minutos.
Después de la RCP, las reacciones se trataron
para eliminar la polimerasa Taq al añadir EDTA a una concentración
final de 5 mM, SDS al 0,5% y proteinasa K a 50 \mug/mL (Matsumura
and Ellington, Mutagenic PCR of Protein-Coding
Genes for In Vitro Evolution. Methods in Molecular Biology
Vol 182: In Vitro Mutagenesis, 2ª ed. Ed J Braman Hamana.
Press Inc Totowa, NJ, 2001). Las reacciones se calentaron a 65ºC
durante 15 minutos y se purificaron con gel como se describe
anteriormente. Los primeros cuatro tratamientos produjeron el
suficiente producto de la RCP para la clonación. El producto de la
RCP se digirió, se ligó con pPRONde y se transformó en células
E. coli Electromax^{TM} DH10B^{TM}. El ADN del plásmido
se aisló de colonias individuales y se secuenció para obtener una
estimación de la tasa de mutación. La tasa de mutación media para
los tratamientos 1-4 varió de 0 a 0,47% (0 a 4,7
nucleótidos alterados por Kb). Las diferentes transformaciones se
realizaron para obtener aprox. 50,000 colonias por cada tratamiento
seleccionado. Las colonias se rasparon de las placas y el ADN del
plásmido se preparó con un procedimiento Qiagen MiniSpin plásmido.
El ADN del plásmido se precipitó con acetato de amonio y etanol
para aumentar su concentración antes de la transformación en
huéspedes de selección.
\vskip1.000000\baselineskip
Para introducir las mutaciones en el gen B
subtilis KAM (ID. SEC. N.º: 3) in vivo, el pPRO KAMI se
traspasó a través de la hebra mutante E. coli XLIRed
(Stratagen). Aproximadamente 50 ng de pPRO-KAMI
plásmido se transformó en glóbulos rojos-I XL según
instrucciones del fabricante y los transformantes se colocaron en
placas en el medio LB que contenía 25 \mug/ml de canamicina.
Aproximadamente 200 transformantes seleccionados al azar se
rasparon de las placas de transformación y se inocularon en dos
porciones de 5 ml de caldo LB que contenía 25 \mug/ml de
canamicina. Una porción creció durante la noche a 30ºC y la otra a
37ºC.
Una pequeña alícuota de cada porción se inoculó
en el caldo fresco LB que contenía 25 \mug/ml de canamicina,
mientras que el ADN del plásmido mutagenizado se extrajo de 1,5 ml
de cada cultivo con el QiaSpin Mini kit (Qiagen). El crecimiento
durante la noche y la extracción del ADN del plásmido se repitió
dos veces más, generando bibliotecas mutagenizadas de plásmidos a
partir de dos temperaturas diferentes y tres ciclos de exposición
de aumento a la hebra mutante. Los ADN de los plásmidos se
concentraron mediante precipitación de etanol antes de la
transformación en hebras de selección.
\vskip1.000000\baselineskip
Para Identificar los genes que codifican los
polipéptidos que pueden llevar a cabo la reacción de la
2,3-aminomutasa de alanina, es necesario realizar
una evaluación o selección eficaz para la actividad deseada. Por lo
tanto, se desarrolló un método de selección al reconocer que E.
coli utiliza beta-alanina para la síntesis del
ácido pantoténico que, a su vez, es un componente de la coenzima A
(CoA) y de la proteína del portador de acil (ACP). La CoA y la ACP
son los portadores predominantes del grupo acil en organismos vivos
y esenciales para el crecimiento.
En E. coli, la vía principal a la
beta-alanina es el aspartato en una reacción
catalizada por el aspartato decarboxilasa (EC 4 1 1 1 1), que es
codificado por el gen panD (figura 3) Una mutación funcional de la
deleción de panD genera una auxotropía de la
beta-alanina y la inhibición del crecimiento, que
puede aliviarse con la adición exógena de pantotenato o
beta-alanina, o mediante la producción de
beta-alanina de otra fuente.
En el análisis se utilizaron dos hebras de E.
coli que son deficientes en síntesis de
beta-alanina. La hebra DV1 (#6865, E. coli
Genetic Stock Center, New Haven CT; Vallari y Rock, J Bacteriol
164:136-42, 1985) es un E. coli mutante
realizado por mutagénesis química, que tiene mutaciones
(cromosómicas) del anfitrión de los genes de panF y panD que hace
que ambos genes sean no funcionales. El gen de panF codifica la
absorción del pantotenato del medio y, por lo tanto, la combinación
de panD y panF proporciona un requisito más riguroso para que la
beta-alanina crezca. Por lo tanto, aunque la hebra
DV1 era conocida, su uso para seleccionar las células que tenían
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina no era
conocida anteriormente.
La otra hebra de selección, BW25113
\DeltapanD::CAT, incluye una deleción del locus de panD para
evitar la reversión de la mutación de panD que podría crecer sin la
beta-alanina exógena. Esta hebra, que tiene una
inserción de un marcador de resistencia de cloranfenicol conferido
por el gen CAT en el locus panD, se creó con el método de
inactivación del gen de Datsenko y Wanner (Proc Nati Acad Sci. USA
97:6640-5, 2000) usando hebras de E. coli
BW25113/pKD46 y BW 25141/pKD3 para el E. Coli Genetic Stock
Center.
El gen CAT de pKD3 se amplificó con cebadores
TATCAATTCGTTACAGGCGATACATGGCACGCTTCGGC
GCG TGI AGGCTGG AGCTGCTT C (ID. SEC. N.º: 4) yGATGTCGCGGCIGGTGAGTAACCAGCCGATGTCGC
GGCIGGTGAGTAACCAGCCGCAGGGATAACAACATA7GAATATCCTCCTTA G (ID. SEC. N.º: 5), en donde la secuencia subrayada corresponde a las regiones en el cromosoma E. coli inmediatamente antes y después del locus panD, respectivamente, y las regiones sin subrayar son homólogos a las regiones en pKD3 que permiten la amplificación de un fragmento que contiene el gen CAT. La reacción de la RCP incluyó 30 \mul de 10 porciones de tampón concentrado para la CRP (Roche Molecular Biochemicals), el plásmido pKD3, 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 \mulM cada cebador y 15 unidades de polimerasa Taq (Roche Molecular Biochemicals) en un volumen final de 300 \mul. La reacción de la RCP se incubó a 95ºC durante 30 segundos seguido de 30 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, 45ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto y después 72ºC durante 10 minutos. El producto de la RCP se precipitó con etanol, se digirió con Dpnl, purificado con el kit de purificación QlAquick PCR Purification Kit (Qiagen) y se transformó en BW25113/pKD46 que expresaban las funciones de la recombinación. Los transformantes se colocaron en las placas LB que contenían 25 \mug/ml de cloranfenicol y 5 \muM de beta-alanina.
GCG TGI AGGCTGG AGCTGCTT C (ID. SEC. N.º: 4) yGATGTCGCGGCIGGTGAGTAACCAGCCGATGTCGC
GGCIGGTGAGTAACCAGCCGCAGGGATAACAACATA7GAATATCCTCCTTA G (ID. SEC. N.º: 5), en donde la secuencia subrayada corresponde a las regiones en el cromosoma E. coli inmediatamente antes y después del locus panD, respectivamente, y las regiones sin subrayar son homólogos a las regiones en pKD3 que permiten la amplificación de un fragmento que contiene el gen CAT. La reacción de la RCP incluyó 30 \mul de 10 porciones de tampón concentrado para la CRP (Roche Molecular Biochemicals), el plásmido pKD3, 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 \mulM cada cebador y 15 unidades de polimerasa Taq (Roche Molecular Biochemicals) en un volumen final de 300 \mul. La reacción de la RCP se incubó a 95ºC durante 30 segundos seguido de 30 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, 45ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto y después 72ºC durante 10 minutos. El producto de la RCP se precipitó con etanol, se digirió con Dpnl, purificado con el kit de purificación QlAquick PCR Purification Kit (Qiagen) y se transformó en BW25113/pKD46 que expresaban las funciones de la recombinación. Los transformantes se colocaron en las placas LB que contenían 25 \mug/ml de cloranfenicol y 5 \muM de beta-alanina.
\newpage
Las transformaciones resistentes al
cloranfenicol eran colonias únicas purificadas en el medio LB no
selectivo complementado con 5 \muM de
beta-alanina a 43ºC, y colonias únicas probadas
para la retención de la resistencia del cloranfenicol, la pérdida
de resistencia de la ampicilina (que indica la cura de pKD46) y el
requisito para la beta-alanina de crecimiento en un
medio mínimo de M9-glucosa. La confirmación de la
inserción correcta del gen del CAT en el locus de panD se llevó a
cabo mediante la RCP de la colonia de la hebra resultante de
\DeltapanD CAT con cebadores que flanquean el locus de inserción
(TTACCGAGC AGCGT TCAGAG, ID. SEC. N.º: 6; y
CACCTGGCGGTGA
CAACCAT, ID. SEC. N.º: 7). Mientras que se espera que el locus de panD de tipo natural brinde un producto de la RCP de 71,3 pares de bases, el constructor de \Deltapan CAT generó un producto de 1.215 pares de bases. Un derivado de la hebra de \DeltapanD CAT, en la que el gen insertado de CAT se elimina mediante la actividad de la recombinasa FLP codificada por el plásmido pCP20, se creó según se describe anteriormente (Datsenko y Wanner, Proc Natl Acad Set USA 97: 6640-5,2000). Esta hebra se conoce como \DeltapanD.
CAACCAT, ID. SEC. N.º: 7). Mientras que se espera que el locus de panD de tipo natural brinde un producto de la RCP de 71,3 pares de bases, el constructor de \Deltapan CAT generó un producto de 1.215 pares de bases. Un derivado de la hebra de \DeltapanD CAT, en la que el gen insertado de CAT se elimina mediante la actividad de la recombinasa FLP codificada por el plásmido pCP20, se creó según se describe anteriormente (Datsenko y Wanner, Proc Natl Acad Set USA 97: 6640-5,2000). Esta hebra se conoce como \DeltapanD.
Una vía secundaria a la
beta-alanina existe en E. coli basado en la
vía reductora del catabolismo del uracilo (West, Can, J Microbiol,
44: 1106-9, 1998, figura. 2). En esta vía, el
uracilo se reduce a dihidrouracilo por la enzima dihidropirimidina
deshidrogenasa (EC 1.3 1 2). El dihidrouracilo es convertido
entonces por la dihidropirimidinasa (EC 3.5 2 2) a
N-carbamoilo-beta-alanina,
que, a su vez, es hidrolizado por el
N-carbamoilo-beta-alanina
amidohidrolasa (EC 3 5 1 6) a beta-alanina, CO2 y
NH_{3}. Para evitar la formación de beta-alanina
por esta vía, el gen que codifica la dihidropirimidina
deshidrogenasa, yeiA (GenBank número de acceso AAC75208) se eliminó
por inserción con el método de Datsenko y Wanner, según se describe
anteriormente. El gen del CAT de pKD3 se amplificó con los
cebadores GCGGCGTGAAGTTTCCCAACCCGTTCTGCCTCTCTTCTTCGT
GTAGGCTGG AGCIGCT T C (ID. SEC. N.º: 8), y
TTACAACGITACCGGGTGTTCTTTCTCGCCTTTCTTAAACCAIATGAATATCCTCCTTAG
(ID. SEC. N.º: 9), en donde la secuencia subrayada corresponde a
las regiones en el cromosoma E. coli inmediatamente antes y
después del locus yeiA, respectivamente, y las regiones sin
subrayar son homólogos a las regiones en pKD3 que permiten la
amplificación de un fragmento que contiene el gen CAT. Los mutantes
de inserción resistentes al cloranfenicol se aislaron como se
describe anteriormente y el marcador de resistencia se transdujo en
la hebra \DeltapanD para generar el mutante doble
\DeltapanD/AyeiA CAT.
Se generaron células electrocompetentes de E.
coli BW 25115 \DeltapanD: CAT, \DeltapanD, o
\DeltapanD/AyeiA CAT, y se utilizaron como anfitriones para la
transformación de bibliotecas de los aminomutase ADN de la
2,3-aminomutasa de lisina mutante, según se describe
en el Ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de la 2,3-aminomutasa de
lisina de Porphyromonas gingivalis se amplificó mediante RCP
del ADN genómico y clonado en los sitios de NdeI y NodI del vector
pET22B (Novagen). Se llevó a cabo una PCR mutagénica con el método
de Cadwell y Joyce (PCR Methods Appl 2:28-33,
1992), con las cebadores del promotor T7 y terminación T7 para la
amplificación y 6,25 \muL o 9,38 \muL de tampón mutagénico por
cada 100 \muL de reacción. Los productos de la RCP se purificaron
con gel (Qiagen) y se digirieron secuencialmente con NdeI y NotI.
Los productos digeridos de la RCP se ligaron al vector pPRONde y se
transformaron en E. coli Electromax^{TM} DH10B^{TM}
según se describió en el Ejemplo 2. Las diferentes
transformaciones, se realizaron para obtener por lo menos 60.000
colonias por tratamiento de mutación. Las colonias se rasparon de
las placas y el ADN del plásmido se preparó y precipitó para
incrementar su concentración. Las bibliotecas resultantes tenían
tasas de mutación del 0,3% y 0,35%.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bibliotecas de plásmidos de la
2,3-aminomutasa de lisina mutagenizada generadas
anteriormente en el Ejemplo 2 se transformaron en células DV1
electrocompetentes de la hebra de E. coli. Los transformantes
se colocaron en placas LB que contenían 25 \mug/ml de canamicina
en la dilusión apropiada para obtener una estimación de los
transformantes totales y en el medio mínimo M9 complementado con
0,4% de glucosa, 0,2% de Vitamin Assay Casamino Acids (DIFCO/Becton
Dickinson, Sparks, MD) y 25 \mug/ml de canamicina (Sigma, St
Louis, MO). Para algunas selecciones, se agregó IPTG a 0,25 mM.
La hebra \DeltapanD.CAT de E. coli
descrita en el Ejemplo 4 se transformó de manera similar con las
bibliotecas generadas en los ejemplo 2, 3 y 5, excepto que los
transformantes se colocaron en placas en el medio mínimo M9
complementados con 0,4% de glucosa y 25 \mug/ml de canamicina
(Sigma, St. Louis. MO). Para algunas selecciones en bibliotecas de
B. subtilis, se agregó IPTG a 0,25 mM, se agregó
Fe_{2}(NH_{4})_{2}SO_{4} a 50 \muM y
cloroamfenicol a 25 \mug/mL. Para algunas selecciones en
bibliotecas de P gingivalis, se agregó IPTG a 50 \muM, se
agregó Fe_{2}(NH_{4})_{2}SO_{4} a 50 \muM,
se agregó cloroamfenicol a 25 \mug/mL, se agregó
L-alanina a 1 mg/mL y se agregó
L-lisina a 2 mg/mL.
Los transformantes que crecían en las placas
medias mínimas surgieron a una frecuencia de aproximadamente 1 x
10^{4} relativo a la cantidad total de transformantes según se
mide por el número de colonias que crecían en LB más 25 \mug/ml
de canamicina. El ADN del plásmido de las colonias que crecían en
medio mínimo se preparó usando el kit de Qiagen Miniprep y se
retransformaron en la hebra \DeltapanD CAT de E. coli para
confirmar que la capacidad de crecer en ausencia de
beta-alanina añadida la confería una función
llevada por el plásmido. El ADN del plásmido se preparó de colonias
retransformadas y el gen kam se secuenció para determinar cualquier
cambio con respecto las secuencias del gen kam del tipo natural de
B subtilis o P gingivalis kam.
Una secuencia mutada del gen kam de B
subtilis, que codifica una 2,3-aminomutasa de
alanina se muestra en ID. SEC. N.º: 20 y la secuencia
correspondiente del aminoácido se muestra en ID. SEC. N.º: 21. El
plásmido que lleva esta secuencia se designa
pLC4-7LCl. Se observaron tres cambios del aminoácido
en la secuencia mutada al compararse con la secuencia del gen kam
de B subtilis del tipo natural (figura 4). Había una sustitución de
L103M, una sustitución de M136V y una sustitución de D339H en la
proteína de la 2,3-aminomutasa de alanina (en donde
el primer aminoácido es la secuencia del tipo natural, el número es
la posición del aminoácido y el segundo aminoácido es la secuencia
observada en la secuencia de 2,3-aminomutasa de
alanina). El motivo de enlace del grupo FeS (aminoácidos
134-146 de ID. SEC. N.º: 21) y motivo de enlace PLP
putativo (aminoácidos 288-293 de ID. SEC. N.º: 21)
también muestran en la figura 4. Esta es la primera demostración de
las secuencias del ácido nucleico y aminoácido de la
2,3-aminomutasa de alanina.
Una secuencia mutada del gen kam de P
gingivalis, que codifica una 2,3-aminomutasa de
alanina se muestra en ID. SEC. N.º 29, y la secuencia
correspondiente del aminoácido se muestra en ID. SEC. N.º 30. Se
observaron cinco cambios del aminoácido en la secuencia mutada si
se compara a la secuencia de P. gingivalis del tipo natural
(figura 5). Había una sustitución de N19Y, una sustitución de L53P,
una sustitución de H85Q, una sustitución de D331G y sustitución de
M342T en la proteína de la 2,3-aminomutasa de
alanina. Sin embargo, es posible que no todas estas mutaciones sean
necesarias para tener actividad de 2,3-aminomutasa
de alanina. Al alinear las proteínas mutantes de B subtilis
y P gingivalis, la sustitución de P gingivalis D331G
está situada en la ubicación correspondiente dentro de la proteína
como el sustituto de B subtilis D339H (figura 6), indicando
que puede ser de importancia particular. El motivo de enlace del
grupo FeS (aminoácidos 126-138 de ID. SEC. N.º: 30)
y motivo de enlace PLP putativo (aminoácidos 280-285
de ID. SEC. N.º: 30) también muestran en la figura 5. Esta es otra
demostración de las secuencias del ácido nucleico y aminoácido de
la 2,3-aminomutasa de alanina.
La capacidad de los genes mutados de kam de
convertir alfa-alanina a
beta-alanina, y de permitir así la producción de
pantotenato, se determinó usando las pruebas líquidas de crecimiento
que comparan el crecimiento de los transformantes de OpanD en
medio mínimo que contienen pantotenato con crecimiento en medio que
carece de pantotenato. El inóculo de inicio incluía células lavadas
de un cultivo de crecimiento o células raspadas de una placa.
Como ejemplo de usar células lavadas como
inóculo, los cultivos de 3-5 mL se iniciaron de
colonias únicas y se hicieron crecer durante la noche a 30ºC en
caldo LB más 40 \mug/ml de canamicina. La OD600 de los cultivos
se leyeron y los números equivalentes de células de cada cultivo se
cosechó por centrifugación (aprox. 600 OD total x \muL, p. ej. OD
4,0 x 150 \mul). Las células se lavaron dos veces con NaCl al
0,85%, se resuspendieron en 200 \mul de NaCl al 0,85%, y 30
\muL se utilizaron para inocular 3 ml de del medio mínimo basado
en M9 (6 g/L de Na_{2}HPO_{4}, 3 g/L de KH_{2}PO_{4}, 0.5
g/L de NaCl, 1 g/L de NH_{4}Cl, 2 mM de MgSO_{4}, 4 g/L de
glucosa, 1 mM de CaCl_{2}, 250 \muM de IPTG, 40 \mug/mL de
canamicina, 50 \muM de
FE(NH_{4})_{2}(SO_{4})_{2}) en
tubos de vidrio de 13 mm de diámetro a una OD_{600} de inicio de
aprox. 0,05. Los cultivos de control contenían medio mínimo
complementados con 20 \muM de pantotenato o caldo LB con 40
\mug/mL de canamicina. Los cultivos se cultivaron a 37ºC sin
agitar durante aprox. 18 horas y se midió la OD_{600}.
Según se muestra en la tabla 1, mientras que las
células que llevaban el control del vector se cultivaron en medio
mínimo sin pantotenato o beta-alanina añadido a una
OD_{600} media de 0,21 con reservas residuales de pantotenato o
beta-alanina (aprox. el 30% de la OD_{600}
alcanzada en presencia de pantotenato), las células que llevaban el
clon de la 2,3-aminomutasa de alanina se cultivaron
a una OD_{600} media de 0,50, aprox. el 90% de lo logrado en
presencia de pantotenato. La adición de Fe^{2+} no incrementó el
crecimiento de las células de control del vector, pero permitió que
las células que poseen 2,3-aminomutasa de alanina
lograran densidades de crecimiento iguales a las obtenidas en
presencia de pantotenato o en un medio rico de caldo LB. Esto
indica que el gen de la 2,3-aminomutasa de alanina
proporciona una fuente de beta-alanina que
complementa la mutación de panD.
Como ejemplo de usar cultivos en placas como
inóculo, una colonia se raspó de una placa y se resuspendió en 50
\mul de medio mínimo que carecía de pantotenato. El resuspensión
(20 \mul) se utilizó para inocular de 1 mL de medio mínimo en un
microtubo de 1.5 ml y 20 \muL se utilizaron para inocular un mL
de medio mínimo complementado con pantotenato. El último cultivo
sirvió como control para la cantidad de variación de inóculo
añadido. La respuesta del cultivo al crecimiento sin pantotenato se
expresó como cociente de crecimiento en medios que carecen de
pantotenato al crecimiento en medios que contienen pantotenato. Los
cultivos se cultivaron a 25-37ºC durante
1-3 días sin agitar y se midió la OD_{600}. Se
obtuvo una prueba más anaeróbica del crecimiento al llenar los
tubos a un mayor grado. Esto fue útil en para probar los mutantes
de P gingivalis:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las mutaciones identificadas en el gen de la
2,3-aminomutasa de lisina de B. subtilis del
tipo natural anterior en el ejemplo 5 se crearon individualmente en
el gen de 2,3-aminomutasa de lisina de B
subtilis del tipo natural (ID. SEC. N.º: 3) con el kit de
mutagénesis dirigida al sitio Stratagen
Quik-Change^{TM}. Los oligonucleótidos usados
para generar la mutación de L103M fueron:
CACAAAACAAAATACGAIATGGAAGACCCGCTCCATGAGGArGAA
GATTCA (ID. SEC. N.º: 10), y TGAATCnCATCCrCATGGAGCGGGTCTTCCATArCGTATTTTGTTTTGTG (ID. SEC. N.º: 11). Los oligonucleótidos usados para generar la mutación de MI36V fueron: GAAICAATGTTCCGTA
TACTGCCGCT AC (ID. SEC. N.º: 12) y GTAGCGGCAGTATACGGAACATTGATTC (ID. SEC. N.º: 13). Los oligonucleótidos a generar la mutación de D339H fueron: GTTCCTACCTTTGTTGTACACGCACCAGGCG (ID. SEC. N.º: 14), y CGCCTGGTGCGIGTACAACAAAGGTAGGAAC (ID. SEC. N.º: 15).
GATTCA (ID. SEC. N.º: 10), y TGAATCnCATCCrCATGGAGCGGGTCTTCCATArCGTATTTTGTTTTGTG (ID. SEC. N.º: 11). Los oligonucleótidos usados para generar la mutación de MI36V fueron: GAAICAATGTTCCGTA
TACTGCCGCT AC (ID. SEC. N.º: 12) y GTAGCGGCAGTATACGGAACATTGATTC (ID. SEC. N.º: 13). Los oligonucleótidos a generar la mutación de D339H fueron: GTTCCTACCTTTGTTGTACACGCACCAGGCG (ID. SEC. N.º: 14), y CGCCTGGTGCGIGTACAACAAAGGTAGGAAC (ID. SEC. N.º: 15).
Usando la prueba líquida de crecimiento descrita
en el ejemplo 6, las células con plásmidos que portaban la mutación
de L103M solos fueron capaces de crecer en un medio mínimo sin
pantotenato ni beta-alanina añadido, no obstante, no
al mismo grado que las células con el plásmido
pLC4-7LC1, en donde aquellas que llevaban las
mutaciones de M136V o D339H solo tenían el fenotipo anfitrión de
LpanD. Las combinaciones de la mutación de L103M con las mutaciones
de M136V y de D339H en una secuencia de B subtilis kam del
tipo salvaje de otra manera proporcionaron un gen que confería la
misma capacidad de crecer en ausencia de
beta-alanina o pantotenato que
pLC4-7LC1, confirmando que estas tres mutaciones, o
un subconjunto de ellas, son suficientes para proporcionar
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina.
Un experto en la materia entenderá que pueden
generarse sustituciones alternativas en estas posiciones. Por lo
tanto, usando oligonucleótidos similares a ID. SEC. N.º: 10 y 11 en
los cuales el codón que correspondía a L103 fue aleatorizado, los
mutantes con las sustituciones L103K, L103R, L103E y L 1035 que se
obtuvieron proporcionaron a la hebra de \DeltapanD la capacidad de
crecer en ausencia de beta-alanina o pantotenato.
Además, usando los oligonucleótidos similares a ID. SEC. N.º: 14 y
15 en los cuales el codón que correspondía a D339 fue aleatorizado,
los mutantes con las sustituciones D339Q, D339T, D339N se
obtuvieron proporcionaron a la hebra de \DeltapanD la capacidad
de crecer en ausencia de beta-alanina o
pantotenato.
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Un método alternativo para identificar las
células que tienen actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina es colocar las células en placas, tales como las células
DV1 o panD CAT descritas anteriormente, en los medios descritos
anteriormente, sin transfectarlas con la biblioteca de
2,3-aminomutasa de lisina mutagenizada. Dichas
células se seleccionan según se describe anteriormente y se
verifican para detectar la presencia de actividad de
2,3-aminomutasa de alanina según se describe en los
ejemplos 6 y 9.
Las células se pueden mutagenizar antes de
colocar en las placas, p. ej. al exponer las células a la
irradiación UV o a productos químicos (tales como MES). Esto
permite el aislamiento de los mutantes que tienen mutaciones en uno
o más genes diferentes que hagan que la célula tenga actividad de
2,3-aminomutasa de alanina.
Alternativamente, las células pueden no
alterarse antes de colocarse en las placas (es decir, no
transformarse ni Mutarenizarse). Este método permite el aislamiento
de hebras que se obtienen naturalmente y que poseen actividad de
2,3-aminomutasa de alanina.
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Las células obtenidas con los métodos de
investigación descritos anteriormente se verificaron para comprobar
su actividad de 2,3-aminomutasa de alanina. Para
las células que se transformaron con una biblioteca mutagenizada
(ejemplos 2, 3 y 5), los plásmidos se aislaron del anfitrión de la
selección mediante métodos estándares de biología molecular. Los
plásmidos resultantes se retransformaron en el anfitrión de
selección, los plásmidos se volvieron a aislar y los clones
resultantes se secuenciaron según se describe en el ejemplo 6. Para
las células sin transformar (ejemplo 8), el gen que confiere la
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina se puede
clonar, p. ej. con la clonación en perdigonada.
Se pueden utilizar varios análisis para evaluar
la actividad de 2,3-aminomutasa de alanina, tal
como la biosíntesis que mide de [^{13}C]coenzima A
[3-^{13}C] de alanina vía
[3-^{13}C] beta-alanina, al
utilizar un ensayo de enzimas que mida la conversión de la
alfa-alanina a beta-alanina, o un
ensayo que mida la presencia de beta-alanina en
células o extractos de células que posean
2,3-aminomutasa de alanina.
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La deleción del gen panD, cuyo producto génico
(aspartato 1-decarboxilasa) cataliza la producción
del beta-alanina del aspartato, lo que genera una
deficiencia de pantotenato y por lo tanto a la incapacidad de
producir la coenzima A. Sin embargo, las células OpanD que poseen
2,3-aminomutasa de alanina capaz de producir
beta-alanina a partir de
alfa-alanina podrían ser capaces de evitar esta
deficiencia; en especial, estas células, cuando crecen en presencia
de [3-^{13}C]alfa-alanina,
incorporarían la etiqueta [^{13}C] en la coenzima A. Esta prueba
se utilizó para confirmar que la secuencia de
2,3-aminomutasa de alanina de B subtilis
aislada en el Ejemplo 6 (ID. SEC. N.º: 20 y 21) podía catalizar la
conversión de alfa-alanina a
beta-alanina.
Las células de E. coli \DeltapanD/AyeiA
CAT transformadas con pPRONde, pPRO-KAM1 o
pLC4-7LC1 se cultivaron durante la noche a 37ºC en
el medio mínimo (ejemplo 6) excepto con 25 \mug/ml de canamicina
y 10 \muM de
Fe(NH_{4})_{2}(SO_{4})_{2} y con
1 mM de alanina (no etiquetada) y 10 \muM de
beta-alanina. Los cultivos se diluyeron 100 veces
en medio mínimo con 25 \mug/ml de canamicina, 10 \muM de
Fe(NH_{4})_{2}(SO_{4})_{2}, y 11
mM de
[3-^{13}C]alfa-alanina
(99%, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA) pero ninguna
alfa-alanina ni beta-alanina no
etiquetada. Después de un cultivo a 30ºC durante aprox. 20 horas,
las células se recuperaron por centrifugación y los extractos se
generaron por el método de Jaskowski y Rock (J. Bacteriol 148:
926-32, 1981) en presencia del 10 mM de
ditiotreitol para convertir los tioésteres de la coenzima A a la
forma libre de sulfidrilo.
Los extractos se analizaron con un sistema
Micromass Ultima LC/MS que incluía una cromatografía líquida Waters
2690 con un monitor de absorbencia Waters 996
Photo-Diode Array (PDA) colocado en serie entre la
cromatografía y el espectrómetro de masas triple cuadrupolo. Las
separaciones de LC se realizaron con una columna de cromatografía
de fase inversa de 4,6 x 150 mm YMC ODS-AQ
(partículas de 3 \mum, poros 120 A) a temperatura ambiente. La
elución del gradiente de los analitos se realizó con 25 mM acuosos
de acetato de amonio que contenía 0,5% (v/v) de ácido acético
(tampón A) y acetonitrilo que contiene 0,5% (v/v) de ácido acético
(tampón B). La elución fue isocráctica al 10% B.,
0-10 minutos, después lineal de 10% B a 100% B,
10-12 minutos. El caudal era de 0,250 mL/min y la
absorbancia de UV de la matriz de fotodiodos se verificó de 200 nm
a 400 nm. Todos los parámetros del sistema electrospray MS se
optimizaron y seleccionaron en base a la generación de iones
moleculares protonados ([M + H]+) de los analitos del interés y a
la producción de iones fragmento característicos. Los siguientes
parámetros instrumentales se utilizaron para la detección de
ESI-MS de la coenzima A en el modo de ion positivo:
capilar: 4.0 V; cono: 80 V; hexagonal 1:25 V; abertura: 0 V;
hexagonal 2:0 V; temperatura de origen: 100ºC; temperatura de
evaporación del solvente: 350ºC; gas de evaporación del solvente:
500 1/h; gas del cono: 40 1/h; resolución baja de masa: 15,0;
resolución alta de masa: 15,0; energía del ion: 0; multiplicador:
650. Las incertidumbres para los cocientes informados de masa/carga
(m/z) y las masas moleculares son \pm0,01%. El cociente de áreas
máximas con m/z 769 ([13C]coenzima A) al área máxima con m/z
768 (coenzima sin etiquetar A) se demuestra en la tabla 3.
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Los resultados que se muestran en la tabla 3
confirman que las células que llevan el plásmido que poseen el
mutante con la actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina (ID. SEC. N.º: 20 y 21), cuando se cultivan en
[13C]alfa-alanina, producen un cociente más
alto de [13C]coenzima A a [12C]coenzima A en
comparación con la abundancia normal de la [13C]coenzima A o
de las células que llevan el vector o el gen de
2,3-aminomutasa de lisina de B subtilis del
tipo natural. Esto demuestra que la secuencia de
2,3-aminomutasa de alanina puede producir
beta-alanina, un intermedio obligatorio en la
biosíntesis de la coenzima A.
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Se puede llevar a cabo un ensayo de enzimas que
mida la conversión de alfa-alanina a
beta-alanina, o que mida la presencia de
beta-alanina para determinar si una célula tiene
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina. Por
ejemplo, el método descrito por Chen y col. (Biochem. J
348:539-49, 2000) para determinar la actividad de
2,3-aminomutasa de lisina se puede aplicar a la
determinación de la actividad de 2,3-aminomutasa de
alanina al sustituir L- [U-I4C] alanina por L-
[U-I4C] lisina en la incubación con el extracto de
células o enzimas reductivamente preincubados, y la separación de
la alfa-alanina y la beta-alanina
radiactiva mediante electroforesis de papel seguido recuento de
centelleo de los puntos que corresponden a la
alfa-alanina y a la beta-alanina,
respectivamente. Alternativamente, la
2,3-aminomutasa de alanina purificada y
reductivamente preincubada se puede incubar con la
alfa-alanina y la mezcla de reacción se puede
separar mediante cromatografía líquida de alto rendimiento para
separar la beta-alanina de la
alfa-alanina y para cuantificar el producto (Abe y
col. J. Chromatography 3,112:43-9, 1998).
La formación de beta-alanina a
partir de alfa-alanina se puede también supervisar
en las células enteras de la hebra de E. coli \DeltapanD
CAT transformada con un plásmido que expresa una
2,3-aminomutasa de alanina mediante incubación de
las células en el medio mínimo M9 (Sambrook y col. Clonación
molecular: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989)
que contiene 0,4% (w/v) de glucosa, 25 \mug/ml de canamicina
(para un plásmido que confiere resistencia a la canamicina), 0,25
nM de IPTG y 1 mg/ml de [I3C] alfa-alanina
etiquetada, extracción de las células y detección de [I3C]
beta-alanina por cromatografía líquida de alto
rendimiento/espectometría de masas usando los métodos conocidos por
los expertos en la materia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron las vías biosintéticas que permiten
la producción de 3-HP a través de la
beta-alanina (figura 1). Una vía a
3-HP a partir de la beta-alanina
implica el uso de un polipéptido que tiene actividad de CoA
transferasa, es decir, una enzima de una clase de enzimas que
transfiere un grupo CoA de un metabolito a otro. Según se muestra
en la figura 1, la beta-alanina se puede convertir
a beta-alanina-CoA con un
polipéptido que tenga actividad de CoA transferasa y donantes de
CoA tales como el acetilo-CoA o el
propionil-CoA. Alternativamente, el
beta-alanil CoA se puede generar por la acción de un
polipéptido que tenga actividad de CoA sintetasa. El
beta-alanil-CoA puede se puede
deaminar para formar acrilil-CoA mediante un
polipéptido que tenga actividad de la liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA. La hidración del
acrilil-CoA en la posición beta para proporcionar
3-HP-CoA se puede realizar a partir
de un polipéptido que tenga actividad de
3-HP-CoA deshidratara. El
3-HP-CoA puede actuar como donante
de CoApara la beta-alanina, una reacción que puede
catalizar un polipéptido que tiene actividad de CoA transferasa,
generando así 3-HP como producto. Alternativamente,
el 3-HP-CoA se puede hidrolizar
para proporcionar 3-HP a partir de un polipéptido
que tenga actividad específica de CoA hidrolasa.
Estas vías utilizan varias enzimas que se
clonaron y expresaron según se describe en el documento WO 02/42418
o a continuación. Las células Megasphaera elsdenii (ATCC
17753), Chloroflexus aurantiacus (ATCC 29365),
Clostridium propionicum (AICC 25522), Clostridium
acetobutylicum (ATCC 824), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
17933), Bacillus subtilis (ATCC 23857), Atcaligenes
faecalis (ATCC 25094) y ADNc de ratas (Clontech, Palo Alto, CA)
se utilizaron como fuentes de ADN. Un experto en la materia
entenderá que se pueden utilizar métodos similares para obtener la
secuencia de estas enzimas a partir de cualquier organismo.
Los genes individuales se clonaron, expresaron y
analizaron antes de las creaciones del operón. Los operones
sintéticos para la producción de 3-HP en E.
coli se clonaron en un vector de expresión de
pET-11a (5,7 kb) bajo el control del promotor T7
(Novagen), el vector pPROLar.A (2,6 kb) con promotor
lac/ara-1 (CJontech, Palo Alto, CA), y el vector
pTrc99A (4,2 kb) con el promotor trc (Pharmacia Biotech, Uppsala,
Suecia). Varios operones con diversas combinaciones de genes
relevantes se generaron según se describe a continuación. Los
ensayos para propionil-CoA transferasa y
acrilil-CoA hidratasa (o 3-HP
deshidratasa) se describen en el documento WO 02/42418.
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A. faecalis (ATCC # 700596) es una
bacteria de marisma que metaboliza el acrilato a través del
3-HP. El 3-HP producido a partir
del acrilato probablemente se convierte a semialdehído malónico por
una 3-HP deshidrogenasa. Para aislar el gen que
codifica esta deshidrogenasa, el ADN genómico A faecalis se
aisló de la siguiente manera. Se cultivó un cultivo de cinco mL de
A faecalis a 37ºC en caldo tripticasa de soja y las células
después se resuspendieron en 400 ml de tampón TE. Posteriormente,
20 ml de 10% SDS, 100 \mul de 10 mg/ml proteinasa K y 10 mL de 100
mg/ml lisozima se agregaron a la suspensión celular y la mezcla se
incubó durante dos horas a 42ºC y se mezcló ocasionalmente. A esta
mezcla, se añadió 150 ml de fenol y la mezcla se agito durante al
menos dos horas a 37ºC, después se añadió aproximadamente 800 ml de
cloroformo. La mezcla se mezcló en el vórtice y se centrifugó
durante 30 minutos a 15.000 RPM. La fase acuosa superior se
transfirió a un tubo limpio de microcentrifugación y el ADN se
precipitó con 60 ml de 3M NaOAc y aproximadamente 1 mL de etanol, y
se recuperó por bobinado. El ADN se resuspendió con 400 ml de
tampón TE y 20 ml, 200 mg/ml de RNase se añadieron y la mezcla se
incubó durante 1 hora a 37ºC. El ADN se reprecipitó con NaOAC y
etanol, se lavó varias veces con etanol al 70% y se resuspendió en
tampón TE.
Los siguientes cebadores degenerados se
diseñaron en base a regiones conservadas de secuencias de
aminoácido públicamente conocidas de los genes de
3-hidroxiisobutrato deshidrogenasa que se espera
que sean homólogos a la 3-HP deshidrogenasa deseada
AFHPDHFI:5'TIYATYGGBYTSGGBAAYATGGG3' (ID. SEC. N.º: 16);
AFHPDHF
2:5'GAYGCNCCNGTBWSSGGBGG 3'(ID. SEC. N.º: 17); y AFHPDHR2:5'CATRTTRTTRCARATYTTNGC 3' (ID. SEC. N.º: 18). Las reacciones de la RCP que usaban el ADN genómico de A faecalis como plantilla se llevaron a cabo con ADN polimerasa de Taq (Roche) según las instrucciones del fabricante, usando cualquier ID. SEC. N.º: 16 y 18 (reacción A) o ID. SEC. N.º: 17 y 18 (reacción B). El programa de la RCP consistió en una incubación inicial a 94ºC durante 2 minutos, 4 ciclos a 94ºC, 30 segundos; 56ºC, 45 segundos, 72ºC 3 minutos; 4 ciclos a 94ºC, 30 segundos; 54ºC, 45 segundos, 72ºC 3 minutos; 4 ciclos a 94ºC, 30 segundos; 52ºC, 45 segundos, 72ºC 3 minutos; 4 ciclos a 94ºC, 30 segundos; 50ºC, 45 segundos, 72ºC 3 minutos; y 16 ciclos a 94ºC, 30 segundos; 47ºC, 45 segundos, 72ºC 3 minutos, seguido por una incubación final de 7 minutos a 72ºC. Ambas reacciones dieron productos de aprox. 500 bp. El producto de la RCP de la reacción A fue aislado con gel, clonado en pCRII y transformado en células TOP 10 químicas competentes, seleccionadas en el medio LB que contenía 50 mg/ml de canamicina. Se seleccionaron los clones con el tamaño correcto de inserción y se aislaron y secuenciaron sus plásmidos De acuerdo con estas secuencias, se diseñaron los siguientes cebadores anidados específicos del gen: GWHPDF1: 5' GGTTTACGAGGGCGAGAACGGCITGCT 3' (ID. SEC. N.º: 19); GWHPDF2: 5' CAAGCTGGGTCTGTTCA'f GCTGGATG 3' (ID. SEC. N.º: 26); GWHPDR1: 5' AAGCGGTTCTCGCCCTCGTAAACCTGA 3' (ID. SEC. N.º: 27); y GWHPDR2: 5' CGCATTCAAGTCAAA
GACGTTCAGGCT A 3'' (ID. SEC. N.º: 32) y la técnica Genome Walk se utilizó para aislar el ORF entero del gen que codifica a 3-HP deshidrogenasa. La secuencia de este ORF se demuestra en ID. SEC. N.º: 33, y la secuencia correspondiente de la proteína en ID. SEC. N.º: 34. El codón de inicio de 3-HP deshidrogenasa está en la posición 408 del ID. SEC. N.º: 33 y está precedido por un sitio de unión al ribosoma en las posiciones 397-403 del ID. SEC. N.º: 33. El codón de terminación está en la posición 1304 del ID. SEC. N.º: 33.
2:5'GAYGCNCCNGTBWSSGGBGG 3'(ID. SEC. N.º: 17); y AFHPDHR2:5'CATRTTRTTRCARATYTTNGC 3' (ID. SEC. N.º: 18). Las reacciones de la RCP que usaban el ADN genómico de A faecalis como plantilla se llevaron a cabo con ADN polimerasa de Taq (Roche) según las instrucciones del fabricante, usando cualquier ID. SEC. N.º: 16 y 18 (reacción A) o ID. SEC. N.º: 17 y 18 (reacción B). El programa de la RCP consistió en una incubación inicial a 94ºC durante 2 minutos, 4 ciclos a 94ºC, 30 segundos; 56ºC, 45 segundos, 72ºC 3 minutos; 4 ciclos a 94ºC, 30 segundos; 54ºC, 45 segundos, 72ºC 3 minutos; 4 ciclos a 94ºC, 30 segundos; 52ºC, 45 segundos, 72ºC 3 minutos; 4 ciclos a 94ºC, 30 segundos; 50ºC, 45 segundos, 72ºC 3 minutos; y 16 ciclos a 94ºC, 30 segundos; 47ºC, 45 segundos, 72ºC 3 minutos, seguido por una incubación final de 7 minutos a 72ºC. Ambas reacciones dieron productos de aprox. 500 bp. El producto de la RCP de la reacción A fue aislado con gel, clonado en pCRII y transformado en células TOP 10 químicas competentes, seleccionadas en el medio LB que contenía 50 mg/ml de canamicina. Se seleccionaron los clones con el tamaño correcto de inserción y se aislaron y secuenciaron sus plásmidos De acuerdo con estas secuencias, se diseñaron los siguientes cebadores anidados específicos del gen: GWHPDF1: 5' GGTTTACGAGGGCGAGAACGGCITGCT 3' (ID. SEC. N.º: 19); GWHPDF2: 5' CAAGCTGGGTCTGTTCA'f GCTGGATG 3' (ID. SEC. N.º: 26); GWHPDR1: 5' AAGCGGTTCTCGCCCTCGTAAACCTGA 3' (ID. SEC. N.º: 27); y GWHPDR2: 5' CGCATTCAAGTCAAA
GACGTTCAGGCT A 3'' (ID. SEC. N.º: 32) y la técnica Genome Walk se utilizó para aislar el ORF entero del gen que codifica a 3-HP deshidrogenasa. La secuencia de este ORF se demuestra en ID. SEC. N.º: 33, y la secuencia correspondiente de la proteína en ID. SEC. N.º: 34. El codón de inicio de 3-HP deshidrogenasa está en la posición 408 del ID. SEC. N.º: 33 y está precedido por un sitio de unión al ribosoma en las posiciones 397-403 del ID. SEC. N.º: 33. El codón de terminación está en la posición 1304 del ID. SEC. N.º: 33.
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Dos genes acl se clonaron a partir de C.
propionicum. acl-1 (ID. SEC. N.º: 22) codifica
una proteína del aminoácido 145 (ID. SEC. N.º: 23) y
acl-2 (ID. SEC. N.º: 53) codifica una proteína del
aminoácido 144 (ID. SEC. N.º: 54) Estas dos proteínas son altamente
homólogas y se diferencian por solamente 8 aminoácidos en el
extremo C-terminal. Los genes acl-1
y acl-2 se clonaron con los siguientes cebadores:
OSacINdeF:
5'-GGGAAITCCATATGGTAGG
TAAAAAGGTTGTACATC-3' (ID. SEC. N.º: 35), y OSaclBamR: 5' CGACGGATCCATTCGTCCGCTTGAATAAC
TAAAG 3' (identificación SEQ NO 36) para acl-1 e ID. SEC. N.º: 35 y OSacl2BamR: 5' CGACGGATCCCGAAAAI
GTCACCAAAAATTAT'TGAG-3' (ID. SEC. N.º: 37) para acl-2. Las secuencias resultantes se clonaron en el vector pETIIa y se digirieron con Ndel y BamHI. Los plásmidos resultantes pACL-1 y pACL-2 se transformaron en células intoBL21 (DE3). BL21(DE3) que transporta pET 1 la (control), pACL-1 y pACL-2 se cultivaron en 10 ml de medio LB complementado con 50 \mug/ml de carbenicilina a OD600\sim0,5 y se indujo con 100 \muM de IPTG durante 4 horas. Las células inducidas se recogieron por centrifugación a 3.500 rpm en la centrifugadora Avanti J20 (Beckman, Fullerton, CA) y se trataron con Bug Buster (Novagen, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. El extracto celular resultante se utilizó en un ensayo de enzimas que siguió a la conversión de acrilil-CoA a beta-alanina-CoA (la reacción inversa con respecto a la vía en la figura 1).
TAAAAAGGTTGTACATC-3' (ID. SEC. N.º: 35), y OSaclBamR: 5' CGACGGATCCATTCGTCCGCTTGAATAAC
TAAAG 3' (identificación SEQ NO 36) para acl-1 e ID. SEC. N.º: 35 y OSacl2BamR: 5' CGACGGATCCCGAAAAI
GTCACCAAAAATTAT'TGAG-3' (ID. SEC. N.º: 37) para acl-2. Las secuencias resultantes se clonaron en el vector pETIIa y se digirieron con Ndel y BamHI. Los plásmidos resultantes pACL-1 y pACL-2 se transformaron en células intoBL21 (DE3). BL21(DE3) que transporta pET 1 la (control), pACL-1 y pACL-2 se cultivaron en 10 ml de medio LB complementado con 50 \mug/ml de carbenicilina a OD600\sim0,5 y se indujo con 100 \muM de IPTG durante 4 horas. Las células inducidas se recogieron por centrifugación a 3.500 rpm en la centrifugadora Avanti J20 (Beckman, Fullerton, CA) y se trataron con Bug Buster (Novagen, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. El extracto celular resultante se utilizó en un ensayo de enzimas que siguió a la conversión de acrilil-CoA a beta-alanina-CoA (la reacción inversa con respecto a la vía en la figura 1).
La mezcla del ensayo contenía 10 \mul de
1MTAE, 20 \mul de IM NH4C1, 2 \mul de 100 \muM
acrilil-CoA, 10 \mul de extracto celular y 158
\mul de H2O. La reacción enzimática se incubó durante cinco
minutos a 37ºC y se detuvo al añadir 200 \mul de IFA al 10%. La
mezcla se cargó en la columna Cl 8 Sep-Pak Vac lcc
(Waters, Milford, MA), se eluyó con 200 \mul de acetonitrilo al
40%, 0,1% de TFA y se redujo en volumen a 100 \mul mediante
centrifugación en SpeedVac (Savant Instruments, Holbrook, NY). La
formación de beta-alanil-CoA fue
detectada por LC-MS con métodos estándares. Tanto
las enzimas ACL-1 y ACL-2 estaban
activas y se utilizaron en la creación del operón de
beta-alanina.
\vskip1.000000\baselineskip
La estructura de lectura abierta yfdE
(identificada como proteína hipotética en la base de datos de
PubMed) se amplificó mediante RCP. Debido a que la estructura de
lectura abierta tenía dos sitios potenciales de inicio, las
siguientes cebadores se utilizaron para clonar y expresar ambos
genes: yfdE gtg nde sen
(5'-AGAGAGCATATGTCTTTTCACCT
TCGGC-3'; ID. SEC. N.º: 38), e yfdE atg nde sen (5'-AGAGAGGGATCCGCGGCTCCCACAATGTTGAAATG-3' ID. SEC. N.º: 39) para yfdE-1 e yfdE gtg nde sen (ID. SEC. N.º: 38) e yfdE bam anti(5'-AGAGAGCATATGACAAA
TAATGAAAGCAAAGG-3', ID. SEC. N.º: 40) para yfdE-2.
TCGGC-3'; ID. SEC. N.º: 38), e yfdE atg nde sen (5'-AGAGAGGGATCCGCGGCTCCCACAATGTTGAAATG-3' ID. SEC. N.º: 39) para yfdE-1 e yfdE gtg nde sen (ID. SEC. N.º: 38) e yfdE bam anti(5'-AGAGAGCATATGACAAA
TAATGAAAGCAAAGG-3', ID. SEC. N.º: 40) para yfdE-2.
El ADN cromosómico de E. coli MG1655 se
utilizó como plantilla para la RCP realizada con Pfu Turbo
(Stratagene) con las siguientes condiciones de la RCP: 94ºC durante
5 minutos; 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30
segundos y a 72ºC durante 2 minutos 20 segundos, seguido por la
incubación a 72ºC durante 7 minutos. La reacción de la RCP se
purificó con el kit de purificación QlAquick PCR purification Kit
(Qiagen), se digirió con NdeI y BamHI, se clonó en pEI28b (Novagen),
se digirió con las mismas enzimas de restricción y se transformó en
células TOP 10 químicamente competentes (Invitrogen). Los plásmidos
de los clones positivos se aislaron y transformaron en células de
expresión BL21 (DE3) (Novagen). Las células se cultivaron en un
medio LB a 37ºC a un OD_{600} de 0,6 y se indujeron con 100
\muM de IPTG y se incubaron unas 3 horas adicionales después de
la inducción. Las células se cosecharon por centrifugación y se
lavaron una vez con NaCl al 0,85%. El pellet de células se almacenó
a -80ºC para usarse en el futuro.
El pellet de células se descongeló en hielo y se
resuspendió en 4 ml de tampón de unión (kit de purificación de
Novagen HisBind). Escombros de las células se lisaron en tres
series mediante una prensa francesa (SLM Aminco) (10.000 PSI). Los
residuos celulares fue eliminaron mediante centrifugación (30.000
xg durante 30 minutos). El extracto se filtró a través de un filtro
de jeringa 0,45 \mum antes de cargarse en un cartucho Quick 900
siguiendo de las instrucciones del fabricante (Novagen). La
proteína purificada se desaló con una columna PD-10
(Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. El tampón usado
fue 5 mM de ácido bórico, 5 mM de Tris, 5 mM de ácido cítrico y 5
mM de NaH_{2}PO_{4} con un pH de 7,0.
La proteína purificada se ensayó con una mezcla
de reacción que contenía 100 mM de fosfato K, con un pH de 7,0, 100
mM de beta-alanina, 1 mM de
acetilo-CoA y 20 \mul de CoA transferasa
purificada en un volumen total de ensayo de 200 \mul. La reacción
se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente y después se
detuvo con 100 \mul de ácido trifluroacético a 10% (TFA). Las
reacciones se purificaron con 1 cc de cartuchos SepPak VAC (Waters
Milford, MA), se acondicionaron con 1 ml de metanol y se lavaron
dos veces con 1 mM de TFA al 0,1%. La muestra se aplicó y el
cartucho se lavó dos veces con 1 ml de TFA al 0,1%. La muestra se
eluyó con 200 \mul de acetonitrilo al 40% que contenía TFA al
0,1%, se secó al ½ de su volumen en un evaporador giratorio y se
analizó por cromatografía líquida/espectometría de masas. Se
encontró un pico correspondiente a la masa prevista para
beta-alanil-CoA en el ensayo con
las proteínas yfdE-1 o yfdE-2 y este
pico no se encontró en los controles que omitían las proteínas
purificadas, indicando que las CoA transferasas son responsables de
la síntesis de beta-alanil-CoA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron los operones para la siguiente
conversión: beta-alanina a
beta-alanil-CoA a
acrilil-CoA a 3-HP. Se amplificó un
gen que codifica la CoA transferasa a partir del ADN genómico de
M. elsdenii mediante RCP con OSNBpctF
(5'-GGGAATTCCATATGAGAAAAGrAGAAATCATTACAGCTG-3';
ID. SEC. N.º: 41) y OSHIR
(OSHTR:5'-ACGTTGATCTCCTTCTACATTATTTTTTCAGTCCCATG-3';
ID. SEC. N.º: 42) cebadores.
Se amplificó un gen CoA hidratasa a partir del
ADN genómico de C aurantiacus mediante RCP con cebadores
OSTHF (5'-CATGGGACTGAAAAAAT
AATGTAGAAGGAGATCAACGT-3'; ID. SEC. N.º: 43) y
OSHBR(5'-CGACGGATCCTCAACGACCACTGAAGT
TGG-3'; ID. SEC. N.º: 44).
Se amplificaron los genes liasa de amoniaco de
beta-alanina-CoA
ACL-1 y ACL-2 a partir del ADN
genómico de C propionicum con los pares imprimadores
OsaclXbaF
(5'-CTAGTCTAGAGCTTTCTAAGAAACGATTTCCG-3'';
ID. SEC. N.º: 45) y OSaclNdeR
(5'-GGGAATTCCATATGCGTAACTCCTCCIGCTATCATTCACCGGGGTGCTTTCT-3';
ID. SEC. N.º: 46) para acl-1 y OSacl2XbaF
(5'-CTAGTCTAGAGGAAACCGCTIAACGAACTC-3'';
ID. SEC. N.º: 47) y OSacl2-2NdeR
(5'-GGGAATTCCATATGCG
TAACTTCCTCCTGCTATTAnGAGGGTGCTTTGCArCC-3'; ID. SEC.
N.º: 48) para acl-2.
La RCP se realizó con un termovariador Perkin
Elmer 2400 con polimerasa Pfu Turbo (Stratagen) según las
instrucciones del fabricante. La RCP se realizó bajo las siguientes
condiciones: paso inicial de desnaturalización a 94ºC durante 2
minutos; 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos: 55ºC durante 30
segundos, 72ºC durante 2 minutos; extensión final a 72ºC durante 7
minutos. Los productos de la RCP resultantes se purificaron con gel
usando el kit de extracción con gel Qiagen Gel Extraction Kit
(Qiagen, Inc.).
Los productos de la RCP de la
CoA-transferasa y CoA-hidratasa se
montaron junto en un conjunto de RCP. Los cebadores OSIHF y OSHTR
(ID. SEC. N.º: 42 y 43) son complementarios entre sí, lo que
permitió que los extremos complementarios del ADN se hibridaran
mutuamente durante la RCP y extendieran el ADN en ambas
direcciones. Para garantizar la eficacia del conjunto y después de
la amplificación, se añadieron dos cebadores de terminación
OSNBpctF y OSHBR (ID. SEC. N.º: 41 y 44) a la mezcla del conjunto
de la RCP que contenía 100 ng de productos de la RCP
CoA-transferasa y CoA-hidratasa
purificadas y la mezcla de rTth polimerasa (Applied Biosystems,
Foster City, CA) y la polimerasa Pfu Turbo (Stratagen) en una
proporción de 8:1. La mezcla de polimerasa garantizó una fidelidad
más alta de la reacción de la RCP. El conjunto de la RCP se ejecutó
bajo siguientes condiciones: paso inicial de denaturalización a
94ºC durante 1 minuto; 20 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 54ºC
durante 30 segundos, 68ºC durante 2,5 minutos; extensión final a
68ºC durante 7 minutos. El producto de la RCP montado era
purificado con gel según se describe anteriormente y se digirió con
NdeI y BamHI. Los sitios para estas enzimas de restricción se
introdujeron al producto de la RCP montado con cebadores OSNB pctF
(NdeI) y OSHBR (BamHI) (ID. SEC. N.º: 41 y 44). El producto de la
RCP digerido se incubó a 80ºC durante 30 minutos (para inactivar
las enzimas de restricción) y se utilizó directamente para el
vector Hgation a pET 1 1a.
El vector pET 1 la se digirió con Ndel y BamHI,
se purificó con gel con el kit de extracción con gel Qiagen Gel
Extraction kit, se trató con fosfatasa alcalina de camarón según lo
sugiere el fabricante (Roche Molecular Biochemicals) y se utilizó
para el ligado con el producto de la RCP montado. El ligado se
realizó a 16ºC durante la noche con T4 ligasa (Roche Molecular
Biochemicals). La mezcla del ligado se transformó en células
químicamente competentes de NovaBlue (Novagen) y se colocaron en
placas LB complementadas con 50 \mug/ml de carbenicilina. Se
seleccionaron colonias individuales para la purificación del ADN
del plásmido; el ADN del plásmido se obtuvo usando el kit Qiagen
Spin Miniprep Kit. Los plásmidos se digirieron con NdeI y BamHI y
se analizaron con electroforesis en gel.
El plásmido resultante se llamó pTH, se digirió
con XbaI y Ndel, se purificó con electroforesis en gel y el kit de
extracción con gel Qiagen Gel Extraction kit como se describe
anteriormente, y se usó como vector para la consiguiente clonación
de los productos ACL-1 y ACL 2 PCR digeridos con las
mismas enzimas. El ligado se realizó como se describe anteriormente
y la mezcla del ligado se transformó en células químicamente
competentes de NovaBlue, como se describe anteriormente. Se
seleccionaron colonias individuales para la purificación del ADN
del plásmido; el ADN del plásmido se obtuvo usando el kit Qiagen
Spin Miniprep Kit. Los plásmidos se digirieron con XbaI y Ndel, y
se analizaron con electroforesis en gel. Los plásmidos pATH
resultantes que llevan el operón creado se transformaron en las
células de E. coli BL21 (DE3) para determinar la expresión
de los genes clonados.
Para medir la expresión del gen y la producción
de 3-HP, las células de BL21 (DE3) que llevan los
plásmidos pATH-1 y pATH 2 se cultivaron a
OD600\sim0,5 en medio de M9CA (1Difco Laboratories, Sparks, MA)
complementado con 10 g/l de glucosa, 5 g/l de
beta-alanina y 50 \mug/ml de carbenicilina, y se
indujeron con 100 \muM de IPTG en condiciones aeróbicas. Las
células BL21 (DE3) que llevan el vector pET1 la sirvieron como
control. Las muestras celulares se tomaron 2 y 4 horas después de
la inducción de IPTG para el análisis por electroforesis en gel de
la poliacrilamida. Las tres enzimas se expresaron como se muestra
en la banda con el tamaño apropiado en el gel. La producción de
3-HP a partir de beta-alanina se
detectó con ambos constructores de operones, pATH-1
y pATH-2, pero no en las células de control
mediante análisis de LC-MS.
\vskip1.000000\baselineskip
En una vía alternativa o adicional, la
beta-alanina puede deaminarse con un polipéptido
que tiene actividad de
beta-alanina-2-oxoglutarato
aminotransferasa para producir semialdehído malónico, que se puede
reducir aún más a 3 HP con un polipéptido que tenga actividad de
3-HP deshidrogenasa o un polipéptido que tenga
actividad de 3-hidroxisobutirato deshidrogenasa.
\newpage
Los métodos para aislar, secuenciar, expresar y
probar la actividad de dichos polipéptidos se describen en el
documento WO 02/42418. El experto en la materia entenderá que se
pueden utilizar métodos similares para obtener la secuencia de
cualquier polipéptido de cualquier organismo.
El gen que codifica el
4-aminobutirato aminotransferasa se amplió a partir
del ADN genómico del C acetobutyticum mediante RCP con
cebadores OsabatF
(5'-CCCGGAATTCTTTAATATGCGATTTGGAGGAG-3';
ID. SEC. N.º 49) y OSDAIR
(5'-GTCCGTCTCCCTTTCAGCTTAAATCGCTATTCTTATAGC-3';
ID. SEC. N.º 50). Un gen que codifica
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa se amplió a
partir del ADN genómico de P. aeruginosa mediante RCP con
cebadores OSATDF
(5'-GCTATAAGAATAGCGATTTAAGCTGAAAGGGAGACGGAC-3';
ID. SEC. N.º 51) y OSibdR
(5'-CGACCGATCCGCAGTGAGTGAGCCTTGGAG-3;
ID. SEC. N.º 52). La RCP se realizó con un termovariador Perkin
Elmer 2400 con polimerasa Pfu Turbo según las instrucciones del
fabricante y bajo las siguientes condiciones: paso inicial de
desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos; 25 ciclos a 94ºC
durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5
minutos; extensión final a 72ºC durante 10 minutos. Los productos
de la RCP resultantes se purificaron con gel usando el kit de
extracción con gel Qiagen Gel Extraction Kit.
Los productos de la RCP de
4-aminobutirato aminotransferasa y
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa se montaron
juntos en un conjunto de la RCP. Las cebadores que se muestran en
la ID. SEC. N.º: 50 y 51) son complementarios entre sí, y por lo
tanto, los extremos complementarios del ADN se hibridan mutuamente
durante la RCP y extienden el ADN en ambas direcciones. Para
garantizar la eficacia del conjunto y después de la amplificación,
se añadieron dos cebadores de terminación OSabatP y OSibdR (ID.
SEC. N.º: 49 y 52) a la mezcla del conjunto de la RCP que contenía
100 ng de 4-aminobutirato aminotransferasa y
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa purificados y la
mezcla de rTth polimerasa y la polimerasa Pfu Turbo en una
proporción de 8:1. El conjunto de la RCP se ejecutó bajo siguientes
condiciones: paso inicial de denaturalización a 94ºC durante 1
minuto; 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30
segundos, 68ºC durante 3 minutos; extensión final a 68ºC durante 7
minutos. El producto de la RCP montado era purificado con gel como
se describe anteriormente y se digirió con EcoRI y BamHI. Los
sitios para estas enzimas de restricción se introdujeron al
producto montado de la RCP con los cebadores OSabatF (EcoRI) (ID.
SEC. N.º: 49) y OSibdR (BamHI) (ID. SEC. N.º: 52). El producto de
la RCP digerido se calentó a 80ºC durante 30 minutos, se purificó
con gel usando el kit de extracción con gel Qiagen Gel Extraction
kit y se utilizó para la unión al vector pPROLar A.
pPROLar A se digirió con EcoRI y BamHI, se
purificó con gel con el kit de extracción con gel Qiagen Gel
Extraction kit, se trató con fosfatasa alcalina de camarón según lo
sugiere el fabricante y se utilizó para el ligado con el producto
de la RCP montado. El ligado se realizó como se describe
anteriormente y se transformó en células químicamente competentes
de TOP 10 (Novagen) y se colocaron en placas LB complementadas con
25 \mug/ml de canamicina. Se seleccionaron colonias individuales
para la purificación del ADN del plásmido; el ADN del plásmido se
obtuvo usando el kit Qiagen Spin Miniprep Kit. Los plásmidos se
digirieron con EcoRI y BamHI y se analizaron con electroforesis en
gel. El plásmido resultante que lleva los genes de
4-amino-butirato aminotransferasa y
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa se designó
pATD.
Para observar la expresión del gen y la
producción de 3-HP, las células TOP 10 que llevan
plásmidos pATD o sin plásmidos (control) se cultivaron a
OD600\sim0,5 en medio LB complementado con 5 g/l de glucosa, 5
g/l de beta-alanina y 25 \mug/ml de canamicina, y
se indujo con 100 \muM de IPTG y 0,5% arabinosa bajo condiciones
aeróbicas. La producción de 3-HP a partir de
beta-alanina se detectó con las células que llevan
pATD, pero no en las células de control mediante el análisis
LC-MS. Se observó 3-HP en los
sobrenadantes celulares después de 6 y 24 horas de inducción de
IPTG.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron varios operones en el ejemplo 10
que permiten la producción de 3-HP vía
beta-alanina a través de varias vías alternativas.
Los métodos divulgados en este ejemplo amplían aquel, incluyendo
las secuencias divulgadas de 2,3-aminomutasa de
alanina divulgadas en la presente descripción en un operón. Esto
permite la producción de 3-HP a través de
alfa-alanina.
\vskip1.000000\baselineskip
La creación de un operón para la conversión de
alfa-alanina a beta-alanina a
beta-alanil-CoA a
acrilil-CoA a 3 HP se realizó de la siguiente
manera. Se utilizó plásmido pLC4-7LCI que
transporta 2,3-aminomutasa de alanina (ejemplo 6;
ID. SEC. N.º: 20 y 21) para la creación de
pLCATH2-1. El operón AT'H-2 se
amplificó a partir de pA7H-2 (ejemplo 10) con los
siguientes cebadores: OSacI2NotF2:
5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAGAT T
AAAGGAGOAATTCT
CAATGG-3' (ID. SEC. N.º: 55) y OShydXbaR: 5'-CTAGTCT AGATCAACGACCACTGAAGTTGG-3' (ID. SEC. N.º: 56). La RCP se llevó a cabo como se describe anteriormente usando la mezcla de polimerasa rT th y polimerasa Pfu Turbo en una proporción de 8:1 bajo las siguientes condiciones: paso inicial de denaturalización a 94ºC durante 2 minutos; 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 2 minutos; extensión final a 68ºC durante 7 minutos.
CAATGG-3' (ID. SEC. N.º: 55) y OShydXbaR: 5'-CTAGTCT AGATCAACGACCACTGAAGTTGG-3' (ID. SEC. N.º: 56). La RCP se llevó a cabo como se describe anteriormente usando la mezcla de polimerasa rT th y polimerasa Pfu Turbo en una proporción de 8:1 bajo las siguientes condiciones: paso inicial de denaturalización a 94ºC durante 2 minutos; 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 2 minutos; extensión final a 68ºC durante 7 minutos.
El producto de la RCP resultante se purificó con
el kit de purificación Qiagen PCR Purification Kit y se digirió con
NotI y XbaI. El ADN digerido se calentó a 65ºC durante 30 minutos
para la inactivación enzimática, se purificó con gel con el kit de
extracción con gel Qiagen Gel Extraction Kit y se reprodujo en el
plásmido pLC4-7LC-1 digerido con las
mismas enzimas. El ligado se realizó a 16ºC durante la noche con T4
ligasa. La mezcla del ligado se transformó en células químicamente
competentes de Tuner (Novagen) y se colocaron en placas LB
complementadas con 25 \mug/ml de canamicina. Se seleccionaron
colonias individuales para la purificación del ADN del plásmido; el
ADN del plásmido se obtuvo usando el kit Qiagen Spin Miniprep Kit.
Los plásmidos se digirieron con NotI y XbaI y se analizaron con
electroforesis en gel. Las células Turner
(pLCATH2-1) resultantes se utilizaron para observar
la expresión de los genes clonados y la producción de
3-HP a partir de la alfa-alanina y
beta-alanina.
\vskip1.000000\baselineskip
La creación de un operón para la conversión de
alfa-alanina a beta-alanina a
semialdehído malónico a 3 HP se realizó de la siguiente manera. Se
utilizó plásmido pLC4-7LC1 (ejemplo 6) que
transporta 2,3-aminomutasa de alanina (ejemplo 6;
ID. SEC. N.º: 20 y 21) para la creación de pLCATD1. El operón ATD
se amplió a partir del plásmido pATD (ejemplo 10) con: OSabaiNotF:
5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAATATGCGATTTGGAGGAG-3'
(ID. SEC. N.º: 57) y OsibdXbaR:
5'-CTAGTCTAGAGCAGrGAGTGAGCCTTGGAG 3' (ID. SEC. N.º:
58). La RCP se llevó a cabo según se describe anteriormente para el
operón 4 y el producto de la RCP resultante se purificó, digirió
con NotI y XbaI, se clonó en el plásmido
pL.C4-7L.C-1, se transformó en
células Turner químicamente competentes, y las colonias
individuales se seleccionaron como se describe para el operón
4.
\vskip1.000000\baselineskip
Para observar la expresión del gen y la
producción de 3-HP, las células Tuner que llevan
plásmidos pLCATH2-1, pLCATD1 o el vector pPROLar se
cultivaron a OD600\sim0,5 en medio LB complementado con 5 g/l de
glucosa, 5 g/l de alfa-alanina o 5 g/l de
beta-alanina y 25 \mug/ml de canamicina, y se
indujo con 100 \muM de IPTG y 0,5% arabinosa bajo condiciones
aeróbicas. La producción de 3-HP a partir de
beta-alanina se detectó con las células que llevan
pLCATH2-1 y pLCATD1, pero no en las células de
control mediante el análisis LC-MS. Se observó
3-HP en los sobrenadantes celulares después de 22
horas de inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
La creación de un operón para la conversión de
piruvato a alfa-alanina a
beta-alanina a semialdehído malónico a 3 HP se
realizó de la siguiente manera. La codificación del gen para
2,3-aminomutasa de alanina se amplió a partir de
pLC4-7LC1 mediante RCP con los cebadores KAM10F
(5-CACACAGAATTCATT AAAGAGG AG-3';
ID. SEC. N.º: 59) y KAMRBATR
5'-CATAATCAAACTCAAAGTCAACCATAIAAGAICTCCICCTACTICATGAA
GAATCCCCT CC-3'; ID. SEC. N.º: 60). Un gen de beta-alanina aminotransferasa se amplió a partir del cADN de rata mediante RCP con los cebadores KAMRBATF (5'-GGAGGG GATTCTTCATGAAGTAAGGAGGAGArCITA
TATGGTTGACTTTGAGnTGATTATG-3'; ID. SEC. N.º: 61) y RBATAFDR (5'-CGTGITACTCAITTGICTCCTCGT
CATTTACTTGAAGTCTGCT AAGATAC-3'(ID. SEC. N.º: 62). 3-HP deshidrogenasa se amplió a partir del ADN genómico de A. faecalis mediante RCP con los cebadores RBATAFDF (5'-GTATCTTAGCAGACTTCAAGTA
AATGACGAGGAGACAAAATGAGTAACACG-3'; ID. SEC. N.º: 63) y AFDRAATR (5'TCATTCACCC
GTGAGGCCATGAATATATCTCCTTCTTAAGCTTAGTGCTTCTGACGGTAC-3'; ID. SEC. N.º: 64). El gen de alfa-alanina aminotransferasa se amplió a partir de cADN de rata con los cebadores AFDRAATF (5'GT ACCGTCA
GAAGCACTAAGCTTAAGAAGGAGAIATAFTCATGGCCTCACGGGTGAATGA-3'; (ID. SEC. N.º: 65) y
RATGPTOR (5'-GACT'AGATATCTCAGGAGTACTCATGGGTGAA-3' (ID. SEC. N.º: 66).
GAATCCCCT CC-3'; ID. SEC. N.º: 60). Un gen de beta-alanina aminotransferasa se amplió a partir del cADN de rata mediante RCP con los cebadores KAMRBATF (5'-GGAGGG GATTCTTCATGAAGTAAGGAGGAGArCITA
TATGGTTGACTTTGAGnTGATTATG-3'; ID. SEC. N.º: 61) y RBATAFDR (5'-CGTGITACTCAITTGICTCCTCGT
CATTTACTTGAAGTCTGCT AAGATAC-3'(ID. SEC. N.º: 62). 3-HP deshidrogenasa se amplió a partir del ADN genómico de A. faecalis mediante RCP con los cebadores RBATAFDF (5'-GTATCTTAGCAGACTTCAAGTA
AATGACGAGGAGACAAAATGAGTAACACG-3'; ID. SEC. N.º: 63) y AFDRAATR (5'TCATTCACCC
GTGAGGCCATGAATATATCTCCTTCTTAAGCTTAGTGCTTCTGACGGTAC-3'; ID. SEC. N.º: 64). El gen de alfa-alanina aminotransferasa se amplió a partir de cADN de rata con los cebadores AFDRAATF (5'GT ACCGTCA
GAAGCACTAAGCTTAAGAAGGAGAIATAFTCATGGCCTCACGGGTGAATGA-3'; (ID. SEC. N.º: 65) y
RATGPTOR (5'-GACT'AGATATCTCAGGAGTACTCATGGGTGAA-3' (ID. SEC. N.º: 66).
La RCP se realizó según se describe
anteriormente bajo las siguientes condiciones: paso inicial de
desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos; 10 ciclos a 94ºC
durante 30 segundos, 48ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 2
minutos; 5 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 30
segundos, 72ºC durante 2 minutos; 10 ciclos a 94ºC durante 30
segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 2 minutos; la
extensión final a 72ºC durante 7 minutos. Los productos de la RCP
se purificaron con gel con el kit de extracción con gel Qiagen Gel
Extraction Kit.
Productos de la RCP de
2,3-aminomutasa de alanina y
beta-alanina aminotransferasa, así como productos
de la RCP de 3-HP deshidrogenasa y
alfa-alanina aminotransferasa, se montaron en pares
en dos conjuntos de la RCP. Los pares de cebadores con ID. SEC.
N.º: 60 y 61, así como ID. SEC. N.º: 64 y 65 eran complementarios
entre sí, y por lo tanto, los extremos complementarios del ADN se
hibridan mutuamente durante la RCP y extienden el ADN en ambas
direcciones. Para garantizar la eficacia del conjunto y después de
la amplificación, se añadieron los siguientes dos cebadores de
terminación (ID. SEC. N.º: 59 y 62) a la mezcla del conjunto de la
RCP que contenía 100 ng de dos productos de la RCP de alanina
aminomutasa y beta-alanina aminotransferasa
purificada y la mezcla de rTth polimerasa y la polimerasa Pfu Turbo
en una proporción de 8:1. Se añadieron otros dos cebadores de
terminación, ID. SEC. N.º: 63 y 66 a la mezcla del conjunto de la
RCP que contenía 100 ng de 3-HP deshidrogenasa y
alfa-alanina aminotransferasa y la mezcla de rTth
polimerasa y la polimerasa Pfu Turbo en una proporción de 8:1. El
conjunto de la RCP se ejecutó bajo siguientes condiciones: paso
inicial de desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos; 5 ciclos a
94ºC durante 30 segundos, 48ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 4
minutos; 5 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 30
segundos, 68ºC durante 4 minutos; 5 ciclos a 94ºC durante 30
segundos, 55ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 4 minutos; 10
ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, 68ºC
durante 4 minutos; extensión final a 68ºC durante 7 minutos.
Se llevó a cabo un segundo conjunto de RCP para
combinar los pares montados para generar el operón 6 que contenía
los cuatro genes. Se añadieron dos cebadores de terminación (ID.
SEC. N.º: 59 y 66) a la mezcla del conjunto de la RCP que contenía
100 ng del par purificado de alanina
aminomutasa/beta-alanina aminotransferasa y la
mezcla de rTth polimerasa y la polimerasa Pfu Turbo en una
proporción de 8:1. El conjunto de la RCP se ejecutó bajo siguientes
condiciones: paso inicial de desnaturalización a 94ºC durante 2
minutos; 15 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30
segundos, 70ºC durante 5 minutos; 10 ciclos a 94ºC durante 30
segundos, 55ºC durante 30 segundos, 70ºC durante 5 minutos;
extensión final a 70ºC durante 7 minutos.
El producto de la RCP montado era purificado con
gel según se describe anteriormente y se digirió con EcoRI y EcoRV.
Los sitios para estas enzimas de restricción se introdujeron al
producto de la RCP montado con cebadores (ID. SEC. N.º: 59 (EcoRI)
y ID. SEC. N.º: 66 (EcoRV). El producto de la RCP digerido se
calentó a 65ºC durante 30 minutos, se purificó con gel usando el
kit de extracción con gel Qiagen Gel Extraction kit y se utilizó
para la unión al vector digerido con EcoRI y SmaI. El ligado se
realizó a 16ºC durante la noche con T4 ligasa y la mezcla se
transformó en las células Tuner químicamente competentes y se
colocaron en placas LB complementadas con 50 \mug/ml de
carbenicilina. Se seleccionaron colonias individuales para la
purificación del ADN del plásmido; el ADN del plásmido se obtuvo
usando el kit Qiagen Spin Miniprep Kit. Los plásmidos se analizaron
mediante RCP con los cebadores ID. SEC. N.º: 59 y 66 y se
analizaron mediante electroforesis en gel. El plásmido resultante
se nombró pTrc\beta-ala.
Las células
Tuner(pTrc\beta-ala) se utilizaron para
determinar la expresión de los genes clonados y la producción de
3-HP a partir de la glucosa,
alfa-alanina y beta-alanina. Tuner
(pTrc99A) se utilizó como control. Las células se cultivaron a
OD600\sim-0,5 en medio M9CA (Difco Laboratories)
complementado con 5 g/l de glucosa y 50 \mug/ml de carbenicilina;
o 5 g/l de glucosa, 5 g/l de alfa-alanina y 50
\mug/ml de carbenicilina; o 5 g/l de glucosa, 5 g/l de
beta-alanina y 50 \mug/ml de carbenicilina; y se
indujo con 100 \muM de TPTG y arabinosa al 0,5% bajo condiciones
aeróbicas. La producción de 3-HP a partir de
beta-alanina se detectó con las células que llevan
pTrc\beta-ala, pero no en las células de control
mediante el análisis LC-MS. 3-HP se
observó en sobrenadantes de la célula después de 22 horas de
inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
El pantotenato se puede producir a partir de
beta-alanina mediante polipéptidos que tengan
actividad de alfa-ketopantoato
hidroximetiltransferasa (EC 2.1 2.11),
alfa-ketopantoato reductasa (EC 1.1.1.169) y
pantotenato sintasa (EC 6 3 2.1) (fig. 3).
Con los métodos de reproducción descritos en los
Ejemplos 10 y 11, es posible aislar, secuenciar, expresar y probar
los polipéptidos de alfa-ketopantoato
hidroximetiltransferasa (EC 2.1.2.11),
alfa-ketopantoato reductasa (EC 1.1.1.169) y
pantotenato sintasa (EC 6.3.2.1). Un experto en la materia
comprenderá que se pueden utilizar métodos similares para obtener
la secuencia de cualesquiera polipéptidos de cualquier
organismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Con secuencias disponible públicamente de
secuencias de cADN y aminoácidos, y las enzimas y secuencias
divulgadas en la presente descripción, por ejemplo
2,3-aminomutasa de alanina, CoA transferasa, liasa
de amoniaco de beta-alanil-CoA,
3-HP-CoA deshidratasa,
4-aminobutirato aminotransferasa,
beta-alanina-2-oxoglutarato
aminotransferasa, 3-hidroxipropionato
dehidrogenasa, 3-hidroxisobutirato deshidrogenasa,
glutamato deshidrogenara, 3-HP CoA
hidrolasa,3-hidroxiisobutirilo, CoA hidrolasa,
sintasa de polihidroxiácido, lipasa, esterasa, hidrolasa de CoA,
alfa-ketopantoato hidroximetiltransferasa,
alfa-ketopantoato reductasa, pantotenato sintasa,
pantotenato kinasa,
4'-fosfopantetenoil-1-cisteína
sintetasa, 4'-fosfopantotenoilcisteína
descarboxilasa, ATP:4'-fosfopanteteina
adeniltransferasa, defosfo-CoA kinasa,
aldehído:NAD(+) óxido-reductasa acetilante, alcohol:
NAD (+) óxido-reductasa, aldehído deshidrogenasa
(NAD (P)+) y alcohol deshidrogensa, así como las variantes, los
polimorfismos, los mutantes, los fragmentos y las fusiones de los
mismos, se puede realizar la expresión y purificación de cualquier
proteína, tal como una enzima, mediante técnicas estándar de
laboratorio. Un experto en la materia entenderá que las enzimas y
los fragmentos de las mismas se pueden producir de forma
recombinante en cualquier célula u organismo de interés, y
purificar antes de su uso, p. ej. antes de la producción de
3-HP, pantotenato y de los derivados de los
mismos.
Los métodos para producir las proteínas
recombinantes son conocidos en la materia. Por lo tanto, el alcance
de esta divulgación incluye la expresión recombinante de cualquier
proteína o fragmento de la misma, p. ej. una enzima. Por ejemplo,
consulte la patente de los EE. UU. N.º: 5.342.764 a Johnson y col;
la patente US 5,846,819 a Pausch y col.; la US 5,876,969 a Fleer y
col. y Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, New York, 1989, Cap. 17).
Brevemente, las secuencias parciales, completas
o variables del cADN que codifican una proteína o un péptido, se
pueden unir a un vector de expresión, tal como un vector bacteriano
de expresión. Las proteínas y/o los péptidos pueden crearse al
colocar un promotor arriba de la secuencia del cADN. Los ejemplos
de promotores incluyen, entre otros, lac, trp, tac, trc, las
regiones importantes del operador y promotor del fago lambda, la
región del control de la proteína de la cápside de fd, los
promotores tempranos y tardíos de SV40, los promotores derivados
del polioma, adenovirus, retrovirus, baculovirus y virus de los
simios, el promotor para 3-fosfoglicerato cinasa,
los promotores del ácido de la levadura fosfatasa, el promotor de
los factores de alfa-emparejamiento de la levadura
y las combinaciones de los mismos.
Los vectores adecuados para la producción de
proteínas nativas intactas incluyen pKC30 (Shimatake y Rosenberg,
1981, Nature 292:128), pKKI77-3 (Amann y Brosius,
1985, Cene 40: 183) y pET-3 (Studier y Moffatt,
1986, Mol. Siol 189:113). Una secuencia de ADN se puede transferir
a otros vehículos de clonación, tales como otros plásmidos,
bacteriófagos, cósmidos, virus animales y cromosomas artificiales
de la levadura (YACs) (Burke y col, 1987, Science
236:806-12). Estos vectores se pueden introducir en
una variedad de anfitriones incluyendo las células somáticas y los
organismos simples o complejos, tales como bacterias, hongos
(Timberlake y Marshall, 1989, Science 236:806-12),
invertebrados, plantas (Gasser y Fraley, 11989, Science 244:1293) y
mamíferos (Pursel y col., 1989, Science 244:1293), que se hacen
trangénicos por la introducción del cADN heterólogo.
Para la expresión en células mamíferas, una
secuencia del cADN se puede unir a los promotores heterólogos,
tales como el virus de los simios SV40, el promotor en el vector
pSV2 (Mulligan y Berg, 1981, Ptoc Nati Acad Sci USA
78:2072-6), e introducir en las células, tales como
células de mono CDS-1 (Gluzman, 1981, Cell
23:175-82) para alcanzar la expresión transitoria o
a largo plazo. La integración estable del constructo genético
quimérico se puede mantener en células mamíferas mediante selección
bioquímica, tal como neomicina (Southern y Berg, 1982, Mol Appl
Genet 1:327-41) y ácido micofenólico (Mulligan y
Berg, 1981, Proc Nati Acad Sci USA 78:2072-6).
La transferencia del ADN en eucariótica, tal
como células humanas o de otros mamíferos, es una técnica
convencional. Los vectores se introducen en las células receptoras
como ADN puro (transfección) mediante, p. ej. precipitación con
fosfato de calcio (Graham y vander Eb, 1973, Virology 52:466),
fosfato de estroncio (Brash y col, 1987, Mol Cell Biol 7:2013),
electroporación (Neumann y col, 1982, EMBO J. 1:841), lipofección
(Feigner y col, 1987, Proc Nati Acad. Sci USA 84:7413),
DEAE-dextrano (McCuthan y col., 1968, J Nati Cancer
inn.41:351), microinyección (Mueller y col., 1978, Cell 15:579),
fusión de protoplastos (Schafner, 1980, Proc Nati Acad. Set USA
77:2163-7) o pistolas de pellets (Klein y col.,
1987, Nature 32 7:70) Alternativamente, el cADN se puede introducir
mediante infección con vectores de virus, por ejemplo retrovirus
(Bernstein y col., 1985, Gen Engrg. 7:235) como el adenovirus
(Ahmad y col., 1986, Virol 57:267) o herpes (Spaete y col, 1982,
Cell 30:295).
\vskip1.000000\baselineskip
Las enzimas divulgadas en la presente
descripción, p. ej. 2,3-aminomutasa de alanina,
transferasa de CoA, liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA,
3-HP-CoA dehidratasa,
4-aminobutirato aminotransferasa,
beta-alanina-2-oxoglutarato
aminotransferasa, 3-hidroxipropionatodehidrogenasa,
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa, glutamato
deshidrogenasa, 3-HP-CoA hidrolasa,
hidrolasa de 3 hidroxiisobutril-CoA, sintasa de
polihidroxiácido, lipasa, esterasa, COA hidrolasa,
alfa-ketopantoato hidroximetiltransferasa,
alfa-ketopantoato reductasa, pantotenato sintasa,
pantotenato kinasa,
4'-fosfopantetenoil-1-cisteína
sintetasa, 4'-fosfopantotenoilcisteína
descarboxilasa, ATP:4'-fosfopanteteina
adeniltransferasa, defosfo-CoA kinasa, aldehído
acetilante:NAD(+) óxido-reductasas, alcohol:NAD(+)
óxido-reductasas, aldehído deshidrogenasas (NAD
(P)+) y alcohol dehidrogenasas (y las variantes, las fusiones, los
polimorfismos, los fragmentos y las mutaciones de las mismas) se
pueden químicamente sintetizar por cualquier cantidad de métodos
manuales o automatizados de síntesis conocidos en la materia. Por
ejemplo, la síntesis del péptido de la fase sólida (SFPS) se lleva
a cabo en una escala de 0,25 millimol (mM) usando un sintetizador
de péptidos modelo 431A de Applied Biosystems y con la protección
del terminal amino 9-fluorenilmetiloxicarbonilo
(Fmoc), uniéndose con
diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzotriazoIeor2-ClH-benzotria2ol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
hexafluorofosfate/hidroxibenzotriazol (HBTTJ/HOBT) y usando
p-hidroximetilfenoximetilpoliestireno (HMP) o la
resina de Sasrin para los ácidos en el extremo carboxi terminal o
las amidas en el extremo carboxi terminal de la resina amida
Rink.
Los aminoácidos derivados de Fmoc se preparan a
partir de los aminoácidos precursores apropiados mediante
tritiación y trifenilmetanol en ácido trifluoroacético, seguido de
la derivatización de Fmoc según se describe en Atherton y col.
(Solid Ptmse Peptide Synthesis, IRI Press: Oxford, 1989).
Los péptidos Sasrin unidos a la resina se
analizan con una solución de 1% IFA en diclorometano para generar
el péptido protegido. Cuando sea apropiado, los precursores
protegidos del péptido se ciclan entre el terminal amino y
carboxilo mediante la reacción de la amina libre
amino-terminal y el ácido libre
carboxilo-terminal con difenilfosforilazida en los
péptidos nacientes en el que se protegen las cadenas laterales del
aminoácido.
Los productos amida unidos a la resina HMP o
Rink se analizan rutinariamente y se protegen los péptidos ciclados
desprotegidos que contienen cadenas laterales con una solución
compuesta por ácido trifluoroacético (TFA), opcionalmente también
incluye agua, tioanisol y etaneditiol, en proporciones de 100: 5:
5: 2,5, para 0,5-3 horas en RT.
Los péptidos crudos se purifican mediante
cromatografía líquida de alta presión (HPLC) preparativa, p. ej.
con una columna Waters DeltaPakC18 y una elución gradiente de
DeltaPakClS con TFA al 0,1% en el agua modificada con el
acetonitrilo. Después de la elución de la columna, el acetonitrilo
se evapora de las fracciones eluidas, que entonces se liofilizan.
La identidad de cada producto generado y purificado de esta manera
se puede confirmar mediante espectroscopia de masas con bombardeo
de átomos rápido (FABMS) o la espectroscopia de masas electrospray
(ESMS).
Debido a las muchas realizaciones posibles a las
cuales se aplican los principios de nuestra divulgación, debe
reconocerse que las realizaciones ilustradas son solamente ejemplos
particulares de la divulgación y no deben tomarse como limitación
en el alcance de la divulgación. Por el contrario, el alcance de la
divulgación está de acuerdo con las siguientes reivindicaciones.
Por lo tanto, reivindicamos como nuestra invención todo lo que
sigue dentro del alcance de estas reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante, es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento de la patente europea. Aunque se ha puesto mucho
cuidado en recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u
omisiones y la EPO declina toda responsabilidad al respecto.
\vskip1.000000\baselineskip
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g o t/u.
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<211> 298
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<212> PRT
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<213> Alcaligenes faecalis
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<210> 35
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> PCR primer
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<211> 34
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> PCR primer
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<210> 43
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<211> 38
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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\hskip1cm
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<212> DNA
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\hskip1cm
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<211> 53
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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\hskip1cm
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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\hskip1cm
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<210> 48
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<211> 54
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> PCR primer
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\hskip1cm
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<210> 49
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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\hskip1cm
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<210> 50
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<211> 39
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> PCR primer
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<400> 50
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\hskip1cm
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<210> 51
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<211> 39
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> PCR primer
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<400> 51
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\hskip1cm
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<210> 52
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> PCR primer
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<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Clostridium propionicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(435)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium propionicum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
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<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR primer
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<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR primer
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PRC primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR primer
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (81)
1. Una célula transformada que comprende la
actividad de 2,3-aminomutasa de alanina, en donde
la célula abarca al menos una molécula exógena de ácido nucleico,
en donde la molécula de ácido nucleico abarca una secuencia de
ácido nucleico que codifica una 2,3-aminomutasa de
alanina que produce beta-alanina a partir de
alfa-alanina, en donde la secuencia del ácido
nucleico que codifica una 2,3-aminomutasa de
alanina abarca:
a) nucleótidos 307-1017 de una
secuencia mostrada en ID. SEC. N.º: 20, o
b) nucleótidos 55-1026 de una
secuencia mostrada en ID. SEC. N.º: 29, o
c) nucleótidos 307-1017 de ID.
SEC. N.º: 20 o nucleótidos 55-1026 de ID. SEC. N.º:
29 que incluyen una o más sustituciones que dan lugar a unas o más
sustituciones conservadoras del aminoácido, o
d) una secuencia del ácido nucleico que tiene
por lo menos una identidad del 6096 con ID. SEC. N.º: 20 o ID. SEC.
N.º: 29, en donde la molécula de ácido nucleico no tiene la
secuencia ID. SEC. N.º: 1 ó 2 de
US-B1-6248874.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método de producir una célula de la
reivindicación 1, que abarca mutar una
2,3-aminomutasa de lisina para producir la molécula
exógena de ácido nucleico según se define en la reivindicación 1,
transformando una célula con la molécula exógena de ácido
nucleico.
3. La célula de la reivindicación 1, en donde el
ácido nucleico que abarca los nucleótidos 307-1017
de ID. SEC. N.º: 20 o nucleótidos 55-1026 de una
secuencia mostrada en ID. SEC. N.º: 29 incluye unas o más
sustituciones que den lugar a no más de 10 sustituciones
conservadoras del aminoácido.
4. La célula de la reivindicación 1(d) en
donde la secuencia del ácido nucleico que codifica una
2,3-aminomutasa de alanina abarca una secuencia que
tiene por lo menos una identidad del 90% con ID. SEC. N.º: 20 o ID.
SEC. N.º: 29.
5. La célula de la reivindicación 4, en donde la
secuencia del ácido nucleico que codifica una
2,3-aminomutasa de alanina abarca una secuencia que
tiene al menos una identidad del 95%, con ID. SEC. N.º: 20 o ID.
SEC. N.º: 29.
6. La célula de la reivindicación 1, en donde la
secuencia del ácido nucleico que codifica una
2,3-aminomutasa de alanina abarca ID. SEC. N.º: 20
o ID. SEC. N.º: 29.
7. El método de la reivindicación 2, en donde la
2,3-aminomutasa de lisina mutada es una
2,3-aminomutasa de lisina procariótica mutada.
8. El método de la reivindicación 7, en donde la
2,3-aminomutasa de lisina mutada procariótica es
una 2,3-aminomutasa de lisina Bacillus subtilis,
Deinococcus radiodurans, Clostridium subterminale, Porphyromonas
gingivalis o Escherichia coli mutada.
9. El método de la reivindicación 8, en donde la
2,3-aminomutasa de lisina mutada es una
2,3-aminomutasa de lisina B Subtilis
mutada.
10. El método de la reivindicación 9, en donde
la mutación de 2,3-aminomutasa de lisina B,
subtilis (ID. SEC. N.º: 31) abarca una sustitución de L.103M,
L.1G3K, L103R, L103E o L103S.
11. El método de la reivindicación 9, en donde
la mutación de 2,3-aminomutasa de B.
subtilis (ID. SEC. N.º: 31) abarca una sustitución de L103M,
una sustitución de M13.6V, una sustitución de D339H o cualquier
combinación de las mismas.
12. El método de la reivindicación 9, en donde
la mutación de 2,3-aminomutasa de lisina B.
subtilis (ID. SEC. N.º: 31) abarca una sustitución de D339H,
D339Q, D339T, o D339N.
13. El método de la reivindicación 7, en donde
la 2,3-aminomutasa de lisina mutada es una
2,3-aminomutasa de lisina P. gingivalis
mutada.
14. El método de la reivindicación 13, en donde
la mutación de 2,3-aminomutasa de P.
gingivalis (ID. SEC. N.º: 28) abarca una sustitución de N19Y,
una sustitución de L53P, una sustitución de H85Q, una sustitución
de D331G, una sustitución de M342T o cualquier combinación de las
mismas.
15. La célula de la reivindicación 1, donde la
célula es procariótica.
16. La célula de la reivindicación 15, en donde
la célula procariótica es una célula de Lactobaciilus, Lactococcus,
Bacillus o Escherichia.
17. La célula de la reivindicación 15, en donde
la célula procariótica es una célula de Escherichia coli o
Bacillus licheniformis.
18. La célula de la reivindicación 1, en el que
la célula es una célula de levadura.
19. El célula de la reivindicación 1, en donde
la célula produce ácido 3-hidroxipropionico
(3-HP).
20. La célula de la reivindicación 19, donde la
célula además tiene:
actividad de transferasa de CoA o CoA
sintetasa;
actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA; y
actividad de 3HP-CoA
deshidratasa.
\vskip1.000000\baselineskip
21. La célula de la reivindicación 20, en donde
la célula tiene además actividad de
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa y/o
3-hidroxiisobutirilo-CoA
hidrolasa.
22. La célula de la reivindicación 19, donde la
célula además tiene:
actividad 4-aminobutirato o
actividad de aminotransferasa
beta-alanina-2-oxoglutarato;
y 3-HP deshidrogenasa o actividad de
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
23. La célula de la reivindicación 1, donde la
célula además tiene:
actividad de transferasa de CoA o CoA
sintetasa;
actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA;
actividad de deshidratasa de
3-hidroxipropionil-CoA;
3-hidroxipropionil-CoA
hidrolasa y/o
3-hidroxiisobutirilo-CoA hidrolasa;
y
actividad de lipasa y/o esterasa.
\vskip1.000000\baselineskip
24. La célula de la reivindicación 23, en donde
la célula produce un éster de 3-HP.
25. La célula de la reivindicación en donde el
éster de 3-HP es
3-hidroxipropionato de metilo,
3-hidroxipropionato de etilo,
3-hidroxipropionato de propilo,
3-hidroxipropionato de butilo o
3-hidroxipropionato de
2-etilhexil.
26. La célula de la reivindicación 1, donde la
célula además tiene:
actividad de
CoA-transferasa,
actividad de la liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA,
actividad de
3-hidroxipropionil-CoA deshidratasa
y
actividad de sintasa de polihidroxiácido.
\vskip1.000000\baselineskip
27. La célula de la reivindicación 26, en donde
la célula produce un 3-HP polimerizado.
28. La célula de la reivindicación 1, donde la
célula además tiene:
actividad de
CoA-transferasa,
actividad de la liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA y
actividad de sintasa de polihidroxiácido.
\vskip1.000000\baselineskip
29. La célula de la reivindicación 28, en donde
la célula produce un acrilato polimerizado.
\newpage
30. La célula de la reivindicación 1, donde la
célula además tiene actividad de CoA transferasa:
actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA; y
actividad de lipasa y/o esterasa.
\vskip1.000000\baselineskip
31. La célula de la reivindicación 30, en donde
la célula produce un acrilato.
32. La célula de la reivindicación 31, en donde
el éster del acrilato es un acrilato de metilo, acrilato de etilo,
acrilato de propilo y acrilato de butilo.
33. La célula de la reivindicación 31, en donde
la célula produce 1,3-propanodiol.
34. La célula de la reivindicación 33, donde la
célula además tiene:
actividad de transferasa de CoA o CoA
sintetasa;
actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA;
actividad de deshidratasa de
3-hidroxipropionil-CoA;
actividad de aldehído acetilante: NAD(+)
óxido-reductasa; y
actividad de alcohol:NAD(+)
óxido-reductasa.
\vskip1.000000\baselineskip
35. La célula de la reivindicación 33, donde la
célula además tiene:
actividad de CoA transferasa;
actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA;
actividad de
3-hidroxipropioil-CoA
deshidratasa;
3-hidroxipropionil-CoA
hidrolasa y/o
3-hidroxiisobutirilo-CoA
hidrolasa;
actividad de aldehído deshidrogenasa (NAD (P)+);
y
actividad de alcohol deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
36. La célula de la reivindicación 1, en donde
la célula produce un pantotenato.
37. La célula de la reivindicación 36, que
además tiene actividad de alfa-ketopantoato
hidroximetiltransferasa, alfa-ketopantoato
reductasa y pantotenato sintasa.
38. La célula de la reivindicación 1, en donde
la célula produce una coenzima A (CoA).
39. El célula de la reivindicación 38, además
tiene actividad de pantotenato kinasa,
4'-fosfopantetenoil-1-cisteína
sintetasa, 4'-fosfopantotenoilcisteina
descarboxilasa, ATP:4'-fosfopanteteina
adeniltransferasa, y defosfo-CoA kinasa.
40. Un polipéptido que tiene actividad de
2,3-aminomutasa de alanina, que produce
beta-alanina a partir de
alfa-alanina, en donde el polipéptido abarca.
a) una secuencia que tiene por lo menos una
identidad de secuencia del 60% con ID. SEC. N.º: 21 ó 30, o
b) aminoácidos 50-390 de una
secuencia mostrada en ID. SEC. N.º: 21, o
c) aminoácidos 15-390 de una
secuencia mostrada en ID. SEC. N.º: 30, o
d) una secuencia mostrada en ID. SEC. N.º: 21 ó
30 incluyendo una o más sustituciones conservadoras del
aminoácido,
en donde el polipéptido no está codificado por
un ácido nucleico que tiene la secuencia ID. SEC. N.º 1 o 2 de
US-B1-6248874.
\vskip1.000000\baselineskip
41. Un método para producir un polipéptido según
la reivindicación 40, que comprende mutar una
2,3-aminomutasa de lisina.
42. El método de la reivindicación 41, en donde
la secuencia del aminoácido de 2,3-aminomutasa de
lisina es una 2,3-aminomutasa de lisina de
Bacillus subtilis, Deinococcus radiodurans, Clostridium
subterminale, Porphyromonas gingivalis o Escherichia
coli mutada.
43. El método de la reivindicación 42, en donde
la secuencia del aminoácido de 2,3-aminomutasa de
lisina es una 2,3-aminomutasa de lisina de
Bacillus subtilis o Porphyromonasgingivalis
mutada.
44. El método de la reivindicación 43 en donde
la 2,3-aminomutasa de lisina mutada de B.
subtilis abarca una sustitución de D339H en la secuencia de
tipo natural ID. SEC. N.º: 31.
45. El método de la reivindicación 43 en donde
la 2,3-aminomutasa de lisina mutada de P.
gingivalis abarca una sustitución de D331G en la secuencia de
tipo natural ID. SEC. N.º: 28.
46. El polipéptido de la reivindicación 40, en
donde el polipéptido abarca una secuencia que tiene al menos una
identidad de secuencia del 90% con ID. SEC. N.º: 21 ó 30.
47. El polipéptido de la reivindicación 46, en
donde el polipéptido abarca una secuencia que tiene al menos una
identidad de secuencia del 95% con ID. SEC. N.º: 21 ó 30.
48. El polipéptido de la reivindicación 47, en
donde el polipéptido abarca el ID. SEC. N.º: 21 ó 30.
49. El polipéptido de la reivindicación
40(d), en donde el polipéptido abarca no más de 10
sustituciones conservadoras del aminoácido.
50. Un ácido nucleico aislado que abarca una
secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de
cualquiera de las reivindicaciones 40 ó 46 a 49.
51. El ácido nucleico aislado de la
reivindicación 50 operativamente enlazado a una secuencia del
promotor.
52. El ácido nucleico aislado la reivindicación
50, en donde el ácido nucleico que abarca los nucleótidos
307-1017 de ID. SEC. N.º: 20 o nucleótidos
55-1026 de ID. SEC. N.º: 29.
53. El ácido nucleico aislado de la
reivindicación 50, en donde el ácido nucleico abarca una secuencia
que tiene al menos una identidad de secuencia del 90% con ID. SEC.
N.º: 20 o ID. SEC. N.º: 29.
54. El ácido nucleico aislado de la
reivindicación 50, en donde el ácido nucleico abarca una secuencia
que tiene al menos una identidad de secuencia del 95% con ID. SEC.
N.º: 20 o ID. SEC. N.º: 29.
55. El ácido nucleico aislado de la
reivindicación 53, en donde la secuencia del ácido nucleico incluye
una o más sustituciones que dan lugar a una o más sustituciones
conservadoras del aminoácido.
56. El ácido nucleico aislado de la
reivindicación 55, en donde la secuencia del ácido nucleico incluye
una o más sustituciones que dan lugar a no más de 10 sustituciones
conservadoras del aminoácido.
57. El ácido nucleico aislado la reivindicación
54, en donde el ácido nucleico que abarca ID. SEC. N.º: 20 ó
29.
58. Un vector que comprende el ácido nucleico
aislado de la reivindicación 50.
59. Un ácido nucleico recombinante que comprende
el ácido nucleico aislado de la reivindicación 50.
60. Una célula transformada con el ácido
nucleico recombinante de la reivindicación 59.
61. Un mamífero transgénico no humano que
comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindica-
ción 59.
ción 59.
62. Un anticuerpo que se une específicamente al
polipéptido de la reivindicación 40.
63. Un método para producir un polipéptido que
tiene actividad de 2,3-aminomutasa de alanina, que
produce beta-alanina a partir de
alfa-alanina que comprende cultivar la célula de la
reivindicación 60 en condiciones que permitan que la célula
produzca el polipéptido.
64. Un método para hacer
beta-alanina a partir de
alfa-alanina, que comprende el cultivo de la célula
de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 6 ó 15 a 39 bajo
condiciones que permitan que la célula genere
beta-alanina a partir de
alfa-alanina.
65. El método de la reivindicación 64, en donde
la célula comprende una deleción funcional de panD.
66. Un método para generar 3-HP,
que abarca el cultivo de la célula de cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 22 en condiciones en las cuales la célula
produzca el 3-HP.
67. Un método para generar
1,3-propanodiol, que abarca el cultivo de la célula
de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35 en condiciones en las
cuales la célula produzca el 1,3-propanodiol.
68. Un método para generar pantotenato, que
abarca el cultivo de la célula de cualquiera de las
reivindicaciones 36 a 37 en condiciones en las cuales la célula
produzca el pantotenato.
69. Un método para generar CoA, que abarca el
cultivo de la célula de cualquiera de las reivindicaciones 38 a 39
en condiciones en las cuales la célula produzca el CoA.
70. Un método para generar 3-HP,
que comprende:
purificar beta-alanina de la
célula de la reivindicación 1;
poner en contacto beta-alanina
con un polipéptido que comprenda la actividad de CoA transferasa
para formar beta-alanil-CoA;
poner en contacto beta-alanina
CoA con un polipéptido que comprenda la actividad de
beta-alanil-CoA para formar
acrilil-CoA;
poner en contacto acrilil-CoA
con un polipéptido que comprenda la actividad de
3HP-CoA deshidratasa para formar
3-HP-CoA; y
poner en contacto
3-HP-CoA con un polipéptido que
comprenda la actividad de CoA transferasa,
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa
y/o la actividad de
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa
para formar 3-HP.
\vskip1.000000\baselineskip
71. Un método para generar 3-HP,
que comprende:purificar beta-alanina de la célula
de la reivindicación 1;
poner en contacto beta-alanina
con un polipéptido que comprenda la actividad de
4-aminobutirato aminotransferasa y/o
aminotransferasa
beta-alanina-2-oxoglutarato
para formar semialdehído malónico; y
poner en contacto el semialdehído malónico con
un polipéptido que comprenda la actividad de 3-HP
deshidrogenasa y/o 3-hidroxisobutirato
deshidrogenasa para formar 3-HP.
\vskip1.000000\baselineskip
72. Un método para generar 3-HP,
que comprende:
transfectar la célula de la reivindicación 1,
con un ácido nucleico que codifique un polipéptido que comprenda la
actividad de CoA transferasa, con un ácido nucleico que codifique
un polipéptido que comprenda la actividad de liasa de amoniaco de
beta-alanil-CoA y con un ácido
nucleico que codifique un polipéptido que comprenda la actividad de
CoA transferasa,
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa
y/o 3-hidroxiisobutirilo-CoA
hidrolasa; y
cultivar la célula transfectada para permitir
que la célula transfectada forme 3-HP.
\vskip1.000000\baselineskip
73. Un método para generar 3-HP,
que comprende:
transfectar la célula de la reivindicación 1,
con un ácido nucleico que codifique un polipéptido que comprenda la
actividad de 4-aminobutirato aminotransferasa y/o
aminotransferasa
beta-alanina-2-oxoglutarato
y con un ácido nucleico que codifique un polipéptido que comprenda
la actividad de 3-HP deshidrogenasa y/o de
3-hidroxisobutirato deshidrogenasa; y
cultivar la célula transfectada para permitir
que la célula transfectada forme 3-HP.
\vskip1.000000\baselineskip
74. Un método para generar 1.3 el propanediol a
partir de 3-HP, que comprende:
generar 3-HP con el método de la
reivindicación 71;
poner en contacto 3-HP con un
polipéptido que comprenda la actividad de
óxido-reductasa de aldehído acetilante:NAD(+) y un
polipéptido que comprenda la actividad de alcohol:NAD(+)
óxido-reductasa.
\newpage
75. Un método para generar 1.3 el propanediol,
que comprende:
transfectar la célula de la reivindicación 1 con
un ácido nucleico que codifique un polipéptido que comprenda la
actividad de CoA transferasa o CoA sintetasa; con un ácido nucleico
que codifique un polipéptido que comprenda la actividad de liasa de
amoniaco de beta-alanil-CoA; un
ácido nucleico que codifique un polipéptido que comprenda la
actividad de 3-hidroxipropionil-CoA
hidrolasa y/o
3-hidroxiisobutirilo-CoA hidrolasa;
un ácido nucleico que codifique un polipéptido que comprenda la
actividad de óxido-reductasa de aldehído
acetilante:NAD(+); un ácido nucleico que codifique un polipéptido
que comprenda la actividad de
3-HP-CoA deshidratasa que cataliza
la conversión de Acrilil-CoA a
3-HP-CoA y un ácido nucleico que
codifique un polipéptido que comprenda la actividad de
alcohol:NAD(+) óxido-reductasa; y
cultivar la célula transfectada para permitir
que la célula transfectada forme
1,3-propanodiol.
\vskip1.000000\baselineskip
76. Un método para generar 1.3 el propanediol,
que comprende:
transfectar la célula de la reivindicación 1 con
un ácido nucleico que codifique un polipéptido que comprenda la
actividad de CoA transferasa o CoA sintetasa; con un ácido nucleico
que codifique un polipéptido que comprenda la actividad de liasa de
amoniaco de beta-alanil-CoA; un
ácido nucleico que codifique un polipéptido que comprenda la
actividad de 3-hidroxipropionil-CoA
hidrolasa; con un ácido nucleico que codifique un polipéptido que
comprenda la actividad de
3-hidroxipropionil-CoA hidrolasa
y/o 3-hidroxiisobutirilo-CoA
hidrolasa; con un ácido nucleico que codifique un polipéptido que
comprenda la actividad de actividad de aldehído deshidrogenasa (NAD
(P)+); con un ácido nucleico que codifique un polipéptido que
comprenda la actividad de alcohol deshidrogenasa y
cultivar la célula transfectada para permitir
que la célula transfectada forme
1,3-propanodiol.
\vskip1.000000\baselineskip
77. Un método para generar pantotenato, que
comprende:
purificar beta-alanina de la
célula de la reivindicación 1; y poner en contacto
beta-alanina con alfa-ketopantoato
hidroximetiltransferasa, alfa-ketopantoato
reductasa y pantotenato sintasa para formar el pantotenato.
\vskip1.000000\baselineskip
78. Un método para generar pantotenato, que
comprende:
transfectar la célula de la reivindicación 1,
con un ácido nucleico que codifique un polipéptido que comprenda la
actividad de alfa-ketopantoato
hidroximetiltransferasa, un ácido nucleico que codifique un
polipéptido que comprenda la actividad de
alfa-ketopantoato reductasa y con un ácido nucleico
que codifique un polipéptido que comprenda la actividad de
pantotenato sintasa para formar el pantotenato; y
cultivar la célula transfectada para permitir
que la célula transfectada forme pantotenato.
\vskip1.000000\baselineskip
79. La célula de la reivindicación 1, en el que
la célula es una célula vegetal.
80. Un vegetal que comprende la célula de la
reivindicación 79.
81. Un vegetal transgénico que comprende el
ácido nucleico recombinante de la reivindicación 50.
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