CN106148292B - 一种肌醇加氧酶突变体及其应用 - Google Patents

一种肌醇加氧酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肌醇加氧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过定点突变获得酶活提升的肌醇加氧酶突变体，并将其与醛酸脱氢酶(udh)在酵母中共表达，强化了葡萄糖二酸合成途径。经比较，重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115‑udh‑mioxK59V/R171S产量最高，摇瓶发酵培养时，在YPD‑MI培养基中，生产葡萄糖二酸1.20g/L。本发明采用代谢工程策略，改造微生物菌株来合成目的产物葡萄糖二酸，为生物法高效生产葡萄糖二酸奠定了一定基础。

Description

一种肌醇加氧酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种肌醇加氧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
葡萄糖二酸(Glucaric acid，Saccharic acid，GA)又名葡萄糖质酸，是葡萄糖的醛基及C-6上羟基均被氧化成羧酸而形成的糖酸，主要由葡萄糖氧化制得。葡萄糖二酸及其内酯在一些植物及哺乳动物中均有发现，特别是在一些十字花科蔬菜(如花椰菜、苜蓿芽等)、水果(樱桃、葡萄柚、柑橘等)中含量丰富。葡萄糖二酸作为一种重要的反应中间体，在生产聚合物材料、食品添加剂及医药临床等领域具有重要的应用价值，并曾被美国能源部选为“最具价值的生物炼制产品”之一。
目前葡萄糖二酸的制备主要通过化学氧化葡萄糖的方法，硝酸氧化法可以通过控制反应的过程，将葡萄糖氧化成葡萄糖二酸及一些小分子物质，达到反应的目的，但是，因产生大量有毒的气体或液体，对环境造成一定污染，因此该方法使用受到一定限制。2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基(TEMPO)氧化法因其反应条件温和、选择性高，但在反应过程中难以控制温度、pH等条件达到最佳，且催化剂十分昂贵。因此，此方法仍需要加以改进。
在生物法中，葡萄糖二酸与抗坏血酸是哺乳动物中葡萄糖醛酸代谢途径的终产物，然而，从葡萄糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反应。随着合成生物学的发展，微生物法发酵生产葡萄糖二酸也逐渐受到研究者的重视。Prather团队通过组合不同来源的途径酶，在大肠杆菌和酿酒酵母中成功构建了葡萄糖二酸合成途径。但葡萄糖二酸产量还有待提升。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种肌醇加氧酶(miox)突变体，所述肌醇加氧酶突变体是(a)或(b)或(c)：
(a)在SEQ ID NO.1所示序列基础上，第59位的赖氨酸突变为缬氨酸，或将171位的精氨酸突变为丝氨酸，或在将59位的赖氨酸突变为缬氨酸的同时，将171位的精氨酸突变为丝氨酸；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有肌醇加氧酶酶活性的由(a)衍生的蛋白质；
(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有肌醇加氧酶酶活性的蛋白质。
所得到的肌醇加氧酶突变体K59V、R171S、K59V/R171S氨基酸序列分别如SEQ IDNO.2-4所示。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种重组表达所述肌醇加氧酶(miox)突变体的重组酵母，是将编码肌醇加氧酶(miox)突变体与醛酸脱氢酶(udh)的基因通过融合，克隆表达至酵母菌株中，构建重组酵母。所得重组酵母能以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物合成葡萄糖二酸。
在本发明的一种实施方式中，所述醛酸脱氢酶基因udh来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。例如Gene ID:1045739所示的醛酸脱氢酶基因udh。所述的醛酸脱氢酶基因udh前有GAP启动子。
在本发明的一种实施方式中，编码肌醇加氧酶(miox)突变体与醛酸脱氢酶(udh)的基因在酵母中整合表达。
在本发明的一种实施方式中，所述酵母为以下任意一种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、毕赤酵母(Pichiapastoris)。
在本发明的一种实施方式中，醛酸脱氢酶基因udh是以GAP启动子启动。
在本发明的一种实施方式中，将GAP启动子、udh基因及miox突变基因按照顺序融合，并在融合片段上下游分别引入酶切位点SacI、NotI的融合片段，并连接到表达载体pPIC9K上，筛选获得正确的重组质粒，转化到宿主菌P.pastoris GS115中即得到重组酵母菌。
本发明的第三个目的是提供一种利用所述重组酵母菌生产葡萄糖二酸的方法，是以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物催化合成葡萄糖二酸。
在本发明的一种实施方式中，是将重组酵母菌种子液以5％-10％的接种量接种至发酵培养基中，于25℃-30℃，180rpm-220rpm，培养24h-96h。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的碳源为葡萄糖和/或肌醇。
在本发明的一种实施方式中，将种子培养液按10％接种量接种到含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，温度为30℃，摇床转速为200rpm，培养72h。
本发明的有益效益：本发明通过对葡萄糖二酸途径限速酶：肌醇加氧酶的突变，获得酶活提升的肌醇加氧酶，并将其与醛酸脱氢酶融合共表达，使葡萄糖二酸产量有所提升。重组菌P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V、P.pastoris GS115-Udh-MioxR171S、P.pastorisGS115-Udh-MioxK59V/R171S葡萄糖二酸产量分别为0.98g/L、1.15g/L及1.20g/L，相比于对照菌株(0.85g/L)，分别提升了15.3％、35.3％及41.2％。
附图说明
图1肌醇加氧酶突变体酶活；control：P.pastoris GS115-Udh-Miox；K59V：P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V；R171S：P.pastoris GS115-Udh-MioxR171S；K59V/R171S：P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V/R171S。
图2采用不同肌醇加氧酶突变体重组毕赤酵母摇瓶发酵产葡萄糖二酸；control：P.pastoris GS115-Udh-Miox；K59V：P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V；R171S：P.pastorisGS115-Udh-MioxR171S；K59V/R171S：P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V/R171S
具体实施方式
序列表中为核苷酸序列信息说明：
SEQ ID NO.1为肌醇加氧酶原始氨基酸序列；
SEQ ID NO.2为肌醇氧化酶突变体K59V；
SEQ ID NO.3为肌醇氧化酶突变体R171S；
SEQ ID NO.4为肌醇氧化酶突变体K59V/R171S
肌醇加氧酶的酶活测定方法：
以肌醇作为底物，根据肌醇加氧酶转化肌醇生成葡萄糖醛酸的含量，检测MIOX的催化活性。肌醇加氧酶单位酶活定义：1min内生成1nmol·mg-1醛酸所需要的酶量。具体检测方法如下：配制含有50mmol·L-1Tris-Cl(pH 7.0)，2mmol·L-1L-半胱氨酸，1mmol·L-1Fe(NH4)2(SO4)2和10g·L-1肌醇的底物反应液。在1.5mL EP管内加入900μL反应液，然后加入100μL破壁后上清粗酶液，立即放入30℃恒温金属浴中反应，反应1h后，通过加入100μL的30％三氯乙酸终止反应。以不添加肌醇的反应液作为对照。将上述反应液取1mL加入玻璃比色管内，然后加入2mL苔黑素试剂，混匀后，在沸水中反应15min。当反应物冷却至室温时，在670nm下测量吸光度。根据葡萄糖醛酸标准曲线计算得出葡萄糖醛酸的含量，从而计算MIOX酶活。
葡萄糖二酸产量的测定方法：
(1)样品的Affi-Gel凝胶处理：取1mL发酵液在12000r·min-1下离心5min。取0.9mL发酵液上清或葡萄糖二酸标准溶液加入2mL EP管内，然后加入0.1mL 1mol·L-1磷酸钾缓冲液及50mgAffi-Gel，漩涡震荡5次，每次间隔20min，然后将样品5000r·min-1离心5min，弃上清。用1mL 80mmol·L-1磷酸钾-20mmol·L-1硼酸缓冲液(pH 7.0)加入到沉淀中，漩涡震荡，离心弃上清。0.375mL 0.1mol·L-1HCI洗脱两次，混合离心，将上清转移到1.5mLEP管中，用1mol·L-1NaOH调中性，加去离子水补足到0.9mL。经0.22μm滤膜过滤，供液相分析。
(2)HPLC分析条件：流动相为5mmol·L-1稀硫酸，色谱柱为Aminex HPX-87H(美国Bio-Rad)，流速0.6mL·min-1，柱温45℃，进样量10μL，检测器为紫外检测器(210nm)。
培养基：
YPD培养基(g·L-1)：胰蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。
发酵培养方法：
挑取生长良好的单菌落接种于250mL三角瓶装液量为25mL的YPD液体培养基中，30℃，220r·min-1培养24h。再将该种子培养液按5％接种量转接至50mL(摇瓶容量为500mL)的发酵培养基YPD中发酵，培养72h。
实施例1肌醇加氧酶miox突变体菌株的构建
利用定点突变试剂盒(TakaRa)，设计两对引物(如表一所示)，以pUC57-miox(该质粒构建方法参见Liu,Y.,et al.,Production ofglucaric acidfrom myo-inositol inengineeredPichia pastoris.Enzyme and Microbial Technology,2016.91:p.8-16.)为模板进行PCR，将肌醇加氧酶分子内部的59位的赖氨酸突变为缬氨酸；或将171位的精氨酸突变为丝氨酸，分别命名为K59V及R171S。产物回收后进行转化验证，得到正确的转化子分别命名为pUC57-mioxK59V及pUC57-mioxR171S。以测序正确的菌株pUC57-mioxK59V为模板，对肌醇加氧酶分子内部的171位精氨酸突变为丝氨酸，转化得到正确的转化子命名为pUC57-mioxK59V/R171S。
实施例2重组毕赤酵母pPIC9KGAP-Udh-mioxK59V、pPIC9KGAP-Udh-mioxR171S、pPIC9KGAP-Udh-mioxK59V/R171S的构建
以pGAPZB(商品化质粒，invitrogen公司购买)为模板，以GAP-F\R为引物对扩增启动子，以恶臭假单胞菌基因组为模板，以udh-F\R为引物对扩增udh基因(Gene ID:1045739)。同时以pUC57-mioxK59V、pUC57-mioxR171S、pUC57-mioxK59V/R171S质粒为模板，miox-F/R为引物分别扩增肌醇加氧酶突变体基因，使用融合PCR的方法将三突变体基因分别与udh基因融合，并在融合片段上下游分别引入酶切位点SacI、NotI。双酶切后连接转化，鉴定将正确后重组质粒线性化后电转入表达宿主中，重组克隆子经验证正确，命名为pPIC9KGAP-Udh-mioxK59V、pPIC9KGAP-Udh-mioxR171S、pPIC9KGAP-Udh-mioxK59V/R171S酵母菌。
如图1所示，相比表达突变前的肌醇加氧酶与醛酸脱氢酶的对照菌P.pastorisGS115-Udh-Miox，表达突变后的肌醇加氧酶与醛酸脱氢酶的P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V、P.pastoris GS115-Udh-MioxR171S、P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V/R171S的重组毕赤酵母的葡萄糖二酸产量均有提高；其中，重组毕赤酵母Pichiapastoris GS115-udh-mioxK59V/R171S产量最高，摇瓶发酵培养时，在YPD-MI(在YPD培养基中添加10g/L肌醇)的培养基中，生产葡萄糖二酸1.20g/L。
表一实施例中应用的引物
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种肌醇加氧酶突变体，其特征在于，所述肌醇加氧酶突变体是(a)：
(a)在SEQ ID NO.1所示序列基础上，第59位的赖氨酸突变为缬氨酸，或将171位的精氨酸突变为丝氨酸，或在将59位的赖氨酸突变为缬氨酸的同时，将171位的精氨酸突变为丝氨酸。
2.编码权利要求1所述肌醇加氧酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体或细胞。
4.一种重组表达权利要求1所述肌醇加氧酶突变体的重组酵母，其特征在于，是将编码肌醇加氧酶突变体与醛酸脱氢酶的基因通过融合，克隆表达至酵母中，构建重组酵母。
5.根据权利要求4所述的一种重组表达权利要求1所述肌醇加氧酶突变体的重组酵母，其特征在于，所述醛酸脱氢酶基因udh来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
6.根据权利要求4所述的一种重组表达权利要求1所述肌醇加氧酶突变体的重组酵母，其特征在于，编码肌醇加氧酶突变体与醛酸脱氢酶的基因在酵母中整合表达。
7.根据权利要求4所述的一种重组表达权利要求1所述肌醇加氧酶突变体的重组酵母，其特征在于，所述酵母为以下任意一种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、毕赤酵母(Pichia pastoris)。
8.根据权利要求4所述的一种重组表达权利要求1所述肌醇加氧酶突变体的重组酵母，其特征在于，将GAP启动子、udh基因及miox突变基因按照顺序融合，并在融合片段上下游分别引入酶切位点SacI、NotI的融合片段，并连接到表达载体pPIC9K上，筛选获得正确的重组质粒，转化到宿主菌P.pastoris GS115中即得到重组酵母菌。
9.一种利用权利要求4-8任一所述的重组酵母生产葡萄糖二酸的方法，其特征在于，是以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物催化合成葡萄糖二酸。
10.权利要求4-8任一所述的重组酵母在食品、化工、制备药物方面的应用。
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