KR101625443B1 - 글루카르산의 세포적 제조 - Google Patents

글루카르산의 세포적 제조 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및 우로네이트 데히드로게나제의 재조합 발현을 통해 세포에서 글루쿠론산 및 글루카르산을 제조하는 것에 관한 것이다. 또한, 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 클로닝 및 특성분석이 개시되어 있다.

Description

글루카르산의 세포적 제조 {CELLULAR PRODUCTION OF GLUCARIC ACID}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에, 2008년 4월 4일자로 출원된 미국 가출원 제61/042,502호 (발명의 명칭: "글루카르산의 미생물적 제조(Microbial Production of Glucaric Acid)", 그 전체 내용은 본원에 포함됨)의 이익을 주장한다.
정부 이익
허가 번호 제N000140510656호 하에 미해군 연구청의 자금이 본 연구에 부분적으로 투자되었다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 재조합 유전자 발현을 통한 글루쿠론산 및 글루카르산의 제조에 관한 것이다.
발명의 배경
재조합 DNA 기술의 응용을 포함하는 대사적 조작은 여러 목적 (재조합 단백질 제조, 생산성 증진을 위한 경로 조작, 및 신규 생성물 생성을 위한 신규 경로 설계)을 위해 세포 기능을 최적화시킬 수 있는 가능성을 보였다. 숙주 종에서 발견되지 않은 일련의 전환들로 정의됨에 따라, 1,3-프로판디올 (문헌 [C. E. Nakamura and G. M. Whited (2003). Curr. Opin. Biotechnol. 14: 454-459]), 아모르파디엔 (amorphadiene) (문헌 [Nature Biotech, 21, pp796-802]) 및 1,2,4-부탄트리올 (문헌 [JACS, 125, pp12998-12999])의 생성을 위한 신규 경로가 이. 콜라이 (E. coli)에서 설계 및 구축되었다. 이러한 접근법에서는, 효소 이용률에 기초하여 각 단계를 설계하고, 각종 유기체로부터 동원된 효소 활성을 확인하고, 효소적 단계들을 조립하여 신규 경로를 구축하였다. 상기 예의 배후에 있는 기본 발상은 상호교체가능한 부품으로서의 효소들을 포함하는 단백질을 고안하는 것이며, 이러한 개념을 설명하기 위해 "합성 생물학"이란 용어가 사용되었다 (문헌 [Nature 421, p118; Nature Chemical Biology, 3, pp521-525]).
D-글루카르산은 과일, 채소 및 포유동물에서 발견되며, 콜레스테롤 감소 (문헌 [Z. Walaszek, et al. (1996). Nutr. Res. 16: 673-681]) 및 항암 화학요법 (문헌 [J. Singh and K. P. Gupta (2003). Biomed. Environ. Sci. 16: 9-16])을 위해 연구되었다. 최근 보고서 (문헌 [T. Werpy and G. Petersen (2004). "Top Value Added Chemicals From Biomass," Vol. I, PNNL and NREL])에서는, D-글루카르산이 "생물질로부터 얻어지는 최고 부가가치 화학물질"이자, 새로운 나일론 및 초분지형 폴리에스테르의 제조를 위한 유망 출발 물질로서 확인되었다. 4개의 키랄 탄소를 가지며 고도로 관능성화된 화합물인 D-글루카르산은 현재 D-글루코스의 화학적 산화, 즉 질산을 산화제로서 사용하는 비선택적 고비용 공정에 의해 제조된다 (문헌 [T. Werpy and G. Petersen (2004). "Top Value Added Chemicals From Biomass," Vol. I, PNNL and NREL]). 효소를 이용한 새로운 촉매적 방법은 높은 수율 및 선택성을 달성할 수 있다. 글루카르산의 제조를 위한 생물학적 접근법은 포유동물의 기존 D-글루쿠론산 경로를 모방함으로써 수행될 수 있다. 그러나, 이는 D-글루코스로 출발하여 10개가 넘는 전환 단계로 이루어진 비효율적인 경로이다.
발명의 요약
우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 제1 udh 유전자의 클로닝 및 특성분석이 본원에 기재되어 있다. 또한, 이. 콜라이 세포와 같은 세포에서 이질적인 유기체들로부터의 "생물학적 부품들"을 조합하여 D-글루쿠론산 또는 D-글루카르산의 생성을 위한 새로운 경로를 구축하는 것이 기재되어 있다. 제1 효소인 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 (Ino1/MIPS)는 글루코스로부터 중간체로서의 글루코스-6-포스페이트를 통해 미오-이노시톨을 생성한다 (문헌 [Dean-Johnson and Henry 1989]). 제2 효소인 미오-이노시톨 옥시게나제 (MIOX)는 미오-이노시톨을 글루쿠론산으로 전환시킨다. 이. 콜라이 세포와 같은 세포에서 이들 두 효소가 동시발현되면, 글루코스로부터 글루쿠론산이 생성될 수 있다. 우로네이트 데히드로게나제는 글루쿠론산을 글루카르산으로 전환시킬 수 있다 (문헌 [Bateman, Kosuge et al. 1970]; [Wagner and Hollman 1976]). 본원에 기재된 바와 같이, INO1 및 MIOX와 함께 제3의 유전자가 발현되면, 글루코스로부터 글루쿠론산의 생성이 가능하게 된다. 놀랍게도, 우로네이트 데히드로게나제의 재조합 발현시 경로의 플럭스가 유의하게 증가되어, 다량의 글루카르산이 얻어질 수 있었다.
본 발명은, 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 재조합적으로 발현하며, 미오-이노시톨 옥시게나제를 코딩하는 유전자를 재조합적으로 발현하는 세포를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 박테리아 유전자, 예컨대 슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syringae) 유전자 또는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유전자이다. 몇몇 실시양태에서, 미오-이노시톨 옥시게나제를 코딩하는 유전자는 포유동물 유전자, 예컨대 마우스 유전자이다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 또한, 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자를 재조합적으로 발현한다. 몇몇 실시양태에서, 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자는 진균 유전자 또는 효모 유전자, 예컨대 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 유전자일 수 있다.
상기 효소들을 재조합적으로 발현하는 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 미오-이노시톨 옥시게나제 및/또는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자들은 박테리아에서의 발현을 위한 코돈 최적화에 의해 변형되었다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 진균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포이다.
우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및/또는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자들은 플라스미드로부터 발현될 수 있거나, 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 글루카르산의 생성은 세포에서 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및/또는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 효소의 단백질 조작에 의해 증가되거나, 세포에서 글루카르산 대사 경로의 성분을 돌연변이시킴으로써 증가된다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하는 유전자 변형 미생물을 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명과 연관된 세포를 배양하여 글루쿠론산 또는 글루카르산을 생성하고, 세포로부터 글루쿠론산 또는 글루카르산을 회수하는 것을 포함하는, 글루쿠론산 및 글루카르산의 제조 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 글루쿠론산 또는 글루카르산의 제조 방법은, 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 중 하나 이상을 재조합적으로 발현하도록 세포를 유전자 변형시키고, 상기 세포의 집단을 배양하고, 글루카르산을 생성하도록 유전자 변형된 세포 집단으로부터 글루카르산을 수집하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 세포는 미오-이노시톨 옥시게나제를 재조합적으로 발현하며, 글루쿠론산을 생성한다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 미오-이노시톨 옥시게나제 및 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 재조합적으로 발현하며, 글루쿠론산을 생성한다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 미오-이노시톨 옥시게나제 및 우로네이트 데히드로게나제를 재조합적으로 발현하며, 글루카르산을 생성한다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 미오-이노시톨 옥시게나제, 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 및 우로네이트 데히드로게나제를 재조합적으로 발현하며, 글루카르산을 생성한다.
몇몇 실시양태에서, 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 재조합적으로 발현된 유전자는 박테리아 유전자, 예컨대 슈도모나스 시링가에 유전자 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자이다. 몇몇 실시양태에서, 미오-이노시톨 옥시게나제를 코딩하는 재조합적으로 발현된 유전자는 포유동물 유전자, 예컨대 마우스 유전자이다. 몇몇 실시양태에서, 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 재조합적으로 발현된 유전자는 진균 유전자 또는 효모 유전자, 예컨대 사카로마이세스 세레비시아에 유전자이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 기재된 효소를 재조합적으로 발현하는 세포는 원핵 세포이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포이다. 미오-이노시톨 옥시게나제 및/또는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자들은 박테리아에서의 발현을 위한 코돈 최적화에 의해 변형될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 기재된 효소를 재조합적으로 발현하는 세포는 진핵 세포이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 진균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포이다. 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및/또는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자들은 플라스미드 상에서 발현되거나, 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 글루카르산의 생성은 세포에서 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및/또는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 효소의 단백질 조작에 의해, 또는 세포에서 글루카르산 대사 경로의 성분의 돌연변이에 의해 증가될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 세포 및 방법에 의해 생성되는 글루카르산을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 글루카르산은 세포 배양물 내의 세포가 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 중 하나 이상을 재조합적으로 발현하도록 유전자 변형된 세포 배양물에 의해 생성된다. 몇몇 실시양태에서, 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 박테리아 유전자, 예컨대 슈도모나스 시링가에 유전자 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자이다. 몇몇 실시양태에서, 미오-이노시톨 옥시게나제를 코딩하는 유전자는 포유동물 유전자, 예컨대 마우스 유전자이다. 몇몇 실시양태에서, 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자는 진균 유전자 또는 효모 유전자, 예컨대 사카로마이세스 세레비시아에 유전자이다.
몇몇 실시양태에서, 글루카르산은 원핵 세포로부터 생성된다. 몇몇 실시양태에서, 원핵 세포는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 미오-이노시톨 옥시게나제 및/또는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자들은 박테리아에서의 발현을 위한 코돈 최적화에 의해 변형된다. 글루카르산은 또한 진핵 세포에 의해 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 진균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포이다.
글루카르산의 생성을 위해, 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및/또는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자들은 플라스미드 상에서 발현되거나, 또는 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 글루카르산의 생성은 세포에서 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및/또는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 효소의 단백질 조작에 의해, 또는 세포에서 글루카르산 대사 경로의 성분의 돌연변이에 의해 증가된다.
본 발명은 또한 (a) 서열 1, 서열 23, 또는 서열 25를 포함하는 단리된 핵산 분자; (b) 서열 2, 서열 24 또는 서열 26의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자; (c) (a) 또는 (b)의 전장 서열의 역상보체인 단리된 핵산 분자; 및 (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 대해 95％ 이상의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 단리된 핵산 분자를 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 또한, 전사 조절 요소에 작동가능하게(operably) 결합된 상기 논의된 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한, 본원에 기재된 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 단리된 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드는 서열 2, 서열 24 또는 서열 26에 대해 95％ 이상의 아미노산 동일성을 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 재조합 발현 벡터를 함유하는 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포이다. 우로네이트 데히드로게나제 유전자를 재조합적으로 발현하는 세포를 사용하여, 폴리펩티드의 발현이 가능한 조건 하에 상기 세포를 배양하고, 배양 배지 또는 세포로부터 폴리펩티드를 회수함으로써, 우로네이트 데히드로게나제 단백질을 생성할 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 단리된 항체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 서열 2에 대해 95％ 이상의 아미노산 동일성을 포함하는 폴리펩티드에 선택적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 서열 1에 대해 95％ 이상의 아미노산 동일성을 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 결합한다. 상기 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이들의 항원-결합성 단편일 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 이. 콜라이에서 글루카르산의 생성을 위해 설계된 경로를 도시하는 개략도이다. PTS = 포스포에놀피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템; Ino1 (MIPS) = 사카로마이세스 세레비시아에로부터의 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제; 포스파타제 = SuhB, 내인적 이. 콜라이 효소 (문헌 [Matsuhisa et al. J. Bacteriol. (1995) 177:200-205]); MIOX = 코돈 최적화에 의한 미오-이노시톨 옥시게나제의 마우스 버전; Udh = 슈도모나스 시링가에로부터의 우로네이트 데히드로게나제; PEP = 포스포에놀피루베이트.
도 2는 BL21(DE3)(pRSFD-IN-MI)에서 글루쿠론산의 생성을 도시하는 그래프이다. 배양물을 10 g/L 글루코스 및 0.1 mM IPTG로 보충된 LB 배지에서 30℃에서 3벌식으로 성장시켰다. 데이타 점은 3개의 생물학적 복제물의 평균 및 표준 편차이다. △ = 글루쿠론산 (좌축); □ = 미오-이노시톨 (좌축); ◇ = 글루코스 (우축). 글루코스 농도는 g/L로 나타낸다.
도 3은 세 유전자를 보유한 BL21(DE3)에서 발현된 재조합 Ino1, MIOX, 및 Udh의 시험관내 활성을 도시하는 그래프이다. 배양물을 10 g/L 글루코스로 보충된 LB 배지에서 30℃에서 성장시키고, 0.05 mM IPTG와 함께 인큐베이션하였다. MIOX 활성은 배경을 감안하여 순수 활성으로서 제시되었다. 데이타는 3개의 생물학적 복제물의 평균 및 표준 편차이다. △ = Ino1; □ = MIOX; ◇ = Udh.
도 4는 마우스 MIOX 유전자, 및 이. 콜라이에서의 발현을 위한 코돈 최적화에 의한 그의 합성 버전의 DNA 서열 정렬이다. DNA 서열 정렬은 벡터 NTI(Vector NTI) 소프트웨어 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 이용하여 수행하였다.
도 5는 박테리아에서 글루쿠론산 및 글루카르산의 이화작용을 나타내는 계략도이다. 글루쿠론산 소비는 uxaC 유전자의 녹-아웃에 의해 방해된다. uxaC 녹-아웃에서 우로네이트 데히드로게나제의 존재는 글루쿠론산에 대한 이. 콜라이의 성장을 가능하게 한다.
도 6은 피. 시링가에로부터의 추정 Udh의 효소적 검정을 도시하는 그래프이다. PSPTO_1053 ORF의 발현된 단백질을 함유하는 이. 콜라이 용해물은 보조인자로서 NAD+를 사용하여 글루쿠론산을 산화시킬 수 있다.
도 7은 이. 콜라이의 조질의 용해물에서 다양한 공급원으로부터 발현된 udh 유전자의 활성을 도시하는 그래프이다. pTATudh2 = 아그로박테리움 투메파시엔스, pTPPudh = 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), pTPSudh = 슈도모나스 시링가에. 빈 막대 = IPTG 무함유, 채워진 막대 = 0.1 mM IPTG 함유.
도 8은 글루카레이트의 LC-MS 크로마토그램을 도시한다. 도 8a는 효소적 반응 혼합물로부터 분리된 글루카레이트를 나타낸다. 도 8b는 글루카레이트 표준을 나타낸다. 글루카레이트는 그의 질량으로 특성화되고 (m/z = 209, 210, 419, 420 및 441), 용리액의 피크는 또한 글루카레이트 표준의 질량에 상응한다.
도 9는 정제된 Udh의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 정제된 Udh를 변성 조건 하에 12％ 나트륨 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 중에서 전기영동에 적용하였다. 레인 1, 분자량 마커; 레인 2 및 3, pETATu를 발현하는 이. 콜라이 BL21(DE3)의 조질의 추출물 및 정제된 에이. 투메파시엔스 Udh; 레인 4 및 5, pETPPu를 발현하는 이. 콜라이 BL21(DE3)의 조질의 추출물 및 정제된 피. 푸티다 Udh; 레인 6 및 7, pETPSu를 발현하는 이. 콜라이 BL21(DE3)의 조질의 추출물 및 정제된 피. 시링가에 Udh. 정제된 Udh는 화살표 기호로 표시하였다.
도 10은 에이. 투메파시엔스, 피. 푸티다, 및 피. 시링가에 udh로부터의 Udh의 활성에 대한 pH 및 온도의 효과를 도시하는 그래프이다. 도 10a는 pH의 함수로서 상대 활성을 도시한다. 도 10b는 지정된 온도에서 30분 동안 인큐베이션한 후의 상대 활성을 도시한다. 도 10c는 검정 온도의 함수로서 상대 활성을 도시한다. 실선과 사각형: 에이. 투메파시엔스 Udh. 대시선과 원: 피. 푸티다 Udh. 점선과 삼각형: 피. 시링가에 Udh.
도 11은 염색체 상에서 udh 유전자의 좌위를 도시하는 개략도 및 인접 유전자를 도시하는 표를 나타낸다. 도 11a: 피. 시링가에 pv. 토마토 균주 DC3000; 도 11b: 피. 푸티다 KT2440; 및 도 11c: 에이. 투메파시엔스 균주 C58. 도 11d는 인접 유전자의 신원을 도시하는 표이다. 이들 좌위 및 신원은 NC_004578 (피. 시링가에 pv. 토마토 균주 DC3000), NC_002947 (피. 푸티다 KT2440) 및 NC_003063 (에이. 투메파시엔스 균주 C58)의 게놈 서열을 나타낸다.
도 12는 서열 정렬 및 계통발생학적 분석을 나타낸다. 도 12a는 피. 시링가에 pv. 토마토 균주 DC3000, 피. 푸티다 KT2440, 및 에이. 투메파시엔스 균주 C58로부터의 우로네이트 데히드로게나제의 정렬을 도시한다. 정렬을 위해, 동일한, 보존적인, 및 유사한 아미노산 서열을 각각 흑색, 짙은 회색, 및 밝은 회색 블록으로 나타낸다. 1차 서열 모티프는 GxxGxxG 및 YxxxK로 표시한다. 도 12b는 다양한 원핵생물 및 진핵생물 종으로부터의 우로네이트 데히드로게나제 동족체의 계통발생학적 분석을 도시한다. 계통발생학적 분석은 피. 시링가에 pv. 토마토 균주 DC3000의 PSPTO_1053의 동족체를 이용하여 수행하였다. 우로네이트 데히드로게나제는 진하게 표시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 측면은 세포에서 재조합 유전자 발현을 통해 글루쿠론산 및 글루카르산을 생성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 글루쿠론산을 글루카르산으로 전환시키는 효소인 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 클로닝이 본원에 기재되어 있다. 우로네이트 데히드로게나제를 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 및 미오-이노시톨 옥시게나제와 함께 재조합적으로 발현하여 글루코스로부터 글루쿠론산 및 글루카르산을 생성하도록 설계 및 시행된 신규 경로가 기재된다. 이 신규 경로는 나일론 및 폴리에스테르의 생성에서부터 항암 요법에 이르는 범위에 널리 적용되는 분자인 글루카르산을 생성하기 위한, 예상치못하게 유효한 새로운 시스템을 나타낸다.
세포에서 글루쿠론산 및 글루카르산의 생성을 위해 본원에 기재된 신규 경로는 몇몇 효소적 성분과 관련이 있다. 제1 효소, 사카로마이세스 세레비시아에의 INO1 유전자에 의해 코딩되는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 (Ino1/MIPS)는 글루코스로부터 중간체로서 글루코스-6-포스페이트를 통해 미오-이노시톨을 생성한다 (딘-존슨(Dean-Johnson) 및 헨리(Henry)의 1989년도 문헌). 사카로마이세스 세레비시아에 서열은 예를 들어 젠뱅크 (GenBank) 수탁 번호 NC_001142 (GeneID: 853288)를 갖는다. 효모에서, 미오-이노시톨은 막 인지질의 구성성분이며, 그의 유도체는 세포 신호전달에 중요하다. MIPS 기질, 글루코스-6-포스페이트는 PTS 시스템에 의한 글루코스 수송의 결과로서 이. 콜라이에 존재한다 (포스트마(Postma), 렌겔러(Lengeler) 등의 1993년도 문헌). 제2 효소, 미오-이노시톨 옥시게나제 (MIOX)는 미오-이노시톨을 글루쿠론산으로 전환시킨다. 이 효소는 포유동물 공급원에 주로 존재하며, 미오-이노시톨 이화작용의 제1 단계를 나타낸다 (챠랄람푸스(Charalampous) 및 라이라스(Lyras)의 1957년도 문헌). 마우스 서열은 예를 들어 젠뱅크 수탁 번호 NC_000081 (GeneID: 56727)을 갖는다. 세포, 예컨대 이. 콜라이에서 이들 두 효소의 동시발현은 글루코스로부터 글루쿠론산의 생성을 가능하게 한다.
글루카르산의 생성을 위한 신규 경로에서 제3 단계는 글루쿠론산에서 글루카르산으로의 전환이며, 이 단계는 우로네이트 데히드로게나제에 의해 수행될 수 있다 (베이트맨(Bateman), 코수지(Kosuge) 등의 1970년도 문헌; 와그너(Wagner) 및 홀맨(Hollman)의 1976년도 문헌). 실시예 2에 기재된 바와 같이, 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 클로닝하고 특징분석하여 이 경로를 구축하였다. 실시예 2에 제시된 바와 같이, 우로네이트 데히드로게나제를 슈도모나스 시링가에 pv. 토마토 DC300, 슈도모나스 푸티다 KT2440 및 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 C58로부터 클로닝하였다. 피. 시링가에로부터의 udh 유전자 서열은 젠뱅크, 수탁 번호 EU377538로 수탁되어 있다. 슈도모나스 시링가에 pv. 토마토 DC300A udh의 DNA 및 단백질 서열은 각각 서열 1 및 2로 제공된다. 에이. 투메파시엔스 및 피. 푸티다로부터의 상응하는 유전자는 각각 수탁 번호 BK006462 (DNA: 서열 23; 단백질: 서열 24) 및 BK006380 (DNA: 서열 25; 단백질: 서열 26)로 수탁되어 있다. 우로네이트 데히드로게나제의 클로닝은 당업계에 공지된 상동성 조사의 표준 방법, 예컨대 BLAST 조사를 이용하여 다양한 종에서 우로네이트 데히드로게나제 단백질의 식별을 가능하게 한다.
본원에 기재된 바와 같이, 세포에서 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 및 미오-이노시톨 옥시게나제의 공동 발현은 글루코스로부터 글루쿠론산의 생성을 유도한다. 이들 효소를 발현하는 세포가 우로네이트 데히드로게나제를 추가로 발현하는 경우, 이는 1) 글루코스로부터 미오-이노시톨의 생성, 2) 미오-이노시톨에서 글루쿠론산으로의 전환, 및 3) 글루쿠론산에서 글루카르산으로의 전환으로 이루어진 세 단계 경로를 통해 글루코스로부터 글루카르산의 예상치못하게 유효한 수준의 생성을 유도한다. 상기 기재된 제1 단계를 우회하여 단계 2 및 3으로 이루어진 두 단계 경로도 본 발명에 포함된다. 이 특별한 실시양태에서, 글루코스를 생성할 수 있는 세포를 사용하면 세포의 성장 배지에 글루코스를 공급할 필요가 없게 될 것이다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 세포는 글루코스 중합체, 예컨대 옥수수 전분에 의해 제공된다.
본 발명의 측면은 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및 우로네이트 데히드로게나제 중 하나 이상을 재조합적으로 발현하는 세포에 관한 것이다. 본 발명은 원핵 및 진핵 세포를 비롯한 임의 유형의 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포이다. 다른 실시양태에서, 상기 세포는 진균 세포 또는 효모 세포, 예컨대 에스. 세레비시아에 세포이다. 다른 실시양태에서, 상기 세포는 포유동물 세포, 예컨대 마우스 세포이다. 일부 세포는 본 발명과 연관된 효소 중 하나 이상을 내인적으로 발현할 수 있음을 이해해야 한다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 상기 효소를 내인적으로는 전혀 발현하지 않고, 상기 효소 중 1, 2 또는 3개를 재조합적으로 발현할 것이다. 다른 실시양태에서, 세포는 상기 효소 중 하나를 내인적으로 발현하고, 다른 1 또는 2개의 효소를 재조합적으로 발현할 것이다. 다른 효소에서, 세포는 상기 효소 중 2개를 내인적으로 발현하고, 다른 1 또는 2개의 효소를 재조합적으로 발현할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 유전자를 내인적으로 발현하고, 또한 동일한 하나 이상의 유전자를 재조합적으로 발현할 것이다.
몇몇 실시양태에서, 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 재조합 발현 벡터에서 발현된다. 본원에 사용된 "벡터"는, 목적하는 서열 또는 서열들이 상이한 유전적 환경 사이에서의 수송을 위해 또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 제한 및 라이게이션에 의해 삽입될 수 있는 임의의 수많은 핵산일 수 있다. 벡터는 전형적으로 DNA로 이루어지지만, RNA 벡터 또한 이용가능하다. 벡터로는 플라스미드, 포스미드, 파지미드, 바이러스 게놈 및 인공 염색체가 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
클로닝 벡터는 숙주 세포의 게놈에서 자율적으로 복제되거나 그에 통합될 수 있는 것이며, 이는 추가로 상기 벡터가 확인가능한 방식으로 절단될 수 있고 새로운 재조합 벡터가 숙주 세포에서 복제하는 능력을 보유하도록 목적하는 DNA 서열이 라이게이션될 수 있는 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 특징으로 한다. 플라스미드의 경우, 목적하는 서열의 복제는, 플라스미드의 카피수가 숙주 박테리아 내에서 증가함에 따라 여러회 일어날 수 있거나, 또는 숙주가 생식하기 전에 유사분열에 의해 숙주 당 1회만 일어날 수 있다. 파지의 경우, 복제는 용해기 동안에 능동적으로 또는 용원기 동안에 수동적으로 일어날 수 있다.
발현 벡터는, 목적하는 DNA 서열이 조절 서열에 작동가능하게 결합되어 RNA 전사물로서 발현될 수 있도록 제한 및 라이게이션에 의해 삽입될 수 있는 것이다. 벡터는 추가로 벡터로 형질전환 또는 형질감염되었거나 되지 않은 세포의 식별에 사용하기 적합한 하나 이상의 마커 서열을 함유할 수 있다. 마커로는 예를 들어 항생제 또는 다른 화합물에 대한 내성 또는 감수성을 증가 또는 감소시키는 단백질을 코딩하는 유전자, 당업계에 공지된 표준 검정에 의해 검출가능한 활성을 가진 효소 (예를 들어, β-갈락토시다제, 루시퍼라제 또는 알칼린 포스파타제)를 코딩하는 유전자, 및 형질전환 또는 형질감염된 세포, 숙주, 콜로니 또는 플라크의 표현형에 가시적으로 영향을 미치는 유전자 (예를 들어, 녹색 형광 단백질)가 있다. 바람직한 벡터는 그들이 작동가능하게 결합된 DNA 세그먼트에 존재하는 구조적 유전자 생성물의 자율적인 복제 및 발현이 가능한 것이다.
본원에 사용된 코딩 서열 및 조절 서열은, 이들이 조절 서열의 영향 또는 조절 하에 코딩 서열의 발현 또는 전사가 일어나도록 하는 방식으로 공유 결합된 경우 "작동가능하게" 결합된 것이라고 한다. 코딩 서열이 기능적 단백질로 번역되는 것이 바람직한 경우, 5' 조절 서열에서 프로모터의 유도에 의해 코딩 서열이 전사된다면, 그리고 두 DNA 서열 사이의 결합 특성이 (1) 프레임-이동 돌연변이를 유발하지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 단백질로 번역되는 상응하는 RNA 전사물의 능력을 방해하지 않는다면, 두 DNA 서열이 작동가능하게 결합된 것이라고 한다. 따라서, 생성된 전사물이 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 프로모터 영역이 해당 DNA 서열의 전사를 달성할 수 있다면, 상기 프로모터 영역은 코딩 서열에 작동가능하게 결합된 것이다.
본 발명의 임의의 효소를 코딩하는 핵산 분자가 세포에서 발현되는 경우, 다양한 전사 조절 서열 (예를 들어, 프로모터/인헨서 서열)을 사용하여 그의 발현을 지시할 수 있다. 프로모터는 미감작(native) 프로모터, 즉 그의 내인적 환경에서의 유전자의 프로모터일 수 있고, 이는 유전자 발현의 정상적 조절을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 프로모터는 구성적일 수 있다 (즉, 프로모터가, 그의 연관 유전자가 지속적으로 전사되도록 탈조절됨). 다양한 조건부 프로모터, 예컨대 분자의 존재 또는 부재에 의해 제어되는 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
유전자 발현에 필요한 조절 서열의 정확한 특성은 종 또는 세포 유형 간에 달라질 수 있으나, 필요에 따라 각각 전사 및 번역의 개시에 관여하는 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 일반적으로 포함한다. 특히, 상기 5' 비-전사 조절 서열은 작동가능하게 연결된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성화 서열을 의도하는 대로 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 임의로 5' 리더 서열 또는 신호 서열을 포함할 수 있다. 적절한 벡터의 선택 및 설계는 당업자의 능력 및 재량 내에 있다.
발현을 위해 필요한 모든 요소를 포함하는 발현 벡터는 상업적으로 입수가능하고, 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]를 참조한다. 세포는 이종 DNA (RNA)의 세포로 도입함으로써 유전적으로 조작된다. 상기 이종 DNA (RNA)는 숙주 세포 내 이종 DNA의 발현을 가능하게 하는 전사 요소의 작동가능한 제어하에 있다. 글루카르산의 생성을 위한 신규 경로의 이종 발현은 이. 콜라이를 사용하는 실시예 부분에서 입증된다. 신규 글루카르산 생성 경로는 또한 다른 박테리아 세포, 원시 세포, 진균, 포유동물 세포, 식물 세포 등에서 발현될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 2종 이상의 본 발명의 핵산은 동일한 발현 벡터 또는 플라스미드에 클로닝될 수 있다. 실시예 부분에서 논의된 바와 같이, 몇몇 실시양태에서, INO1 유전자 및 MIOX 유전자는 동일한 플라스미드, 예컨대 pRSFD 플라스미드에 클로닝된다.
핵산 분자, 또는 글루카르산을 생성하기 위한 임의의 효소를 코딩하는 핵산 분자는 당업계의 표준 기술 및 방법을 이용하여 세포 또는 세포들에 도입될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 표준 프로토콜, 예를 들어 형질전환, 예컨대 화학적 형질전환 및 전기천공법, 형질도입, 입자 충격법 등에 의해 도입될 수 있다. 글루카르산을 생성하기 위한 효소를 코딩하는 핵산 분자(들)을 발현하는 것은 또한 핵산 분자를 게놈으로 통합함으로써 달성될 수 있다. 핵산 분자(들)은 당업계에 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 세포의 게놈 DNA로 통합될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명과 연관된 효소는 박테리아 세포에서 재조합적으로 발현된다. 본 발명에 따른 박테리아 세포는 임의 유형 (풍부 또는 최소)의 배지 및 조성물 중에서 배양될 수 있다. 실시예 1은, 글루코스가 보충되고 IPTG로 유도된 풍부 배지 (LB 배지, BD 바이오사이언시즈 (BD Biosciences); 캘리포니아주, 산호세)가 최적으로 확인되는 실시양태를 나타낸다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 통상적 최적화는 최소 배지, 예컨대 M9 최소 배지를 비롯한 다른 유형의 배지의 사용을 가능하게 한다. 선택된 배지는 다양한 추가 성분으로 보충될 수 있다. 이와 유사하게, 배지 및 성장 조건의 다른 측면을 통상적 질험을 통해 최적화할 수 있다. 예를 들어, pH 및 온도는 최적화될 수 있는 인자의 비제한적 예이다. 본 발명의 측면에 따라, 세포 성장에 사용되는 액체 배양물은 당업계에서 사용되고 공지되어 있는 임의의 배양 용기에 수용할 수 있다.
본 발명의 측면에는 세포로부터의 글루카르산 생성을 최적화하는 전략이 포함된다. 글루카르산의 최적화된 생성은, 최적화 전략의 수행에 따라 이러한 전략의 부재하에 얻는 것보다 더 많은 양의 글루카르산을 생성하는 것을 지칭한다. 한 전략은 적절한 프로모터 및 리보솜 결합 부위의 선택을 통해 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및/또는 우로네이트 데히드로게나제의 발현 수준을 최적화하는 것이다. 몇몇 실시양태에서, 이는 고-카피수 플라스미드, 또는 저- 또는 중-카피수 플라스미드의 선택 및 사용을 포함한다. 또한, 전사의 종료 단계는 구조, 예컨대 스템-루프(stem-loop)의 도입 또는 제거를 통해 유전자 발현의 조절을 위해 표적화될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 글루카르산의 생성에 대해 앞서 최적화된 세포를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 글루카르산의 생성 이전에 세포내 글루카르산 대사 경로의 하나 이상의 성분을 돌연변이시켜, 세포가 생성되는 생성물을 소모하지 않도록 하는 것이 최적일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 글루카르산의 향상된 생성을 유도하는 돌연변이에 대한 스크리닝이 무작위 돌연변이유발 스크리닝 또는 공지되어 있는 돌연변이의 스크리닝을 통해 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 게놈 단편의 산탄 클로닝을, 증가된 글루카르산 생성을 위한 이들 단편을 갖는 세포 또는 유기체의 스크리닝을 통해 글루카르산 생성의 증가를 유도하는 게놈 영역을 동정하기 위해 이용할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 돌연변이가 동일한 세포 또는 유기체에서 조합될 수 있다.
또한, 단백질 발현의 최적화가 몇몇 실시양태에서 필요할 수 있는데, 예를 들어 박테리아 세포에서의 발현에 대한 코돈 최적화를 통해서 세포에 도입되기 전에 본 발명과 연관된 효소에 대한 유전자 코딩을 변경한다. 다양한 유기체에 대한 코돈 사용은 코돈 사용 데이터베이스 (Codon Usage Database) 인터넷 사이트에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 이. 콜라이에서의 발현에 대한 코돈 최적화와 함께 합성된 마우스 MIOX 유전자를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 단백질 조작을 이용하여 하나 이상의 본 발명과 연관된 효소의 발현 또는 활성을 최적화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질 조작 접근법은 관련 단백질의 구조에 기초하여 효소에 대한 3D 상동성 모델을 구축하거나, 또는 효소의 3차원 (3D) 구조를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 3D 모델에 기초하여, 효소에서의 돌연변이를 구축하고 세포 또는 유기체로 도입시킬 수 있으며, 후속으로 글루카르산의 증가된 생성에 대해 스크리닝할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포에서의 글루카르산 생성은, 본 발명과 연관된 효소로서 동일한 경로에서 작용하는 효소의 조작을 통해 증가될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 본 발명과 연관된 효소 중 하나의 상류에서 작용하는 효소 또는 다른 인자의 발현을 증가시키는 것이 유리할 수 있다. 이는 임의의 표준 방법을 이용하여 상류 인자를 과다-발현시킴으로써 달성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 한 측면에서 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드, 이들 폴리펩티드의 유전자 코딩, 그의 기능적 변형 및 변이체, 뿐만 아니라 그와 관련된 용도를 포함한다. 본 발명의 우로네이트 데히드로게나제 핵산의 동족체 및 대립유전자는 통상적인 기술에 의해 동정할 수 있다. 또한, 엄격한 조건하에 본원에 기재된 우로네이트 데히드로게나제 핵산으로 혼성화된 핵산이 본 발명에 포함된다. 본원에 사용된 용어 "엄격한 조건"은 당업자에게 친숙한 파라미터를 지칭한다. 핵산 혼성화 파라미터는 이러한 방법이 기록된 참고문헌, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley ＆ Sons, Inc., New York]에서 찾아볼 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 사용된 엄격한 조건은, 예를 들어 65℃의 혼성화 완충액 (3.5 x SSC, 0.02％ 피콜 (Ficoll), 0.02％ 폴리비닐 피롤리돈, 0.02％ 소 혈청 알부민, 2.5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5％ SDS, 2 mM EDTA) 중에서의 혼성화를 지칭한다. SSC는 0.15 M 나트륨 클로라이드/0.015 M 나트륨 시트레이트 (pH 7)이고; SDS는 나트륨 도데실 술페이트이고; EDTA는 에틸렌디아민테트라아세트산이다. 혼성화 후, DNA가 옮겨진 막을, 예를 들어 실온에서 2 x SSC로, 이어서 68℃ 이하의 온도에서 0.1 - 0.5 x SSC/0.1 x SDS로 세척한다.
사용될 수 있는 (유사한 정도의 엄격성을 나타내는) 다른 조건, 시약 등이 존재한다. 숙련된 기술자는 이러한 조건에 친숙할 것이므로, 이는 본원에 기재하지 않는다. 그러나, 숙련된 기술자라면 본 발명의 우로네이트 데히드로게나제 핵산의 동족체 및 대립유전자의 명확한 식별을 가능하게 하는 방식의 조건을 조작할 수 있을 것임을 (예를 들어, 엄격성이 낮은 조건 이용) 이해할 것이다. 또한, 숙련된 기술자는 이러한 분자의 발현을 위한 세포 및 라이브러리 스크리닝, 후속의 통상적 단리, 후속의 적절한 핵산 분자의 단리 및 서열분석 방법에 친숙하다.
일반적으로, 동족체 및 대립유전자는 전형적으로 각각 우로네이트 데히드로게나제 핵산 및 폴리펩티드의 서열에 대해 75％ 이상의 뉴클레오티드 동일성 및/또는 90％ 이상의 아미노산 동일성을 공유할 것이며, 일부 경우에는 90％ 이상의 뉴클레오티드 동일성 및/또는 95％ 이상의 아미노산 동일성을 공유할 것이고, 또다른 경우에는 95％ 이상의 뉴클레오티드 동일성 및/또는 99％ 이상의 아미노산 동일성을 공유할 것이다. 상동성은 NCBI (매릴랜드주, 베데스다)에 의해 개발된 공식적으로 입수가능한 다양한 소프트웨어 툴 (NCBI 인터넷 사이트를 통해 얻을 수 있음)을 이용하여 계산할 수 있다. 예시적인 툴에는, 역시 NCBI 인터넷 사이트 (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 입수가능한 BLAST 소프트웨어가 포함된다. 맥벡터 (MacVector) 서열 분석 소프트웨어 (옥스포드 몰레큘러 그룹 (Oxford Molecular Group))를 이용하여 패어와이즈 (Pairwise) 및 클러스탈더블유 (ClustalW) 정렬 (블로섬30 (BLOSUM30) 매트릭스 세팅) 및 카이트-둘리틀 (Kyte-Doolittle) 수치료 분석을 달성할 수 있다. 또한, 상기 핵산의 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 보체가 본 발명에 포함된다.
우로네이트 데히드로게나제 유전자에 대한 스크리닝에서, 당업자에게 공지된 기술, 예컨대 셔던 블롯, 노던 블롯 및 증폭 프로토콜, 예컨대 나타낸 서열로 혼성화되는 프라이머를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응을 적용할 수 있다.
본 발명은 또한, 축퇴성 핵산 (미감작 물질에 존재하는 이들에 대한 대안적 코돈 포함)을 포함한다. 예를 들어, 세린 잔기는 코돈 TCA, AGT, TCC, TCG, TCT 및 AGC에 의해 코딩된다. 각각의 6개 코돈은 세린 잔기 코딩의 목적에 있어서 동등하다. 따라서, 시험관내 또는 생체내에서 임의의 세린-코딩 뉴클레오티드 삼중항을 사용하여 단백질 합성 장치를 지시함으로써, 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 연장에 세린 잔기를 도입시킬 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 유사하게, 다른 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 삼중항에는 CCA, CCC, CCG 및 CCT (프롤린 코돈); CGA, CGC, CGG, CGT, AGA 및 AGG (아르기닌 코돈); ACA, ACC, ACG 및 ACT (트레오닌 코돈); AAC 및 AAT (아스파라긴 코돈); 및 ATA, ATC 및 ATT (이소류신 코돈)가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 아미노산 잔기를 다중 뉴클레오티드 서열에 의해 유사하게 코딩할 수 있다. 따라서, 본 발명은 유전 부호의 축퇴로 인해 코돈 서열에서 생물학적으로 단리된 핵산과 구분되는 축퇴성 핵산을 포함한다. 본 발명은 또한 숙주 세포의 최적의 코돈 사용을 적합하게 하는 코돈 최적화를 포함한다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 치환 및 결실을 포함하는 변형된 핵산 분자를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 이들 변형된 핵산 분자 및/또는 그들이 코딩하는 폴리펩티드는 변형되지 않은 핵산 분자 및/또는 폴리펩티드의 하나 이상의 활성 또는 기능 (예컨대, 우로네이트 데히드로게나제 효소적 활성)을 유지한다. 특정 실시양태에서, 변형된 핵산 분자는 변형된 폴리펩티드, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 보존적 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 변형된 핵산 분자는 변형되지 않은 핵산 분자와 구조적으로 관련되며, 바람직한 실시양태에서는 변형되지 않은 핵산 분자와 구조적으로 충분히 관련되어 당업자에게 공지된 엄격한 조건하에 변형된 핵산 분자와 변형되지 않은 핵산 분자가 혼성화된다.
예를 들어, 단일 아미노산 변화를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 핵산 분자를 제조할 수 있다. 각각의 이들 핵산 분자는 본원에 기재된 바와 같은 유전 부호의 축퇴에 상응하는 뉴클레오티드 변화를 제외한 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다. 마찬가지로, 2개의 아미노산 변화를 갖는 (예를 들어, 2 내지 6개의 뉴클레오티드 변화를 갖는) 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 핵산 분자를 제조할 수 있다. 이들과 같이 다수로 변형된 핵산 분자는 당업자에 의해 쉽게 파악될 것이다 (예를 들어, 아미노산 2 및 3, 2 및 4, 2 및 5, 2 및 6 등을 코딩하는 코돈에서의 뉴클레오티드의 치환 포함). 상기 예에서, 2개의 아미노산의 각 조합은, 아미노산 치환에 대해 코딩하는 뉴클레오티드 치환 뿐만 아니라 변형된 핵산 분자의 세트 내에 포함된다. 또한, 당업자에게 쉽게 파악되는 바와 같이 (예를 들어, 정지 코돈 또는 스플라이스 부위(들)의 도입에 의해) 추가의 치환 (즉, 3개 이상), 부가 또는 결실을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 추가의 핵산 분자를 제조할 수 있으며, 이는 본 발명에 포함된다. 임의의 상기 핵산 또는 폴리펩티드는 본원에 개시된 핵산 및/또는 폴리펩티드에 대한 활성 또는 구조 관계의 보유에 대해 통상적 실험에 의해 시험될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 우로네이트 데히드로게나제 핵산에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드는, 예를 들어 생체내 또는 시험관내에서 글루쿠론산을 글루카르산으로 전환시키기 위해 단독으로 또는 융합 단백질로서 유용하다. 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드는 조직 또는 세포 균질액을 비롯한 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있고, 또한 발현 시스템에 적절한 발현 벡터의 구축, 발현 시스템으로의 발현 벡터의 도입 및 재조합적으로 발현된 단백질의 단리에 의해 다양한 원핵 및 진핵 발현 시스템에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 잘 확립되어 있는 펩티드 합성 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
본 발명은 상기 기재된 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 본원에 사용된 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 "변이체"는 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 1급 아미노산 서열에 하나 이상의 변형을 함유하는 폴리펩티드이다. 우로네이트 데히드로게나제 변이체를 만들어내는 변형은 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드에 대해 행해져서 1) 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하거나; 2) 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 특성, 예컨대 글루쿠론산에서 글루카르산으로의 전환 능력, 발현 시스템에서의 단백질 안정성 또는 단백질-단백질 결합의 안정성을 강화시키거나; 3) 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드에 신규 활성 또는 특성을 제공하거나 (예컨대, 항원 에피토프의 첨가 또는 검출가능한 잔기의 첨가); 또는 4) 우로네이트 데히드로게나제 분자와 또다른 분자 (예를 들어, 효소적 기질) 사이에 동등하거나 더 나은 결합을 제공하도록 할 수 있다. 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드에 대한 변형은 전형적으로 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 대해 행해지고, 결실, 점 돌연변이, 절단, 아미노산 치환 및 아미노산 또는 비-아미노산 잔기의 부가를 포함할 수 있다. 별법으로, 변형은, 예컨대 절단, 링커 분자의 첨가, 검출가능한 잔기, 예컨대 바이오틴의 첨가, 지방산의 첨가 등에 의해 폴리펩티드에 대해 직접적으로 행해질 수 있다. 또한, 변형은 모든 또는 일부의 우로네이트 데히드로게나제 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질도 포함한다. 당업자는 단백질 서열에 있어서 단백질 구조의 변화에 대한 효과를 예측하는 방법에 친숙할 것이며, 따라서 공지된 방법에 따라 변이체 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드를 "설계"할 수 있다. 단백질을 새롭게 설계할 수 있는 이러한 방법의 한 예는 문헌 [Dahiyat and Mayo in Science 278:82-87, 1997]에 기재되어 있다. 상기 방법을 공지된 단백질에 적용하여 폴리펩티드 서열의 단 한 부분만을 변경할 수 있다. 문헌 [Dahiyat and Mayo]의 계산적 방법을 적용하여, 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 특정 변이체를 제시하고 시험하여 변이체가 목적하는 구조를 보유하는지를 측정할 수 있다.
일반적으로, 변이체는, 특이적으로 변형하여 폴리펩티드의 목적하는 생리학적 활성과 관련없는 그의 특성을 변경한 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 치환하거나 제거하여 원치않는 디술파이드 결합을 방지할 수 있다. 이와 유사하게, 발현 시스템 내의 프로테아제에 의한 단백질 분해작용을 제거함으로써 특정 아미노산 (예를 들어, KEX2 프로테아제 활성이 나타나는 효모 발현 시스템 내의 2염기성 아미노산 잔기)을 변화시켜, 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 발현을 강화시킬 수 있다.
우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 돌연변이는, 바람직하게는 코딩 서열의 아미노산 판독 프레임을 보존하고, 바람직하게는 혼성화되어서 변이체 폴리펩티드의 발현에 해가 될 수 있는 2차 구조 (예컨대, 헤어핀(hairpin) 또는 루프)를 형성할 것 같은 핵산의 영역을 만들지 않는다.
돌연변이는 아미노산 치환의 선택, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에서의 선택된 부위의 무작위 돌연변이유발에 의해 행해질 수 있다. 이어서, 변이체 폴리펩티드가 발현되며, 하나 이상의 활성에 대해 시험하여 돌연변이가 목적하는 특성을 갖는 변이체 폴리펩티드를 제공하는지를 측정한다. 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 없지만, 특정 숙주에서의 번역을 위해 바람직한 코돈을 제공하는 변이체 (또는 비-변이체 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드)에 대해서 추가의 돌연변이를 행할 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이에서의 핵산의 번역을 위해 바람직한 코돈은 당업자에게 널리 공지되어 있다. cDNA 클론 또는 우로네이트 데히드로게나제 유전자의 비코딩 서열에 대해 또다른 돌연변이를 행하여 폴리펩티드의 발현을 강화시킬 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이 박테리아 또는 포유동물 발현 벡터 내로 변이체 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 적절한 숙주 세포 내로 벡터를 도입시키고, 변이체 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드를 발현시키고, 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 기능적 능력에 대해 시험함으로써, 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드 변이체의 활성을 시험할 수 있다.
숙련된 기술자는 또한 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드에서 보존적 아미노산 치환을 달성하여 상기 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체 (즉, 상기 변이체는 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 기능적 능력을 유지함)를 제공할 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 치환이 이루어진 단백질의 상대 전하 또는 크기 특성을 변경시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는, 당업자에게 공지된 폴리펩티드 서열 변경 방법, 예컨대 이러한 방법을 편집해 놓은 문헌, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 또는 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley ＆ Sons, Inc., New York]에서 발견되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체의 예는 본원에 개시된 단백질의 아미노산 서열 내에 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 군의 아미노산 중에서 이루어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
일반적으로, 변이체 폴리펩티드 제조 시, 모든 아미노산보다 적은 아미노산이 변경되는 것이 바람직하다. 특정 아미노산 잔기가 기능을 부여하는 것으로 공지되어 있는 경우, 이러한 아미노산은 대체되지 않을 것이거나, 또는 다르게는, 보존적 아미노산 치환에 의해 대체될 것이다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드 제조 시, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 잔기가 변경될 수 있다. 일반적으로, 가장 적은 수의 치환이 이루어지는 것이 바람직하다. 따라서, 변이체 폴리펩티드 제조를 위한 한 가지 방법은 특정 단일 아미노산 대신 모든 다른 아미노산을 치환한 다음, 변이체의 활성 검정하고, 그 후 최상의 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 사용하여 상기 방법을 반복하는 것이다.
우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체를 제조하기 위한 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 변경함으로써 달성된다. 이러한 치환은 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 PCR-지정 돌연변이, 쿤켈(Kunkel)의 방법에 따른 부위-지정 돌연변이유발 (문헌 [Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985]), 또는 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 화학적 합성에 의해 이루어질 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명은 여러가지 용도를 갖고, 그 중 일부는 본원에 기재되어 있다. 먼저, 본 발명은 우로네이트 데히드로게나제 단백질 분자의 단리를 허용한다. 숙련된 기술자들에게 공지된 다양한 방법을 활용하여 단리된 우로네이트 데히드로게나제 분자를 얻을 수 있다. 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드를 천연 생산하는 세포로부터 크로마토그래피적 수단 또는 면역학적 인식으로 정제될 수 있다. 별법으로, 발현 벡터를 세포 내로 도입하여 폴리펩티드의 생성을 야기할 수 있다. 또다른 방법에서, mRNA 전사물을 세포 내로 미세주입하거나 또는 다르게 세포 내로 도입하여 코딩된 폴리펩티드의 생성을 야기할 수 있다. 망상적혈구 용해물 시스템과 같은 세포-무함유 추출물에서의 mRNA의 번역을 이용하여 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 당업자는 또한 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드를 단리하기 위해 공지된 방법을 쉽게 따를 수 있다. 여기에는, 이에 제한되지는 않지만, 면역크로마토그래피, HPLC, 크기-배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 및 면역-친화성 크로마토그래피가 포함된다.
본 발명의 분자의 발현은 당업자들에게 공지된 통상의 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 이러한 방법에는, 이에 제한되지는 않지만: 직접 RNA 증폭, RNA에서 cDNA로의 역전사, 실시간 RT-PCR, cDNA의 증폭, 혼성화, 및 면역학적으로 기초하는 검정 방법 (이에 제한되지는 않지만, 면역조직화학, 항체 샌드위치 포획 검정, ELISA, 및 효소-결합 면역스팟 검정 (EliSpot 검정)이 포함됨)이 포함된다. 예를 들어, 대상체 또는 조직 중 본 발명의 핵산 분자 수준의 존재의 측정은 폴리머라제 쇄 반응을 비롯한 임의의 표준 핵산 측정 검정, 또는 표지된 혼성화 탐침을 이용한 검정을 통해 수행될 수 있다. 이러한 혼성화 방법에는, 이에 제한되지는 않지만, 마이크로어레이 기술이 포함된다.
본 발명은 또한, 우로네이트 데히드로게나제 (Udh)에 대한 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 2에 대해 95％ 이상의 아미노산 동일성을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 1과 95％ 이상의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 24에 대해 95％ 이상의 아미노산 동일성을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 23과 95％ 이상의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 26에 대해 95％ 이상의 아미노산 동일성을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 25와 95％ 이상의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 결합한다.
본 발명의 항체는 단백질, 단백질 단편, 단백질 또는 그의 단편을 발현하는 세포 등을 동물에게 투여하여 폴리클로날 항체를 생산하는 것을 비롯한 임의의 다양한 방법에 의해 제조된다. 본 발명은 또한 Udh에 대한 모노클로날 항체의 제조 방법을 제공한다. 모노클로날 항체의 제조는 당업계에 공지되어 있는 기술에 따라 수행된다. 항체 분자의 작은 일부 만이, 즉 파라토프 만이 그의 에피토프에 대한 항체의 결합에 포함된다는 것은 당업계에 공지되어 있다 (일반적으로, 문헌 [Clark, W.R., 1986, The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I., 1991, Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford] 참조). pFc' 및 Fc 영역은, 예를 들어, 보완적 캐스케이드의 이펙터이지만, 항원 결합에 포함되지는 않는다. pFc' 영역이 효소적으로 절단되거나 또는 pFc' 영역 없이 생성되는 항체 (F(ab')2 단편으로 명시됨)는, 무손상 항체의 항원 결합 부위 둘다를 유지한다. 유사하게는, Fc 영역이 효소적으로 절단되거나 또는 Fc 영역 없이 생성되는 항체 (Fab 단편으로 명시됨)는 무손상 항체 분자의 항원 결합 부위 중 하나를 유지한다. Fab 단편은 공유 결합된 항체 경쇄 및 Fd로 표시되는 항체 중쇄 부분으로 이루어진다. Fd 단편은 항체 특이성의 주요 결정 요인이고 (단일 Fd 단편은 항체 특이성 변경 없이 10개 이하의 상이한 경쇄와 결합될 수 있음), Fd 단편은 단리에서 에피토프-결합능을 유지한다.
당업계에 공지된 바와 같이 항체의 항원-결합 부분 내에는, 상보성 결정 영역 (CDR) (항원의 에피토프와 직접 상호작용함) 및 프레임워크 영역 (FR) (파라토프의 3차원 구조를 유지함)이 존재한다 (일반적으로, 문헌 [Clark, 1986; Roitt, 1991] 참조). IgG 면역글로블린의 중쇄 Fd 단편 및 경쇄 둘다에는, 3개의 상보성 결정 영역 (CDR1 내지 CDR3)에 의해 각각 분리되는 4개의 프레임워크 영역 (FR1 내지 FR4)이 존재한다. CDR, 및 특히 CDR3 영역, 보다 구체적으로 중쇄 CDR3은 항체 특이성에 대해 매우 책임이 있다.
포유동물 항체의 비-CDR 영역이 원래 항체의 에피토프 특이성을 유지하면서 비특이성 또는 이종특이성 항체의 유사한 영역으로 대체될 수 있다는 것이 당업계에 현재 잘 확립되어 있다. 이것은 "인간화" 항체 (여기서, 비-인간 CDR을 인간 FR 및/또는 Fc/pFc' 영역에 공유적으로 연결시켜 기능적 항체를 생성함)의 개발 및 사용에서 가장 명백하게 명시된다. 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호, 제5,225,539호, 제5,585,089호, 제5,693,762호 및 제5,859,205호를 참조한다. 전장 인간 모노클로날 항체는 또한 큰 부분의 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 로커스에 대해 트랜스제닉 마우스를 면역화시켜 제조할 수 있다. 이들 마우스 (예를 들어, 제노마우스 (아브게닉스(Abgenix)), HuMAb 마우스 (메다렉스(Medarex)/젠팜(GenPharm)))의 면역화에 따라, 모노클로날 항체는 표준 하이브리도마 기술에 따라 제조할 수 있다. 이러한 모노클로날 항체는 인간 면역글로불린 아미노산 서열을 가질 것이고, 따라서 인간에게 투여 시에 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응을 유발하지 않을 것이다. 따라서, 당업자에 명백할 바와 같이, 본 발명은 또한 F(ab')2, Fab, Fv 및 Fd 단편; 키메라 항체 (여기서, Fc 및/또는 FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄 CDR3 영역은 상동성 인간 또는 비-인간 서열에 의해 대체됨); 키메라 F(ab')2 단편 항체 (여기서, FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄 CDR3 영역은 상동성 인간 또는 비-인간 서열에 의해 대체됨); 키메라 Fab 단편 항체 (여기서, FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄 CDR3 영역은 상동성 인간 또는 비-인간 서열에 의해 대체됨); 및 키메라 Fd 단편 항체 (여기서, FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 영역은 상동성 인간 또는 비-인간 서열에 의해 대체됨)를 제공한다. 본 발명은 또한 소위 단일 쇄 항체, 도메인 항체 및 중쇄 항체를 포함한다.
우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 및 미오-이노시톨 옥시게나제를 코딩하는 유전자가 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있음을 인지해야 한다. 본원에 제시된 실시예 부분에서 논의된 실시양태에서, 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 효소는 사카로마이세스 세레비시아에로부터의 유전자 (INO1)에 의해 코딩되고, 미오-이노시톨 옥시게나제 효소는 마우스 유전자 (MIOX)에 의해 코딩되고, 우로네이트 데히드로게나제 효소는 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 푸티다 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자 (udh)에 의해 코딩된다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 이러한 효소에 대한 상동성 유전자는 많은 종 중에 존재하며, 이는 상동성 조사에 의해, 예를 들어 NCBI 인터넷 사이트 (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 이용가능한 단백질 BLAST 조사를 통해 확인될 수 있다. 이들 효소를 코딩하는 유전자는, 예를 들어 당업자에 의해 이해될 것과 같이 축퇴성 프라이머를 이용하여, 소정의 효소를 함유한 임의의 공급원으로부터의 DNA로부터 PCR 증폭될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 소정의 효소를 코딩하는 유전자는 합성될 수 있다. 여기서 논의된 효소를 코딩하는 유전자를 얻는 임의의 수단은 본 발명의 경로를 구축하는 것과 양립할 수 있다.
실시예
실시예 1: 글루카르산 생성: 재조합 에셰리키아 콜라이 ( Escherichia coli )에서의 생합성 경로
합성 경로는 에셰리키아 콜라이에서 글루코스로부터 글루쿠론산 및 글루카르산의 생성에 대해 구축되어 있다 (도 1). 사카로마이세스 세레비시아에로부터의 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제 (Ino1) 및 마우스로부터의 미오-이노시톨 옥시게나제 (MIOX)를 코딩하는 유전자의 동시발현은 중간체 미오-이노시톨을 통한 글루쿠론산의 생성을 도출하였다. 0.3 g/L 이하의 글루쿠론산 농도를 배양 브로쓰 중에서 측정하였다. MIOX의 활성은 속도 제한적이고, 최종 생성물로서의 미오-이노시톨 및 글루쿠론산 둘다를 대략 동일 농도로 축적시켰다. 제3 효소인, 슈도모나스 시링가에로부터의 우로네이트 데히드로게나제 (Udh)의 포함은 글루쿠론산에서 글루카르산으로의 전환을 용이하게 하였다. 상기 재조합 효소의 활성은 Ino1 및 MIOX의 활성보다 2 등급 초과로 더 크고, 1 g/L 초과의 글루카르산 농도가 관찰되도록 하는 경로를 통해 전체 플럭스를 증가시켰다. 이것은 글루카르산의 생물학적 생성을 위한 신규 미생물 시스템, 즉 생물질로부터 "최상-가치 부가된 화학물질"을 나타낸다.
재료 및 방법
균주, 성장 배지 및 플라스미드
이. 콜라이 균주 DH10B
Figure 112010071661882-pct00001
Figure 112010071661882-pct00002
를 모든 분자 생물 조작에 사용하였다. DH10B 및 BL21 스타(Star)™ (DE3)
Figure 112010071661882-pct00003
을 유기 산 생성을 위한 숙주로 사용하였다. 두가지 균주 모두의 컴피턴트 세포는 인비트로젠 코포레이션 (캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터 구입하였다. 배양물을 LB 또는 M9 배지 중에서 증식시켰다. LB (밀러(Miller)) 배지는 제조자 지침 (BD 바이오사이언시스(Biosciences), 캘리포니아주 산 호세 소재)에 따라 탈수된 분말로부터 제조하였다. M9는 기재된 바와 같이 제조하였고 (32), 이것은 1X M9 염 (12.8 g/L Na2HPO4·7H2O, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl), 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2 및 10 g/L (1％) 글루코스로 구성되어 있다. 류신은 DH10B에 대해 최종 농도 105 ㎍/mL로 첨가하였다. 카나마이신을 최종 농도 20 ㎍/mL로 첨가하고, 암피실린을 최종 농도 100 ㎍/mL로 첨가하였으며, 여기서 플라스미드 지속을 위해 선택적인 압력을 제공하는 것이 바람직하였다.
모든 분자 생물학 조작은 표준 실행에 따라 수행하였다 (32). 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 (Ino1, MIPS로도 공지됨)를 코딩하는 INO1 유전자를 사카로마이세스 세레비시아에의 게놈 DNA 제제로부터 하기의 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시켰다: 정방향 -
Figure 112010071661882-pct00004
(서열 3); 역방향 -
Figure 112010071661882-pct00005
(서열 4). 프라이머의 5' 말단에 포함되는 EcoRI 및 HindIII 제한 부위는 밑줄 쳐 있다. 미오-이노시톨 옥시게나제를 코딩하는 마우스 MIOX 유전자는 젠뱅크 수탁 번호 AF197127을 기초로 하는, DNA 2.0 (캘리포니아주 멘로 파크 소재)로부터의 이. 콜라이에서 발현시키기 위해 코돈 최적화로 합성하였다. 858개 뉴클레오티드 (286개 코돈) 서열의 최적화는 제작사에 의해 수행되고, 그 결과는 하기와 같이 요약하였다: 19.2％의 뉴클레오티드가 변경되고, 286개 코돈 중 153개 코돈 (53.5％)에 영향을 미침. 최적화된 코돈 중에서, 144개 (94.1％)는 단지 3번째 뉴클레오티드 위치에서만 변경되었다. 상기 코돈 중 3개에서 모든 3개 뉴클레오티드가 변경되었다. 합성 유전자는 플라스미드 pJ2-MIOX로서 수용되었다. EcoRI 및 HindIII 제한 부위는 유전자의 5' 및 3' 말단 각각에 포함되었다. 이. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 마우스 MIOX 유전자 및 그의 합성 버전의 서열 정렬을 도 4에 나타낸다. 두 유전자 모두를 IPTG-유도성 플라스미드 pMMB206 (25) 및 pTrc99A (2) 내에 서브클로닝하여, 발현된 효소의 활성을 확인하였다. 생성된 플라스미드는 pMMB-INO1, pTrc-INO1, pMMB-MIOX 및 pTrc-MIOX로 명시되었다. 두 유전자 모두의 동시발현을 위해, 2개의 T7 프로모터를 함유한 pRSFDuet-1 벡터 (노바젠(Novagen))를 사용하였다 (뉴저지주 깁스타운 소재). INO1 유전자를 EcoRI 및 HindIII 부위를 사용하여 제1 위치 내로 서브클로닝시켜 플라스미드 pRSFD-IN을 생성하였다. MIOX 유전자를 제2 위치 내로 도입하기 위해, pJ2-MIOX의 HindIII 부위는 클레나우(Klenow) 효소를 사용하여 말단-충전시킨 후에 EcoRI로 절단하였다. pRSFD-IN을 먼저 XhoI로 절단하고 말단-충전시킨 다음, EcoRI-호환성 MfeI로 절단한 후에 MIOX 유전자 단편과 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드를 pRSFD-IN-MI로 명시하였다. 슈도모나스 시링가에로부터의 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 udh 유전자 (젠뱅크 수탁 번호 EU377538)의 단리는 실시예 2에 제시한다. 슈도모나스 시링가에로부터의 udh 유전자를 기재된 바와 같이 pTrc99A 내로 서브클로닝하여 pT1053 (이후 pTrc-udh로서도 지칭됨)을 제조하였다 (40).
MIPS (INO1), MIOX 및 UDH 활성을 위한 효소 검정
INO1, MIOX 및 udh 유전자의 기능적 발현은 효소 활성의 시험관내 검정을 통해 확인하였다. 먼저, 배양물 1 내지 2 mL로부터의 세포 펠렛을 1 mg/mL 리소자임을 함유한 10 mM 트리스-Cl (pH 8.0) 100 내지 200 μL 중에 재현탁시켜 조질의 용해물을 제조하였다. 액체 질소 중의 동결 및 30 내지 40℃의 물 중의 해동을 5회 순환으로 교차시켜 세포 용액을 용해시켰다. 생성된 용액을 14,000 rpm으로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 불용물을 제거하였다. 용해물의 총 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 방법 (11)을 이용하여 측정하였다.
미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 활성을 위한 검정을 종래 기재된 바와 같이 수행하였다 (1, 6). 간단하게, 50 mM 트리스-아세테이트 (pH 7.5), 0.8 mM NAD+, 14 mM NH4Cl, 5 mM 머캅토에탄올 및 5 mM 글루코스-6-포스페이트로 이루어진 반응 완충액 중에서 글루코스-6-포스페이트 기질을 미오-이노시톨-1-포스페이트로 전환시켰다. 용해물을 첨가하여 반응을 개시하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 0.4 부피의 20％ 트리클로로아세트산을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 생성물을 정량화하기 위해, 동 부피의 0.2 M NaIO4를 이용하여 산화시킴으로써 무기 포스페이트를 미오-이노시톨-1-포스페이트로부터 제거하였다. 동 부피의 1 M Na2SO3을 첨가하여 과량의 퍼요오데이트를 파괴하였다. 글루코스-6-포스페이트의 부재 하에 퍼요오데이트의 첨가 없이 대조군 반응을 확립하였다.
미오-이노시톨 옥시게나제 활성을 위한 검정을 종래 기재된 바와 같이 수행하였다 (4, 30, 31). 반응 완충액은 50 mM 트리스-Cl (pH 8.0), 2 mM L-시스테인, 1 mM Fe(NH4)2(SO4)2 및 60 mM 미오-이노시톨로 구성되었다. 샘플을 기질의 부재 하에 10분 동안 30℃에서 예비-인큐베이션하여 MIOX 효소를 활성화시켰다. 1시간 동안 30℃에서 반응물을 인큐베이션하고, 1/10 부피의 30％ 트리클로로아세트산을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 생성된 글루쿠론산을 오르시놀 시약을 사용하여 정량화하였다 (13). 상기 시약은 5.4 mg FeCl3을 함유한 진한 HCl 10 mL 중 오르시놀 40 mg으로 구성되었다. 1 부피의 샘플을 2 부피의 오르시놀 시약과 혼합하고, 비등수 중에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, 670 nm에서의 흡광도를 측정하여 글루쿠론산 농도를 측정하였다. 대조군 반응물을 미오-이노시톨의 부재 하에 확립하여 배경으로 간주하였다.
우로네이트 데히드로게나제 활성을 위한 검정을 종래 기재된 바와 같이 340 nm에서 NADH 보조인자 생성을 모니터링함으로써 수행하였다 (35, 40). 반응 혼합물은 상기 기재된 바와 같이 제조된 100 mM 나트륨 포스페이트 완충액 (pH 8.0), 2.5 mM 글루쿠론산, 0.9 mM NAD+ 및 박테리아 용해물을 함유하였다.
산 생성을 위한 성장 조건
배양물을 10 g/L 글루코스로 보충된 LB 배지 중에서 성장시키고, 결과에 나타낸 바와 같이 IPTG로 유도하였다. 접종원을 LB 배지 중에 제조하고, 1 또는 2％ (v/v)를 사용하여 50 또는 100 mL의 배지를 함유한 250-mL 배플드 플라스크에 접종하였다. 배양물을 30℃ 및 250 rpm에서 인큐베이션하고, 주기적으로 샘플링하여 배양 배지 중의 세포 밀도 및 생성물 농도를 측정하였다.
유기 산의 검출 및 정량화
글루쿠론산 및 글루카르산을 포함한 대사물질을 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 정량화하였다. 글루카르산 검정을 위해, 샘플을 종래 기술된 바와 같이 (28, 40) 사전 처리하여, 글루쿠론산을 포함한 다른 대사물질로부터 글루카르산을 분리하였다. 간단하게, 보론산 친화성 겔 (아피(Affi)-겔 보로네이트 겔, 바이오-래드 래보레이토리스(Bio-Rad Laboratories), 캘리포니아주 헤르큘러스 소재) (이것은 글루카르산에 존재하는 동일면 인접 시스-히드록실 기에 대한 친화성을 가짐 (28))을 샘플과 혼합하고, 80 mM 칼륨 포스페이트 - 20 mM 붕산 완충액 (pH 7.0)으로 세척하였다. 글루카르산을 0.1 M 염산으로 용리하였다. 10 M NaOH를 첨가하여 용리액을 중화시킨 다음 HPLC로 처리하였다. HPLC 분석을 아미넥스(Aminex) HPX-87H 컬럼 (300 mm x 7.8 mm, 바이오-래드 래보레이토리스, 캘리포니아주 헤르큘러스 소재) 및 반사율 및 다이오드 어레이 검출기가 장착된 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 기기 상에서 다음의 조건 하에 수행하였다: 이동 상, 물 중 5 mM 황산; 유속, 0.5 mL/분; 주입 부피, 50 μL; 온도, 55℃; UV 파장, 210 nm.
결과
재조합 Ino1 및 MIOX 활성의 검증
이. 콜라이 발효를 통해 고농도의 미오-이노시톨을 생성하기 위해 사카로마이세스 세레비시아에로부터의 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 (Ino1)를 사용하는 것은 이미 보고되어 있다 (15). 21 g/L 이하의 생성물 역가를 고 세포 밀도 하에 수득하고, 유가 발효를 54시간 동안 작동시켰다. 진탕 플라스크에서 Ino1의 성능을 확인하기 위해, 상응하는 유전자를 증폭시키고, 호환성 벡터 내로 삽입한 다음, 일반적인 실험실 균주 DH10B에서의 발현을 위해 고-카피수 및 중-카피수 플라스미드 둘다에 서브클로닝하였다. 플라스미드 pTrc-INO1은 수백의 카피수를 생성하는 변형된 ColE1 레플리콘을 함유하지만, pMMB-INO1은 카피수가 10 정도인 RSF1010 레플리콘을 기초로 한다. 2가지 플라스미드를 평가하여, 호환성 벡터를 사용하는 단일 균주에서 INO1 및 MIOX 유전자의 동시발현을 위한 가능성을 조사하였다. pTrc-INO1 및 pMMB-INO1 각각을 포함하고 30℃에서 인큐베이션된 배양물에 대해 344 nmol/hr/mg 및 128 nmol/hr/mg의 시험관내 활성이 측정가능하고, 이것은 효소의 성공적인 발현을 나타내는 것이다 (표 1). 그러나, 고-카피수 플라스미드로부터의 발현 만이 측정가능한 양의 미오-이노시톨 (0.37 g/L)을 배양 배지 중에 축적시켰다. 활성은 또한 강력한 온도 함수이고, 37℃에서 성장시킨 배양물에 대해서는 검출가능하지 않았다. 미오-이노시톨 생성은 또한 M9 최소 배지 중에서 시험하였다. 유일한 탄소 공급원으로서의 글루코스를 함유한 최소 배지 중에서의 성장이 글루코스 플럭스를 증가시키고, 이에 따라 미오-이노시톨 생성을 증가시킬 수 있는 것으로 가정되었다. 그러나, 미오-이노시톨이 단 절반의 양으로 생성되고, 이것은 글루코스 플럭스가 더 높을 필요가 있을 수 있는 경우, 상기 조건 하에 발현된 Ino1 효소가 기질에 대한 당분해에 대해 효과적으로 경쟁하지 않음을 시사한다. 후속 실험은 글루코스로 보충된 LB 배지 중에서 수행하였다.
MIOX는 주로 진핵 기원의 단백질이고, 인간, 마우스, 래트 및 돼지로부터의 동족체가 가장 잘 특성분석되어 있다 (3, 4, 30, 31). 미오-이노시톨 옥시게나제 (MIOX)를 이. 콜라이에서 기능적으로 발현시키고, 효소 성질의 특성분석을 위해 정제하였으나; 본 발명자들의 지식에 따라, 포유동물 MIOX를 글루쿠론산 생성을 위한 전세포 재조합 시스템에서 사용하지는 않았다. 마우스 버전의 효소는 이. 콜라이에서의 발현 시 가장 바람직한 성질을 갖는 것으로 밝혀졌고 (3), 연구를 위해 선택되었다. 이. 콜라이에 대해 코돈 최적화된 유전자 합성 버전은 DNA 2.0으로부터 구입하였다. 이 유전자를 또한 사용되는 고-카피수 및 저-카피수 벡터 둘다 내로 서브클로닝하여 DH10B에서의 Ino1 활성을 평가하였다. 상기 효소가 포유동물 기원이기 때문에, MIOX 활성은 37℃에서 최초로 평가하였다.
MIOX 효소는 시험관내 활성화를 위해 Fe2+ 및 시스테인을 필요로 하는 것으로 공지되어 있다 (4). 이들 화합물의 배양 배지로의 첨가는 시험관내 검정에서 측정된 바와 같이 pTrc-MIOX로부터의 효소의 발현을 개선시키지는 않고, 오히려 활성을 감소시켰다 (표 2). 글루쿠론산은 더 낮은 농도이긴 하지만 배양 배지 중에서 여전히 측정되었다. 효소 활성에서의 관찰된 감소는 세포 밀도에서의 유의한 감소와 부합하고, 이는 숙주에 대한 이들 화합물의 독성을 나타낸다. 종래 보고된 바와 같이 (30, 31), MIOX 활성은 고 농도의 Fe2+ 및 시스테인에 의해 억제되었다. 세포외 농도는 시험관내 검정에서 효소를 활성화시키는 수준으로 설정되었지만, 상응하는 세포내 농도는 알려지지 않았다. 또한, 배양 배지 중에 미오-이노시톨을 포함하는 것이 이. 콜라이 내 가용성 MIOX 발현을 개선시켰음은 이미 보고된 바 있다 (3). 또한, 이러한 거동은 본원에서 관찰되었고, 미오-이노시톨 보충 없이 발현되었을 때 효소의 활성에서의 급격한 감소를 나타냈다 (표 2). 재조합 MIOX의 한 가지 두드러진 특징은 그의 명백한 불안정성이다 (3). 높은 활성은 기하급수적 단계 (접종 후 6시간) 동안 취해진 샘플에서 관찰되었지만, 정체기 (접종 후 24시간)에는 실질적으로 강하되었다 (표 2). 비어있는 pTrc99A 플라스미드를 함유한 대조군 샘플에서 측정된 바와 같이, 검정의 배경 활성은 일반적으로 시간에 따라 증가하였다. 검정의 높은 배경은 비록 더 작은 범위이긴 하지만 다른 생물학적 화합물과 반응하는 것으로 알려진 오르시놀 시약의 비-특이성으로부터 생성된다는 것을 주목한다. 결과적으로, 상기 검정은 효소 활성의 정밀한 정량화에 대해 신뢰할 만하지 않을 수 있다. 그러나, 미오-이노시톨의 존재 및 부재 하의 샘플 간의 관찰된 차이점, 및 초기 시점 및 후기 시점에서의 미오-이노시톨을 함유한 샘플 사이의 관찰된 차이점은 충분히 커서, 그 경향성이 유의한 것으로 여겨질 수 있다.
시험관내 효소 활성 및 글루쿠론산의 생체내 생성은 더 낮은 카피수 pMMB-MIOX 구축물을 함유한 배양물 중에서는 관찰되지 않았고, 이는 측정가능한 MIOX 활성을 달성하기 위해 높은 발현 수준이 요구됨을 시사한다. INO1은 30℃에서 단지 활성적으로 발현되기 때문에, 생체내 MIOX 성능은 또한 고-카피수 플라스미드로부터 상기 온도에서 평가하였다. 필적만한 양의 글루쿠론산 (0.40 g/L)이 배양물 중에서 24시간 후에 생성되었고, 역가는 48시간 후에는 0.78 g/L로 2배가 되었다.
글루쿠론산의 생성
글루코스로부터의 글루쿠론산의 생성은 동일 균주에서 INO1 및 MIOX 모두의 동시발현을 필요로 한다. pTrc-INO1 및 pMMB-MIOX 또는 pMMB-INO1 및 pTrc-MIOX를 함유하는, 이중으로 형질전환된 균주가 상기 생성에 사용될 수 있다는 예상대로, 상용성 플라스미드 pTrc99A 및 pMMB206이 모두 조사되었다. 그러나, 본 발명자들의 결과에 의하면, 배양 배지에서 각 목적 생성물의 축적에 의해 결정되는 바와 같은 합당한 생체내 활성은 단지 고-카피수 플라스미드로부터의 모든 유전자의 발현에 의해 달성가능하였다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 T7 프로모터 뒤에 각각 다중-클로닝 부위의 쌍을 함유하는 고-카피수 pRSFDuet 벡터 내로 모든 효소를 도입하였다. 효소 활성은 앞서 기재된 바와 같이 확인하였고, 발현은 SDS-PAGE에 의해 입증하였다 (데이타는 제시되지 않음). 이러한 방식으로, IPTG 농도 0.1 mM이 바람직한 것으로 결정되었다. 또한, 숙주 균주를 DH10B에서 BL21(DE3)로 변경하여 T7 프로모터로부터의 발현을 가능하게 하였다. 본 발명자들은 앞서 DH10B가 성장을 위해 글루쿠론산을 소비할 수 없다는 것을 관찰하였다 (데이타는 제시되지 않음). BL21(DE3)은 글루쿠론산을 대사시킬 수 있으나, 그의 소비는 이화산물 억제에 제공되는 것처럼 보였다 (데이타는 제시되지 않음). 따라서, 과량의 글루코스로 균주를 배양하는 것은 목적 생성물의 소비를 방지시킨다.
pRSFD-IN-MI를 수반하는 BL21(DE3) 균주는 단지 약 270 mg/L의 수준이긴 하지만 클루코스로부터 글루쿠론산을 생성할 수 있었다 (도 2). 배양 프로파일은, 글루쿠론산이 24시간 후에 존재하며 이때 중간체는 검출가능하지 않았고, 농도가 4일간 50％ 증가하였음을 보여준다. 그러나, 48시간 후에, 유의한 양의 미오-이노시톨이 배양 배지에 나타났다. 미오-이노시톨은 배지에 계속 축적되었고, 실험 말기에 목적 최종 생성물인 글루쿠론산보다 약간 더 높은 농도로 존재하였다. 최종 글루쿠론산 농도인 0.27 g/L는 상기 DH10B(pTrc-MIOX) 시스템에서 미오-이노시톨의 직접적인 전환에 의해 관찰된 농도 (0.78 g/L)보다 낮았다. 미오-이노시톨의 축적은, MIOX 활성이 글루쿠론산의 고 농도 생성에 있어서 제한 인자임을 제시한다. 시험관내 검정으로, Ino1 활성이 실험 전반에 걸쳐 벡터-단독 대조군의 경우보다 상당히 높았으며, 한계 배경 활성만이 3일 후에 나타났다는 것을 확인하였다 (데이타는 제시되지 않음). 대조적으로, MIOX 활성은 1일 후에 배경보다 단지 약간 더 높았으며, 이후 배경과 구별되지 않았다. 이는 MIOX 활성이 24시간 후에 급격히 하락함을 나타내는 앞서 요약된 결과 (표 2)와 일치한다. 추가로, 이 시스템에서 MIOX의 활성은 Ino1에 의해 생성된 미오-이노시톨의 농도에 의해 제한되는 것 같다. 60 mM (10.8 g/L) 미오-이노시톨의 세포외 보충이 세포내 농도 또한 이만큼 높다는 것을 의미하지는 않지만, Ino1 활성으로부터 초래되는 미오-이노시톨의 세포내 농도가 동등한 농도에 못미치는 것 같다고 의심하기에 합당하다.
글루카르산의 생성
실시예 2는 슈도모나스 시링가에 pv. 토마토 DC3000 (40)로부터의 유전자 코딩 우로네이트 데히드로게나제 활성의 클로닝 및 특징분석을 나타낸다. udh 유전자는 이. 콜라이에서 매우 잘 발현되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 높은 효소 활성을 생성한다. 글루카르산의 생성을 위해, 본 발명자들은 pRSFD-IN-MI와 상용성인 pTrc99A에 udh 유전자를 수반하는 미리 구축된 벡터를 이용하였다. 두 벡터는 INO1, MIOX, 및 udh를 수반하는 이. 콜라이 균주를 구축하기 위해 BL21(DE3)에 도입되었다. 이 균주의 생산성은 여러 상이한 도입 조건 하에 측정되었다 (표 3). 놀랍게도, 앞서 2개의 제1 유전자를 수반하는 시스템에서 단지 0.27 g/L의 글루쿠론산이 관찰되었지만, 1 g/L 이하의 글루카르산이 생성되었다. 글루쿠론산에 대해 앞서 사용되었던 조건과 동일한 도입 조건 하에서 (표 3, 조건 A), 0.72 g/L의 글루카르산이 생성되었다. 시스템을 추가로 특성분석하기 위해, 조질의 용해물에서의 효소 활성이 각각의 배양일 후에 측정되었다 (도 3). Udh 활성이 가장 높았으며, 이는 Ino1 활성보다 2배 넘게 더 높고 MIOX 활성보다 3배 더 높았다. 따라서, Udh의 가장 높은 활성은 글루카르산 경로를 통해 글루코스 플럭스를 끌어들이는 것처럼 보이며, 이는 비교적 높은 글루카르산 역가를 유도한다. 이들 샘플에서, MIOX 활성은 앞서 관찰된 바와 같이 시간에 걸쳐 감소하는 것처럼 보이지 않지만, 활성의 크기는 꽤 낮게 유지된다. 추가로, 여기서 제1 데이타 포인트는, 앞서 MIOX 활성이 기하급수적 성장 동안 관찰된 것보다 유의하게 감소되었음을 보여주는 때인 1일 후이다 (표 2). 3일의 배양 시간 후에 글루쿠론산은 검출되지 않았지만 미오-이노시톨은 축적되었으며, 이는 MIOX-촉매 단계가 제한적임을 확인시킨다.
시험된 3개의 유도 조건은 0.72 내지 1.13 g/L 범위의 글루카르산 농도를 초래하였다. 일반적으로, 보다 높은 유도 수준, 즉 보다 높은 IPTG 농도는 글루코스에 대해 보다 높은 수율의 글루카르산을 초래하지만 보다 낮은 생성물 농도를 초래하였다 (예를 들어, 표 3에서 조건 A 및 B의 비교). 또한, 보다 높은 유도 수준은 보다 적은 글루코스 소비 및 보다 낮은 세포 밀도를 초래하며, 이는 3개의 효소의 보다 높은 발현과 관련된 대사 부담을 나타낸다. 그러나, 보다 낮은 글루코스 소비율의 경우에, 보다 높은 분획의 글루코스 플럭스가 생물질에 비해 글루카르산 생성 쪽으로 향하였다. 본 발명자들은 또한, 250-mL 배플 플라스크에서 50 내지 100 mL의 총 배양 부피를 두배로 함으로써 초래된 열악한 통기는 글루카르산 역가를 반으로 감소시키지만 성장은 영향받지 않는다는 것을 관찰하였다 (데이타는 제시되지 않음). 이러한 감소된 역가는 제한 단계를 위한 효소인 MIOX가 보조-기질로서 산소 분자를 사용한다는 사실에 기인하는 것 같다 (12, 38). 마지막으로, 글루카르산의 생성은 M9 최소 배지에서 시험되었으나, 무시할만한 양의 글루카르산이 생성되었다.
논의
세가지 다른 공급원으로부터의 효소, 즉 에스. 세레비시아에로부터의 Ino1, 마우스로부터의 MIOX, 및 피. 시링가에로부터의 Udh를 사용하는 글루카르산 생성을 위한 생합성 경로의 집합이 본원에서 입증된다. 또한, 내인적 포스파타제도 상기 경로에 관여한다. 이. 콜라이의 suhB 유전자 생성물은 시험관내 이노시톨 모노포스파타제 활성을 갖는 것으로 나타났으며, 따라서 이러한 내인적 활성에 합당한 후보이다 (23). 이러한 경로는 열역학적 견지로부터 유인되는데, 이는 최후의 산화제로서 산소 분자를 고려하고 그룹 기여 이론 (21, 24)에 의해 평가되는 바와 같은 세 단계 모두에 대한 표준 자유 에너지 변화 (ΔG)가 모두 마이너스이기 때문이다: 글루코스에서 미오-이노시톨 단계의 경우 -14.3 Kcal/mol; 미오-이노시톨에서 글루쿠론산 단계의 경우 -86.8 Kcal/mol; 글루쿠론산에서 글루카르산 단계의 경우 -55.9 Kcal/mol. 그러나, 코슬라 (Khosla) 및 키슬링 (Keasling)이 나타낸 바와 같이 (18), 대사적 조작은 단순히 다양한 효소를 동원하는 것을 넘어선다. 또한, 숙주 유기체 내 신규 경로의 도입과 같은 혼란이 일어나는 경우 대사 플럭스의 전체적인 최적화를 포함한다. 플라스미드의 유지 및 플라스미드-코딩된 유전자의 발현과 관련된 대사 부담의 문제가 이 경우 특히 관심을 끈다 (9, 10, 17). 본 시스템에서, 검출가능한 양의 글루쿠론산은 단지 고-카피수 플라스미드에 의해 생체내 생성되었다. 제1 기질인 글루코스-6-포스페이트는 중심 대사에 제한적이지 않아야 하는데, 이는 과량의 글루코스로 보충된 LB 배지가 성장에 사용되었기 때문이다. 따라서, 신속하고 강한 당분해 경로와 경쟁하고 글루코스-6-포스페이트를 글루쿠론산으로 전환하기 위해 재조합 유전자의 높은 발현 수준이 필요한 것처럼 보인다. M9 배지에서 단지 소량의 미오-이노시놀이 생성되고 검출가능한 양의 유기 산이 생성되지 않았다는 결과는, 글루코스가 유일한 탄소 및 에너지 공급원인 경우 거의 모든 기질이 내인적 세포 대사에 진입한다는 것을 암시한다. 이러한 경쟁은 또한, 배지에서 글루코스 농도가 보다 높을 때 공정의 처음 이틀 동안 글루코스에 대한 글루카르산의 수율이, 농도가 보다 낮을 때 이후의 날들의 수율보다 일반적으로 더 높은 이유를 설명할 수 있다 (데이타는 제시되지 않음). 높은 MIOX 활성을 달성하기 위한 미오-이노시톨의 요건은, Ino1 효소로부터의 낮은 생산성이 궁극적으로 M9 배지에서 유기 산의 형성에 대한 제한이 될 수 있음을 제시한다. 별법으로, MIOX는 최소 배지에서 불량하게 발현될 수 있다. Ino1을 이용한 이전의 연구는 다른 화학적으로 한정된 배지에서 높은 수준의 미오-이노시톨을 생성하였으며 또한 유전자 발현을 위해 고-카피수 플라스미드를 사용하였다는 것을 주목해야 하지만, 이들 실험은 수일 동안 보다 큰 규모의 공급-배치식 발효에서 수행되었다 (15). 글루코스 공급의 개시 전 최초 배치 기간 동안 (대략 10시간), 미오-이노시톨 농도는 1 g/L 미만이었다. 따라서, 공급-배치식 조건 하의 배양이 본 시스템의 생산성을 어느 정도 향상시킬 수 있는지 조사할 만한 가치가 있다.
플라스미드 카피수는 본 합성 시스템의 성능에 영향을 주는 발현 수준과 관련된 유일한 인자가 아니다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 발현을 증가시키기 위해 유도물 농도를 증가시키는 것은 보다 낮은 생성물 농도를 초래하였다. 글루코스 소비율 및 성장률이 대사 부담 감소로 인해 향상되었더라도, 0.05 mM 미만의 IPTG 농도는 글루카르산 생성을 향상시키지 않았다 (데이타는 제시되지 않음). 이. 콜라이 성장은 30℃에서보다 37℃에서 더 우수하며, 속도-제한 효소 MIOX의 활성은 37℃에서 더 높을 것이다. 그러나, 발효는 30℃에서 수행되었는데, 이는 Ino1이 단지 이러한 낮은 온도에서 기능적으로 발현되었기 때문이다. Udh의 보고된 이상 열적 불안정성을 고려하면 (7, 35), 30℃보다 낮은 온도가 그의 활성을 위해 더 좋을 수 있지만, 본 발명자들은 30℃에서의 Udh 활성이 Ino1 또는 MIOX의 활성보다 훨씬 높다는 것을 관찰하였으며 (도 3), Ino1의 기능적 발현을 최대화하기 위한 배양 온도로서 30℃를 선택하였다.
이 시스템의 생산성에 대한 전체 제한을 고려하여, 경로에서 중간체에 의한 잠재력 억제가 조사되어야 한다. 돼지 신장으로부터의 MIOX는 D-글루카르산에 의해 시험관내 억제되지만 D-글루쿠로네이트 및 D-글루쿠로놀락톤에 의해서는 시험관내 억제되지 않는다는 것이 보고되었다 (30, 31). D-글루카르산의 부재 하에도 정체기에서 MIOX 활성이 급격히 하락한 것을 볼 때 (표 2), 낮은 MIOX 활성은 중간체에 의한 억제라기 보다는 그의 고유의 불안정에 기인하는 것 같다 (3). 또한, 본 발명자들은 suhB 유전자 또는 상동성 포스파타제를 과발현시키지 않았다는 것을 주목해야 한다. 그러나, 미오-이노시톨-1-포스페이트는 배양 생성물 중에서 검출되지 않았지만 미오-이노시톨은 축적되었다. 따라서, 본 발명자들은 포스파타제 활성이 경로를 통한 플럭스를 제한하지 않는다고 결론내렸다. 또한, 이. 콜라이는 D-글루카레이트 이화 경로를 함유한다 (16). 실제로, 성장을 위한 유일한 탄소 공급원으로서 D-글루카레이트를 소비하는 이. 콜라이의 능력은 우로네이트 데히드로게나제 활성을 확인하기 위한 스크린을 개발하는데 사용되었다 (40). 또한, BL21(DE3)은 D-글루쿠론산을 대사시킬 수 있다. 그러나, 모든 유기 산의 소비가 이화산물 억제에 제공되어, 글루코스의 존재 하에 생성물의 바람직하지 않은 손실을 방지하는 것처럼 보인다 (데이타는 제시되지 않음). 따라서, D-글루카르산 역가의 이론적 한계는 산의 독성 및 각 단계의 역학에 의해 결정되는 것처럼 보인다. 이. 콜라이 성장 및 글루코스 소비는 10 g/L 만큼 높은 농도의 칼륨 글루카레이트 및 나트륨 글루쿠로네이트의 첨가에 의해 영향받지 않는 것으로 관찰되었다 (데이타는 제시되지 않음); 따라서, 속도-제한 단계의 역학을 향상시키는 데에 촛점을 맞추어 역가를 향상시킬 여지가 있다. 이러한 합성 경로에 대해 글루코스 플럭스를 향상시키기 위한 추가의 최적화는 상이한 공급원으로부터 보다 우수한 효소를 동원하고, 이들 효소를 조작하고, 경쟁 경로를 하향조절하는 것을 수반할 수 있다.
이. 콜라이에서 고-카피수 (pTrc) 및 중-카피수 (pMMB) 플라스미드로부터 발현된 재조합 INO1의 활성. 배양물은 10 g/L 글루코스 및 pTrc-INO1과 pMMB-INO1 각각에 대해 0.1 mM 또는 1.0 mM IPTG로 보충된 LB 배지 내 30℃에서 성장하였다. 시험관내 활성은 중간-기하급수적 단계에서 취한 샘플의 조질 용해물로부터 결정되었지만, 생체내 활성은 48시간 후 배양 배지 내 미오-이노시톨의 농도로서 보고된다. 나타낸 데이타는 단일 실험으로부터 표시된다. N/D = 검출가능하지 않음.
배양물 시험관내 활성
(nmol/hr/mg) 		생체내 활성
(g/L)
pTrc-INO1 344 0.37
pMMB-INO1 128 N/D
다양한 배양 조건 하에 이. 콜라이에서 고-카피수 pTrc-MIOX로부터 발현된 재조합 MIOX의 활성. 배양물은 LB 배지 내 37℃에서 성장하였으며, 1.0 mM IPTG로 유도되었다. 글루쿠론산은 24시간에 측정되었다. 보충물: MI = 미오-이노시톨 (60 mM, 10.8 g/L), Fe = Fe(NH4)2(SO4)2 (1 mM), Cys = L-시스테인 (2 mM). N/D = 검출가능하지 않음. N/A = 측정되지 않음.
배양 조건 6시간에서의 활성
(nmol/min/mg) 		24시간에서의 활성
(nmol/min/mg) 		글루쿠론산
(g/L)
pTrc99A 대조군 N/D 82 N/D
+ MI 430 76 0.44
+ MI, + Fe, + Cys 180 42 0.33
- MI 28 15 N/A
Figure 112010071661882-pct00006
실시예 1에 대한 참조문헌
Figure 112010071661882-pct00007
Figure 112010071661882-pct00008
Figure 112010071661882-pct00009
Figure 112010071661882-pct00010
실시예 2: 슈도모나스 시링가에 pv. 토마토 균주 DC3000 및 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 C58로부터 우로네이트 데히드로게나제의 클로닝 및 특성분석
우로네이트 데히드로게나제를 슈도모나스 시링가에 pv. 토마토 DC3000, 슈도모나스 푸티다 KT2440 및 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 C58로부터 클로닝하였다. 단지 탄소 공급원으로서 글루쿠로네이트를 소비할 수는 없지만 글루카레이트 상에서 성장할 수 있는 에셰리키아 콜라이 돌연변이체를 사용한 신규한 상보성 검정을 사용하여 유전자를 동정하였다. 피. 시링가에의 숏건 라이브러리 (shotgun library)를 글루쿠론산을 함유하는 최소 배지에서의 형질전환된 세포의 성장에 의해 돌연변이체 이. 콜라이에서 스크리닝하였다. 생존 콜로니를 글루쿠론산을 글루카르산으로 전환시킬 수 있는 우로네이트 데히드로게나제에 평가하였다. 이러한 방식으로, 0.8 Kb 개방 판독 프레임을 확인한 다음 udh로서 입증하였다. 상동성 효소를 서열분석된 게놈의 유사도 조사에 근거하여 피. 푸티다 및 에이. 투메파시엔스에서 동정하였다. 이. 콜라이에서 발현된 3 가지 유기체 각각으로부터의 재조합 단백질을 정제하고 특성분석하였다. 모든 3 가지 효소에 대해, 전환수 (kcat)는 갈락투로네이트보다 기질로서의 글루쿠로네이트에 대해 더 높았으나, 미카엘리스 (Michaelis) 상수 (Km)는 갈락투로네이트에서 더 낮았다. 에이. 투메파시엔스 효소가 가장 높은 속도 상수 (글루쿠로네이트에 대한 kcat = 1.9 x 102 s-1)를 갖는 것으로 발견되었고, 이는 슈도모나스 효소 둘 다보다 2배 초과 더 높았다.
개론
박테리아에서의 알도헥수로네이트 이화작용은, 이성질체화 단계로의 개시 및 산화 단계로의 개시의 2 가지 상이한 경로에 관여하는 것으로 보고되었다. 이성질체화 경로에서, 알도헥수로네이트 (글루쿠로네이트, 갈락투로네이트)는 우로네이트 이소머라제에 의해 케토헥수로네이트로 이성질체화되고, 궁극적으로 피루베이트 및 3-포스포글리세르알데히드로 분해된다. 이성질체화 경로는 에셰리키아 콜라이 (7), 에르위니아 카로토보라 (Erwinia carotovora) (18) 및 에르위니아 크리산테미 (Erwinia chrysanthemi) (15), 아레오박테르 아에로게네스 (Areobacter aerogenes) (9, 23), 및 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens) (28)를 비롯한 박테리아에서 일어나는 것으로 이미 보고되었다. 산화 경로에서, 알도헥수로네이트는 우로네이트 데히드로게나제에 의해 알도헥사레이트로 산화되고, 추가로 피루베이트로 이화된다 (2, 5, 7, 9, 18, 19, 24). 이 경로의 핵심 효소인 우로네이트 데히드로게나제 (Udh)는 2 종의 식물 병원체 박테리아인 슈도모나스 시링가에 및 아그로박테리움 투메파시엔스에서 연구되었다. 현재, Udh의 특성과 관련하여 한정된 연구만이 문헌에 보고되었으며 (3, 6, 38, 43), 서열은 아직 확인되지 않았다. Udh는 전체 분자량이 약 60,000인 NAD-결합된 산화환원효소로서 분류된다 (EC 1.1.1.203). 이는 각각 약 30,000 분자량의 2 개의 서브유닛으로 구성된 호모-이량체이다 (38). Udh는 약 8.0의 최적 pH를 갖는 열적으로 불안정한 가역적 효소이다 (3, 6, 38).
알도헥수로네이트 이화작용에 대한 이성질체화 경로를 갖는 이. 콜라이 MG1655에서, 글루쿠로네이트는 exuT에 의해 코딩된 알도헥수로네이트 수송자에 의해 수송되고, uxaC에 의해 코딩된 우로네이트 이소머라제에 의해 프룩투로네이트로 전환된다 (22, 30). 프룩투로네이트는 엔트너-두도로프 (Entner-Doudoroff) 경로로 전달되어 2-케토-3-데옥시-6-포스포-글루코네이트를 통해 에너지 공급원으로서 이용된다 (7, 27, 31, 32). 따라서, uxaC가 결실된 이. 콜라이 MG1655는 탄소 공급원으로서 글루쿠로네이트를 사용할 수 없다. 이러한 상기 균주에서, 글루카레이트는 gudD에 의해 코딩된 D-글루카레이트 데히드라타제에 의해 5-케토-4-데옥시-D-글루카레이트로 전환된 다음, 피루베이트 또는 2-포스포글리세레이트를 통한 해당작용에 전달된다 (27, 33). 최근에, Udh 함유 피. 시링가에 pv. 토마토 DC3000 및 에이. 투메파시엔스 균주 C58의 것을 비롯한 다수의 박테리아 게놈 서열이 공개되었다 (4, 10). 피. 시링가에의 숏건 라이브러리를 구축하여 Udh를 코딩하는 유전자를 동정하였다. Udh에 대한 스크리닝은 이. 콜라이 MG1655 ΔuxaC에서 수행하였다. 우로네이트 데히드로게나제가 글루쿠로네이트를 글루카레이트로 전환시키기 때문에 (도 5), 단지 탄소 공급원으로서 글루쿠로네이트를 함유하는 최소 배지에서 성장할 수 있는, 피. 시링가에의 숏건 라이브러리를 내포하고 있는 이. 콜라이 ΔuxaC 균주는 Udh를 코딩하는 유전자를 수송할 수 있다. 일단 최초 Udh가 피. 시링가에로부터 동정되면, BLAST 상동성 조사로 다른 박테리아로부터 Udh의 식별을 유도할 수 있다.
재료 및 방법
박테리아 균주, 플라스미드 및 성장 조건
상기 연구에서 사용되는 균주, 플라스미드 및 프라이머 서열은 표 4에 제시된다. 배지 및 화학적 시약은 시그마 (Sigma) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 또는 비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences) (미국 캘리포니아주 산 조스 소재)로부터 입수하였다. 피. 시링가에 pv. 토마토 균주 DC3000을 게놈 라이브러리의 공급원으로서 사용하였고, 이는 메사추세츠 종합 병원 (Massachusetts General Hospital)의 프레드릭 오스벨 (Frederick Ausubel) 박사에 의해 기증받았다. 피. 시링가에를 50 μg/mL의 리팜피신이 함유된 LB (루리아-베르타니 (Luria-Bertani)) 배지에서 30℃에서 성장시켰다. 슈도모나스 푸티다 KT2440 (ATCC 47054)은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) (ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 입수하였고, LB 배지에서 30℃에서 성장시켰다. 이. 콜라이 균주는 2YT 배지 (트립톤 16 g, 효모 추출물 10 g, 및 리터 당 염화나트륨 10 g)에서 37℃에서 성장시켰다. 필요에 따라, 암피실린 및 카나마이신을 각각 100 및 25 μg/mL로 배지에 첨가하였다. 에셰리키아 콜라이 DH10B (F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu) 7697 galU galK λ- rpsL nupG)를 게놈 라이브러리 및 스크리닝된 유전자의 서브클로닝에 대해 숙주 균주로서 사용하였다 (인비트로젠 코포레이션, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재). 이. 콜라이 MG1655 ΔuxaC를 위스콘신-매디슨 대학교의 이. 콜라이 게놈 프로젝트 (E. coli Genome Project)의 에프. 알. 블라트너 (F. R. Blattner) 박사로부터 제공받았다. M9 최소 한천에 대해, 22 mM 글루코스, 글루쿠로네이트 또는 글루카레이트를 탄소 공급원으로서 사용하였다. 플라스미드 벡터 pTrc99A 및 pTrc99SE를 게놈 라이브러리의 구축에 대해 사용하고, 각각 후보 유전자에 대한 발현 벡터로서 사용하였다 (표 4). 플라스미드 pTrc99SE는 한국의 경상 대학교의 김선원 (Seon-Won Kim) 교수에 의해 기증받았다. pBluescript (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 일반적 클로닝 벡터로서 사용하였다.
피. 시링가에 게놈 라이브러리의 게놈 DNA 제조, 구축 및 스크리닝
게놈 DNA 제조 및 일반적 클로닝 절차를 문헌 [Sambrook et al. (35)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 에이. 투메파시엔스 균주 C58의 게놈 DNA는 ATCC로부터 입수하였다 (ATCC Number 33970D). 제한 효소 및 T4 리가제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs) (미국 메사추세츠주 베벌리 소재)로부터 입수하였다. 피. 시링가에 게놈 DNA를 BfuCI를 사용하여 부분 소화시킨 다음 0.8％ 아가로스 겔 상에 로딩하였다. 2-6 Kb 단편을 겔로부터 정제한 다음, 탈인산화된 BamHI 말단을 갖는 pTrc99A에 라이게이션시켰다. 4℃에서 2일 동안 라이게이션시킨 후, 반응 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 DH10B를 형질전환시켰다. 성공적인 형질전환주 클론을 한천 플레이트로부터 수집하여 모은 다음 -80℃에 보관하였다. 콜로니 풀로부터 단리된 플라스미드 풀을 사용하여 이. 콜라이 MG1655 ΔuxaC를 형질전환시켜 Udh 활성에 대해 스크리닝하였다. 형질전환된 균주를 22 mM 글루쿠로네이트를 함유한 M9 최소 한천 플레이트에서 4일 동안 30℃에서 배양하였다. 플라스미드를 정제하고 서열분석하여 플레이트로부터 생존 클론을 스크리닝하였다. 서열분석 결과를 젠뱅크, 수탁 번호 NC_004578 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 보고된 바와 같은 피. 시링가에 pv. 토마토 균주 DC3000의 게놈 서열과 비교하였다.
udh 유전자를 함유하는 발현 플라스미드 벡터의 구축
PCR 증폭은 제조업자에 의해 기재된 바와 같이 Pfu 터보 에이디 (Turbo AD) (스트라타젠 (Stratagene), 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 수행하였다. iolE, iolB 및 PSPTO_1053의 3 개의 후보 유전자를 표 4에 열거된 바와 같은 프라이머를 사용하여 게놈 DNA로부터 각각 증폭시켰다. PCR 생성물을 EcoRV-소화된 pBluescriptII에 둔단 라이게이션시켜 pBiolE, pBiolB, pBiolEB 및 pB1053을 야기하였으며, 이들을 각각 서열분석하여 그의 본질을 확인하였다. iolE, iolB 및 iolEB를 각각 EcoRI 및 SalI로의 소화에 의해 절단한 다음, 상기 효소에 의해 소화된 pTrc99A에 라이게이션시켜 각각 pTiolE, pTiolB 및 pTiolEB를 구축하였다. pB1053으로부터의 PSPTO_1053은 NcoI 및 SacI로의 소화에 의해 절단한 다음, 상기 효소에 의해 소화된 pTrc99A에 라이게이션시켜 pT1053을 생성하였다.
에이. 투메파시엔스, 피. 푸티다 및 피. 시링가에의 게놈 DNA로부터의 추정 udh 유전자를 각각 프라이머 쌍 ATudh2-F/ATudh-R, PPudh-F/PPudh-R 및 PSudh-F/1053-R을 사용하여 증폭시켰다 (표 4). PCR 생성물을 EcoRV로 소화된 pBluescriptII에 둔단 라이게이션시켜 플라스미드 pBATudh2, pBPPudh 및 pBPSudh를 생성하였다. 플라스미드 pTATudh2, pTPPudh 및 pTPSudh를 구축하기 위해, 상응하는 유전자를 각각 pBATudh2, pBPPudh 및 pBPSudh로부터 EcoRI 및 SacI로 절단하고, pTrc99SE의 동일한 부위 내에 삽입하였다.
단백질 정제 및 역학 파라미터의 측정
에이. 투메파시엔스, 피. 푸티다 및 피. 시링가에의 게놈 DNA로부터의 udh 유전자를 표 4에 열거된 바와 같이 프라이머 ATuEQ-F/R, PPuEQ-F/R 및 PSuEQ-F/R을 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 SacI 및 HindIII을 사용하여 소화시키고, 6X His-Tag를 함유한 pET21b의 동일 부위로 삽입하여 각각 pETATu, pETPPu 및 pETPSu를 구축하였다 (표 4). 이들 플라스미드를 사용하여 이. 콜라이 BL21 (DE3)을 형질전환시켜 단백질 발현에 사용하였다. 상기 재조합 이. 콜라이 BL21 균주를 IPTG 유도 후 30℃, 250 rpm에서 6시간 동안 배양하였다. 제조업자 (인비트로젠 코포레이션 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재))에 의해 기재된 바와 같이 프로본드(ProBond)TM 정제 시스템을 사용하여 단백질 정제를 수행하였다. SDS-PAGE (나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 문헌 [Sambrook et. al.] (35)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 정제된 단백질의 기질에 대한 효소 활성을 340 nm 및 실온에서 최초 NADH 세대를 모니터링하여 측정하였다. 글루쿠로네이트 및 갈락투로네이트에 대한 역학 분석은 100 mM 트리스-HCl, pH 8.0 중 0 내지 10 mM 글루쿠로네이트 또는 갈락투로네이트 및 1.2 mM NAD+를 사용하여 수행되었다. NAD+에 대한 역학 분석은 100 mM 트리스-HCl, pH 8.0 중 0 내지 2 mM NAD+ 및 10 mM 글루쿠로네이트를 사용하여 수행되었다. 일련의 효소적 검정을 수행하여 출발 기질 농도의 함수로서 최초 활성을 평가하였다. 이들 데이타를 이용하여 비선형 최소 자승 회귀법에 의해 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 역학 모델의 파라미터인 kcat 및 Km에 피팅하였다. 내재 매트랩(Matlab)® 함수 nlinfit를 사용하여 이행된 가우스-뉴턴(Gauss-Newton) 방법을 통해 비선형 최소 자승 회귀 분석을 수행하였다.
Udh에 의해 글루쿠로네이트로부터 생성된 글루카레이트의 측정을 위한 LC-MS 및 CD 분석
Udh에 의해 글루쿠로네이트로부터 글루카레이트를 생성하기 위한 반응 혼합물은 20 mM 글루쿠로네이트, 21.6 mM NAD+, 40 mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 8.0으로 이루어져 있었고, 박테리아 용해물은 상기 기재된 바와 같이 제조되었다. 상기 반응 혼합물에 조질의 용해물 또는 정제된 단백질을 첨가하여 효소 반응을 수행하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션한 후, 1 M 수산화나트륨을 첨가하여 중지시켰다. 글루카레이트의 동일면의 인접한 시스-히드록실 기와 결합할 수 있는 보론산 친화성 겔 (어피(Affi)-겔 보로네이트 겔, 바이오-래드 래보레이토리즈(Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재))로 패킹된 컬럼을 사용하여 글루카레이트를 반응 혼합물로부터 분리하였다 (29). 글루쿠로네이트는 그의 트랜스-디올 기로 인해 겔에 결합할 수 없다. 어피-겔 컬럼을 반응 혼합물로 로딩한 후, 상기 컬럼을 80 mM 칼륨 포스페이트-20 mM 붕산 완충액 (pH 7.0)으로 세척하고, 이어서 0.1 M HCl을 첨가하여 글루카레이트를 용리하였다. 5 M NaOH를 첨가하여 용리액을 중화시킨 후, 아미넥스(Aminex) HPX-87H 컬럼 (300×7.8 mm, 바이오-래드 래보레이토리즈 (미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)) 및 전자 분무 이온화 검출기가 장착된 애질런트 1100 시리즈 LC/MSD (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies, 미국 소재))로 분석하였다. 질량 스펙트럼을 양이온 및 음이온 검출 모드 둘 다에서 수득하였다. 도 8에 나타낸 스펙트럼은 음이온 검출 모드로부터 수득한 것이다. 0.1％ (v/v) 트리플루오로아세트산, pH 2.0을 이동상으로서 실온에서 0.5 mL/분의 유속으로 사용하였다.
글루쿠로네이트로부터 형성된 글루카레이트의 입체화학을 그의 원편광 이색성 (CD) 스펙트럼과 인증된 글루카레이트 표준 스펙트럼을 비교하여 확인하였다. CD는 아비브(Aviv) 모델 202 CD 분광기 (아비브 바이오메디칼(Aviv Biomedical, 미국 뉴저지주 레이크우드 소재)) 상에서 수행하였다. 반응 혼합물은 20 mM 글루쿠론산, 7 mM NAD+, 100 mM 칼륨 포스페이트 완충액 (pH 8.0)을 함유하였고, 정제된 효소는 상기 기재된 바와 같이 제조되었다. 글루카레이트를 상기 기재된 보론산 친화성 겔을 사용하여 글루쿠로네이트로부터 분리하였다.
서열 식별 및 정렬 분석을 포함한 컴퓨터 분석
BiocycTM (http://biocyc.org/)를 이용하여 관련 대사경로 및 대사물질을 식별하였다. 피. 시링가에, 피. 푸티다 및 에이. 투메파시엔스에 대한 DNA 서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 각각 수탁 번호 NC_004578, NC_002947 및 NC_003063으로 얻었다. 상동성 및 보존된 도메인 조사를 NCBI의 BLAST 알고리즘을 사용하여 수행하였다. 서열 관리 및 정렬은 벡터 NTI 소프트웨어 (인비트로젠 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재))를 사용하여 수행하였다. 정렬 및 계통발생학적 분석은 벡터 NTI의 AlignX 모듈을 사용하여 수행하였다.
udh 서열에 대한 젠뱅크 수탁 번호
피. 시링가에로부터의 udh 유전자 서열을 젠뱅크, 수탁 번호 EU377538 (핵산 서열은 서열 1이고; 아미노산 서열은 서열 2임)로 기탁하였다. 에이. 투메파시엔스 및 피. 푸티다로부터의 상응하는 유전자를 각각 수탁 번호 BK006462 (DNA: 서열 23; 단백질: 서열 24) 및 BK006380 (DNA: 서열 25; 단백질: 서열 26)으로 기탁하였다.
Udh 활성의 효소적 분석
효소적 분석용 박테리아 용해물을 동결-해동 방법에 의해 제조하였다. udh 유전자를 갖는 이. 콜라이 균주를 0.1 mM IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드)를 함유한 LB 배지에서 밤새 성장시켰다. 펠렛을 1 mg/mL 리소자임 용액에 재현탁시키고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 상기 현탁액을 액체 질소에서 동결시킨 후, 37℃의 수조에서 해동하였다. 상기 단계를 5회 반복하였다. 세포 용해물을 4℃에서 15분 동안 14,000 rpm에서 원심분리하고, 상등액을 효소적 분석에 사용하였다. 글루쿠로네이트에 대한 Udh 활성을 340 nm에서 NADH (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 환원됨) 세대를 모니터링하여 측정하였다 (38). 상기 반응 혼합물은 2.5 mM 글루쿠로네이트, 0.9 mM NAD+ (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드) 및 100 mM 나트륨 포스페이트 완충액으로 이루어져 있었다. 실온에서 상기 반응 혼합물에 용해물을 첨가하여 반응을 개시하고, 모니터링하였다. Udh 활성에 대한 최적 pH를 측정하기 위해서, HCl 또는 NaOH 용액을 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 6.5 내지 9.9로 조정하였다. 브래드포드(Bradford) 방법 [Bradford (1976) Anal Biochem 72:248-54]을 이용하여 총 단백질 농도를 측정하였다. 비(比)활성을 총 단백질의 밀리그램 당 단위 (1U = 생성된 1 μmol NADH/분)로 나타내었다. 화학 물질은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 구입하였다.
결과
슈도모나스 시링가에로부터의 udh 유전자의 클로닝
피. 시링가에에서 Udh 활성에 상응하는 유전자를 식별하기 위해서 확립된 스크리닝은 이. 콜라이 MG1655의 돌연변이체 균주를 사용하였다. uxaC의 결실은, 글루쿠로네이트 상에서의 성장은 방해하는 반면에 단독 탄소 공급원으로서 글루카레이트 상에서의 성장 능력은 유지한다. Udh는 글루쿠로네이트의 글루카레이트로의 전환을 촉매하고 (3, 38), 피. 시링가에 게놈 라이브러리로부터의 udh 유전자를 갖는 이. 콜라이 MG1655ΔuxaC 클론은 단독 탄소 공급원으로서 글루쿠로네이트 상에서 성장시켜야 한다. 이. 콜라이 DH10B 및 pTrc99A를 각각 피. 시링가에 게놈 라이브러리의 최초 구축을 위한 숙주 균주 및 플라스미드 벡터로 사용하였다. 라이브러리 플라스미드 풀을 이. 콜라이 DH10B 클론 풀로부터 제조한 후, 이를 사용하여 ΔuxaC 균주를 형질전환시켰다. 형질전환된 ΔuxaC 클론을 글루쿠로네이트를 함유하는 M9 최소 한천 상에서 4일 동안 30℃에서 인큐베이션하였다.
10개의 한천 플레이트로부터, 28개의 클론을 추가 스크리닝을 위해 선택하였고, 이들 각각은 2 내지 5 kb의 삽입 단편을 함유하였다. 이들로부터, 다양한 크기의 삽입물을 갖는 8개의 클론을 피. 시링가에 게놈 서열 (젠뱅크 수탁 번호 NC_004578)과의 비교를 위해 서열분석하였다. 이들 클론 중 6개는 iolE 또는 iolB, 또는 이들 둘 다를 포함한 반면, 1개의 클론은 정해지지 않은 PSPTO_1053 개방 판독 프레임을 함유하였다. 최종 클론은 iolEB 및 PSPTO_1053 영역의 키메라를 포함하였다. 라이브러리 단편으로부터의 개방 판독 프레임을 PCR-증폭시키고, 발현 벡터 pTrc99A 내로 삽입하여 플라스미드 pTiolE, pTiolB, pTiolEB 및 pT1053을 수득하였다. 이들 벡터를 함유한 클론을 사용하여 우로네이트 데히드로게나제 활성에 상응하는 유전자를 결정하였다. 이. 콜라이 MG1655, 즉 ΔuxaC 유도체, 및 후보 유전자로 형질전환된 4개의 ΔuxaC 클론을 단독 탄소 공급원으로서 글루쿠로네이트를 함유한 M9 최소 한천 상에서 인큐베이션하였다. 야생형인 ΔuxaC (pTiolB), ΔuxaC (pTiolEB) 및 ΔuxaC (pT1053) 균주는 M9-글루쿠로네이트 한천 상에서 성장시킨 반면, ΔuxaC (pTrc99A) 및 ΔuxaC (pTiolE) 균주는 그렇게 하지 않았다. 이에 따라, iolB 및 PSPTO_1053은 단독 탄소 공급원으로서 글루쿠로네이트 상에서의 성장을 초래하였고, 이는 이들을 후보 udh 유전자로서 식별하였다.
2개의 후보 유전자 사이의 추가 구별을 위해, 플라스미드 pTiolB 및 pT1053을 사용하여 이. 콜라이 DH10B를 형질전환시켜 재조합 유전자를 발현하였다. 생성된 클론을 0.1 mM IPTG를 갖는 LB 배지에서 성장시켰다. 이들 두 클론으로부터의 조질의 용해물 중 Udh 활성의 분석은, pT1053을 갖는 균주는 Udh 활성을 나타내지만 pTiolB는 그렇지 않음을 제시하였다 (도 6). 상기 검정은 기질로서 글루쿠로네이트를 사용하였고, 340 nm에서 NADH의 생성을 모니터링하였다. 그 결과, 828 bp PSPTO_1053 유전자가 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 것으로 추정되었다. 이 후, 상기 유전자를 udh로 지칭하고, 젠뱅크 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)에 수탁 번호 EU377538 (핵산 서열은 서열 1이고; 아미노산 서열은 서열 2임)로 등록하였다.
피. 푸티다 및 에이. 투메파시엔스로부터의 udh 유전자의 클로닝 및 식별
피. 시링가에로부터의 udh의 번역된 단백질 서열을 NCBI로부터의 BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)를 이용해 분석하여 추정 동족체를 식별하였다. 에이. 투메파시엔스의 Udh 활성은 이전에 연구된 바 있다 (5, 6, 43). 에이. 투메파시엔스의 개방 판독 프레임 Atu3143의 번역물이 47.8％의 가장 높은 서열 동일성을 가졌고, 상동성 Udh에 대한 후보로 고려되었다. 또다른 후보 개방 판독 프레임인 슈도모나스 푸티다 KT2440의 PP1171이 또한 75.6％의 서열 동일성으로 피. 시링가에 Udh와 매우 유사한 것으로 밝혀졌다. Atu3143 및 PP1171을 그의 각각의 게놈으로부터 PCR-증폭시키고, 피. 시링가에로부터의 udh와 함께 플라스미드 벡터 pTrc99SE로 통합하여, 발현된 재조합 단백질의 상대 활성 비교용으로 각각 플라스미드 pTATudh2, pTPPudh 및 pTPSudh를 생성하였다. 형질전환된 DH10B 클론을 0.1 mM IPTG의 존재 또는 부재하에 LB에서 배양한 후, 조질의 용해물을 제조하여 효소적 분석을 수행하였다 (도 7). 상기 검정으로 에이. 투메파시엔스 및 피. 푸티다의 재조합 단백질에 대한 기질로서 글루쿠로네이트의 존재하에 NAD+-소모 활성을 확인하였고, 이는 이전에 피. 시링가에를 사용하여 얻어진 것과 유사하였다. 에이. 투메파시엔스 및 피. 푸티다로부터의 2종의 udh 유전자를 또한 젠뱅크에 각각 수탁 번호 BK006462 (DNA: 서열 23; 단백질: 서열 24) 및 BK006380 (DNA: 서열 25; 단백질: 서열 26)으로 기탁하였다.
재조합 Udh의 정제 및 특성분석, 및 반응 생성물의 분석
피. 시링가에 udh 유전자를 함유한 조질의 이. 콜라이 용해물을 사용하는 효소 반응으로 기질로서 글루쿠로네이트를 사용하는 활성의 존재를 확인하였고, 반응 속도는 적은 기질 로딩의 경우 글루쿠로네이트 농도에 비례하였다 (데이타는 제시되지 않음). 상기 활성은 또한 보조인자로서 NAD+를 사용하였지만, NADP+는 사용하지 않았다 (데이타는 제시되지 않음). 이러한 결과는 상기 기질이 산화되었음을 나타내었다. 글루쿠로네이트의 구조 조사는 2가지 가능한 산화 지점을 제시한다: 알콜의 케톤으로의 전환 또는 알데히드의 카르복실산으로의 전환 (후자의 반응은 글루카레이트를 생성함). 이들 두 생성물의 차이는 질량 스펙트럼으로부터 명백해야 하며, 전자는 기질에 대해 -2의 질량 차이를 생성하고, 후자는 +16의 질량 차이를 생성하였다. 효소 반응의 생성물이 글루카레이트임을 확인하기 위해서, 샘플을 LC-MS로 분석하였다. 효소 반응으로부터 분리된 용리액 및 글루카레이트 표준물의 스펙트럼은 일치하고, 이는 글루카레이트가 Udh 반응의 생성물임을 제시한다 (도 8).
3종의 udh 유전자 각각을 6X-His tag와 함께 이. 콜라이에서 발현시키고, 정제하여 상응하는 효소의 역학 파라미터를 측정하였다. 정제된 효소를 SDS-PAGE로 분석하여 단량체의 분자량을 확인하고, 순도를 평가하였다 (도 9). 피. 시링가에 및 피. 푸티다의 Udh의 분자량은 둘 다 대략 30 KDa이었고, 이는 클로닝된 유전자 및 이전 보고서 (38)의 번역물 모두와 일치하였다. 에이. 투메파시엔스 Udh는 약간 더 큰 32 KDa이다.
정제된 제제를 사용하여 각 효소에 대해 역학 파라미터인 kcat 및 Km을 측정하였다. 글루쿠로네이트 및 갈락투로네이트 둘 다를 기질로서 사용하였고, 또한 NAD+ 보조인자 농도를 다양하게 하여 상응하는 Km을 측정하였다 (표 5). 보조인자 농도를 다양하게 하여 얻어진 kcat의 측정값은 기질로서 글루쿠로네이트를 사용하여 얻어진 값의 20％ 이내였다 (데이타는 제시되지 않음). 모든 사례에서, 갈락투로네이트에 대한 kcat보다 글루쿠로네이트에 대한 kcat가 높았다. 가장 높은 속도 상수는 기질로서 글루쿠로네이트를 사용한 에이. 투메파시엔스 효소의 경우로 나타났고 (kcat = 1.9 x 102 s-1), 이는 슈도모나스 효소에 대한 속도보다 2배 이상 높았다. 그러나, 미카엘리스 (친화성) 상수는 모든 사례에서 갈락투로네이트의 경우에 좀 더 낮았고, 기질로서 갈락투로네이트를 사용한 피. 시링가에 효소가 가장 낮은 Km, 0.04 mM을 갖는 것으로 밝혀졌다. 1차 속도 상수, kcat/Km은 기질이 갈락투로네이트인 경우에 가장 높고, 피. 시링가에에서 관찰된 글루쿠로네이트 및 갈락투로네이트 사이에 가장 큰 차이가 있다.
또한, pH 및 온도 변화에 대한 효소 활성의 반응을 조사하였다 (도 10). 에이. 투메파시엔스 및 피. 시링가에 효소 둘 다에 대해 8.0의 최적 pH가 관찰되었지만, 피. 시링가에 Udh의 경우 활성은 pH 약 7 내지 pH 약 8 사이에서 비교적 변화가 없었다 (도 10a). 이러한 pH 거동은 피. 시링가에 Udh에 대한 이전 보고서 (3)와 일치한다. 피. 푸티다 효소는 pH 약 7.0에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 일반적으로, 효소 활성은 pH 약 5 내지 pH 약 8 사이에서 대략 10％ 정도 변하였고, 3종의 효소 모두에서 8 초과의 pH 값에 대해 관찰된 활성은 유의하게 감소하였다.
온도의 영향력을 2가지 방식으로 평가하였다. 먼저, 효소 제제를 30분 동안 다양한 온도에 노출시킨 후, 표준 조건하에서 효소 검정을 수행하여 열적 안정성을 조사하였다. 에이. 투메파시엔스 Udh는 슈도모나스 효소의 열적 안정성보다 유의하게 높은 열적 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 10b). 활성은 에이. 투메파시엔스 제제를 37℃에 노출시킨 후 최대치의 거의 80％가 유지된 반면, 다른 효소 둘 다의 경우 상응하는 활성은 최대치의 20％ 미만이었다. 두 슈도모나스 효소에 대한 안정성 프로파일은 서로 유사하였다. 마지막으로, 효소 활성을 승온하에 수행된 검정에 대해 평가하였다. 이들 활성은 4 내지 42℃ 사이의 승온으로 활성을 증가시키는 일반적인 경향에 따르며, 이는 온도에 대한 촉매 속도 상수의 아레니우스(Arrhenius)-유형 의존성과 일치한다 (도 10c).
이들 반응의 생성물의 최종 특성분석을 위해, 보론산 친화성 겔을 사용하여, 정제된 단백질을 사용하는 시험관내 반응에서 전체 3종의 효소로부터 생성된 추정 클루카레이트를 단리하였다. 이어서, 3종의 생성물의 샘플을 원편광 이색성 (CD) 분석에 적용하여 화합물의 입체화학을 조사하였다. 3개의 스펙트럼은 모두 글루카레이트 표준과 일치하였고, 이로써 생성물은 글루카르산과 동일하고, 3종의 유전자는 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자와 동일함이 확인되었다 (데이타는 제시되지 않음).
논의
우로네이트 데히드로게나제 (Udh)는 박테리아에서 알도헥수로네이트 이화작용을 위한 산화 경로의 제1 단계를 촉매한다. 박테리아 중 피. 시링가에 및 에이. 투메파시엔스에서 유일하게 제한된 Udh의 연구가 보고된 바 있다. 또한, Udh는 진핵생물에서 보다 드물게 연구되어 왔다. Udh 서열은 양조용 포도 비티스 비니페라(Vitis vinifera)에서 보고되었고, 갈락투로네이트 리덕타제 (EC 1.1.1.203; BRENDA 수탁 번호 A1Y2Z0, 젠뱅크 수탁 번호 DQ843600)로서 식별되었다. 본 발명자들은 이. 콜라이에서의 발현에 대해 최적화된 코돈 사용빈도 (DNA 2.0, 미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)를 이용하여 상기 유전자를 합성하고, 재조합 단백질을 발현하였다. 그러나, 보조인자로서 NAD+ 또는 NADP+를 사용하는 경우 Udh와 관련된 활성은 관찰되지 않았다 (데이타는 제시되지 않음). 현재 작업에서 식별된 피. 시링가에 Udh를 이용한 상기 서열의 정렬은 이들 사이에 단지 10％ 동일성을 나타낸다. 본 발명자들은 브이. 비니페라 효소가 이. 콜라이에서 기능적으로 발현될 수 없다는 가능성을 배제할 수 없지만, 상기 정렬에 기초하여, 본 발명자들은 브이. 비니페라로부터의 보고된 서열이 우로네이트 데히드로게나제가 아니거나, 또는 상기 효소의 상당히 다른 버전인 것으로 결론내린다.
피. 시링가에의 샷건 라이브러리를 이. 콜라이 ΔuxaC에 도입하여 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 udh 유전자를 스크리닝하고, PSPTO_1053 및 iolB 유전자를 가능한 Udh 후보로서 동정 및 스크리닝하였다. 효소적 분석에 의해, 결국 PSPTO_1053이 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 udh 유전자인 것으로 동정되었다. 글루쿠로네이트 이화작용이 폐지된 이. 콜라이의 uxaC 결실 돌연변이체에서, 글루쿠로네이트는 우로네이트 데히드로게나제에 의해 글루카레이트로 전환된 후, 에너지 공급원으로 사용될 수 있는 피루베이트 또는 2-포스포글리세레이트로 분해되었다 (27, 33). 이. 콜라이 ΔuxaC에서, iolB 유전자의 도입은 글루쿠로네이트를 단독 탄소 공급원으로 함유하는 M9 한천 위에서의 성장도 허용하지만, 상기 유전자는 Udh 활성은 보유하지 않았다. IolB는 이전에 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis) 및 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei)에서의 미오-이노시톨 이화작용과 관련된 단백질로서 보고된 바 있었다 (41, 42). IolB는 바실루스 수브틸리스에서의 미오-이노시톨 분해에 사용되는 iol 오페론에 속하며, 5-데옥시-글루쿠로네이트를 2-데옥시-5-케토-D-글루코네이트로 전환시킨다 (42). 피. 시링가에의 IolB는 비. 수브틸리스의 것과 약 48％의 상동성을 가진다. 본 발명의 스크리닝에서, IolB를 갖는 세포에서의 정확한 글루쿠로네이트 소비 메카니즘은 불명확하다. 아마도, 상기 단백질은 글루쿠로네이트를 이. 콜라이 대사와 양립가능한 유사 화합물로 전환시킬 수 있는 것으로 생각된다.
피. 시링가에, 피. 푸티다 및 에이. 투메파시엔스의 게놈에서의 udh 유전자 좌위를 도 11에 나타냈다. 피. 시링가에 및 피. 푸티다의 udh 좌위는 각각 대략 1,150 및 1,346 kbp인 반면, 에이. 투메파시엔스의 udh 좌위는 대략 150 kbp이다. 에이. 투메파시엔스에서, udh에 인접한 유전자 Atu3140, 3141, 3142 및 3145는 각각 kdgD, kduD, kduI 및 kdgF이며, 펙틴 분해와 관련된다. 펙틴은 식물 세포벽으로부터 유래된, α-1,4-결합 D-갈락투로네이트 잔기로 이루어진 헤테로폴리사카라이드이다. 박테리아에 의한 펙틴 분해 및 섭취는 위구비외-코트-파타(Hugouvieux-Cotte-Pattat) 등에 의해 에르위니아 크리산테미 및 에르위니아 카로토보라를 비롯한 식물 병원성 펙토박테리아에서 잘 조사되어 있다 (12-14). 이. 크리산테미에서, 펙틴은 kdu 또는 kdg 오페론의 유전자에 의해 분해되어 에너지 공급원으로 사용된다. 피. 시링가에 및 피. 푸티다에서, udh에 인접한 유전자는 TRAP (3부분 ATP-비의존성 원형질막 주위) 디카르복실레이트 수송체 및 포린으로서 동정된다. 이들 유전자 중에서, 포린 단백질 (PSPTO_1054, PP_1173)이 펙틴 분해로부터 유래된 올리고갈락투로네이트의 섭취와 관련된 것으로 알려져 있다 (34). 따라서, 식물 병원성 박테리아에서의 우로네이트 데히드로게나제는, 추후에 헥사레이트로 전환되는, 숙주 식물 세포벽 펙틴으로부터 유래된 헥수로네이트의 이용 시에 기능을 할 수도 있었다.
피. 시링가에, 피. 푸티다 및 에이. 투메파시엔스로부터의 3종의 우로네이트 데히드로게나제의 정렬 및 이들의 상동체에 대한 계통발생학적 분석을 수행하였다 (도 12). 상기 효소의 서열은 보존 도메인과 관련된 2개의 주요 서열 모티프 YxxxK 및 GxxGxxG를 나타낸다 (도 12a). YxxxK 모티프는 피. 시링가에 Udh의 Tyr145와 Lys149 사이에 위치하며, 3-알파/베타 히드록시스테로이드 데히드로게나제 도메인의 주요 모티프이다 (11, 37). 피. 시링가에 Udh의 Gly18-24에 위치한 GxxGxxG 모티프는, NAD+ 결합 도메인에서 발견되었던 로스만 폴드(Rossman fold) GxxxG 또는 Gx1-2GxxG와 유사하다 (20). 계통발생학적 분석에서, 우로네이트 데히드로게나제는 아키아, 및 프로테오박테리아, 시아노박테리아, 녹색 비유황 박테리아 및 그람-양성 박테리아를 비롯한 박테리아에서의 NAD-의존성 에피머라제/데히드라타제, 뉴클레오티드 당 에피머라제, 3-베타 히드록시스테로이드 데히드로게나제/이소머라제 및 단쇄 데히드로게나제/리덕타제와 상동성을 나타낼 뿐만 아니라, 진균, 식물 및 인간을 비롯한 일부 진핵생물에서의 뉴클레오티드 당 에피머라제와도 상동성을 나타낸다 (도 12b). 본 연구에서 스크리닝된 3종의 우로네이트 데히드로게나제는 알파 및 감마-프로테오박테리아에 존재하고, 이들의 상동성은 아키아인 할로루브룸 라쿠스프로푼디(Halorubrum lacusprofundi) 및 나트로노모나스 파라오니스(Natronomonas pharaonis), 그리고 진균인 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)에 상대적으로 근접한다.
본 발명자들은 글루쿠로네이트를 글루카레이트로 효과적으로 전환시킬 수 있는, 에이. 투메파시엔스, 피. 푸티다 및 피. 시링가에로부터의 3종의 우로네이트 데히드로게나제를 스크리닝 및 서열분석하였다. 상기 효소는 몇몇 유형의 박테리아에서 우론산의 이화작용에 중요하지만, 알다르산, 예컨대 글루카르산의 생성을 위한 생합성 경로의 발견에도 유용할 수 있다. 글루카레이트는 뉴클레오티드 당 대사의 최종 생성물이며, 포유동물 및 식물에서 천연적으로 발견된다 (21, 39). 글루카레이트 및 그의 유도체, 예컨대 글루카로-1,4-락톤은 이전에 해독 및 천연 항암 화합물 (8, 21, 36, 39), 뿐만 아니라 중합체 합성을 위한 빌딩 블록 (16)으로서 연구된 바 있었다. 이것은 또한 생물질로부터 생성되는 잠재적인 "최고 부가가치" 화학물질로 지정된 바 있었다 (40). 현재, 글루카레이트는 질산 또는 산화질소와 같은 강산화제를 사용한 화학적 산화에 의해 글루코스로부터 합성된다 (25). 본 발명자들은 본 연구에서 동정된 피. 시링가에의 udh를 사용하여, 이. 콜라이에서의 합성 경로로부터 글루카르산을 성공적으로 생성하였다 (26).
실시예 2에 대한 참고문헌
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당업자라면 통상의 실험 그 이상을 사용하지 않고도, 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물도 하기 특허청구범위에 포함되는 것으로 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌은 그 전체 내용이 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Massachusetts Institute of Technology Moon, Tae S Yoon, Sang-Hwal Prather, Kristala L J <120> Cellular Production of Glucaric Acid <130> M0605.70158WO00 <140> not yet assigned <141> 2009-04-03 <150> 61/042,502 <151> 2008-04-04 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 828 <212> DNA <213> Pseudomonas syringae <400> 1 atggcatcgg ctcataccac tcaaactccc ttcaatcgcc tcctgctgac cggtgctgca 60 ggcggcctgg gcaaggtatt gcgcgagaca ttgcgccctt actcacacat tctgcgactc 120 tctgatatcg ccgagatggc gcccgcggtc ggcgaccatg aagaagtgca ggtctgcgat 180 ctggcggaca aagacgccgt acaccgtctg gtcgaaggcg tggacgccat tctgcatttt 240 ggcggcgtgt cggtcgaacg gcctttcgag gaaatcctcg gcgctaatat ctgcggcgtg 300 ttccatatct acgaggccgc ccgccggcat ggcgtgaaac gcgtgatctt cgccagctcc 360 aaccatgtga tcggtttcta caagcagaac gaaaccatcg acgcgcactc cccgcgccgc 420 ccggacagct actatggttt gtccaagtcc tacggcgaag acatggccag cttctacttt 480 gatcgttacg gcatcgaaac cgtcagcatc cgcatcggct catcgttccc tgaaccacag 540 aaccgcagaa tgatgagcac ctggctgagc ttcgatgacc tgacccggtt gctcgagcgc 600 gccctgtaca cgccggacgt cggccacacc gtggtgtatg gcgtgtcgga caacaagacc 660 gtgtggtggg acaaccgctt tgccagcaaa ctggactacg cccctaaaga cagctcggag 720 gtcttccgcg ccaaggtcga cgcccagcca atgccggcgg acgacgaccc ggcaatggtt 780 taccagggcg gtgcgtttgt agcgtccgga ccgttcggcg ataaataa 828 <210> 2 <211> 275 <212> PRT <213> Pseudomonas syringae <400> 2 Met Ala Ser Ala His Thr Thr Gln Thr Pro Phe Asn Arg Leu Leu Leu 1 5 10 15 Thr Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Lys Val Leu Arg Glu Thr Leu Arg 20 25 30 Pro Tyr Ser His Ile Leu Arg Leu Ser Asp Ile Ala Glu Met Ala Pro 35 40 45 Ala Val Gly Asp His Glu Glu Val Gln Val Cys Asp Leu Ala Asp Lys 50 55 60 Asp Ala Val His Arg Leu Val Glu Gly Val Asp Ala Ile Leu His Phe 65 70 75 80 Gly Gly Val Ser Val Glu Arg Pro Phe Glu Glu Ile Leu Gly Ala Asn 85 90 95 Ile Cys Gly Val Phe His Ile Tyr Glu Ala Ala Arg Arg His Gly Val 100 105 110 Lys Arg Val Ile Phe Ala Ser Ser Asn His Val Ile Gly Phe Tyr Lys 115 120 125 Gln Asn Glu Thr Ile Asp Ala His Ser Pro Arg Arg Pro Asp Ser Tyr 130 135 140 Tyr Gly Leu Ser Lys Ser Tyr Gly Glu Asp Met Ala Ser Phe Tyr Phe 145 150 155 160 Asp Arg Tyr Gly Ile Glu Thr Val Ser Ile Arg Ile Gly Ser Ser Phe 165 170 175 Pro Glu Pro Gln Asn Arg Arg Met Met Ser Thr Trp Leu Ser Phe Asp 180 185 190 Asp Leu Thr Arg Leu Leu Glu Arg Ala Leu Tyr Thr Pro Asp Val Gly 195 200 205 His Thr Val Val Tyr Gly Val Ser Asp Asn Lys Thr Val Trp Trp Asp 210 215 220 Asn Arg Phe Ala Ser Lys Leu Asp Tyr Ala Pro Lys Asp Ser Ser Glu 225 230 235 240 Val Phe Arg Ala Lys Val Asp Ala Gln Pro Met Pro Ala Asp Asp Asp 245 250 255 Pro Ala Met Val Tyr Gln Gly Gly Ala Phe Val Ala Ser Gly Pro Phe 260 265 270 Gly Asp Lys 275 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 gaattcatga cagaagataa tattgctc 28 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 aagcttctac aacaatctct cttcg 25 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 aggaggtaat aaat 14 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 cgaattcagg aggtacaacc atgcctgttt cag 33 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 cgtcgactta tcgcgcatcg gccagcagtt g 31 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 8 cgaattcagg aggattgaat catgagtc 28 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 9 cgtcgactta aagatccagc agccagc 27 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 10 gccatggcat cggctcatac cac 23 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 cgagctctta tttatcgccg aacggtcc 28 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 12 ctagaattca tgaaacggct 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20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 ctgaagcttg ttgaacgggc cggccacggc g 31 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 21 tcagagctcg gcatcggctc ataccactca aactcc 36 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 ctgaagcttt ttatcgccga acggtccgga cgc 33 <210> 23 <211> 798 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 23 atgaaacggc ttcttgttac cggtgcggcg ggccagcttg gccgcgtcat gcgcgagcgt 60 ctcgcaccga tggcggagat actgcgcctt gccgatctct ccccgctcga cccggcaggg 120 ccgaacgaag aatgcgtgca atgcgacctt gccgatgcca atgccgtgaa tgccatggtc 180 gccggttgcg acggtattgt tcatctcggc ggcatctcgg tggagaagcc cttcgaacaa 240 atccttcagg gcaatatcat cgggctttat aatctctacg aggccgcccg cgcccatgga 300 cagccacgca tcgtctttgc cagctccaac cacacgatcg gctattatcc gcagaccgaa 360 cggctcggtc cggatgttcc ggcgcggccg gacggtcttt acggcgtctc caaatgtttc 420 ggcgaaaacc tcgcccgcat 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100 105 110 Ile Gly Tyr Tyr Pro Gln Thr Glu Arg Leu Gly Pro Asp Val Pro Ala 115 120 125 Arg Pro Asp Gly Leu Tyr Gly Val Ser Lys Cys Phe Gly Glu Asn Leu 130 135 140 Ala Arg Met Tyr Phe Asp Lys Phe Gly Gln Glu Thr Ala Leu Val Arg 145 150 155 160 Ile Gly Ser Cys Thr Pro Glu Pro Asn Asn Tyr Arg Met Leu Ser Thr 165 170 175 Trp Phe Ser His Asp Asp Phe Val Ser Leu Ile Glu Ala Val Phe Arg 180 185 190 Ala Pro Val Leu Gly Cys Pro Val Val Trp Gly Ala Ser Ala Asn Asp 195 200 205 Ala Gly Trp Trp Asp Asn Ser His Leu Gly Phe Leu Gly Trp Lys Pro 210 215 220 Lys Asp Asn Ala Glu Ala Phe Arg Arg His Ile Thr Glu Thr Thr Pro 225 230 235 240 Pro Pro Asp Pro Asn Asp Ala Leu Val Arg Phe Gln Gly Gly Thr Phe 245 250 255 Val Asp Asn Pro Ile Phe Lys Gln Ser 260 265 <210> 25 <211> 807 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 25 atgaccacta cccccttcaa tcgcctgctg ctcaccggag ccgcaggcgg cctgggcaag 60 gtccttcgcg aacgcctgaa aggctacgcc gaggtcctgc gcctgtctga catcagcccc 120 atggccccgg ccgcgggccc gcatgaagaa gtcattacct gtgacctggc cgacaaggct 180 gcggtgcata ccctggtcga gggcgtagac gccatcatcc actttggcgg ggtttctacc 240 gaacacgcct tcgaagagat tctcggcccc aatatctgcg gcgtgttcca cgtgtacgag 300 gcggcgcgca agcacggggt caagcgcatc atcttcgcca gctccaacca caccatcggt 360 ttctatcgcc aggatgagcg catcgacgct cacgcgccgc gccggcccga cagctattac 420 gggctgtcca agtgctacgg cgaagatgtg gccagcttct actttgaccg ctacggcatc 480 gagaccgtca gcattcgcat cggctcgtcg ttcccgcagc cacagaacct gcgcatgctc 540 tgcacctggc tcagttacga cgacctggtg cagttgatcg aacgcgggct gttcaccccc 600 ggggttggcc acaccatcgt ctacggcgcc tccgacaatc gcaccgtgtg gtgggacaac 660 cgccatgccg cgcacctggg ctatgtaccc aaggacagct ccgaaacctt ccgcgcagcc 720 gtggaggccc aaccggcacc cgccgccgat gacccgagca tggtctacca gggcggcgct 780 ttcgccgtgg ccggcccgtt caactga 807 <210> 26 <211> 268 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 26 Met Thr Thr Thr Pro Phe Asn Arg Leu Leu Leu Thr Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Leu Gly Lys Val Leu Arg Glu Arg Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Val 20 25 30 Leu Arg Leu Ser Asp Ile Ser Pro Met Ala Pro Ala Ala Gly Pro His 35 40 45 Glu Glu Val Ile Thr Cys Asp Leu Ala Asp Lys Ala Ala Val His Thr 50 55 60 Leu Val Glu Gly Val Asp Ala Ile Ile His Phe Gly Gly Val Ser Thr 65 70 75 80 Glu His Ala Phe Glu Glu Ile Leu Gly Pro Asn Ile Cys Gly Val Phe 85 90 95 His Val Tyr Glu Ala Ala Arg Lys His Gly Val Lys Arg Ile Ile Phe 100 105 110 Ala Ser Ser Asn His Thr Ile Gly Phe Tyr Arg Gln Asp Glu Arg Ile 115 120 125 Asp Ala His Ala Pro Arg Arg Pro Asp Ser Tyr Tyr Gly Leu Ser Lys 130 135 140 Cys Tyr Gly Glu Asp Val Ala Ser Phe Tyr Phe Asp Arg Tyr Gly Ile 145 150 155 160 Glu Thr Val Ser Ile Arg Ile Gly Ser Ser Phe Pro Gln Pro Gln Asn 165 170 175 Leu Arg Met Leu Cys Thr Trp Leu Ser Tyr Asp Asp Leu Val Gln Leu 180 185 190 Ile Glu Arg Gly Leu Phe Thr Pro Gly Val Gly His Thr Ile Val Tyr 195 200 205 Gly Ala Ser Asp Asn Arg Thr Val Trp Trp Asp Asn Arg His Ala Ala 210 215 220 His Leu Gly Tyr Val Pro Lys Asp Ser Ser Glu Thr Phe Arg Ala Ala 225 230 235 240 Val Glu Ala Gln Pro Ala Pro Ala Ala Asp Asp Pro Ser Met Val Tyr 245 250 255 Gln Gly Gly Ala Phe Ala Val Ala Gly Pro Phe Asn 260 265

Claims (75)

  1. 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 재조합적으로 발현하며, 미오-이노시톨 옥시게나제를 코딩하는 유전자를 재조합적으로 발현하는 세포.
  2. 제1항에 있어서, 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가 박테리아 유전자인 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미오-이노시톨 옥시게나제를 코딩하는 유전자가 포유동물 유전자인 세포.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자를 재조합적으로 발현하는 세포.
  5. 제4항에 있어서, 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자가 효모 유전자인 세포.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 원핵 세포인 세포.
  7. 제6항에 있어서, 원핵 세포가 박테리아 세포이고, 미오-이노시톨 옥시게나제 또는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자들이 박테리아에서의 발현을 위한 코돈 최적화에 의해 변형된 것인 세포.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 진핵 세포인 세포.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자들이 플라스미드 상에서 발현되거나 또는 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 세포.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 글루카르산의 생성이, 세포에서의 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 또는 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제 효소의 단백질 조작에 의해서 또는 세포에서 글루카르산 대사 경로의 성분을 돌연변이시킴으로써 증가되는 것인 세포.
  11. 제1항 또는 제2항의 세포를 배양하여 글루카르산을 생성하는 것을 포함하는, 글루카르산의 제조 방법.
  12. 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하는 유전자 변형 미생물.
  13. 우로네이트 데히드로게나제 및 미오-이노시톨 옥시게나제를 재조합적으로 발현하거나 또는 우로네이트 데히드로게나제, 미오-이노시톨 옥시게나제 및 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 재조합적으로 발현하도록 세포를 유전자 변형시키고, 상기 세포의 집단을 배양하고, 글루카르산을 생성하도록 유전자 변형된 세포 집단으로부터 글루카르산을 수집하는 것을 포함하는, 글루카르산의 제조 방법.
  14. (a) 서열 1, 서열 23 또는 서열 25를 포함하는 단리된 핵산 분자;
    (b) 서열 2, 서열 24 또는 서열 26의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자;
    (c) (a) 또는 (b)의 전장 서열의 역상보체인 단리된 핵산 분자; 및
    (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 대한 95％ 이상의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 단리된 핵산 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 핵산 분자.
  15. 전사 조절 요소에 작동가능하게 결합된 제14항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  16. 제14항의 핵산 분자에 의해 코딩되거나 또는 서열 2에 대한 95％ 이상의 아미노산 동일성을 포함하는, 단리된 우로네이트 데히드로게나제 폴리펩티드.
  17. 제15항의 재조합 발현 벡터를 포함하는 세포.
  18. 제2항에 있어서, 우로네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가 슈도모나스 시링가에 (Pseudomonas syringae) 유전자, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 유전자 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 유전자인 세포.
  19. 제3항에 있어서, 미오-이노시톨 옥시게나제를 코딩하는 유전자가 마우스 유전자인 세포.
  20. 제5항에 있어서, 미오-이노시톨 1-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자가 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) 유전자인 세포.
  21. 제7항에 있어서, 박테리아 세포가 이. 콜라이 (E. coli) 세포인 세포.
  22. 제8항에 있어서, 진핵 세포가 진균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포인 세포.
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