CN107177564A

CN107177564A - 一种干酪乳杆菌来源的l‑乳酸脱氢酶及其应用

Info

Publication number: CN107177564A
Application number: CN201710474462.0A
Authority: CN
Inventors: 邬敏辰; 李雪晴; 袁风娇; 刘艳; 李剑芳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-06-21
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2017-09-19

Abstract

本发明公开了一种干酪乳杆菌来源的L‑乳酸脱氢酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种新的乳酸脱氢酶，并实现了该基因的异源表达。通过构建含有该基因的重组质粒pET‑22b(+)‑Lcldh1,将其转化至大肠杆菌中，获得了含有表达质粒pET‑22b(+)‑Lcldh1的重组大肠杆菌E.coli/Lcldh1。以10mmol/L苯丙酮酸为底物，重组LcLDH1工程菌全细胞催化，反应1h，获得L‑PLA的浓度为8.59mmol/L，产率为85.9％，ee_p>99％。纯化后LcLDH1的比活力达到294.2U/mg，表现出了较高的催化活性和对映选择性，有明显的应用潜力和经济价值。

Description

一种干酪乳杆菌来源的L-乳酸脱氢酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种干酪乳杆菌来源的L-乳酸脱氢酶及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

苯乳酸(Phenyllactate acid，PLA)，系统名为2-羟基-3-苯基丙酸，是一种高值有机酸，其具有两种对映异构体：L-PLA和D-PLA。PLA的分子式为C₉H₁₀O₃，相对分子质量为166.17，其性质稳定，熔点为121～125℃；PLA在水中溶解度较好，并且其在水溶液中有较好的热稳定性。L-PLA和D-PLA都具有广谱抑菌效果，可作为天然抑菌剂，替代化学合成的防腐剂，而且可经聚合反应合成聚苯乳酸新型高分子材料，替代聚乳酸高分子材料。因此，苯乳酸在化工、制药、生物、材料和食品等领域有广阔的应用前景。

PLA可由多种微生物代谢产生，是菌体在代谢途径中一个副产物，如大多数的乳酸菌如植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)等，也有一些真菌如白地霉(Geotrichum candidum)，荧光维克酵母(Wickerhamiafluorescens)TK1可产PLA，但现有的野生菌株自产PLA的浓度很低。目前，PLA可以通过化学和生物的方法合成，但由于化学方法苛刻的反应条件、复杂的技术路线、副产物多不易分离，尤其对环境造成污染等缺点，生物合成法因其高效性，反应条件温和等优点，近年来受到广大研究者的青睐。

已有研究表明，微生物中多种L-乳酸脱氢酶可不对称还原苯丙酮酸生成L-PLA，但是不同L-LDH不对称还原苯丙酮酸的能力存在明显差异，如贾江花等克隆表达了来源于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)中的L1-LDH和L2-LDH基因，重组L1-LDH对苯丙酮酸的比活力为71.06U/mg，而重组L2-LDH对苯丙酮酸的比活力仅为0.06U/mg，并未测定其对映体纯度。王颖等克隆了来源于Bacillus megaterium Z2013513的ldhL基因并在大肠杆菌中实现表达，测得粗酶液对苯丙酮酸的酶活力为3.4U/mg。在37℃、200r/min条件下，25g/L(干重)重组菌经60min将70.32mmol/L苯丙酮酸全细胞转化合成50.59mmol/L L-PLA，ee_p为96.89％，底物摩尔转化率仅为71.94％。因此，利用分子生物学手段不断挖掘出性状优良的L-LDH，对于获得高纯度，高产量的L-PLA具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种来源于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的L-乳酸脱氢酶，LcLDH1，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有苯丙酮酸还原活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码所述L-乳酸脱氢酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ IDNO.1所示的L-乳酸脱氢酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-22b(+)为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21、E.coli JM109、E.coliDH5α、或E.coli TOP10。

本发明的第四个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，是将SEQ ID NO.1所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET-22b(+)。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。

本发明的第五个目的是提供生产所述乳酸脱氢酶的方法，是将所述基因工程菌接种至LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为0.3～0.5mmol/L的IPTG诱导6～10h。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导是在18～22℃进行诱导。

本发明的第六个目的是提供所述L-乳酸脱氢酶的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是以苯丙酮酸为底物，加入所述L-乳酸脱氢酶，转化生产L-苯乳酸。

在本发明的一种实施实施方式中，所述应用是向每1mmol/L苯丙酮酸中加入3mg含所述乳酸脱氢酶的重组湿菌体，于30～37℃200～220rpm条件下反应30～120min。

本发明的有益效果：来源于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的L-乳酸脱氢酶基因序列克隆，L-乳酸脱氢酶工程菌的构建以及重组L-乳酸脱氢酶的异源表达和活性测定的方法。本发明构建的重组菌株E.coli/Lcldh1在反应80min后可不对称还原10mmol/L苯丙酮酸生成8.59mmol/L的L-苯乳酸，产率为85.9％，对映体过量值(ee_p)>99％。纯化的LcLDH1对苯丙酮酸的比活性为294.2U/mg。

附图说明

图1为重组LcLDH1的SDS-PAGE分析；其中，M:Protein marker；1:E.coli/pET22b全细胞(对照菌)；2:E.coli/LcLDH1全细胞；3纯化后的LcLDH1。

具体实施方式

LcLDH1的活性测定：总反应体系，包括50mmol/L乙酸钠缓冲液(pH5.0)，0.2mmol/LNADH，8mmol/L苯丙酮酸，对照组中不含NADH，其他成分相同。混匀后于30℃保温5min，加入适量的酶液。检测NADH在340nm处吸收值的变化。酶活力单位(U)定义为：在上述条件下，每分钟催化氧化1μmol NADH所需要的酶量。同时，采用Bradford方法测定蛋白含量。

底物和产物的检测：反应结束后，取一定量的转化液加入甲醇终止反应，进行反相HPLC分析：色谱柱为ProntoSIL C18(150mm×4.6mm×0.25μm)，流动相成分：0.05％三氟乙酸/水(A)和0.05％三氟乙酸/甲醇(B)混合液。梯度洗脱程序为：0～15min 20％～65％B；15～16min 65％～100％B；16～19min保持100％B；紫外光检测器，柱温：30℃；流速1mL/min。检测波长为210nm，PPA的保留时间11.372min，PLA的保留时间为12.858min。

另取一部分转化液于1mL乙酸乙酯中进行萃取，上层有机相经无水硫酸镁干燥后过0.22μm有机滤膜采用正相HPLC进行手性分析，色谱柱为Daicel OD-H(250mm×4.6mm)，分析条件为：流动相为正己烷/异丙醇/三氟乙酸(98:2:0.05，v/v)，流速为1mL/min，检测波长为210nm，柱温：30℃，D-PLA和L-PLA的保留时间分别为33.896min，35.806min。根据实验数据计算对映体过量值：ee_p＝[L-PLA-D-PLA/(L-PLA+D-PLA)]×100％。

实施例1LcLDH1基因的克隆与表达质粒的构建

根据L.casei BL23的L-LDH(CAP07851)对应的核苷酸序列设计如下引物：

LcLDH1-F：5’-CATATGGTGGCAAGTATTACGGATAA-3’，含Nde I酶切位点。

LcLDH1-R：5’-CTCGAGCTGACGAGTTTCGATGTCATT-3’，含Xho I酶切位点。

提取干酪乳杆菌的总DNA，以LcLDH1-F和LcLDH1-R为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃ 4min；94℃ 30s，51℃ 30s，72℃ 1min 10s，30个循环；72℃ 10min。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-Lcldh1)，转化入E.coli JM109中，经菌液PCR鉴定正确后送上海生工测序，得到LcLDH1核苷酸序列。将测序结果正确的pUCm-T-Lcldh1与pET-22b(+)质粒均用Nde I和Xho I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-22b(+)-Lcldh1，并对重组质粒进行序列测定。

实施例2重组菌E.coli/Lcldh1的构建与诱导表达

将pET-22b(+)-Lcldh1转化入E.coli BL21(DE3)中，经含有Amp的抗性平板筛选后，挑取阳性转化子于2mL含Amp的抗性LB液体培养基中，37℃ 220rpm摇床振荡培养14～16h。按2％的接种量转接于30mL相同培养基中，37℃ 220rpm摇床振荡培养至对数生长中期(OD₆₀₀＝0.6～0.8)，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，20℃ 220rpm诱导培养8h。诱导结束后，离心收集菌体并用磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)洗涤数次，用于SDS-PAGE分析。以仅含空pET-22b(+)的菌株为对照，结果见图1，重组菌E.coli/Lcldh1(即E.coli BL21(DE3)pET-22b(+)-Lcldh1)在36.4kDa处具有大小与目的酶相同的蛋白条带，对照菌没有条带。利用液相色谱测定LcLDH1转化苯丙酮酸生成PLA的产量及测定产物的对映选择性。对照组分别用仅含空pET-22b(+)和无IPTG诱导的工程菌在相同条件下培养。8000rpm，5min收集菌体。加入一定量的破碎液(20mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl)，超声破碎后，4℃，12000rpm，10min离心取上清液即为粗酶液，经测定，其酶活为93.99U/mL。经Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析纯化破碎液，测定纯LcLDH1的比活性。经测定，纯化后的酶液的比酶活为294.2U/mg。

实施例3重组菌全细胞催化苯丙酮酸生成L-PLA

于1mL离心管中加入300μL菌悬液(30mg湿菌体)和250μL磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，37℃保温5min，再依次加入50μL葡萄糖(终浓度50mmol/L)和400μL苯丙酮酸(终浓度10mmol/L)，反应1h后，取200μL反应液加入800μL甲醇终止反应，过0.22μm有机滤膜，进行HPLC分析；另取200μL反应液，用1mL乙酸乙酯进行萃取，上层有机相经无水硫酸钠干燥后过0.22μm有机滤膜，进行对映选择性分析。结果显示，当体系反应40min后，L-PLA的浓度为5.62mmol/L，产率为56.2％，ee_p>99％，当反应80min后，苯丙酮酸完全被消耗，产生8.59mmol/L的L-PLA，产率为85.9％，ee_p>99％。

对照例1

具体实施方式同实施例2，区别在于，用仅含空pET-22b(+)和无IPTG诱导的工程菌在相同条件下诱导表达，按照实施例3测得两种工程菌催化苯丙酮酸，获得L-PLA的浓度仅为0.32mmol/L和0.46mmol/L。

对照例2

合成编码Genbank登录号为KTE98134.1L-乳酸脱氢酶的基因序列，将该基因命名为Lcldh2，按照实施例1的策略克隆该基因和构建表达质粒pET22b(+)-Lcldh2，引物设计为：

Lcldh2-F:5′–CATATGATGGCAAGAACAATTGGT–3′下划线部分为NdeⅠ酶切位点

Lcldh2-R:5′–CTCGAGCTTCATTTTTTCAAAGGTATC–3′下划线部分为XhoⅠ酶切位点。

根据实施例2的策略，将LcLDH2在E.coli BL21(DE3)中进行异源表达，得到重组菌E.coli/Lcldh2。将重组菌按照实施例2的步骤进行异源表达得到LcLDH2，按照实施例3将E.coli/LcLDH2菌悬液与10mmol/L苯丙酮酸混匀，于37℃、220r/min共同反应1h后进行液相检测，结果产生3.5mmol/L L-PLA，产率仅为35％，粗酶液的酶活力为47.3U/mg。

对照例3

合成编码Genbank登录号为CAP07856.1的基因序列，将该基因命名为Lcldh3，按照实施例1的策略克隆该基因和构建表达质粒pET22b(+)-Lcldh3。

Lcldh3-F:5′–CATATGATGCGGAACAACGGCAATAT–3′下划线部分为NdeⅠ酶切位点

Lcldh3-R:5′–CTCGAGAGCTTCTTGAGCCTTCTTCA–3′下划线部分为XhoⅠ酶切位点。

根据实施例2的策略，将LcLDH3在E.coli BL21(DE3)中进行异源表达，得到重组菌E.coli/Lcldh3。将重组菌按照实施例2的步骤进行诱导表达得到LcLDH3，按照实施例3的步骤将E.coli/Lcldh3菌悬液与10mmol/L苯丙酮酸混匀，于37℃、220r/min共同反应1h后进行液相检测，结果产生2.7mmol/L L-PLA，产率为27％，粗酶液的酶活力为42.5U/mg。

对照例4

按照实施例1，将Lcldh1连接至pET28a(+)载体上，获得重组质粒pET28a-Lcldh1，将重组质粒导入BL21(DE3)中，得到重组菌BL21/pET28a-Lcldh1并进行诱导表达，按照实施例3将BL21/pET28a-Lcldh1菌悬液与10mmol/L苯丙酮酸混匀，于37℃、220r/min共同反应1h后进行液相检测，发现产生L-PLA的浓度和LcLDH1的对映选择性相比于E.coli BL21(DE3)pET-22b(+)-Lcldh1并没有提高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种干酪乳杆菌来源的L-乳酸脱氢酶及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtggcaagta ttacggataa ggatcaccaa aaagttattc tcgttggtga cggcgccgtt 60

ggttcaagtt atgcctacgc aatggttttg caaggtatcg ctcaggaaat cggaatcgtt 120

gacattttca aggacaagac aaagggtgac gcgattgact tgagcaacgc gctcccattc 180

acaagtccta agaagattta ttcagctgaa tacagcgatg ctaaggatgc tgatctggtt 240

gttatcacag ctggcgctcc tcagaagcct ggcgaaactc gtttggactt ggttaacaag 300

aacttgaaga tcttgaagtc cattgttgac ccaatcgttg attccggctt taacggtatt 360

ttcttagttg ctgccaaccc agttgacatt ttgacctatg caacttggaa actttctggc 420

ttcccgaaga accgggttgt tggttccggt acttcactgg acaccgcccg cttccgtcag 480

tccattgctg aaatggttaa tgttgacgct cgttcggtcc acgcttacat catgggcgaa 540

catggtgaca ctgaattccc tgtatggtcc cacgctaaca ttggtggcgt taccatcgct 600

gaatgggtta aggctcatcc agaaatcaag gaagacaagc ttgttaagat gtttgaagac 660

gttcgtgacg ccgcttatga aatcatcaaa ctcaagggtg cgaccttcta tggtatcgca 720

actgcccttg cccggatttc aaaggcaatc cttaacgacg aaaatgcggt tctgccactt 780

tccgtttaca tggatggtca atatggcttg aacgacatct acatcggtac cccagctgtg 840

atcaaccgta atggtatcca gaacatcctg gaaatcccat tgaccgatca cgaagaagaa 900

tccatgcaga aatctgcttc tcaattgaag aaggctctga ccgatgcttt cgctaagaat 960

gacatcgaaa ctcgtcag 978

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Val Ala Ser Ile Thr Asp Lys Asp His Gln Lys Val Ile Leu Val Gly

1 5 10 15

Asp Gly Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Tyr Ala Met Val Leu Gln Gly

20 25 30

Ile Ala Gln Glu Ile Gly Ile Val Asp Ile Phe Lys Asp Lys Thr Lys

35 40 45

Gly Asp Ala Ile Asp Leu Ser Asn Ala Leu Pro Phe Thr Ser Pro Lys

50 55 60

Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Asp Ala Lys Asp Ala Asp Leu Val

65 70 75 80

Val Ile Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp

85 90 95

Leu Val Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Lys Ser Ile Val Asp Pro Ile

100 105 110

Val Asp Ser Gly Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val

115 120 125

Asp Ile Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Leu Ser Gly Phe Pro Lys Asn

130 135 140

Arg Val Val Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Gln

145 150 155 160

Ser Ile Ala Glu Met Val Asn Val Asp Ala Arg Ser Val His Ala Tyr

165 170 175

Ile Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Val Trp Ser His Ala

180 185 190

Asn Ile Gly Gly Val Thr Ile Ala Glu Trp Val Lys Ala His Pro Glu

195 200 205

Ile Lys Glu Asp Lys Leu Val Lys Met Phe Glu Asp Val Arg Asp Ala

210 215 220

Ala Tyr Glu Ile Ile Lys Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Ala

225 230 235 240

Thr Ala Leu Ala Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu Asn Ala

245 250 255

Val Leu Pro Leu Ser Val Tyr Met Asp Gly Gln Tyr Gly Leu Asn Asp

260 265 270

Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Ile Asn Arg Asn Gly Ile Gln Asn

275 280 285

Ile Leu Glu Ile Pro Leu Thr Asp His Glu Glu Glu Ser Met Gln Lys

290 295 300

Ser Ala Ser Gln Leu Lys Lys Ala Leu Thr Asp Ala Phe Ala Lys Asn

305 310 315 320

Asp Ile Glu Thr Arg Gln

325

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catatggtgg caagtattac ggataa 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcgagctga cgagtttcga tgtcatt 27

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catatgatgg caagaacaat tggt 24

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcgagcttc attttttcaa aggtatc 27

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catatgatgc ggaacaacgg caatat 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctcgagagct tcttgagcct tcttca 26

Claims

1.一种L-乳酸脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2.编码权利要求1所述L-乳酸脱氢酶的基因。

3.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达权利要求1所述的L-乳酸脱氢酶。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，以pET-22b(+)为载体。

5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主为E.coli BL21、E.coliJM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10。

6.一种构建权利要求3所述基因工程菌的方法，其特征在于，是将SEQ ID NO.1所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述载体为pET-22b(+)；所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

8.一种生产权利要求1所述乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，将权利要求3所述基因工程菌接种至LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为0.4～0.5mmol/L的IPTG诱导6～10h。

9.一种苯乳酸的制备方法，其特征在于，以苯丙酮酸为底物，加入权利要求1所述的L-乳酸脱氢酶，转化生产L-苯乳酸。

10.权利要求1所述的L-乳酸脱氢酶在食品、生物、医药、化工领域的应用。