JP2005525100A - アラニン2,3−アミノムターゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年1月18日付で出願された米国特許出願第60/350,727号および2002年4月25日付で出願された米国特許出願第60/375,785号に対する優先権を主張するものである。
本開示は、アラニン2,3-アミノムターゼの核酸およびアミノ酸配列、α-アラニンをβ-アラニンに変換できるアラニン2,3-アミノムターゼ活性を有する細胞、ならびにβ-アラニン、パントテン酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、およびその他の有機化合物を生産するためにこれらの細胞を使用する方法に関する。
有機酸、エステル、および多価アルコールのような有機化合物は、プラスチック材料およびその他の製品を合成するために使用される。有機化合物に対して高まる要求に応じるため、炭化水素よりも炭水化物に基づく原材料を利用する、いっそう効率的かつ費用効率が高い製造方法の開発が進んでいる。例えば、ポリ乳酸の製造に使用される乳酸を大量に製造するのに、ある種の細菌が利用されている。
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)化合物は、鍵となるβ-アラニン中間体を介して、PEPまたはピルビン酸から生体触媒的に生産することができる(図1)。β-アラニンは、カルノシンより、β-アラニルアルギニンより、β-アラニルリジンより、5,6-ジヒドロウラシルおよびN-カルバモイル-β-アラニンを経由してウラシルより、N-アセチル-β-アラニンより、アンセリンより、またはアスパラギン酸より、細胞中で合成することができる(図1および2)。しかし、これらの経路では、3-HPよりもさらに高価である、希少な前駆物質または開始化合物が必要とされるため、相対的に効率が悪い。
略語および用語
用語および方法の以下の説明は、本開示をよりよく説明するために、および本開示を実践するうえで当業者を教え導くために提供される。本明細書では、「含む(comprising)」は「含む(including)」を意味し、そして単数形「一つの(a)」または「一つの(an)」または「その(the)」には、文脈により他に明記されていなければ複数対象が含まれる。例えば、「タンパク質を含む (comprising a protein)」に対する言及には、そのようなタンパク質の一つまたは複数が含まれ、そして「細胞を含む(comprising the cell)」に対する言及には、一つまたは複数の細胞および当業者に周知のその等価物などに対する言及が含まれる。
二つの異なる分離配列断片を人工的に組合せて作り出される配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学合成によりまたは、より一般的には、単離された核酸断片の人為的操作により、例えば遺伝子工学技術により達成されることが多い。組換え型は同様に、人為的に操作されているが、その核酸が単離された生物に見られるのと同じ調節配列およびコード領域を含む、核酸分子を記述するのに使用される。
一つの例として、その他のアミノ酸配列は、長さが僅か約10、12、15、20、25、30、または50残基しかないアミノ酸である。
アラニン2,3-アミノムターゼ活性を有するポリペプチドが、本明細書に開示される。一つの例として、ポリペプチドは、リジン2,3-アミノムターゼ、ロイシン2,3-アミノムターゼ、またはリジン5,6-アミノムターゼの配列のような、変異型アミノムターゼのアミノ酸配列である。アラニン2,3-アミノムターゼ活性を有するポリペプチドの例は、配列番号:21および30に示されている。しかし、本開示には同様に、アラニン2,3-アミノムターゼ活性を保持する、配列番号:21および30の変異体、融合体、および断片が包含される。使用できる断片の例には、以下に限定されることはないが: 配列番号:21のアミノ酸50〜390、50〜350、60〜350、75〜340、または100〜339および配列番号:30のアミノ酸1〜390、15〜390、15〜340または19〜331が含まれる。置換可能であり、その上、依然としてアラニン2,3-アミノムターゼ活性を保持している置換の例には、以下に限定されることはないが: 配列番号:21のV21IもしくはV21L; Y71P; L17I; K361R; A410V; および/またはY430FもしくはY430W置換、ならびに配列番号:30のT40S; V96IもしくはV96L; D102E; A252V; および/またはL393V置換のほか、その組み合わせが含まれる。
アラニン2,3-アミノムターゼ活性を有する細胞が開示される。そのような細胞は、α-アラニンからβ-アラニンを生産することができる。一つの例として、そのような細胞は、天然に存在する突然変異、および/または例えば、細胞を化学的もしくはUV突然変異誘発因子にさらすことで細胞の染色体(その複数)中に誘発される突然変異が原因となって、アラニン2,3-アミノムターゼ活性を有する。アラニン2,3-アミノムターゼ活性を含む細胞は、真核細胞また原核細胞とすることができる。そのような細胞の例には、以下に限定されることはないが、ラクトバチルス(Lactobacillus)、乳酸球菌ラクトコッカス(Lactococcus)、バチルス(Bacillus)、大腸菌(Escherichia)、ジェオバシラス(Geobacillus)、コリネバクテリア(Corynebacterium)、クロストリジウム(Clostridium)、真菌、植物、および酵母細胞が含まれる。一つの例として、植物細胞は、形質転換植物のような、植物の一部分である。
アラニン2,3-アミノムターゼ活性を有する細胞の同定方法が開示される。この方法には、panD遺伝子が機能的に欠失された、原核細胞のような細胞を、α-アラニンは含むがβ-アラニンもパントテン酸も含まれていない培地中で、または細胞が炭素、酸素、水素、および窒素の培地源からα-アラニンを生産できるが、β-アラニンもパントテン酸も含まれていない培地中で培養する段階、およびβ-アラニンまたはパントテン酸欠損培地中で増殖できる細胞を同定する段階が含まれる。特殊な例として、細胞は同様に、panF遺伝子も機能的に欠失される。細胞の増殖により、細胞がα-アラニンからβ-アラニンを生産していることが示唆され、このことから、細胞がアラニン2,3-アミノムターゼ活性を有することが示唆される。対照的に、細胞がβ-アラニンまたはパントテン酸欠損培地で増殖しないおよび/または生存しない場合には、細胞がα-アラニンからβ-アラニンを生産していないことが示唆され、このことから、細胞がアラニン2,3-アミノムターゼ活性を有していないことが示唆される。
アラニン2,3-アミノムターゼ活性を有するアラニン2,3-アミノムターゼ・ペプチドを生産する方法が開示される。この方法には、アラニン2,3-アミノムターゼ活性を有する開示の細胞を、この細胞がアラニン2,3-アミノムターゼ・ペプチドを生産することを可能とする条件の下で、培養する段階が含まれる。一つの例として、この方法には、アラニン2,3-アミノムターゼが生産されるように、アラニン2,3-アミノムターゼをコードする、一つまたは複数の外因性核酸分子(例えば、配列番号:20および/もしくは29またはアラニン2,3-アミノムターゼ活性を保持するその変異体、融合体、もしくは断片を含む配列)を有する細胞を培養する段階が含まれる。
開示のアラニン2,3-アミノムターゼ配列およびアラニン2,3-アミノムターゼ活性を有する開示の細胞の使用のような、アラニン2,3-アミノムターゼによる、α-アラニンからのβ-アラニンの生産に関する方法および材料が開示される。さらに、β-アラニンからのパントテン酸および3-HPの生産のほか、CoAならびに有機化合物、例えば1,3-プロパンジオール、アクリル酸、アクリル酸重合体、アクリル酸エステル、3-HP重合体、3-HPとその他の化合物(例えば酪酸、吉草酸およびその他の化合物)の共重合体、および3-HPエステルの生産に関する方法および材料が開示される。具体的には、本開示により、β-アラニン、パントテン酸および3-HPのほかに、CoAならびに有機化合物、例えば1,3-プロパンジオール、アクリル酸、アクリル酸重合体、アクリル酸エステル、3-HP重合体、および3-HPエステルのようなその誘導体をいっそう効率的に作製するために使用することが可能となる、アラニン2,3-アミノムターゼの核酸(例えば、配列番号:20および29)、ポリペプチド(例えば、配列番号:21および30)、宿主細胞、ならびにα-アラニンからβ-アラニンを生産するための方法および材料が提供される。
図1に示されるように、β-アラニンは、CoAトランスフェラーゼ活性(酵素番号2.8.3.1)またはCoAシンターゼ活性(酵素番号6.2.1.-)を有するポリペプチドを使用して、β-アラニル-CoAに変換可能である。β-アラニンは、α-アラニンをβ-アラニンに変換する宿主細胞中の内在性ポリペプチドにより、ならびに/または配列番号:20および/もしくは29、またはアラニン2,3-アミノムターゼ活性を保持するその断片、変異体、もしくは融合体を含む配列のような、組換え型アラニン2,3-アミノムターゼで形質転換された細胞を用いることにより、α-アラニンから生産可能である。β-アラニル-CoAは次に、β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性(酵素番号4.3.1.6)を有するポリペプチドを使用して、アクリリル-CoAに変換可能である。アクリリル-CoAは次に、3-HP-CoAデヒドラターゼ活性(酵素番号4.2.1.-) を有するポリペプチドを使用して、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA(3-HP-CoA)に変換可能である。3-HP-CoAは次に、以下: CoAトランスフェラーゼ活性(酵素番号2.8.3.1)を有するポリペプチド、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドロラーゼ活性(酵素番号3.1.2.-)を有するポリペプチド、および3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼ活性(酵素番号3.1.2.4)を有するポリペプチドを含むがこれらに限定されることはない、3-HP-CoAを3-HPに変換するために使用できる、幾つかの酵素により3-HPに変換可能である。
図3に示されているように、パントテン酸は、β-アラニンをパントテン酸に変換する、α-ケトパントイン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(酵素番号2.1.2.11)、α-ケトパントイン酸リダクターゼ(酵素番号1.1.1.169)、およびパントテン酸シンターゼ(酵素番号6.3.2.1)活性を有するペプチドにより、β-アラニンから生産することができる。
リジン2,3-アミノムターゼ活性を有するポリペプチドならびにそのようなポリペプチドをコードする核酸は、以下: クロストリジウム・サブテルミナレ(Clostridium subterminale)、大腸菌、枯草菌(B. subtilis)、デイノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、アクイフェックス・アエロリカス(Aquifex aeolicus)、またはヘモフィラス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)を含むがこれらに限定されることはない、さまざまな種から得られる。例えば、リジン2,3-アミノムターゼ活性を有するアミノ酸配列は、枯草菌(B. subtilis)については配列番号:31に、そしてポルフィロモナス・ジンジバリス(P. gingivalis)については配列番号:28に示されている。
図1および3に描かれた経路に規定されている各段階は、細胞内で(インビボで)または細胞外で(インビトロで、例えば、容器中またはカラム中で)行うことができる。さらに、有機化合物は、インビボ合成およびインビトロ合成を組み合わせることにより、生成させることができる。さらに、インビトロ合成の段階または段階(複数)は、化学反応または酵素反応を介してもよい。
図1に挙げられている酵素のような、本明細書に記載のポリペプチドは、宿主細胞中で個別に、または宿主細胞中で一緒に生産させることができる。さらに、特定の酵素活性を持つポリペプチドは、天然に存在するまたは天然に存在しないポリペプチドとすることができる。天然に存在するポリペプチドは、野生型および多型ポリペプチドを含む、天然に見られるようなアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドである。天然に存在するポリペプチドは、動物(例えば、哺乳動物)、植物、真菌、および細菌種を含むがこれらに限定されない、任意の種から得られる。天然に存在しないポリペプチドは、天然には見られないアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドである。従って、天然に存在しないポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドの変異型、または遺伝子工学で作り変えられたポリペプチドとすることができる。例えば、アラニン2,3-アミノムターゼ活性を持つ天然に存在しないポリペプチドは、リジン2,3-アミノムターゼ活性を持つ天然に存在するポリペプチドの改変型とすることができ、これは少なくともいくらかのアラニン2,3-アミノムターゼ活性(配列番号:21および/または30のような)を有する。ポリペプチドは、例えば、配列の付加、欠失、置換、またはその組み合わせにより変異させることができる。
本明細書に提供される核酸およびアミノ酸配列は、β-アラニン、パントテン酸および3-HPのほか、CoA、ならびに有機化合物、例えば1,3-プロパンジオール、アクリル酸、アクリル酸重合体、アクリル酸エステル、3-HPエステル、および3-HP重合体のようなその誘導体を生産するために、細胞とともに使用することができる。そのような細胞は、米国立衛生研究所の分類学のウェブページ内に掲載されているもののような、任意の種由来とすることができる。細胞は、真核細胞または原核細胞とすることができる。例えば、遺伝子組換え細胞は、哺乳動物細胞(例えば、ヒト、マウス、およびウシ細胞)、植物細胞(例えば、トウモロコシ、小麦、米、および大豆細胞)、真菌細胞(例えば、アスペルギルス(Aspergillus)およびリゾープス(Rhizopus)細胞)、酵母細胞、または細菌細胞(例えば、ラクトバチルス(Lactobacillus)、乳酸球菌ラクトコッカス(Lactococcus)、バチルス(Bacillus)、大腸菌(Escherichia)、およびクロストリジウム(Clostridium)細胞)とることができる。一つの例として、細胞は、微生物である。「微生物」という用語は、細菌、藻類、真菌、および原虫を含むがこれらに限定されることはない、任意のミクロ生物を指す。従って、大腸菌、枯草菌(B. subtilis)、バチルス・リケニフェルミス(B. licheniformis)、サッカロマイセス・セレヴィシエ(S. cerevisiae)、クルベロマイセス・ラクティス(Kluveromyces lactis)、カンジダ・ブランキイ(Candida blankii)、カンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)、およびピチア・パストリス(Pichia pastoris)は、微生物であり、本明細書の記載に従って使用することができる。別の例として、細胞は、より大きな生物、例えば植物の一部分、例えば形質転換植物である。β-アラニンから3-HP、パントテン酸、またはその他の有機化合物を生産するのに使用できる植物の例には、トウモロコシ、米、小麦、および大豆のような遺伝子組み換え作物が含まれるが、これらに限定されることはない。
ポリペプチド活性が低下した、遺伝子組換え細胞が開示される。細胞および特定のポリペプチド活性に関して「低下した」または「減少した」という用語を本明細書で使用する場合、同一種の対応細胞で測定される活性よりも低いレベルの活性を指す。例えば、酵素活性Xを欠く特定の微生物は、対応する微生物が少なくともある程度の酵素活性Xを有する場合、酵素活性Xが低下している。
酵素活性を持つ精製ポリペプチドを、パントテン酸、3-HP、ならびに/またはCoA、および有機化合物、例えば1,3-プロパンジオール、アクリル酸、アクリル酸重合体、アクリル酸エステル、3-HPエステル、および3-HP重合体のようなその誘導体を生産するために単独でまたは細胞と組み合わせて使用することができる。例えば、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ活性を有する実質的に純粋なポリペプチドを含む調製物を、3-HPの前駆物質である、3-HP-CoAの形成を触媒するように使用することができる。
パントテン酸、3-HP、および/またはその誘導体が生産されるような培地中で、微生物のような生産細胞を培養することにより、パントテン酸、3-HP、および/またはその誘導体を生産する方法が開示される。一般に、培地および/または培養条件は、微生物が十分な密度にまで増殖して、産物を効果的に生産するようなものとすることができる。大規模な生産工程の場合、本明細書のほかに記載されている方法のような任意の方法を使用することができる(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 第二版, 編者: DemainおよびDavies, ASM Press;ならびにPrinciples of Fermentation Technology, StanburyおよびWhitaker, Pergamon)。
図1および3に規定されている段階のいずれかより生産された化合物を、他の有機化合物に化学的に変換することができる。例えば、3-HPを水素化して、有用なポリエステル単量体である1,3-プロパンジオールを形成させることができる。3-HPのような有機酸の水素化は、コハク酸および/または乳酸を水素化するために使用される方法のような、いずれかの方法を用いて行うことができる。例えば、金属触媒を用いて3-HPを水素化することができる。別の例として、3-HPを脱水化して、アクリル酸を形成させることができる。脱水化反応を行うための任意の方法を使用することができる。例えば、3-HPを、触媒(例えば、金属または無機酸の触媒)の存在下で加熱して、アクリル酸を形成させることができる。1,3-プロパンジオールを同様に、オキシドリダクターゼ活性(例えば、酵素分類1.1.1.-の酵素)を持つポリペプチドを用いて、インビトロでまたはインビボで作製することができる。
1,3-プロパンジオールの生産方法、およびその生産のための細胞が開示される。1,3-プロパンジオールは、3-HP-CoAまたは3-HPから生成することができる。オキシドリダクターゼ/デヒドロゲナーゼタイプの活性を持つ酵素をコードする遺伝子をクローニングすることにより、3-HP-CoAまたは3-HPを生産する細胞または微生物を遺伝子工学で作り変えて、1,3-プロパンジオールを生成させることができる。
アラニンについてβ-アラニンを生産するアラニン2,3-アミノムターゼを同定するため、類似の反応を行うが、アラニンまたはβ-アラニンを基質として許容しない酵素を、無作為に突然変異させ、次いでアラニン2,3-アミノムターゼ活性を持つ変異酵素を同定するためにスクリーニングした。本実施例により、枯草菌(Bacillus subtilis)由来リジン2,3-アミノムターゼ(酵素番号5.4.3.2)(配列番号:3および31)のクローニングが記述される。当業者であれば、任意の所望の生物からリジン2,3-アミノムターゼをクローニングするために、類似の方法を使用できることを理解するものと思われる。
、および
を使用した(下線のヌクレオチドは、PCR産物をプラスミドにクローニングするために使用したNdeIおよびNotI部位である)。
枯草菌(B. subtilis)KAM遺伝子(配列番号:3)にインビトロで突然変異を導入するため、幾つかの変異性(error prone)PCR法を使用した。デイノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)(GenBankアクセッション番号:RDR02336)(これは、枯草菌(B. subtilis)KAMタンパク質の配列と52%同一である)、クロストリジウム・サブテルミナレ(Clostridium subterminale)(GenBankアクセッション番号:AF159146)、またはポルフィロモナス・ジンジバリス(P. gingivalis)(不完全ゲノム、The Institute for Genomic Research、実施例5を参照されたい)由来のKAM遺伝子のような、リジン2,3-アミノムターゼをコードする任意のKAM遺伝子に突然変異を導入するのに、類似の方法を使用することができる。
枯草菌(B. subtilis)KAM遺伝子(配列番号:3)にインビボで突然変異を導入するため、pPRO-KAM1を、大腸菌XL1Red(Stratagene)突然変異誘発株により継代した。プラスミドpPRO-KAM1およそ50 ngを、製造元の指示に従い、コンピテント細胞XL1-Redに形質転換し、そして25μg/ml カナマイシンを含有するLB培地に形質転換体をプレーティングした。無作為に選択したおよそ200個の形質転換体を形質転換用プレートからかき取り、そして25μg/ml カナマイシンを含有するLBブロス 5 ml 二部に植菌した。一部は30℃で、もう一部は37℃で一晩増殖させた。
アラニン2,3-アミノムターゼ反応を遂行できるポリペプチドをコードする遺伝子を同定するため、所望の活性に対する効率的なスクリーニングまたは選別が必要とされる。それ故、大腸菌が、後にコエンザイムA(CoA)のおよびアシルキャリアー蛋白質(ACP)の構成成分となる、パントテン酸の合成のためにβ-アラニンを利用することを認識することによる、選別方法を開発した。CoAおよびACPは、生物における有力なアシル基運搬体であり、そして増殖に不可欠である。
を用いて増幅した、なお下線が引かれている配列は、それぞれ、panD遺伝子座のすぐ上流および下流の大腸菌染色体の領域に相当し、そして下線が引かれていない領域は、CAT遺伝子を含む断片の増幅を可能とするpKD3の領域に相同である。PCR反応液には、最終容量300μl中、10×濃縮PCR用緩衝液(Roche Molecular Biochemicals) 30μl、プラスミドpKD3、各0.2 mM dNTP、各0.2μMプライマー、およびTaqポリメラーゼ(Roche Molecular Biochemicals)15単位が含まれた。PCR反応液を95℃で30秒間、その後95℃で30秒間、45℃で30秒間、72℃で1分間の30サイクル、さらに72℃で10分間インキュベートした。PCR産物をエタノールで沈殿させ、DpnIで消化し、QIAquick PCR Purificationキット(Qiagen)により精製し、そして組換え機能を発現しているBW25113/pKD46に形質転換した。形質転換体を25μg/ml クロラムフェニコールおよび5μMβ-アラニンを含有するLBプレートにプレーティングした。
を用いて行った。野生型のpanD遺伝子座からは、713塩基対のPCR産物が得られると予想されるが、ΔpanD::CAT構築物からは、1215塩基対の産物が得られた。挿入されたCAT遺伝子がプラスミドpCP20によりコードされるFLPリコンビナーゼの活性により取り除かれている、ΔpanD::CAT派生株は、以前に報告されているように(DatsenkoおよびWanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640〜5, 2000)構築した。この菌株をΔpanDと呼ぶ。
を用いて増幅した、なお下線が引かれている配列は、それぞれ、yeiA遺伝子座のすぐ上流および下流の大腸菌染色体の領域に相当し、そして下線が引かれていない領域は、CAT遺伝子を含む断片の増幅を可能とするpKD3の領域に相同である。クロラムフェニコール耐性(マーカー)挿入変異株を上述のように単離し、そして二重変異株ΔpanD/ΔyeiA::CATを生産するために、ΔpanD菌株に耐性マーカーを導入した。
ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)由来のリジン2,3-アミノムターゼ遺伝子は、ゲノムDNAからPCRにより増幅し、そしてベクターpET22B(Novagen)のNdeIおよびNotI部位にクローニングした。突然変異誘発PCRは、増幅のためのT7プロモーターおよびT7ターミネーター・プライマーならびに反応液100μL当たり突然変異誘発用緩衝液6.25μLまたは9.38μLを用い、CadwellおよびJoyceの方法(PCR Methods Appl. 2: 28〜33, 1992)により行った。PCR産物をゲル精製(Qiagen)し、そしてNdeIおよびNotIで順に消化した。消化されたPCR産物を、実施例2に記載されているように、pPRONdeベクターに連結し、そして大腸菌Electromax(商標)DH10B(商標)に形質転換した。変異処理につき少なくとも60,000クローンを得るため、形質転換を繰り返し行った。コロニーをプレートからかき取り、そしてプラスミドDNAを調製し、その濃度を増加させるために沈殿させた。得られたライブラリーは、変異率が0.3%および0.35%であった。
実施例2で上述のように作製した、リジン2,3-アミノムターゼ突然変異誘発プラスミド・ライブラリーを、大腸菌DV1株のエレクトロコンピテント細胞に形質転換した。形質転換体を、全形質転換体の推定値を得るため適当に希釈して、25μg/ml カナマイシンを含有するLB培地に、ならびに0.4%グルコース、0.2% Vitamin Assay Casamino Acids (DIFCO/Becton Dickinson, Sparks, MD)、および25μg/ml カナマイシン(Sigma, St. Louis, MO)を添加したM9最小培地にプレーティングした。選択の場合、IPTGを0.25 mMになるまで添加した。
(表1) 増殖試験
(表2) かき取ったコロニー/半嫌気性での試験
Pg aam = アラニン2,3-アミノムターゼ活性を有するポルフィロモナス・ジンジバリス(P. gingivalis)変異型kam遺伝子を持つプラスミドを有する細胞
Bs aam = アラニン2,3-アミノムターゼ活性を有する枯草菌(B. subtilis)変異型kam遺伝子を持つプラスミドを有する細胞
Pg kam = ポルフィロモナス・ジンジバリス(P. gingivalis)野生型kam遺伝子を持つプラスミドを有する細胞
実施例5の上述の、枯草菌(B. subtilis)野生型リジン2,3-アミノムターゼ遺伝子で同定された変異を、Stratagene QuikChange(商標)Site-Directed Mutagenesisキットを用いて、枯草菌(B. subtilis)野生型リジン2,3-アミノムターゼ遺伝子(配列番号:3)にそれぞれ構築した。L103M変異を創出するのに使用したオリゴヌクレオチドは:
とした。
M136V変異を創出するのに使用したオリゴヌクレオチドは:
とした。
D339H変異を創出するためのオリゴヌクレオチドは:
とした。
アラニン2,3-アミノムターゼ活性を有する細胞を同定するための別の方法は、上述のDVIまたはΔpanD::CAT細胞のような細胞を、突然変異誘発リジン2,3-アミノムターゼライブラリーで形質転換せずに、上述の培地にプレーティングすることである。そのような細胞を上述のように選択し、そして実施例6および9に記載されているようにアラニン2,3-アミノムターゼ活性が存在するか検証する。
上述のスクリーニング法を用いて得られた細胞を、そのアラニン2,3-アミノムターゼ活性について検証した。突然変異誘発ライブラリーで形質転換された細胞(実施例2、3、および5)の場合、標準的な分子生物学法を用いて、プラスミドを選択用宿主から単離した。得られたプラスミドを選択用宿主に再形質転換し、プラスミドを再単離し、そして得られたクローンを実施例6に記載されているように塩基配列決定した。非形質転換細胞(実施例8)の場合、アラニン2,3-アミノムターゼ活性を与える遺伝子を例えば、ショットガン・クローニングを用いて、クローニングすることができる。
panD遺伝子(その遺伝子産物(アスパラギン酸 1-デカルボキシラーゼ)は、アスパラギン酸からのβ-アラニンの生産を触媒する)の挿入欠失により、パントテン酸欠乏およびそれ故にコエンザイムAの生産不能が引き起こされる。しかし、α-アラニンからβ-アラニンを生産できるアラニン2,3-アミノムターゼを保持するΔpanD細胞は、この欠乏を回避できると思われる;特に、これらの細胞は、[3-13C]α-アラニンの存在下で増殖した場合、[13C]標識をコエンザイムAに取り込むと思われる。実施例6で単離された枯草菌(B. subtilis)のアラニン2,3-アミノムターゼ配列(配列番号:20および21)が、α-アラニンのβ-アラニンへの変換を触媒できることを確認するために、この試験を使用した。
(表3) [13C]コエンザイムAの生合成
細胞がアラニン2,3-アミノムターゼ活性を持つかどうか決定するために、α-アラニンのβ-アラニンへの変換を測定する、またはβ-アラニンの存在を測定する酵素アッセイ法を行うことができる。例えば、Chenら(Biochem. J. 348: 539〜49, 2000)により報告されている、リジン2,3-アミノムターゼ活性を決定するための方法は、還元的にプレインキュベートされた酵素または細胞抽出物とのインキュベーションでL-[U-14C]リジンの代わりにL-[U-14C]アラニンを使い、そして濾紙電気泳動により放射性のα-アラニンおよびβ-アラニンを分離後、α-アラニンおよびβ-アラニンに相当するスポットをそれぞれシンチレーション計測することにより、アラニン2,3-アミノムターゼ活性の決定に適用することができる。または、精製され且つ還元的にプレインキュベートされたアラニン2,3-アミノムターゼを、α-アラニンとインキュベートし、そして産物のβ-アラニンをα-アラニンから分離し且つその産物を定量化するため、高速液体クロマトグラフィーにより反応混合液を分離することができる(Abeら、J. Chromatography B, 712: 43〜9, 1998)。
β-アラニン経由で3-HPの生産を可能とする生合成経路を創出した(図1)。β-アラニンからの3-HPへの一つの経路には、CoAトランスフェラーゼ活性を持つポリペプチド、すなわち、CoA基を一方の代謝産物からもう一方に転移させる酵素類由来の酵素の使用が含まれる。図1に示されるように、CoAトランスフェラーゼ活性を持つポリペプチドおよびアセチル-CoAまたはプロピオニル-CoAのようなCoA供与体を用いて、β-アラニンをβ-アラニル-CoAに変換することができる。または、CoAシンターゼ活性を持つポリペプチドの作用により、β-アラニル-CoAを生産することができる。β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチドにより、β-アラニル-CoAを脱アミノ化して、アクリリル-CoAを形成させることができる。アクリリル-CoAをβ位で水酸化して3-HP-CoAを産出する反応は、3-HP-CoAデヒドラターゼ活性を持つポリペプチドにより行うことができる。3-HP-CoAはβ-アラニンに対するCoA供与体として機能することが可能であり、CoAトランスフェラーゼ活性を持つポリペプチドが触媒可能な反応により、産物として3-HPが生産される。または、特異的CoAヒドロラーゼ活性を持つポリペプチドにより、3-HP-CoAを加水分解して3-HPを産出することができる。
アルカリゲネス・フェカリス(A. faecalis)(ATCC#700596)は、3-HP経由でアクリル酸を代謝する塩性湿地性の細菌である。アクリル酸から生産される3-HPは、3-HPデヒドロゲナーゼによりマロン酸セミアルデヒドに変換される可能性が高い。このデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離するため、アルカリゲネス・フェカリス(A. faecalis)のゲノムDNAを以下のように単離した。アルカリゲネス・フェカリス(A. faecalis)の培養物5 mlをトリプトソイブロス培地中、37℃で増殖させ、そして細胞を集菌後、TE緩衝液400 mLに再懸濁させた。その後、10% SDS 20 mL、10 mg/ml プロテイナーゼK 100μl、および100 mg/ml リソゾーム 10mLを細胞懸濁液に添加し、この混合溶液を時々混合させながら42℃で2時間インキュベートした。この混合液に、フェノール 150 mLを添加して、この混合液を37℃で少なくとも2時間振盪した後、クロロホルム約800 mLを添加した。この混合液をボルテックスにより混合し、そして15000 rpmで30分間遠心した。上部の水層をきれいな遠心チューブに移し替えてから、3M 酢酸ナトリウム(NaOAc)60 mLおよびエタノール約1 mLによりDNAを沈殿させ、そしてスプーリングにより回収した。TE緩衝液400 mLを用いてDNAを再懸濁させてから200 mg/ml RNase 20 mLを添加し、そしてこの混合液を37℃で1時間インキュベートした。酢酸ナトリウム(NaOAc)およびエタノールによりDNAを再沈殿させ、70%エタノールで数回洗浄しそしてTE緩衝液に再懸濁させた。
鋳型としてアルカリゲネス・フェカリス(A. faecalis)のゲノムDNAを使ったPCR反応は、配列番号:16および18(反応A)または配列番号:17および18(反応B)のいずれかを使用し、製造元の指示に従い、Taq DNAポリメラーゼ(Roche)を用いて行われた。PCRプログラムは、94℃で2分間の開始インキュベーション、94℃で30秒間、56℃で45秒間、72℃で3分間の4サイクル; 94℃で30秒間、54℃で45秒間、72℃で3分間の4サイクル; 94℃で30秒間、52℃で45秒間、72℃で3分間の4サイクル; 94℃で30秒間、50℃で45秒間、72℃で3分間の4サイクル; および94℃で30秒間、47℃で45秒間、72℃で3分間の16サイクル後、72℃で7分間の最終インキュベーションで構成された。どちらの反応でも約500 bpの産物が得られた。反応Aで得られたPCR産物をゲルで単離し、pCR11にクローニングしそしてTOP10化学的コンピテント細胞に形質転換し、50 mg/ml カナマイシンを含有するLB培地で選択した。正しいサイズのインサートを持つクローンを選択し、そしてそれらのプラスミドを単離し且つ塩基配列決定した。これらの配列に基づいて、以下の遺伝子特異的な内側プライマー(nested primers):
を設計し、そして3-HPデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のORF全体を単離するためにGenome Walk法を使用した。
このORFの配列は配列番号:33に示されており、そして対応するタンパク質の配列は配列番号:34に示されている。3-HPデヒドロゲナーゼの開始コドンは、配列番号:33の位置408でありそして配列番号:33の位置397〜403のリボソーム結合部位がその前方に位置する。停止コドンは、配列番号:33の位置1304である。
二つのacl遺伝子がクロストリジウム・プロピオニカム(C. propionicum)からクローニングされた。acl-1(配列番号:22)は、145アミノ酸のタンパク質(配列番号:23)をコードしそしてacl-2(配列番号:53)は、144アミノ酸のタンパク質(配列番号:54)をコードする。これらの二つのタンパク質は相同性が高く、C末端の8アミノ酸だけが異なる。以下のプライマーを用いてacl-1およびacl-2遺伝子をクローニングした: acl-1に対しては
および
、ならびにacl-2に対しては配列番号:35および
を使用した。得られた配列をNdeIおよびBamHIで消化したpET11aベクターにクローニングした。得られたプラスミドpACL-1およびpACL-2をBL21(DE3)細胞に形質転換した。pET11a(対照)、pACL-1およびpACL-2を持つBL21(DE3)を、OD600が約0.5になるまで50μg/ml カルベニシリンを添加したLB培地10 ml中で増殖させ、そして100μM IPTGを加えて4時間誘導した。誘導細胞を、Avanti J20遠心機(Beckman, Fullerton, CA)中、3500 rpmの遠心により回収し、そして製造元の指示に従いBug Buster(Novagen, Madison, WI)で処理した。得られた細胞抽出物は、アクリリル-CoAのβ-アラニン-CoAへの変換(図1の経路に対する逆反応)を追跡する酵素アッセイ法で使用した。
yfdE遺伝子(PubMedデータベースでは仮想タンパク質と特定される)の読み取り枠をPCR法により増幅した。読み取り枠には、可能性のある開始部位が二箇所あったので、両遺伝子をクローニングし且つ発現させるため、以下のプライマーを使用した: yfdE-1遺伝子に対しては、yfdE gtg nde sen
およびyfdE atg nde sen
、ならびにyfdE-2遺伝子に対しては、yfdE gtg nde sen(配列番号:38)およびyfdE bam anti
を使用した。
以下の変換: β-アラニン〜β-アラニル-CoA〜アクリリル-CoA〜3-HPのためのオペロンを構築した。CoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、PCRにより、
プライマーを用いてメガスフェラ・エルスデニイ(M. elsdenii)のゲノムDNAから増幅した。
およびOSaclNdeR
; ならびにacl-2遺伝子に対しては、プライマー対OSacl2XbaF
およびOSacl2-2NdeR
を用いてクロストリジウム・プロピオニカム(C. propionicum)のゲノムDNAから増幅した。
別のまたは付加的な経路で、β-アラニンを、β-アラニン-2-オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ活性を持つポリペプチドにより脱アミノ化してマロン酸セミアルデヒドを産出させることができ、そしてこれを、3-HPデヒドロゲナーゼ活性を持つポリペプチドまたは3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を持つポリペプチドにより3-HPにさらに還元することができる。
プライマーを用いてクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)のゲノムDNAから増幅した。
3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、PCRにより、
プライマーを用いてシュードモナス・アエルギノーザ(P. aeruginosa) のゲノムDNAから増幅した。
PCRは、Pfu Turboポリメラーゼを用い、Perkin Elmer 2400 Thermocyclerにて製造元の指示に従い、以下の条件の下で行った: 最初の変性ステップを94℃で2分間; 94℃で30秒間、56℃で30秒間、72℃で1.5分間を25サイクル; 最後の伸長を72℃で10分間。得られたPCR産物を、Qiagen Gel Extractionキットを用いてゲル精製した。
幾つかの代替経路を介して、β-アラニン経由で3-HPの生産を可能とする、幾つかのオペロンを実施例10で作り出した。本実施例に開示される方法は、開示のアラニン2,3-アミノムターゼの本明細書に開示される配列をオペロンのなかに含めることにより、それを拡張するものである。これにより、α-アラニン経由で3-HPの生産が可能になる。
α-アラニン〜β-アラニン〜β-アラニル-CoA〜アクリリルCoA〜3-HPの変換のためのオペロンを以下のように構築した。pLCATH2-1の構築のために、アラニン2,3-アミノムターゼ(実施例6; 配列番号:20および21)を持つプラスミドpLC4-7LC1を使用した。ATH-2オペロンをpATH-2(実施例10)から、以下のプライマーを用いて増幅した。
PCRを、上述のようにrTthポリメラーゼおよびPfu Turboポリメラーゼが比率8 対 1の混合物を用いて、以下の条件の下で行った: 最初の変性ステップを94℃で2分間; 94℃で30秒間、56℃で30秒間、68℃で2分間を25サイクル; 最後の伸長を68℃で7分間。
α-アラニン〜β-アラニン〜マロン酸セミアルデヒド〜3-HPの変換のためのオペロンを以下のように構築した。pLCATD1の構築のために、アラニン2,3-アミノムターゼ(実施例6; 配列番号:20および21)を持つプラスミドpLC4-7LC1(実施例6)を使用した。ATDオペロンは、以下を用いてpATDプラスミド(実施例10)から増幅した:
オペロン4に対して上に記載されているように、PCRを行い、そして得られたPCR産物を精製し、NotIおよびXbaIで消化し、プラスミドpLC4-7LC-1にクローニングし、化学的コンピテントTuner細胞に形質転換し、そしてオペロン4に対して記載されているように、個別のコロニーを選択した。
遺伝子発現および3-HP生産を観測するため、pLCATH2-1、pLCATD1プラスミドまたはpPROLarベクター(対照)を持つTuner細胞を、OD600が約0.5になるまで5 g/l グルコース、5 g/l α-アラニンまたは5 g/l β-アラニンおよび25μg/ml カナマイシンを添加したLB培地中で増殖させ、そして100μM IPTGおよび0.5%アラビノースを加えて好気的条件の下で誘導させた。β-アラニンからの3-HPの生産が、LC-MS分析により、pLCATH2-1およびpLCATD1を持つ細胞で検出されたが、対照細胞では検出されなかった。3-HPは、誘導から22時間後、細胞上清中に観測された。
ピルビン酸〜α-アラニン〜β-アラニン〜マロン酸セミアルデヒド〜3-HPの変換のためのオペロンを以下のように構築した。アラニン2,3-アミノムターゼをコードする遺伝子を、PCRにより、プライマー
を用いてpLC4-7LC1から増幅した。
β-アラニン・アミノトランスフェラーゼ遺伝子を、PCRにより、プライマー
を用いてラットcDNAから増幅した。
3-HPデヒドロゲナーゼを、PCRにより、プライマー
を用いてアルカリゲネス・フェカリス(A. faecalis)のゲノムDNAから増幅した。
α-アラニン・アミノトランスフェラーゼ遺伝子を、プライマー
を用いてラットcDNAから増幅した。
パントテン酸は、α-ケトパントイン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(酵素番号2.1.2.11)、α-ケトパントイン酸リダクターゼ(酵素番号1.1.1.169)、およびパントテン酸シンターゼ(酵素番号6.3.2.1)活性を持つポリペプチドにより、β-アラニンから生産することができる(図3)。
公に利用可能な酵素のcDNAおよびアミノ酸配列、ならびにアラニン2,3-アミノムターゼ、CoAトランスフェラーゼ、β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ、3-HP-CoAデヒドラターゼ、4-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、β-アラニン-2-オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ、3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ、3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、3-HP-CoAヒドロラーゼ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼ、ポリヒドロキシ酸シンターゼ、リパーゼ、エステラーゼ、CoAヒドロラーゼ、α-ケトパントイン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、α-ケトパントイン酸リダクターゼ、パントテン酸シンターゼ、パントテン酸キナーゼ、4'-ホスホパンテテノイル-1-システイン・シンテターゼ、4'-ホスホパントテノイルシステイン・デカルボキシラーゼ、ATP:4'-ホスホパンテテイン・アデニルトランスフェラーゼ、デホスホ-CoAキナーゼ、アセチル化アルデヒド:NAD(+)オキシドリダクターゼ、アルコール:NAD(+)オキシドリダクターゼ、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(NAD(P)+)およびアルコール・デヒドロゲナーゼのほか、その変異体、多型、突然変異体、断片および融合体のような、本明細書に開示される酵素および配列を用いて、標準的な実験手技により、酵素のような任意のタンパク質の発現および精製が可能とされる。当業者であれば、酵素およびその断片を、関心のある任意の細胞または生物で遺伝子組換え的に生産することが可能であり、そして使用前に、例えば3-HP、パントテン酸およびその誘導体の生産前に精製することが可能であることを理解するものと思われる。
アラニン2,3-アミノムターゼ、CoAトランスフェラーゼ、β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ、3-HP-CoAデヒドラターゼ、4-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、β-アラニン-2-オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ、3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ、3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、3-HP-CoAヒドロラーゼ、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼ、ポリヒドロキシ酸シンターゼ、リパーゼ、エステラーゼ、CoAヒドロラーゼ、α-ケトパントイン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、α-ケトパントイン酸リダクターゼ、パントテン酸シンターゼ、パントテン酸キナーゼ、4'-ホスホパンテテノイル-1-システイン・シンテターゼ、4'-ホスホパントテノイルシステイン・デカルボキシラーゼ、ATP:4'-ホスホパンテテイン・アデニルトランスフェラーゼ、デホスホ-CoAキナーゼ、アセチル化アルデヒド:NAD(+)オキシドリダクターゼ、アルコール:NAD(+)オキシドリダクターゼ、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(NAD(P)+)およびアルコール・デヒドロゲナーゼ(ならびにその変種、融合体、多型、断片、および突然変異体)のような、本明細書に開示される酵素は、当技術分野において周知である、多くの、手動のまたは自動の合成方法のうちのいずれかにより化学的に合成することができる。例えば、固相ペプチド合成(SPPS)は、Applied Biosystems Model 431A Peptide Synthesizer(ペプチド合成機)を使用し、そして9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)アミノ末端保護を、ジシクロヘキシルカルボジイミド/ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは2-(1H-ベンゾ-トリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート/ヒドロキシベンゾトリアゾール(HBTU/HOBT)と組み合わせて使用し、そしてカルボキシル末端が酸の場合にはp-ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン(HMP)もしくはSasrin樹脂またはカルボキシル末端がアミドの場合にはRinkアミド樹脂を使用して、0.25ミリモル(mmole)スケールで行われる。
(配列番号:1および2)枯草菌(B. subtilis)リジン2,3-アミノムターゼ(KAM)遺伝子をクローニングするために使用したPCRプライマーである。
(配列番号:3)枯草菌(B. subtilis)KAM遺伝子の核酸配列である。
(配列番号:4および5)pKD3のCAT遺伝子を増幅するために使用したPCRプライマーである。
(配列番号:6および7)CAT遺伝子がpanD遺伝子座に正しく挿入されていることを確認するために使用したPCRプライマーである。
(配列番号:8および9)pKD3のCAT遺伝子を増幅するために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:10および11)枯草菌(B. subtilis)の野生型リジン2,3-アミノムターゼ遺伝子に突然変異L103Mを発生させるために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:12および13)枯草菌(B. subtilis)の野生型リジン2,3-アミノムターゼ遺伝子に突然変異M136Vを発生させるために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:14および15)枯草菌(B. subtilis)の野生型リジン2,3-アミノムターゼ遺伝子に突然変異D339Hを発生させるために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:16〜19、26、27および32)アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)M3Aから3-HPデヒドロゲナーゼ遺伝子をクローニングするために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:20)アラニン2,3-アミノムターゼDNAの核酸配列である。
(配列番号:21)アラニン2,3-アミノムターゼタンパク質のアミノ酸配列である。
(配列番号:22)β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ(ACL-1)cDNAの核酸配列である。
(配列番号:23)β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ(ACL-1)タンパク質のアミノ酸配列である。
(配列番号:24)CoAトランスフェラーゼcDNAの核酸配列である。
(配列番号:25)CoAトランスフェラーゼタンパク質のアミノ酸配列である。
(配列番号:28)ポルフィロモナス・ジンジバリス(P. gingivalis)KAMのアミノ酸配列である。
(配列番号:29)アラニン2,3-アミノムターゼの核酸配列である。
(配列番号:30)アラニン2,3-アミノムターゼタンパク質のアミノ酸配列である。
(配列番号:31)枯草菌(B. subtilis)KAMのアミノ酸配列である。
(配列番号:33)アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)M3A由来の3-HPデヒドロゲナーゼ遺伝子の核酸配列である。
(配列番号:34)アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)M3A由来の3-HPデヒドロゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列である。
(配列番号:35〜37)β-アラニン-CoAアンモニアリアーゼ(ACL-1およびACL-2)をクローニングするために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:38〜40)大腸菌(E.coli.)からCoAトランスフェラーゼをクローニングするために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:41〜48)ACL-1またはACL-2、CoAトランスフェラーゼおよびCoAヒドラターゼ遺伝子を含む、オペロン1および2を生産するために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:49〜52)4-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼおよび3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、オペロン3を生産するために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:53)β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ(ACL-2)cDNAの核酸配列である。
(配列番号:54)β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ(ACL-2)タンパク質のアミノ酸配列である。
(配列番号:55〜56)pATH-2-2-1プラスミドからATH-2オペロンを増幅するために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:57〜58)pATDプラスミドからATDオペロンを増幅するために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:59〜60)枯草菌(B. subtilis)アラニン2,3 アミノムターゼを増幅するために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:61〜62)ラットβ-アラニン・アミノトランスフェラーゼ遺伝子を増幅するために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:63〜64)アルカリゲネス・フェカリス(A. faecalis)から3-HPデヒドロゲナーゼを増幅するために使用したプライマーの核酸配列である。
(配列番号:65〜66)ラットからα-アラニン・アミノトランスフェラーゼ遺伝子を増幅するために使用したプライマーの核酸配列である。
Claims (107)
- α-アラニンからβ-アラニンを生産する、アラニン2,3-アミノムターゼを含む細胞。
- 形質転換細胞である、請求項1記載の細胞。
- アラニン2,3-アミノムターゼをコードする核酸配列を含有する、少なくとも一つの外因性核酸分子を含む、請求項2記載の細胞。
- 外因性核酸分子が変異型リジン2,3-アミノムターゼである、請求項3記載の細胞。
- 外因性核酸分子が変異型ロイシン2,3-アミノムターゼである、請求項3記載の細胞。
- 外因性核酸分子が変異型リジン5,6-アミノムターゼである、請求項3記載の細胞。
- アラニン2,3-アミノムターゼをコードする核酸配列が、配列番号:20に示される配列のヌクレオチド307〜1017位または配列番号:29に示される配列のヌクレオチド55〜1026位を含む、請求項3記載の細胞。
- 配列番号:20のヌクレオチド307〜1017位または配列番号:29のヌクレオチド55〜1026位を含有する核酸が、一つまたは複数の保存的アミノ酸置換をもたらす一つまたは複数の置換を含む、請求項7記載の細胞。
- 配列番号:20のヌクレオチド307〜1017位または配列番号:29に示される配列のヌクレオチド55〜1026位を含有する核酸が、10個以内の保存的アミノ酸置換をもたらす一つまたは複数の置換を含む、請求項7記載の細胞。
- アラニン2,3-アミノムターゼをコードする核酸配列が、配列番号:20または配列番号:29と少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項3記載の細胞。
- アラニン2,3-アミノムターゼをコードする核酸配列が、配列番号:20または配列番号:29と少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項10記載の細胞。
- アラニン2,3-アミノムターゼをコードする核酸配列が、配列番号:20または配列番号:29を含む、請求項10記載の細胞。
- 変異型リジン2,3-アミノムターゼが、原核生物の変異型リジン2,3-アミノムターゼである、請求項4記載の細胞。
- 原核生物の変異型リジン2,3-アミノムターゼが、枯草菌、デイノコッカス・ラディオデュランス、クロストリジウム・サブテルミナレ、ポルフィロモナス・ジンジバリス、または大腸菌の変異型リジン2,3-アミノムターゼである、請求項13記載の細胞。
- 変異型リジン2,3-アミノムターゼが、枯草菌の変異型リジン2,3-アミノムターゼである、請求項14記載の細胞。
- 枯草菌の変異型リジン2,3-アミノムターゼが、L103M、L103K、L103R、L103E、またはL103S置換を含む、請求項15記載の細胞。
- 枯草菌の変異型リジン2,3-アミノムターゼが、L103M、M136V置換、D339H置換、またはその任意の組み合わせを含む、請求項15記載の細胞。
- 枯草菌の変異型リジン2,3-アミノムターゼが、D339H、D339Q、D339T、またはD339N置換を含む、請求項15記載の細胞。
- 変異型リジン2,3-アミノムターゼが、ポルフィロモナス・ジンジバリスの変異型リジン2,3-アミノムターゼである、請求項14記載の細胞。
- ポルフィロモナス・ジンジバリスの変異型リジン2,3-アミノムターゼが、N19Y置換、L53P置換、H85Q置換、D331G置換、M342T置換、またはその任意の組み合わせを含む、請求項19記載の細胞。
- 変異型リジン5,6-アミノムターゼが、クロストリジウム・スティクランジィの変異型リジン5,6-アミノムターゼである、請求項6記載の細胞。
- 原核細胞である、請求項1記載の細胞。
- 原核細胞が、ラクトバチルス、ラクトコッカス、バチルス、または大腸菌細胞である、請求項22記載の細胞。
- 原核細胞が、大腸菌またはバチルス・リケニフォルミス細胞である、請求項22記載の細胞。
- 酵母細胞である、請求項1記載の細胞。
- 3-ヒドロプロピオン酸(3-HP)を生産する、請求項1記載の細胞。
- 以下の活性をさらに含む、請求項26記載の細胞:
CoAトランスフェラーゼまたはCoAシンテターゼ活性;
β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性;および
3HP-CoAデヒドラターゼ活性。 - 3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドロラーゼおよび/または3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼ活性をさらに含む、請求項27記載の細胞。
- 4-アミノ酪酸および/またはβ-アラニン-2-オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ活性;ならびに3-HPデヒドロゲナーゼ活性または3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ活性をさらに含む、請求項26記載の細胞。
- 細胞は以下の活性をさらに含む、請求項1記載の細胞:
CoAトランスフェラーゼまたはCoAシンテターゼ活性;
β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性;
3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ活性;
3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドロラーゼおよび/または3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼ活性;ならびに
リパーゼおよび/またはエステラーゼ活性。 - 3-HPのエステルを生産する、請求項30記載の細胞。
- 3-HPのエステルが、3-ヒドロキシプロピオン酸メチル、3-ヒドロキシプロピオン酸エチル、3-ヒドロキシプロピオン酸プロピル、3-ヒドロキシプロピオン酸ブチル、または3-ヒドロキシプロピオン酸2-エチルヘキシルである、請求項31記載の細胞。
- 以下の活性をさらに含む、請求項1記載の細胞:
CoAトランスフェラーゼ活性;
β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性;
3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ活性;および
ポリヒドロキシ酸シンターゼ活性。 - 3-HP重合体を生産する、請求項33記載の細胞。
- 以下の活性をさらに含む、請求項1記載の細胞:
CoAトランスフェラーゼ活性;
β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性;および
ポリヒドロキシ酸シンターゼ活性。 - アクリル酸重合体を生産する、請求項35記載の細胞。
- 以下の活性をさらに含む、請求項1記載の細胞:
CoAトランスフェラーゼ活性;
β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性;ならびに
リパーゼおよび/またはエステラーゼ活性。 - アクリル酸エステルを生産する、請求項37記載の細胞。
- アクリル酸エステルが、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、またはアクリル酸ブチルである、請求項38記載の細胞。
- 1,3-プロパンジオールを生産する、請求項1記載の細胞。
- 以下の活性をさらに含む、請求項40記載の細胞:
CoAトランスフェラーゼまたはCoAシンテターゼ活性;
β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性;
3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ活性;
アセチル化アルデヒド:NAD(+)オキシドリダクターゼ活性;および
アルコール:NAD(+)オキシドリダクターゼ活性。 - 以下の活性をさらに含む、請求項40記載の細胞:
CoAトランスフェラーゼ活性;
β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性;
3-ヒドロキシプロピオニン-CoAデヒドラターゼ活性;
3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドロラーゼおよび/または3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼ活性;
アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(NAD(P)+)活性;ならびに
アルコール・デヒドロゲナーゼ活性。 - パントテン酸を生産する、請求項1記載の細胞。
- α-ケトパントイン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、α-ケトパントイン酸リダクターゼ、およびパントテン酸シンターゼ活性をさらに含む、請求項43記載の細胞。
- コエンザイムA(CoA)を生産する、請求項43記載の細胞。
- パントテン酸キナーゼ、4'-ホスホパンテテノイル-1-システイン・シンテターゼ、4'-ホスホパントテノイルシステイン・デカルボキシラーゼ、ATP:4'-ホスホパンテテイン・アデニルトランスフェラーゼ、およびデホスホ-CoAキナーゼ活性をさらに含む、請求項45記載の細胞。
- アラニン2,3-アミノムターゼ活性を含むポリペプチド。
- 変異型リジン2,3-アミノムターゼのアミノ酸配列を含む、請求項47記載のポリペプチド。
- 変異型リジン2,3-アミノムターゼのアミノ酸配列が、枯草菌、デイノコッカス・ラディオデュランス、クロストリジウム・サブテルミナレ、ポルフィロモナス・ジンジバリス、または大腸菌の変異型リジン2,3-アミノムターゼのアミノ酸配列である、請求項48記載のポリペプチド。
- 変異型リジン2,3-アミノムターゼのアミノ酸配列が、枯草菌の変異型またはポルフィロモナス・ジンジバリスの変異型リジン2,3-アミノムターゼのアミノ酸配列である、請求項49記載のポリペプチド。
- 配列番号:21に示される配列のアミノ酸50〜390位または配列番号:30に示される配列のアミノ酸15〜390位を含む、請求項47記載のポリペプチド。
- 配列番号:21または30と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項47記載のポリペプチド。
- 配列番号:21または30と少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む、請求項52記載のポリペプチド。
- 配列番号:21または30を含む、請求項52記載のポリペプチド。
- 一つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含む、請求項52記載のポリペプチド。
- わずか10個の保存的アミノ酸置換を含む、請求項52記載のポリペプチド。
- 請求項47記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸。
- プロモーター配列に操作可能に連結された、請求項57記載の単離核酸。
- 配列番号:20のヌクレオチド307〜1017位または配列番号:29のヌクレオチド55〜1026位を含む、請求項57記載の単離核酸。
- 配列番号:20または配列番号:29と少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項57記載の単離核酸。
- 配列番号:20または配列番号:29と少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項57記載の単離核酸。
- 核酸配列が、一つまたは複数の保存的アミノ酸置換をもたらす一つまたは複数の置換を含む、請求項60記載の単離核酸。
- 核酸配列が、わずか10個の保存的アミノ酸置換をもたらす一つまたは複数の置換を含む、請求項60記載の単離核酸。
- 配列番号:20または29を含む、請求項61記載の単離核酸。
- 請求項57記載の単離核酸を含むベクター。
- 請求項57記載の単離核酸を含む組換え核酸。
- 請求項66記載の組換え核酸で形質転換された細胞。
- 請求項57の組換え核酸を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
- 請求項47記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも一つの外因性核酸分子を含有する形質転換細胞。
- α-アラニンからβ-アラニンを生産する、請求項69記載の形質転換細胞。
- 3-HPを生産する、請求項70記載の細胞。
- 1,3-プロパンジオールを生産する、請求項71記載の細胞。
- パントテン酸を生産する、請求項70記載の細胞。
- CoAを生産する、請求項73記載の細胞。
- 請求項47記載のポリペプチドに特異的に結合する、特異的結合物質。
- 細胞がアラニン2,3-アミノムターゼ活性を含むポリペプチドを生産することを可能とする条件の下で、請求項67記載の細胞を培養する段階を含む、アラニン2,3-アミノムターゼ活性を含むポリペプチドの生産方法。
- 細胞がα-アラニンからβ-アラニンを生産することを可能とする条件の下で、請求項1記載の細胞を培養する段階を含む、α-アラニンからβ-アラニンを生産するための方法。
- 細胞が、α-アラニンからβ-アラニンを生産できるアラニン2,3-アミノムターゼをコードする少なくとも一つの外因性核酸分子を含む、請求項77記載の方法。
- 細胞が原核細胞である、請求項78記載の方法。
- 細胞が酵母、ラクトバチルス、ラクトコッカス、バチルス、または大腸菌細胞である、請求項78記載の方法。
- 細胞がpanD遺伝子の機能的欠失を含む、請求項78記載の方法。
- 以下の段階を含む、アラニン2,3-アミノムターゼ活性を含む細胞の同定方法:
panD遺伝子が機能的に欠失された細胞を、β-アラニンおよびパントテン酸を含んでいない培地中で培養する段階;ならびに
培地中で増殖できる細胞を同定する段階であって、細胞の増殖は、該細胞がα-アラニンからβ-アラニンを生産している(これは、細胞がアラニン2,3-アミノムターゼ活性を含有することを示す)ことを示し、細胞が増殖しないのは、該細胞がα-アラニンからβ-アラニンを生産していない(これは、細胞がアラニン2,3-アミノムターゼ活性を含有しないことを示す)ことを示す、段階。 - 細胞を培養する段階の前に、一つまたは複数の変異型リジン2,3-アミノムターゼを細胞にトランスフェクトする段階をさらに含む、請求項82記載の方法。
- 一つまたは複数の変異型原核生物リジン2,3-アミノムターゼが、枯草菌、デイノコッカス・ラディオデュランス、クロストリジウム・サブテルミナレ、 アクイフェックス・エオリカス、ヘモフィラス・インフルエンザ、大腸菌、および/またはポルフィロモナス・ジンジバリスの変異型リジン2,3-アミノムターゼである、請求項83記載の方法。
- 一つまたは複数の変異型リジン2,3-アミノムターゼが、枯草菌の変異型リジン2,3-アミノムターゼである、請求項83記載の方法。
- 培地中で増殖する細胞を同定する段階の後に、細胞にアラニン2,3-アミノムターゼ活性を付与する、一つまたは複数の変異型リジン2,3-アミノムターゼの突然変異を同定する段階をさらに含む、請求項83記載の方法。
- 一つまたは複数の変異型リジン2,3-アミノムターゼの突然変異を同定する段階に、一つまたは複数の変異型リジン2,3-アミノムターゼを配列決定する段階が含まれる、請求項86記載の方法。
- 細胞が原核細胞である、請求項82記載の方法。
- 細胞が3-HPを生産する条件の下で、請求項1記載の細胞を培養する段階を含む、3-HPを生産するための方法。
- 細胞が、α-アラニンからβ-アラニンを生産するアラニン2,3-アミノムターゼをコードする少なくとも一つの外因性核酸を含み、その結果、3-HPがβ-アラニンから生産される、請求項89記載の方法。
- 細胞が以下の活性をさらに含む、請求項89記載の方法:
CoAトランスフェラーゼまたはCoAシンテターゼ活性;
β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性;
3-HP-CoAデヒドラターゼ活性;ならびに
3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドロラーゼおよび/または3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼ活性。 - 細胞が以下の活性をさらに含む、請求項89記載の方法:
4-アミノ酪酸および/またはβ-アラニン-2-オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ活性;ならびに
3-HPデヒドロゲナーゼおよび/または3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性。 - 細胞が1,3-プロパンジオールを生産する条件の下で、請求項40記載の細胞を培養する段階を含む、1,3-プロパンジオールを生産するための方法。
- 細胞がパントテン酸を生産する条件の下で、請求項43記載の細胞を培養する段階を含む、パントテン酸を生産するための方法。
- 細胞がCoAを生産する条件の下で、請求項45記載の細胞を培養する段階を含む、CoAを生産するための方法。
- 以下の段階を含む、3-HPを生産するための方法:
請求項1記載の細胞からβ-アラニンを精製する段階;
β-アラニル-CoAを形成させるため、β-アラニンを、CoAトランスフェラーゼ活性を含むポリペプチドと接触させる段階;
アクリリル-CoAを形成させるため、β-アラニル-CoAを、β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性を含むポリペプチドと接触させる段階;
3-HP-CoAを形成させるため、アクリリル-CoAを、3HP-CoAデヒドラターゼ活性を含むポリペプチドと接触させる段階;ならびに
3-HPを生産するため、3-HP-CoAを、CoAトランスフェラーゼ活性、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドロラーゼ、および/または3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼ活性を含むポリペプチドと接触させる段階。 - 以下の段階を含む、3-HPを生産するための方法:
請求項1記載の細胞からβ-アラニンを精製する段階;
マロン酸セミアルデヒドを形成させるため、β-アラニンを、4-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼおよび/またはβ-アラニン-2-オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ活性を含むポリペプチドと接触させる段階;ならびに
3-HPを生産するため、マロン酸セミアルデヒドを、3-HPデヒドロゲナーゼおよび/または3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を含むポリペプチドと接触させる段階。 - 以下の段階を含む、3-HPを生産するための方法:
請求項1記載の細胞に、CoAトランスフェラーゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸を、β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸を、ならびにCoAトランスフェラーゼ活性、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドロラーゼ、および/または3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸を、トランスフェクトする段階;ならびに
トランスフェクトされた細胞が3-HPを生産できるようにトランスフェクト細胞を培養する段階。 - 以下の段階を含む、3-HPを生産するための方法:
請求項1記載の細胞に、4-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼおよび/またはβ-アラニン-2-オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸を、ならびに3-HPデヒドロゲナーゼおよび/または3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸を、トランスフェクトする段階;ならびに
トランスフェクトされた細胞が3-HPを生産できるようにトランスフェクト細胞を培養する段階。 - 以下の段階を含む、3-HPから1,3-プロパンジオールを生産するための方法:
請求項97記載の方法を用いて3-HPを生産する段階;
3-HPを、アセチル化アルデヒド:NAD(+)オキシドリダクターゼ活性を含むポリペプチドおよびアルコール:NAD(+)オキシドリダクターゼ活性を含むポリペプチドと接触させる段階。 - 以下の段階を含む、1,3-プロパンジオールを生産するための方法:
請求項1記載の細胞に、CoAトランスフェラーゼまたはCoAシンテターゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸;β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸;3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドロラーゼおよび/または3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸;アセチル化アルデヒド:NAD(+)オキシドリダクターゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸;ならびにアルコール:NAD(+)オキシドリダクターゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸を、トランスフェクトする段階;ならびに
トランスフェクトされた細胞が1,3-プロパンジオールを生産できるようにトランスフェクト細胞を培養する段階。 - 以下の段階を含む、1,3-プロパンジオールを生産するための方法:
請求項1記載の細胞に、CoAトランスフェラーゼまたはCoAシンテターゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸; β-アラニル-CoAアンモニアリアーゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸;3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸;3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドロラーゼおよび/または3-ヒドロキシイソブチリル-CoAヒドロラーゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸;アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(NAD(P)+)活性を含むポリペプチドをコードする核酸;アルコール・デヒドロゲナーゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸を、トランスフェクトする段階、ならびに
トランスフェクトされた細胞が1,3-プロパンジオールを生産できるようにトランスフェクト細胞を培養する段階。 - 以下の段階を含む、パントテン酸を生産するための方法:
請求項1記載の細胞からβ-アラニンを精製する段階;および
パントテン酸を生産するため、β-アラニンを、α-ケトパントイン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、α-ケトパントイン酸リダクターゼ、およびパントテン酸シンターゼと接触させる段階。 - 以下の段階を含む、パントテン酸を生産するための方法:
請求項1記載の細胞に、α-ケトパントイン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸を、α-ケトパントイン酸リダクターゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸を、およびパントテン酸シンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする核酸を、トランスフェクトする段階;ならびに
トランスフェクトされた細胞がパントテン酸を生産できるようにトランスフェクト細胞を培養する段階。 - 植物細胞である、請求項1記載の細胞。
- 請求項104記載の細胞を含む植物。
- 請求項57記載の組換え核酸を含むトランスジェニック植物。
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