CN107177563A - 一种干酪乳杆菌来源的d‑乳酸脱氢酶及其应用 - Google Patents

一种干酪乳杆菌来源的d‑乳酸脱氢酶及其应用 Download PDF

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李雪晴
刘艳
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Abstract

本发明公开了一种干酪乳杆菌来源的D‑乳酸脱氢酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种D‑乳酸脱氢酶，并实现了该基因的异源表达。通过构建含有该基因的重组质粒pET‑28a(+)‑LcldhD,将其转化至大肠杆菌中，获得了含有表达质粒pET‑28a(+)‑LcldhD的重组大肠杆菌E.coli/LcldhD。以10mmol/L苯丙酮酸为底物，重组LcLDHD工程菌全细胞催化，反应40min，获得D‑PLA的浓度为9.91mmol/L，底物转化率为99.1％，eep为98.3％。表现出了较高的催化活性，有明显的应用潜力和经济价值。

Description

一种干酪乳杆菌来源的D-乳酸脱氢酶及其应用
技术领域
本发明涉及一种干酪乳杆菌来源的D-乳酸脱氢酶及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
手性α-羟基酸是合成许多药物、化学材料的重要前体物质。例如，苯乳酸(Phenyllactic acid,PLA)又名2-羟基-3苯基丙酸，存在两种对映异构体，D-PLA和L-PLA。D/L-PLA均具有广谱且高效的抑菌活性，是一种新型天然生物防腐剂，可作为饲料添加剂替代畜禽饲料的抗菌剂。
D-乳酸脱氢酶(D-Lactate dehydrogenase，D-LDH，EC 1.1.1.28)，是脱氢酶中十分重要且研究较多的一种酶，也是生物体内糖酵解途径中一种关键的氧化还原酶。已有研究发现多种D-LDH可不对称还原苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)生成D-PLA，如来源于Pediococcus acidilactici和Pediococcus pentosaceus的PaLDH和PpLDH，LactobacillusplantarumWCFS1中的D-LDH及Lactobacillus bulgaricus ATCC 11842中的D-nLDH等。但是不同的D-LDH不对称还原PPA的能力存在明显差异，胡发根等利用来源于Lactobacillusplantarum的重组LDH将55mM PPA在1h内转化生成了30.5mM D-PLA，摩尔转化率为54.5％，光学纯度达到100％。而来源于Lactobacillus bulgaricus的D-nLDH突变体偶联甲酸脱氢酶后可将50mM PPA在90min内完全转化，其D-PLA产率为99.0％，eep>99.9％。因此，为获得高纯度，高产量的D-PLA，利用分子生物学手段不断挖掘出性状优良的D-LDH，具有重要的工业化应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种来源于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的D-乳酸脱氢酶，命名为LcLDHD，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有苯丙酮酸还原活性的由(a)衍生的蛋白质。
本发明的第二个目的是提供编码所述D-乳酸脱氢酶的基因LcldhD。
在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ IDNO.1所示基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-28a(+)为载体。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21、E.coli JM109、E.coliDH5α、或E.coli TOP10。
本发明的第四个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，是将SEQ ID NO.1所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET-28a(+)。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。
本发明的第五个目的是提供生产所述乳酸脱氢酶的方法，是将所述基因工程菌接种至LB培养基中，培养至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.4～0.5mmol/L的IPTG诱导6～10h。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导是在24～28℃进行诱导。
本发明的第六个目的是提供所述D-乳酸脱氢酶的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是以苯丙酮酸为底物，加入所述D-乳酸脱氢酶，转化生产D-苯乳酸。
在本发明的一种实施实施方式中，所述应用是向每1mmol苯丙酮酸中加入2～8mg含的该D-乳酸脱氢酶的重组菌的湿菌体，于30～37℃，200～220rpm条件下反应20～60min。
有益效果：本发明构建的重组菌株E.coli BL21(DE3)pET-28a(+)-LcldhD可将10mmol/L苯丙酮酸在40min内完全不对称还原生成9.91mmol/L PLA，产率为99.1％，对映体过量值(eep)为98.3％，相比于现有技术，在反应时间缩短一倍以上的同时，转化率提高，取得了预料不到的技术效果。
附图说明
图1为E.coli全细胞的SDS-PAGE分析；M:Protein marker；1:E.coli/pET28a；2:E.coli/LcLDHD。
具体实施方式
LcLDHD的酶活性测定：总反应体系为3mL，包括100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)，0.2mmol/LNADH，8mmol/L苯丙酮酸，对照组中不含NADH，其他成分相同。混匀后于30℃保温5min，加入适量的酶液。检测NADH在340nm处吸收值的变化。酶活力单位(U)定义为：在上述条件下，每分钟催化氧化1μmol NADH所需要的酶量。同时，采用Bradford方法测定蛋白含量。
底物和产物的检测：反应结束后，取一定量的转化液加入甲醇终止反应，进行反相HPLC分析：色谱柱为ProntoSIL C18(150mm×4.6mm×0.25μm)，流动相成分：0.05％三氟乙酸/水(A)和0.05％三氟乙酸/甲醇(B)混合液。梯度洗脱程序为：0～15min 20％～65％B；15～16min 65％～100％B；16～19min保持100％B；紫外光检测器，柱温：30℃；流速1mL/min。检测波长为210nm，苯丙酮酸的保留时间11.372min，PLA的保留时间为12.858min。
另取一部分转化液于1mL乙酸乙酯中进行萃取，上层有机相经无水硫酸镁干燥后过0.22μm有机滤膜采用正相HPLC进行手性分析，色谱柱为Daicel OD-H(250mm×4.6mm)，分析条件为：流动相为正己烷/异丙醇/三氟乙酸(98:2:0.05，v/v)，流速为1mL/min，检测波长为210nm，柱温：30℃，D-PLA和L-PLA的保留时间分别为33.889min，35.797min。根据实验数据计算对映体纯度：eep＝[D-PLA-L-PLA/(D-PLA+L-PLA)]×100％。
实施例1LcldhD基因的克隆与表达质粒的构建
根据L.casei BL23的D-LDH(CAQ65269)对应的核苷酸序列设计如下引物：
LcLDHD-F：5’-GAATTCATGAAGATTATTGCTTACGG-3’，含EcoR I酶切位点。
LcLDHD-R：5’-CTCGAGCTTTGCTGGACCAGTAACTT-3’，含Xho I酶切位点。
提取L.casei的总DNA，以L.casei的总DNA为模板，以LcLDHD-F和LcLDHD-R为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃ 4min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min 10s，30个循环；72℃10min。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-LcldhD)，转化入E.coli JM109中，经菌液PCR鉴定正确后送上海生工测序，得到LcLDHD核苷酸序列。
将测序结果正确的pUCm-T-LcldhD与pET-28a(+)质粒均用EcoR I和Xho I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a(+)-LcldhD，并对重组质粒进行序列测定。
实施例2重组菌的构建与诱导表达
将pET-28a(+)-LcldhD转化入E.coli BL21(DE3)中，经含有Kan的抗性平板筛选后，挑取阳性转化子于2mL含Kan的抗性LB液体培养基中，37℃ 220rpm摇床振荡培养14～16h。按1～2％的接种量转接于30mL相同培养基中，37℃ 220rpm摇床振荡培养至对数生长中期(OD600＝0.6～0.8)，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，16℃ 220rpm诱导培养10h。对照组分别用仅含空pET-28a(+)在相同条件下培养(E.colipET28a)。诱导结束后，离心收集菌体并用磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)洗涤两次后制备含100mg/mL湿细胞的菌悬液，用于SDS-PAGE分析，分析结果见图1，构建成功的重组菌E.coli BL21(DE3)pET-28a(+)-LcldhD在37.8kDa处有明显的蛋白条带，对照E.colipET28a没有大小相同的蛋白条带。
实施例3重组菌全细胞催化苯丙酮酸生成D-PLA
于1mL离心管中加入300μL菌悬液(30mg湿菌体)和250μL磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，37℃保温5min，再依次加入50μL葡萄糖(终浓度50mmol/L)和400μL苯丙酮酸(终浓度10mmol/L)，反应40min后，取200μL反应液加入800μL甲醇终止反应，过0.22μm有机滤膜，进行HPLC分析；利用液相色谱测定LcLDHD重组菌转化10mmol/L苯丙酮酸生成PLA的产量及对映选择性分析，结果显示PLA的浓度为9.31～9.92mmol/L。
另取200μL反应液，用1mL乙酸乙酯进行萃取，上层有机相经无水硫酸钠干燥后过0.22μm有机滤膜，进行对映选择性分析。结果显示，当体系反应20min后D-PLA的产率为76.9％，eep为98％。在反应40min后，苯丙酮酸完全被还原生成D-PLA，产率为99.1％，eep为98.3％。对照例1
具体实施方式同实施例2，区别在于，用仅含空pET-28a(+)和无IPTG诱导的工程菌在相同条件下诱导表达，测得两种工程菌催化苯丙酮酸获得D-PLA的浓度仅为0.81mmol/L和0.78mmol/L。
对照例2
合成编码Genbank登录号为：KDE85061.1的D-乳酸脱氢酶基因序列，将该基因命名为Aoldh，按照实施例1的策略克隆该基因和构建表达质粒pET28a(+)-Aoldh。
Aoldh-F:5′–CATATGATGAAGCTAGCAGTCTTCAG–3′下划线部分为NdeⅠ酶切位点
Aoldh-R:5′–CTCGAGTAACCGGACAGGCTCCTT–3′下划线部分为XhoⅠ酶切位点。
根据实施例2的策略，将Aoldh在E.coli BL21(DE3)中进行异源表达，得到重组菌E.coli Aoldh。将重组菌按照实施例2的步骤进行诱导表达得到AoLDH，按照实施例3将E.coli Aoldh菌悬液与10mmol/L苯丙酮酸混匀，于37℃、220r/min共同反应12h后进行液相检测，结果显示该重组菌产生的PLA浓度与表达空质粒的对照组相同，表明AoLDH对苯丙酮酸无催化活性。
对照例3
按实施例2的方式对重组菌进行诱导，区别在于调整诱导温度为12℃，在其余的条件相同的情况下，D-苯乳酸浓度仅4.02～4.75mM。
对照例4
按实施例2的方式对重组菌进行诱导，区别在于调整诱导温度为20℃，8h，在其余的条件相同的情况下，D-苯乳酸浓度仅5.02～5.75mM。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种干酪乳杆菌来源的D-乳酸脱氢酶及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaagatta ttgcttacgg tgcacgcgtt gacgagattc aatatttcaa gcaatgggcc 60
aaggatacag gcaacacact tgaataccat acagaatttc tcgatgaaaa caccgttgaa 120
tgggctaaag ggtttgatgg catcaattca ttgcagacaa cgccatatgc agccggcgtt 180
tttgaaaaaa tgcatgcgta tggtatcaag ttcctgacga ttcggaatgt gggtacagat 240
aacattgata tgactgccat gaagcaatac ggcattcgtt tgagcaatgt accggcttat 300
tcgccagcag cgattgctga atttgctttg accgatactt tgtacttgct acgtaatatg 360
ggtaaagtac aggctcaact acaggcgggc gattatgaaa aagcgggcac cttcatcggt 420
aaggaactcg gtcagcaaac cgttggcgtg atgggcaccg gtcatattgg gcaggttgct 480
atcaaactgt tcaaagggtt tggcgccaaa gtgattgctt acgatcctta tccaatgaag 540
ggcgatcacc cagattttga ctatgtcagc cttgaagacc tctttaagca aagtgatatc 600
attgatcttc atgttcctgg gattgaacaa aatacccaca ttatcaatga agcggcattt 660
aatttgatga aaccgggtgc gattgtgatc aacacggctc ggctaaatct gattgacacg 720
caagccatgc tcagcaatct taagtctggc aagttggccg gtgtcgggat tgacacctat 780
gaatacgaaa ccgaggactt gttgaatctc gccaagcacg gtagcttcaa ggatccgttg 840
tgggatgagc tgttggggat gccaaatgtt gtcctcagcc cgcacattgc ctactacacc 900
gagacggctg tgcataatat ggtttacttc tcactacaac atctcgttga tttcttgacc 960
aaaggcgaaa ccagcacgga agttactggt ccagcaaag 999
<210> 2
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Lys Ile Ile Ala Tyr Gly Ala Arg Val Asp Glu Ile Gln Tyr Phe
1 5 10 15
Lys Gln Trp Ala Lys Asp Thr Gly Asn Thr Leu Glu Tyr His Thr Glu
20 25 30
Phe Leu Asp Glu Asn Thr Val Glu Trp Ala Lys Gly Phe Asp Gly Ile
35 40 45
Asn Ser Leu Gln Thr Thr Pro Tyr Ala Ala Gly Val Phe Glu Lys Met
50 55 60
His Ala Tyr Gly Ile Lys Phe Leu Thr Ile Arg Asn Val Gly Thr Asp
65 70 75 80
Asn Ile Asp Met Thr Ala Met Lys Gln Tyr Gly Ile Arg Leu Ser Asn
85 90 95
Val Pro Ala Tyr Ser Pro Ala Ala Ile Ala Glu Phe Ala Leu Thr Asp
100 105 110
Thr Leu Tyr Leu Leu Arg Asn Met Gly Lys Val Gln Ala Gln Leu Gln
115 120 125
Ala Gly Asp Tyr Glu Lys Ala Gly Thr Phe Ile Gly Lys Glu Leu Gly
130 135 140
Gln Gln Thr Val Gly Val Met Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val Ala
145 150 155 160
Ile Lys Leu Phe Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Pro
165 170 175
Tyr Pro Met Lys Gly Asp His Pro Asp Phe Asp Tyr Val Ser Leu Glu
180 185 190
Asp Leu Phe Lys Gln Ser Asp Ile Ile Asp Leu His Val Pro Gly Ile
195 200 205
Glu Gln Asn Thr His Ile Ile Asn Glu Ala Ala Phe Asn Leu Met Lys
210 215 220
Pro Gly Ala Ile Val Ile Asn Thr Ala Arg Leu Asn Leu Ile Asp Thr
225 230 235 240
Gln Ala Met Leu Ser Asn Leu Lys Ser Gly Lys Leu Ala Gly Val Gly
245 250 255
Ile Asp Thr Tyr Glu Tyr Glu Thr Glu Asp Leu Leu Asn Leu Ala Lys
260 265 270
His Gly Ser Phe Lys Asp Pro Leu Trp Asp Glu Leu Leu Gly Met Pro
275 280 285
Asn Val Val Leu Ser Pro His Ile Ala Tyr Tyr Thr Glu Thr Ala Val
290 295 300
His Asn Met Val Tyr Phe Ser Leu Gln His Leu Val Asp Phe Leu Thr
305 310 315 320
Lys Gly Glu Thr Ser Thr Glu Val Thr Gly Pro Ala Lys
325 330
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaattcatga agattattgc ttacgg 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctcgagcttt gctggaccag taactt 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catatgatga agctagcagt cttcag 26
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctcgagtaac cggacaggct cctt 24

Claims (10)

1.一种D-乳酸脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有苯丙酮酸还原活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述D-乳酸脱氢酶的基因。
3.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达权利要求1所述的D-乳酸脱氢酶。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，以pET-28a(+)为载体。
5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主为E.coli BL21、E.coliJM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10。
6.一种构建权利要求3所述基因工程菌的方法，其特征在于，是将SEQ ID NO.1所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述载体为pET-28a(+)；所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
8.一种生产权利要求1所述D-乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，将权利要求3所述基因工程菌接种至LB培养基中，培养至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.4～0.5mmol/L的IPTG诱导6～10h。
9.权利要求1所述D-乳酸脱氢酶在食品、生物、医药、化工领域的应用。
10.一种苯乳酸的制备方法，其特征在于，以苯丙酮酸为底物，加入权利要求1所述的D-乳酸脱氢酶，转化生产D-苯乳酸。
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-: "《NCBI reference sequence：WP_003573025.1》", 《GENBANK数据库》 *

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CN108277190A (zh) * 2018-01-18 2018-07-13 江南大学 一种全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法

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